Антибиотическая активность метаболитов Bacillus thuringiensis в отношении бактерий и грибов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Антибиотическая активность метаболитов Bacillus thuringiensis в отношении бактерий и грибов

А.А. Артемов

Аннотация

антибиотический метаболит b. thuringiensis патогенный микроорганизм

Проведено детальное изучение антибиотического действия метаболитов штаммов B. thuringiensisна патогенные бактерии/грибы различных таксономических групп. Осуществлена оценка антибиотической активности водорастворимых метаболитов и белков параспоральных кристаллов штаммов B. thuringiensisв отношении патогенных бактерий/грибков и плесневых грибов. Подобраны условия культивирования исследуемых штаммов для продукции антибиотических субстанций. Обнаружена антибиотическая активность метаболитов B. thuringiensisв отношении микроорганизмов кишечной группы Salmonellathyphimurium2606, Shigellasonnei 32 и EscherichiacoliATCC 25922, фитопатогенного штамма Xantomonasmalvacearum, BacillussubtilisАТСС 6633 и ингибирующее и замедляющее действие на рост Staphylococcusaureusи Candidaalbicans,а также тест-штаммов грибов. Полученные данные позволяют прогнозировать создание на их основе антибиотических препаратов таргетированного действия на патогенные микроорганизмы конкретной таксономической принадлежности.

Ключевые слова: Bacillusthuringiensis, Bt,антибиотическая активность, дельта-эндотоксин, пара- споральные белки, ПСБ

Abstract

Antibiotic activity of Bacillus thuringiensis metabolites against intestinal bacteria and fungi

A.A. Artemov

A detailed study of the antibiotic effect of metabolites of B. thuringiensisstrains on pathogenic bacteria/fungi of various taxonomic groups was carried out. The antibiotic activity of water-soluble metabolites and proteins of parasporal crystals of B. thuringiensisstrains against pathogenic bacteria/fungi and molds was assessed. The cultivation conditions of the studied strains for the production of antibiotic substances were selected. Antibiotic activity of B. thuringiensismetabolites against microorganisms of the intestinal group Salmonella thyphimurium2606, Shigella sonnei32 and Escherichia coliATCC 25922, phytopathogenic strain Xantomonas malvacearum,Bacillus subtilisATCC 6633 and inhibitory and retarding effect on the growth of Staphylococcus aureusand Candida albicans, as well as test strains of fungi was revealed. The data obtained make it possible to predict the creation on their basis of antibiotic preparations with targeted action on pathogenic microorganisms of a specific taxonomic affiliation.

Keywords: Bacillus thuringiensis, Bt, antibiotic activity, delta-endotoxin, parasporal proteins, PBP

Введение

Биопрепараты создаются в основном посредством культивирования микроорганизмов без дополнительной очистки действующих продуцируемых клетками компонентов, из них 90 % коммерческих инсектицидных средств разработано на основе Bt(аэробной спорообразующей бактерии Bacillusthuringiensis)[7]. Поэтому готовый продукт содержит побочные компоненты (споры, клетки, токсины). Предотвратить загрязнение продукции и окружающей среды последними позволяет создание средств на основе очищенных биологически активных веществ. Промышленное производство антибиотиков основано на выращивании микроорганизмов - продуцентов антибиотических субстанций в строго определенных условиях [8]. Так, штаммы аэробной спорообразующей бактерии Bacillusthuringiensis (Bt,открыт Ишиватари Сигетане, 1902 г.) выделяют в процессе роста белковые дельта-эндотоксины с молекулярной массой 30-130 кДа [9]. Представителями Btпродуцируют дельта-эндотоксины, которые выделены в кристаллическом виде. Соединения относятся к семейству гомологичных белков с избирательным инсектицидным действием, неактивных в отношении теплокровных организмов [10]. Спорово-кристаллические субстанции Btна 90-95 % составляют рынок биопрепаратов против насекомых [11], а очищенные дельта-эндотоксины практически не применяются. Описано действие штаммов Btпротив фитопатогенных бактерий и грибов [12], а также антимикробная активность растворов дельта-эндотоксинов Bt[13].

Цель настоящей работы - детальное изучение антибиотического действия метаболитов штаммов B. thuringiensisна патогенные бактерии/грибы различных таксономических групп.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы Btи штаммы для анализа их антагонистической активности. Исследуемые штаммы Bt.типовые штаммы - 3 подвида Btssp. GalleriaeB-1275, Btssp. KurstakiB-1276, Btssp. FinitimusB-1274; атипичные штаммы - BtB-1272 и BtB-1273, выделенные из образцов термальных полей Долины гейзеров (Камчатка) с неустановленным серотипом. Тестовые культуры, в отношении которых проводилась оценка антибиотической активности. патогенные бактерии PseudomonasaeruginosaВ-1295, StaphylococcusaureusВ-1266, Proteusmirabilis 392; представитель нормальной микрофлоры кишечника Enterococcusfaecium7171; тест-штаммы бактерий - Salmonellathyphimurium2606, Shigellasonnei 32, Bacillussubtilis 6644, E. Coli 6645 (рекомендованы Государственной фармакопеей РФ для определения антибиотических свойств лекарственных препаратов); фитопатогенный штамм XanthomonasmalvacearumB-137; возбудитель кандидоза Candidaalbicans; плесневые грибы Penicilliumsp. F-6, VerticilliumlecaniF-8, TrichodermavirideF-9, Chrysoniliasitophila 4.

Исследованные штаммы поддерживаются в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ГНЦ ВБ «Вектор». Причины выбора плесневых грибов, используемых в работе. 1) виды, относящиеся к несовершенным грибам Fungiimperfecti,вызывают порчу хлеба. Chrysoniliasitophila (N. Montagne, A. Leveilleв 1848 г.), а Penicillium (Link, 1809 г.) выделен в процессе работы из пораженного плесенью лука; 2) Verticilliumlecani (Zimmerman, 1899) - энтомопатогенный гриб, применение которого обеспечивает эффективную защиту культур закрытого грунта от тепличной белокрылки/широкого спектра видов тлей (взят для тестирования совместного его использования с Bt); 3) Trichodermaviride (Pers, 1794) конкурирует в субстрате за питание с другими грибами, способен тормозить развитие мицелия конкурентов своими выделениями и питаться непосредственно их мицелием, проявляя явные патогенные свойства. Кроме патогенных бактерий в качестве тест-культуры использован Enterococcusfaecium (Orla-Jensen, 1919) штамм 7171, входящий в состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта человека. Отсутствие бактерии в кишечнике опасно из-за повышения вероятности гибели от инфекции, но при избыточной активности данный энтерококк может выступать причиной различных заболеваний. Штамм Proteusmirabilis (Hauser, 1885) - условно-патогенный возбудитель инфекций мочеполовых органов, приводящих к развитию простатита, цистита, пиелонефрита.

В ходе работы для субкультивирования бактериальных культур использовали рыб- но-пептонный агар (РПА) НПО «Микроген» МЗ РФ; жидкую/агаризованную среду LB «Ditto», США (рН 7,0-7,2). Дрожжи/плесневые грибы выращивали на среде Сабуро (г/л). пептон - 10, глюкоза - 40, агар - 18 (рН 5,4). При наработке биомассы Btкультивированиепроводили на термостатированой качалке КТ 104 (Россия) с использованием жидкой среды LBи картофельной среды (КС) с рН 7,0-7,2: пептон - 0,1 %, К₂НРО₄ - 0,04 %; агар - 1,9 %, картофельный отвар - до 1 л, с добавлением глюкозы и MnSO₄в объеме 0,5 и 0,1 % соответственно.

Антимикробные свойства водорастворимых секретируемых метаболитов штаммов Btопределяли методом отсроченного антагонизма [14]. Для оценки антибиотических свойств культуральной жидкости (КЖ) клетки штаммов Btкультивировали в жидкой среде LBили КС при 30 °С в течение 36-48 ч. Далее КЖ освобождали от клеток/спор центрифугированием и ультрафильтрацией с применением нитроцеллюлозных фильтров (диаметр пор 0,22 мкм). Антибиотическую эффективность КЖ Bt(водорастворимых метаболитов) и специально очищенных растворов 5-эндотоксинов оценивали, применяя метод «колодцев» [15] (табл. 1).

Таблица 1 Применение метода «колодцев» для оценки антибиотической активности

Для приготовления растворов белков параспоральных включений культуры выращивали 2-4 сут. на термостатированной качалке в колбах объемом 500 мл со 100-200 мл КС (200 об./мин, при 30 °С). Выполняли фазово-контрастное микроскопирование КЖ с целью подсчета количественного соотношения вегетативных/спорулирующих клеток. При значительном преобладании последних, а именно при наличии сформированных зрелых спор и параспоральных включений, КЖ центрифугировали для удаления супернатанта. Промывку биомассы выполняли дистиллированной водой, 1 М NaClи трехкратно дистиллированной водой, клетки осаждали на центрифуге JA-21 (Beckman, USA) в течение 20 мин при скорости 8000 об./мин, температуре 2-4 °С. Схема экстрагирования параспоральных включений и активации белковых токсинов с последующим их выделением представлена на рис. 1. Известно, что параспоральные протоксины трансформируются в токсины под действием протеиназ, которые соединены с решеткой параспоральных кристаллов [16].

Рис. 1. Схема экстрагирования параспоральных включений и активации белковых токсинов с последующим их выделением

Последний этап выделения параспоральных белков (ПСБ) занимал 30 мин, осаждение проводили на центрифуге JA-21 (Beckman, USA), ресуспендирование - в 1/15 М-фосфатном буфере (рН 7,8).

Электрофоретические исследования белков КЖ проводили по методу Laemmli[17], протеиновые фракции сравнивали с маркерами молекулярной массы (Bio-Rad, США). Фракции компонентов КЖ получали посредством гель-хроматографии на FractogelHW 50Fв 0,15 М NaCl. Объем пробы - 300 мкл. Скорость элюции 0,3 мл/мин. Фракции собирали каждые 3 мин.

Результаты и их обсуждение

Предварительное исследование антибиотической активности штаммов BtB-1274, B-1272, B-1273 методом отсроченного антагонизма показало, что наиболее выраженный ингибирующий эффект наблюдается в связи с отсутствием ростовой активности Candidaalbicans. В отношении последнего слабовыраженное антибиотическое влияние штамма BtB-1275 наблюдали только в самом начале штриха (ослабление на 15 мм). В отношении E. faecium, S. aureusнаблюдалось только некоторое ослабление роста на 22 и 2,5 мм штриха для штамма B-1275 соответственно и на 25 мм - в отношении первой культуры для B-1274. Относительно кишечной группы бактерий штаммы Btбыли более эффективны. Выяснено, что метаболиты, продуцируемые BtB-1272 и BtB-1273, подавляют рост трех микроорганизмов кишечной группы - Salmonellathyphimurium2606, Shigellasonnei 32 и EscherichiacoliATCC 25922. Рост фитопатогенаXantomonasmalvacearumB-137 и культуры BacillussubtilisАТСС 6633 угнетается культурами BtВ-1274 и В-1275 соответственно. Последний штамм также проявляет антибиотическую активность в отношении Salmonellathyphimurium 2606 и Shigellasonnei 32 (табл. 2).

Таблица 2 Антибиотическое действие метаболитов Bt

Примечание: +/-- наличие/отсутствие зоны угнетения роста. Серым цветом выделены результаты с наличием зоны угнетения роста.

Диффузионным методом «колодцев» установлено наличие антибиотического действия метаболитов Bt, растворенных в КЖ, на штаммы плесневых грибов. Все используемые в работе культуры Btустраняют рост мицелия T. VirideF-9 и значительно угнетают таковой у гриба V. LecaniiF-8. В случае плесневого гриба Penicilliumsp. F-6 только штамм BtB-1276 полностью ингибирует ростовую активность тестовой культуры в результате продуцирования метаболитов с фунгицидной активностью.

Фракционирование КЖ после культивирования штаммов Btвыполнялось для разделения антибиотических продуцируемых белков посредством гель-хроматографии (одного из наиболее простых/воспроизводимых фракционных методов). Показано, что профили элюции компонентов (рис. 2), различаясь в деталях, схожи между собой у всех пяти исследуемых штаммов. При сравнении электрофореграмм белковых компонентов КЖ штаммов Bt(рис. 3) видно, что для конкретного штамма характерен особый набор белков. Установлено, что по молекулярным массам секретируемые метаболиты сосредоточены в пределах 10-75 кДа. При культивировании штаммов Btв среде LBпроцесс споруляции/обра- зования кристаллов белков происходит с низкой скоростью или отсутствует, а в среде КСвышеуказанные явления наблюдаются уже на вторые сутки, что согласуется с известными литературными данными [16]. Схема культивирования штаммов Btв жидких питательных средах для определения антибиотической активности растворов параспоральных белков представлена на рис. 4.

Рис. 2. Профили элюции секретируемых компонентов КЖ штаммов Btна FractogelTSKHW 50Fв 0,15 М NaCl, 0,05 М трис- HCl, рН 7,4, зарегистрированные по поглощению света в ультрафиолетовой области при длине волны 280 нм

Рис. 3. Электрофореграмма белков штаммов Bt,секретируемых в культуральную среду. Примечание: для всех образцов, кроме В-1276, взято по две пробы различного объема. МВ - молекулярный вес

Рис. 4. Схема культивирования штаммов Btв жидких питательных средах для определения антибиотической активности растворов параспоральных белков

Выявлено, что штаммы BtВ-1274 и BtВ-1275 на обеих средах образуют морфологически сходные кристаллы, а B-1272 и B-1273 на среде КС - не только одиночные компактные кристаллические образования, как при культивировании на РПА и LB, но и гроздья/цепочки разных конфигураций и размеров (рис. 5).

Рис. 5. Морфология кристаллов параспоральных включений штаммов Btв зависимости от среды культивирования. КС - картофельная среда

Штаммы Btв дальнейшем культивировали на среде КС в связи с более эффективным образованием кристаллов белка до достижения 95-100 % споруляции, далее готовили растворы ПСБ (см. раздел «Материалы и методы»). В результате тестирования антибиотической активности по диффузионному методу «колодцев» выявлено, что рост плесневых грибов в опытных вариантах в сравнении с контролем был угнетен (табл. 3), в зоне нанесения растворов белков был замедлен процесс споруляции.

Таблица 3Определение антибиотической активности растворов ПСБ штаммов Bit

Список источников

1. Дусыева Я.О. Экологические проблемы в области правового регулирования агропромышленного комплекса в Российской Федерации // Молодой ученый. 2018. № 4 (190). С. 89-93.

2. Савкин В.И. Экологическая безопасность как приоритетное направление развития АПК России // Национальные интересы: приоритеты и безопасность. 2008. № 10. C. 31-35.

3. Гашко Е.С., Почтовик Е.С., Гучева Н.В. Способы снижения остаточного содержания пестицидов в зерне // Молодой исследователь Дона. 2017. № 6 (9). C. 13-21.

4. Chattopadhyay P., Banerjee G., Mukherjee S. Recent trends of modern bacterial insecticides for pest control practice in integrated crop management system // 3 Biotech. 2017. Vol. 7, N 1. P. 60.

5. Захаренко В.А. Рынок пестицидов в России и перспективы его развития // Защита и карантин растений. 2014. № 11. С. 3-6.

6. Рынок минеральных удобрений и средств защиты растений // Дайджест ключевых публикаций в СМИ. 2020. № 6. 28 с.

7. Авдеенко И.А., Сочинская О.Н. Биоинсектициды в сельском хозяйстве // Науч.-метод. электрон. журн. «Концепт». 2016. Т. 11. С. 896-900. http://e-koncept.ru/2016/(дата обращения: 15.08.2016).

8. Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиол. растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 343-353.

9. Каменёк Л.К. Выделение и очистка кристаллов эндотоксина Bacillusthuringiensis// Микробиологические методы борьбы с вредителями растений: науч.-техн. бюл. Новосибирск, 1980. Вып. 2 (36). С.14--15.

10. Каменёк Л.К. Структура, свойства и механизм действия дельта-эндотоксина Bacillusthuringiensis// Эн- томопатогенные бактерии и их роль в защите растений: сб. ст. Новосибирск, 1987. С. 42-57.

11. Каменёк Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillusthuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений // Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 1998. 40 с.

12. Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillusthuringiensisна фитопатогенные грибы // Вестн. защиты растений. 2010. № 1. С. 27-35.

13. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: учебник. 6-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. 430 с.

14. Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы. М.: Высш. шк., 1987. 159 с.

15. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие дельта-эндотоксина четырех подвидов Bacillusthuringiensisна различных прокариот // Микробиология. 1997. Т 66, № 1. С. 25-31

16. Честухина Г.Г., Залунин И.А., Костина Л.И., Котова ТС. и др. Протеиназы, связанные с кристаллами Bac. thuringiensis// Биохимия. 1978. Т. 43, вып. 5. С. 857-864.

17. Маршелл Р.К., Инглис А.С. Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и поли- пептидных цепей // Практическая химия белка: сб. ст. / пер. с англ.; под ред. А. Дарбре. М.: Мир, 1989. С. 15-81.

REFERENCES

1. Dusyeva Ya.O. Ecological problems in the field of legal regulation of the agro-industrial complex in the Russian Federation. Young scientist. 2018;(4(190)):89-93. (In Russ.).

2. Savkin V.I. Ecological safety as a priority direction of development of the agro-industrial complex of Russia. National interests: priorities and safety. 2008;(10):31-35. (In Russ.).

3. Gashko E.S., Postman E.S., Gucheva N.V. Ways to reduce the residual content of pesticides in grain. Young researcher of the Don. 2017;(6(9)):13-21. (In Russ.).

4. Chattopadhyay P., Banerjee G., Mukherjee S. Recent trends of modern bacterial insecticides for pest control practice in integrated crop management system. 3 Biotech. 2017;7(1):60.

5. Zakharenko V.A. The market of pesticides in Russia and the prospects for its development. Protection and quarantine of plants. 2014;(11):3-6. (In Russ.).

6. The market of mineral fertilizers and plant protection products. Digest of key publications in the media. 2020;(6):28. (In Russ.).

7. Avdeenko I.A., Sochinskaya O.N. Bioinsecticides in agriculture. Scientific and methodological electronic journal “Concept”. 2016;11:896-900. (In Russ.).

8. Romanov G.A. Genetic engineering of plants and ways to solve the problem of biosafety. Plant Physiology. 2000;47(3):343-353. (In Russ.).

9. Kamenek L.K. Isolation and purification of Bacillus thuringiensis endotoxin crystals. Microbiological methods ofplant pest control. Scientific and technical bulletin. Novosibirsk, 1980;(2(36)):14-15. (In Russ.).

10. Kamenek L.K. Structure, properties and mechanism of action of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin. In: Entomopathogenic bacteria and their role in plant protection. Novosibirsk; 1987. Р. 42-57. (In Russ.).

11. Kamenek L.K. Delta-endotoxin Bacillus thuringiensis: structure, properties and use for plant protection. Abstract of the thesis. dis. ... Doctors of Biological Sciences. M.; 1998. 40 p. (In Russ.).

12. Smirnov O.V., Grishechkina S.D. Study of the effect of biological preparations based on Bacillus thuringiensis on phytopathogenic fungi. Bulletin of Plant Protection. 2010;(1):27-35. (In Russ.).

13. Egorov N.S. Fundamentals of the doctrine of antibiotics: Textbook. 6th ed., revised. and additional M.: Publishing House of Moscow State University; Nauka; 2004. 430 p. (In Russ.).

14. Egorov N.S. Biotechnology: Problems and prospects. M.: Higher school; 1987. 159 p. (In Russ.).

15. Yudina T.G., Burtseva L.I. The effect of delta-endotoxin of four subspecies of Bacillus thuringiensis on various prokaryotes. Microbiology. 1997;66(1):25-31. (In Russ.).

16. Chestukhina G.G., Zalunin I.A., Kostina L.I., Kotova T.S. et al. Proteinases associated with Bac crystals thuringiensis. Biochemistry. 1978;43(5):857-864. (In Russ.).

17. Marshall R.K., Inglis A.S. Determination of the composition of protein oligomers. Obtaining monomers and polypeptide chains. Sat. Practical protein chemistry /per from English/ ed. A. Darbre. M.: Mir; 1989; Р 15-81. (In Russ.).

Размещено на Allbest.ru