Изменение численности и динамика восстановления микроорганизмов чернозема обыкновенного в условиях хронического загрязнения антибиотиками

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изменение численности и динамика восстановления микроорганизмов чернозема обыкновенного в условиях хронического загрязнения антибиотиками

Акименко Ю.В., Чувараева О.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И.

Южный федеральный университет

Аннотация

В статье представлено комплексное исследование по изучению изменения обилия и динамики восстановления основных эколого-трофических групп микроорганизмов чернозема обыкновенного в условиях хронического загрязнения антибиотиками (тилозином, нистатином и их комплексами). Установлено угнетающее воздействие антибиотиков на микробоценоз чернозема обыкновенного. По степени устойчивости к хроническому воздействию антибиотиков исследованные микроорганизмы образовали ряд: бактерии р. Azotobacter > микромицеты > амилолитические бактерии > аммонифицирующие бактерии. Но, несмотря на хроническое воздействие, наблюдалось восстановление численности основных групп почвенных микроорганизмов через 100 сут. после загрязнения, однако полного восстановлении до контрольных значений не происходит. Развитие у микроорганизмов устойчивости к используемым для борьбы с ними препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов: приспособляемости к изменениям условий внешней среды.

Ключевые слова: Антибиотики, хроническое загрязнение, тилозин, нистатин, чернозем обыкновенный, микробоценоз

Черноземы составляют большую часть почвенного покрова юга России и являются главным земельным ресурсом сельскохозяйственного производства [1]. В сельском хозяйстве и медицине в настоящее время используется огромный арсенал антибиотиков, производство которых увеличивается с каждым годом в десятки и сотни раз. Сейчас работников сельскохозяйственной сферы обвиняют в том, что антибиотики из сельхозугодий попадают в окружающие водоемы. Муниципальные системы очистки воды не в состоянии отфильтровывать антибиотики, и потому сейчас очень важно изучить, как такое загрязнение влияет на состояние экосистем и, в частности, почвенного покрова.

В настоящее время проблеме загрязнения окружающей среды антибиотиками и приобретения к ним устойчивости патогенных микроорганизмов уделяется особое внимание. Ветеринарные антибиотики широко используются во всем мире как в терапевтических целях, так и в качестве кормовых добавок. Т.к. многие антибиотики водорастворимы, вплоть до 90% одной дозы может выделяться с мочой и 75% - с экскрементами животных [2].

В основном, антибиотики попадают в почву из-за применения навоза и сточных вод на сельскохозяйственных землях в качестве удобрения. В настоящее время антибиотики все чаще обнаруживаются в грунтовой и питьевой воде, сточных водах и сельскохозяйственных почвах. Антибиотики из класса тетрациклинов обнаруживаются в почвах в концентрациях 50-900 мг/кг, из класса макролидов - до 50-800 мг/кг [2-5].

Цель исследования - изучить изменение численности и динамику восстановления основных эколого-трофических групп микроорганизмов чернозема обыкновенного в условиях хронического загрязнения антибиотиками.

Отбор почвы для лабораторных модельных исследований производили из пахотного слоя (0-25 см) в Ботаническом саду Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону). Воздушно-сухие образцы почвы обрабатывали растворами ветеринарного антибиотика - тилозина, фунгицидного антибиотика - нистатина и их комплексами. Были выбраны три варианта хронического воздействия: I - постепенное увеличение концентрации антибиотиков от 1 до 1000 мг/кг, II -постепенное снижение концентрации от 1000 до 1 мг/кг и III - внесение одной и той же концентрации 100 мг/кг каждые 10 суток в течение всего опыта. Исследование биологических свойств чернозема проводили через 1, 50 и 100 суток после загрязнения. Контролем служила почва, не загрязненная антибиотиками. микроорганизм чернозем загрязнение антибиотик

Лабораторно-аналитические методы исследования были выполнены на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета с использованием методов, распространенных в экологии, биологии и почвоведении [6].

Комплексное исследование микробиологических свойств чернозема обыкновенного включало определение обилия жизнеспособных микроорганизмов различных эколого-трофических групп методом посева соответствующих разведений на твердые питательные среды: на мясо-пептонном агаре (МПА) определяли численность аммонифицирующих бактерий, на крахмало-аммиачном агаре (КАА) - численность амилолитических бактерий, на среде Чапека - обилие микромицетов. Методом комочков обрастания на среде Эшби определяли обилие бактерий р. Azotobacter.

Результаты лабораторного моделирования хронического загрязнения антибиотиками на численность основных групп микроорганизмов представлены на рис. 1-6.

С постепенным увеличением концентрации от 1 до 1000 мг/кг

С постепенным уменьшением концентрации от 1000 до 1 мг/кг

С постоянной концентрацией 100 мг/кг

Рис. 1. Динамика численности аммонифицирующих бактерий в условиях хронического загрязнения антибиотиками, % от контроля

Аммонифицирующие бактерии оказались более чувствительными к вносимым антибиотикам, чем амилолитики и микромицеты.

При моделировании хронического воздействия с постепенным увеличением концентрации (от 1 до 1000 мг/кг) установили, что на первых сроках (1 сут. после внесения) концентрация 1 мг/кг не приводит к статистически достоверному изменению численности данной группы бактерий. На 50 сут., когда концентрация вносимых антибиотиков уже составляла 500 мг/кг, численность аммонификаторов достоверно отличалась от контроля (снижение на 26% - тилозин, 30% - смесь тилозин+нистатин, соответственно). Нистатин не оказывает подавляющего воздействия на численность аммонификаторов, что связано с его природой и химическим строением, его действие направлено на ингибирование микроскопических грибов. В дальнейшем, несмотря на последующее увеличение концентрации, достоверной разницы в численности бактерий на 50 сут. и 100 сут. не установлено, даже наблюдается незначительное увеличение численности бактерий. Полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии способны приспосабливаться и приобретать устойчивость к вносимым антибиотикам, и дальнейшее увеличение концентрации не будет отражаться на их численности. Показано, что внесение в почву сульфахлоропиридазина на первых сроках исследования приводит к ингибированию численности микроорганизмов, последующее же увеличение концентрации антибиотика вызывает развитие устойчивости у микроорганизмов [7]. Однако даже на 100 сутки численность бактерий значительно снижена (24% - тилозин, 19% - смесь антибиотиков).

С постепенным увеличением концентрации от 1 до 1000 мг/кг

С постепенным уменьшением концентрации от 1000 до 1 мг/кг

С постоянной концентрацией 100 мг/кг

Рис. 2. Динамика численности амилолитических бактерий в условиях хронического загрязнения антибиотиками, % от контроля

Другими модельными исследованиями было показано, что почвенные микроорганизмы проявляют способность к восстановлению исходных характеристик после прекращения селективного действия антибиотика [8]. В частности, при имитации загрязнения почв сточными водами с антибиотиком в почвенной колонке (концентрация тетрациклина 50 мг/л, 300 сут.) отмечено значительное уменьшение общего количества аборигенных гетеротрофов и резкое увеличение почвенных бактерий, устойчивых к тетрациклину. После прекращения его подачи выявлена тенденция восстановления исходных характеристик микроорганизмов: уже через месяц доля устойчивых к тетрациклину бактерий снижается с 25 до 1 %.

С постепенным увеличением концентрации от 1 до 1000 мг/кг

С постепенным уменьшением концентрации от 1000 до 1 мг/кг

С постоянной концентрацией 100 мг/кг

Рис. 3. Динамика численности микромицетов в условиях хронического загрязнения антибиотиками, % от контроля

Кроме того, по результатам ранее проведенных рекогносцировочных исследований по изучению влияния антибиотиков на биологические показатели почв в условиях острого загрязнения антибиотиками, выявлены аналогичные тенденции [9-10].

При моделировании хронического воздействия с постепенным уменьшением концентрации (от 1000 до 1 мг/кг) установили, что на первые сутки после внесения антибиотиков в концентрации 1000 мг/кг происходит значительное снижение численности аммонификаторов, за исключением нистатина (на 78% - тилозин, на 82% - комплекс антибиотиков). Причем, несмотря на дальнейшее уменьшение концентрации, восстановления численности бактерий не происходит, что свидетельствует о сильном нарушении в почвенном микробоценозе. При моделировании хронического воздействия с постоянным внесением одной и той же концентрации (100 мг/кг) установили, что наибольшее снижение численности аммонификаторов происходит на первых сроках после внесения антибиотиков, в дальнейшем наблюдается тенденция к восстановлению их численности, что говорит о возможной адаптации и приобретении устойчивости к антибиотикам.

При исследовании хронического воздействия антибиотиков на численность амилолитических бактерий установлены те же тенденции, что и для аммонифицирующих бактерий. Однако амилолитики проявляют большую устойчивость по отношению к антибиотикам, нежели аммонификаторы.

Изменение численности микромицетов чернозема обыкновенного при хроническом воздействии антибиотиков показано на рис. 3. Антибактериальный антибиотик - тилозин не вызвал статистически достоверных изменений численности микромицетов, в отличие от его комплексов с нистатином. При моделировании хронического воздействия с постепенным увеличением концентрации (от 1 до 1000 мг/кг) установили, что на первых сроках (1 сут. после внесения) концентрация 1 мг/кг не приводит к статистически достоверному изменению численности микромицетов. На 50 сут., когда концентрация вносимых антибиотиков уже составляла 500 мг/кг, численность микромицетов достоверно отличалась от контроля (снижение на 24% - нистатин, 26% - смесь тилозин+нистатин, соответственно). В дальнейшем, несмотря на последующее увеличение концентрации, достоверной разницы в численности микромицетов на 50 и 100 сутки не установлено, даже наблюдается незначительное увеличение их численности.

При моделировании хронического воздействия с постепенным уменьшением концентрации (от 1000 до 1 мг/кг) установили, что на первые сут. после внесения антибиотиков в концентрации 1000 мг/кг происходит значительное снижение численности микромицетов, за исключением тилозина (на 73% - нистатин, на 63% - смесь антибиотиков). При дальнейшем уменьшении концентрации происходит восстановление микромицетов, на 100 сут. исследования разница по сравнению с контролем составляет по 18% для нистатина и его комплекса с тилозином.

При моделировании хронического воздействия с постоянным внесением одной и той же концентрации (100 мг/кг) установили, что наибольшее снижение численности микромицетов происходит на первых сроках после внесения антибиотиков, в дальнейшем наблюдается тенденция к восстановлению их численности, что говорит о возможной адаптации и приобретении устойчивости к антибиотикам. Кроме того, в образцах, загрязненных тилозином, наблюдается увеличение численности микромицетов по сравнению с контролем на 50 и 100 сутки эксперимента (на 19 и 13 %, соответственно), что связано с адаптацией и заселением микромицетами экологической ниши.

Изменение обилия бактерий р.Azotobacter чернозема при хроническом воздействии антибиотиков показано на рис. 4-6.

Анализируя полученные данные, можно отметить, что бактерии данного рода, несмотря на свою устойчивость в рамках острого лабораторного загрязнения, в условиях хронической интоксикации антибиотиками оказались неустойчивыми. В условиях хронического воздействия наблюдается обратная зависимость между концентрацией антибиотиков и снижением обилия бактерий р. Azotobacter. С увеличением концентрации антибиотиков происходит все большее снижение обилия бактерий данного рода в почве. Наибольший эффект ингибирования в отношении азотфиксирующих бактерий проявляет тилозин и его комплекс с нистатином.

При моделировании хронического воздействия с постепенным уменьшением концентрации (от 1000 до 1 мг/кг) установили, что на первые сутки после внесения антибиотиков в концентрации 1000 мг/кг происходит значительное снижение обилия бактерий р. Azotobacter (на 60% при загрязнении тилозином, на 40% - смесью антибиотиков). С уменьшением концентрации происходит все большее восстановление обилия бактерий, на 100 сут. исследования разница по сравнению с контролем составляет около 20% для тилозина и его комплекса с нистатином. Внесение антибиотиков в концентрации 100 мг/кг не приводит к достоверному ингибированию обилия бактерий р. Azotobacter, аналогичные результаты получены в рамках острого лабораторного моделирования. На всех дальнейших сроках исследования обилие бактерий не изменяется.

Рис. 4. Изменение обилия бактерий р.Azotobacter в условиях хронического воздействия антибиотиков с постепенным увеличением концентрации от 1 до 1000 мг/кг в течение 100 суток

Рис. 5. Изменение обилия бактерий р.Azotobacter в условиях хронического воздействия антибиотиков с постепенным уменьшением концентрации от 1000 до 1 мг/кг в течение 100 суток

Рис. 6. Изменение обилия бактерий р.Azotobacter в условиях хронического воздействия антибиотиков с постоянной концентрацией 100 мг/кг в течение 100 суток

Несмотря на хроническое воздействие, наблюдалось восстановление численности основных групп микроорганизмов чернозема обыкновенного. Развитие у микроорганизмов устойчивости к используемым для борьбы с ними препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов: приспособляемости к изменениям условий внешней среды.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-34-00388 и РНФ в рамках научного проекта № 18-76-00010.

Список использованных источников

1. Вальков В.Ф., Казеев К.Ш., Колесников С.И. Почвы юга России. - Ростов н/Д: Эверест. - 2008. - 276 с.

2. Halling-Sшrensen B. Inhibition of aerobic growth and nitrification of bacteria in sewage sludge by antibacterial agents // Arch. Environ. Contam. Toxicol. - 2001. V. 40. - Р. 451-460.

3. Kemper N. Veterinary antibiotics in the aquatic and terrestrial environment a review // Ecological Indicators. - 2008. V. 8. - Р.1-13.

4. Zhou L-J, Ying G-G, Zhao J-L, Yang J-F, Wang L, Yang B, et al. Trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in the sediments of the Yellow River, Hoi River and Liao River in northern China // Environ. Pollut. V. - 2011. V. 159. - P. 1877.

5. Yang J-F, Ying G-G, Zhao J-L, Tao R, Su H-C, Liu Y-S. Spatial and seasonal distribution of selected antibiotics in surface waters of the Pearl Rivers, China. Environ. Sci. Health. - 2011. V.46. - P. 272.

6. Казеев К.Ш., Колесников С.И., Акименко Ю.В., Даденко Е.В. Методы биодиагностики наземных экосистем. - Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета. - 2016. - 356 с.

7. Schmitt H., Van Beelen P., Tolls J., Van Leeuwen C.L., 2004. Pollution-induced community tolerance of soil microbial communities caused by the antibiotic sulfachloropyridazine. Environ. Sci. Technol. 38, 1148-1153.

8. Rysz М., Alvarez J.J. Amplification and attenuation of tetracycline resistance in soil bacteria: aquifer column experiments // Water Res. - 2004. Vol. 38, N 17.

9. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И., Мазанко М.С. Экологические последствия загрязнения почв антибиотиками // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2013, т. 15, № 3. - С. 1196.

10. Акименко Ю.В., Казеев К.Ш., Колесников С.И., Козунь Ю.С., Мясникова М.А., Одабашьян М.Ю., Николаева К.Н., Тимошенко А.Н. Устойчивость микроорганизмов чернозема к загрязнению антибиотиками в условиях полевого модельного опыта // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2014, №104. - С. 135-148. UDC 57.044; 504.05; 631.46.

Размещено на Allbest.ru