Размещено на http://www.allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ ЛЁГКОЙ И ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Кафедра «Технология и товароведение продуктов питания»

Житникова В.С.

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ

по курсу

«Современные методы исследования пищевых продуктов»

для специальностей:

351100 «Товароведение и экспертиза товаров»,

270800 «Технология консервов и пищеконцентратов»,

271100 «Технология молока и молочных продуктов».

Рекомендовано Ученым советом в качестве учебно-методического пособия

Орёл 2002

Учебно-методическое пособие предназначено для выполнения лабораторных работ по курсу «Современные методы исследования пищевых продуктов» для специальностей: 351100 «Товароведение и экспертиза товаров», 270800 «Технология консервов и пищеконцентратов», 271100 «Технология молока и молочных продуктов».

Автор доцент, кандидат технических наук Житникова В.С.

Рецензенты:

профессор, доктор технических наук Иванова Т.Н.

доцент, кандидат химических наук Климова Н.В.

доцент, кандидат сельскохозяйственных наук Левгерова Н.С.

Содержание

• Введение
• 1. Спектральные методы анализа
• 1.1 Спектрофотометрия
• 1.1.1 Спектрофотометрия в УФ и видимых областях
• 1.1.2 Инфракрасная спектроскопия
• 1.2 Пламенная спектроскопия
• Состав и температура газовой смеси
• 1.3 Люминесцентный анализ
• 2. Хроматографические методы исследования
• 2.1 Классификация хроматографических методов анализа
• 2.2 Устройство хроматографических колонок
• 2.3 Термины и определения, применяемые при проведении хроматографических методов анализа
• 2.4 Основные принципы проведения газовой хроматографии
• 2.4.1 Качественный анализ
• 2.4.2 Количественный анализ
• 2.5 Основные принципы проведения высокоэффективной жидкостной хромотографии
• 2.5.1 Качественный анализ
• 2.5.2 Количественный анализ
• 3. Радиометрические методы анализа
• 3.1 Ионизационный метод
• 3.2 Сцинтиляционный метод
• 3.3 Люминесцентный метод
• 3.4 Фотографический метод
• 3.5 Химический метод
• 4. Электрохимические методы анализа
• 4.1 Полярография
• 4.2 Вольтамперометрия
• 4.2.1 Инверсионная вольтаперометрия
• 5. Лабораторные работы
• 5.1 Отработка методики определения количественного содержания каротиноидов в моркови методом спектрофотометрии
• 5.2 Определение алкалоидов (кофеина и теобромина) в чае, кофе, шоколаде, какао
• 5.3 Определение доброкачественности и фальсификации пищевых продуктов методом люминоскопии
• Говядина
• 5.4 Определение химического состава, контроль качества и безвредности пищевых продуктов методом люминоскопии
• 5.5 Ознакомление с устройством и принципом работы газового хроматографа, определение количества пестицидов в предложенных образцах плодоовощной продукции
• 5.7 Ознакомление с устройством и принципом действия жидкостного хроматографа, определение деструкции основных водорастворимых витаминов в отварах и настоях, приготовленных из растительного сырья
• 5.8 Определение фальсификации растворимого кофе методом ВЭЖКХ
• 5.9 Определение токсичных элементов методом ВЭЖХ в пищевых продуктах
• 5.10 Ознакомление с устройством и принципом действия атомно-абсорбционного спектрофотометра типа «Сатурн», определение токсичных элементов атомно-абсорбционным методом в предложенных образцах пищевых продуктов
• 5.11 Определение массовой концентрации общей ртути методом атомной абсорбции на анализаторе ртути типа «Юлия - 5 К»
• 5.12 Основные понятия подготовки проб при проведении радиометрического анализа пищевых продуктов
• 5.13 Экспрессное определение суммарной объемной (ОА) и удельной (УА) активностей с помощью сцинтилляционных радиометров типа РУБ-01П6
• 5.14 Определение гамма - и бета - активности радионуклидов с помощью спектрометрической установки СКС - 99 «Спутник»
• 5.15 Определение токсичных элементов (свинца) методом полярографии в пищевых продуктах
• 5.16 Определение массовой доли йода в пищевых продуктах и сырье методом прямой переменно-токовой полярографии и инверсионной переменно-токовой вольтамперометрии
• 5.17 Определение массовой концентрации ионов меди, свинца, кадмия и цинка в питьевой и минеральных водах
• 5.18 Изучение принципа работы экспресс-анализатора качества сред КС МК “Луч”. Определение массовой концентрации ионов натрия в пищевых продуктах ионометрическим методом
• 6. Математическая обработка результатов измерений
• Литература
• Приложение 1
• Приложение 2

Введение

В современных рыночных условиях проблемы определения качества, повышения питательной ценности и потребительских достоинств пищевых продуктов решаются на основе глубокого исследования их состава, физико-химических и реологических свойств с использованием современных методов анализа, т.к. в последнее время широко распространена фальсификация пищевых продуктов и выпуск недоброкачественной продукции.

Организация эффективного аналитического контроля за качеством сырья и продуктов его переработки стимулировала разработку и внедрение различных современных методов анализа. Универсальных методов, пригодных для анализа любых пищевых продуктов или определения в них элементов в широком диапазоне и концентраций, не имеется, поэтому обычно используют аналитические методы в различных сочетаниях.

Ассортимент пищевых продуктов, выпускаемых предприятиями пищевой промышленности, в настоящее время достаточно велик, и развитие отрасли развивается по следующим направлениям:

- совершенствование способов хранения пищевого сырья,

- разработка рациональных способов хранения пищевого сырья готовой продукции

- разработка новых прогрессивных технологий производства продуктов питания,

- улучшение организации торговли пищевыми продуктами и т. д.,

На всех этих стадиях жизненного цикла товаров должен проводиться физико-химический анализ качества продовольственных товаров, поступающий на потребительский рынок.

Современные методы исследования позволяют устанавливать безвредность продуктов в связи с возможным попаданием в них различных химических соединений, применяемых для борьбы с вредителями сельского хозяйства (пестициды), радиоактивных изотопов, а также искусственных красителей, химических консервантов, полициклических ароматических углеводородов, тяжелых металлов и т.д.

Применение современных методов исследования пищевых продуктов дает возможность не только изучить их свойства, качество и пищевую ценность, но и вскрыть изменения состава, не обнаруживаемыми органолептическими или обычными физическими и химическими методами, прогнозировать изменение качества, установить способы хранения и сроки использования

Настоящее учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальностям 270800 «Технология консервов и пищеконцентратов», 271100 «Технология молока и молочных продуктов», 351100 «Товароведение и экспертиза товаров».

В программах этих специальностей предусматривается изучение дисциплины «Современные методы исследования пищевых продуктов». В структуре названного курса предусматривается изучение физико-химических и количественных характеристик, изменение свойств при различных технологических процессах, основы теории контроля физико-химических свойств продуктов.

Перечисленные проблемы являются неотъемлемым элементом профессиональных знаний, умений и навыков технологов и товароведов-экспертов, требуют серьезного изучения проблем качества пищевых продуктов с учетом современных достижений науки и техники и развитии нормативно-правовой базы.

В связи с этим целью учебно-методического пособия является изучение современных методов исследования сырья и пищевых продуктов, устройства и принципов работы современных аналитических приборов. Пособие включает различные варианты различные варианты лабораторных работ в зависимости от наличия приборов и оборудования в учебном заведении.

Методики контроля показателей качества и безопасности широко представлены в различных стандартах, научно-технической и учебной литературе. Однако эти методики часто основываются на разных принципах и поэтому при исследовании одних и тех же объектов дают заметные расхождения. Это вызывает необходимость проводить математическую обработку полученных результатов анализа на наличие ошибок и сходимости данных, полученных разными методами и в различных лабораториях. Поэтому в пособии приводятся методы математической обработки получаемых данных.

спектральный люминесцентный радиометрический электрохимический

1. Спектральные методы анализа

Среди современных методов физико-химических анализов все большее распространение приобретает спектроскопия, позволяющая получить полную информацию о важнейших свойствах продукта. Главное преимущество спектральных методов состоит в том, что вещество в процессе исследования не разрушается. Кроме того, методику исследований легко модифицировать и автоматизировать. Такие свойства спектроскопических методов делают их незаменимыми при исследовании биологических объектов. Спектроскопические методы позволяют обнаружить незначительные количества даже в довольно сложных системах.

Спектральным анализом понимают совокупность методов количественного и качественного определения состава вещества, основанных на получении и исследовании их спектров испускания, поглощения, отражения и люминесценции.

Основа спектрального анализа - спектроскопия атомов и молекул. Его классифицируют по целям анализа и типам спектров.

Молекулярные спектры поглощения, изучаемые методом абсорбционно-спектрального анализа, связаны с переходами между различными электронными состояниями атомов и молекул. Они возникают в результате переходов электрона, принадлежащего внешней (валентной) электронной оболочке с основного (более низкого по энергии) энергетического уровня на возбуждённый уровень за счет поглощения квантов излучения из сплошного спектра источника. Спектры поглощения молекул в ультрафиолетовой (УФ) и видимой области широко применяются для качественного и количественного анализа.

Атомный спектральный анализ определяет элементарный состав вещества по атомным (ионным) спектрам испускания и поглощения электромагнитного излучения. Происхождение атомных спектров объясняется строением атома.

Спектроскопию можно разделить на эмиссионную и абсорбционную. Эмиссионная спектроскопия исследует излучательную способность вещества. Абсорбционная спектроскопия исследует поглотительную способность вещества. При этом анализируемую пробу помещают между источником электромагнитного излучения с определенным диапазоном частот и спектрофотометром.

В основе флуоресцентного спектрального анализа лежит облучение паров пробы вещества резонансным для исследуемого элемента излучением и наблюдением флюоресценции элемента, входящего в его состав.

Для исследования свойств пищевых продуктов наибольший интерес представляют области: видимая (200-400 нм) со стеклянной оптикой, ультрафиолетовая (400-700 нм) с кварцевой оптикой и инфракрасная (2-15мкм) спектроскопия.

1.1 Спектрофотометрия

Спектрофотометрия используется для идентификации соединений, исследования состава, строения и количественного анализа индивидуальных веществ и многокомпонентных систем.

Кривая зависимости поглощения (функция поглощения) от длины волны или волнового числа называется спектром поглощения вещества и является специфической характеристикой данного вещества.

В спектрофотометрических методах применяют спектрофотометры - приборы, позволяющие проводить анализ как окрашенных, так и бесцветных соединений по избирательному поглощению монохроматического излучения в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра. Природа полос поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра связана с различными электронными переходами в поглощающих молекулах и ионах (электронные спектры). В инфракрасной области она связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества (колебательные спектры). Распространенная в настоящее время аппаратура позволяет измерять ультрафиолетовые спектры в области от 190 до 380 нм, видимые - от 380-780 нм., инфракрасные спектры - от 780-40000 нм. (40 мкм).

1.1.1 Спектрофотометрия в УФ и видимых областях

Спектрофотометрические измерения в УФ и видимой областях чаще проводят для растворов, хотя такие измерения могут быть проведены и для веществ, находящихся в парообразном, жидком и твердом состоянии.

Образец анализируемого вещества при спектрофотометрировании обычно растворяют в соответствующем растворителе. Для этих целей пригодны многие растворители: вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры, разведенные растворы аммиака, едкого натра, хлористоводородной или серной кислоты. Следует использовать растворители, не содержащие примесей, поглощающих в данной спектральной области; для спектрофотометрии выпускаются специальные растворители, гарантирующие отсутствие примесей.

Спектрофотометрический анализ по непосредственному измерению оптической плотности может быть проведен для веществ, обладающих лишь определенными особенностями строения (ароматические соединения, соединения с сопряженными кратными связями, соединения ряда металлов и др.). Измерения оптической плотности D в УФ и видимой области проводятся на фотоэлектрических спектрофотометрах. Основными частями этих приборов являются: источник излучения (лампа накаливания для видимой области, газоразрядная водородная или дейтериевая лампа ультрафиолетовой области); монохроматор, диспергирующая система которого основана на использовании кварцевой призмы или дифракционной решетки; кюветное отделение, в котором располагаются кюветы с исследуемыми веществами; приемное и фотометрическое устройство для сравнительной оценки интенсивности световых ионов I₀ и I, основанное на использовании фотоэлементов.

Измерительная шкала спектрофотометра проградуирована в процентах пропускания Т (т.е. ) и в величинах оптической плотности D (т. е. lg), а шкала длин волн, или волновых чисел -- в нанометрах, или в см^-1 соответственно.

В процессе измерения на пути выходящего из монохроматора пучка излучения определенной длины волны поочередно устанавливается нулевой раствор (растворитель или раствор, содержащий те же вещества, что и исследуемый, за исключением анализируемого компонента), для которого Т=100%, D==0 и исследуемый раствор.

Для снижения величины ошибки при определении D концентрация раствора и толщина слоя его подбираются такими, чтобы D в исследуемой спектральной области находилось в пределах от 0,2 до 0,7. В зависимости от способности вещества к поглощению это обычно достигается при использовании концентраций от 0,01 до 0,00001% (кюветы с толщиной слоя 10 мм).

Показатель поглощения н вычисляют на основании измеренной оптической плотности D для растворов с известной концентрацией по формуле:

н=; (1)

Концентрация может быть выражена в молях на 1 л или в граммах на 100 мл раствора. В зависимости от этого по формуле вычисляют молярный показатель поглощения или удельный показатель поглощения. Молярный показатель поглощения (е) представляет собой оптическую плотность одномолярного раствора вещества при толщине слоя 10 мм; удельный показатель поглощения (Е) - оптическую плотность раствора, содержащего 1г вещества в 100 мл раствора при той же толщине слоя. Переход от удельного показателя поглощения к молярному осуществляется по формуле:

е=Е _, (2)

где М -- молекулярная масса.

Если известно значение н (в форме е или Е), определяют концентрацию исследуемых растворов по величине оптической плотности D (2), пользуясь формулой (при условии подчинения закону Бера).

Для идентификации веществ в ультрафиолетовой области спектра рекомендуется применять регистрирующие спектрофотометры. При измерениях на разных спектрофотометрах значения характерных длин волн могут отличаться на ±2 нм. Если отличие превышает указанный предел, то необходимо провести калибровку шкалы длин волн. При количественных определениях целесообразно использовать такие полосы поглощения, которые отвечают следующим условиям:

1) данная полоса должна быть по возможности свободна от наложения полос поглощения других компонентов анализируемой системы;

2) выбранная полоса должна обладать достаточно высоким показателем поглощения (н) для индивидуального соединения.

Такие полосы называются аналитическими. При анализе используют максимум или минимум полосы поглощения и не следует производить измерения на участках крутого спада или подъема кривой.

Для многокомпонентных систем выделение аналитических полос по каждому отдельному компоненту становится затруднительным В этом случае количественные определения могут быть произведены путем измерения оптической плотности при нескольких значениях длин волн и решения системы линейных уравнений, связывающих суммарную величину оптической плотности смеси при данной длине волны с величиной оптической плотности для каждого индивидуального компонента. Погрешность метода не превышает 2%.

Некоторые анализируемые вещества необходимо предварительно перевести в соединения, поглощающие излучения. Для определения концентрации растворов спектрофотометрическим путем используется закон Бугера - Ламберта - Бера в форме:

С= (3)

где С - концентрация раствора:

н - показатель поглощения раствора, концентрация которого равна 1:

в - толщина слоя вещества, см.

В ряде случаев даже при использовании монохроматического излучения могут наблюдаться отклонения от закона Б - Л - Б, обусловленные процессами диссоциации, ассоциации и комплексообразования. При наличии таких отклонений следует пользоваться не этой формулой, а экспериментально найденной зависимостью оптической плотности от концентрации.

1.1.2 Инфракрасная спектроскопия

Спектры в УФ и видимой областях применяются для идентификации соединений как в чистом виде, так и в составе пищевых продуктов. Эта методика используется для определения химической структуры соединения и его превращения, однако при более точном анализе необходимы исследования поглощения в инфракрасной области.

Инфракрасная (ИК) спектроскопия представляет собой один из новейших физических методов количественного и качественного анализа пищевых продуктов. Этот метод позволяет получить достаточно полную информацию о строении и составе органических веществ.

ИК- излучение применяется для исследования жирно-кислотного состава молочных продуктов, широко используется для определения пестицидов в различных пищевых продуктах и т.д.

Инфракрасный спектр органического соединения является одним из однозначных физических свойств вещества. Для идентификации вещества необходимо знать, к какому классу органических соединений относится определяемое вещество.

Инфракрасная спектроскопия также основана на поглощении излучения. Поглощением в инфракрасной области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Инфракрасные спектры могут быть получены в различных агрегатных состояниях веществ и используются для идентификации, количественного анализа, а также для исследования строения молекул.

Измерения проводят на однолучевых и двухлучевых инфракрасных спектрофотометрах, снабженных диспергирующими системами в виде призм и диффракционных решеток. Наиболее часто используется спектральная область от 2,5 до 20 мкм (4000--500 см^-1).

Каждый инфракрасный спектр характеризуется серией полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом v или длиной волны л и интенсивностью максимумов поглощения (^см-1);

Волновое число н, измеряемое в обратных сантиметрах определяется из соотношения v=, где л--длина волны в микрометрах (мкм).

Обычно при записи спектра на оси абсцисс откладывается в линейной шкале значение волнового числа н (в ^см-1) на оси ординат -- величина пропускания Т( %).

Подготовку образцов к снятию инфракрасных спектров проводят по следующим методикам.

1. Твердых вещества. а) пасты тщательно смешивают 10--20 мг твердого вещества с 1--2 каплями иммерсионной жидкости (вазелиновое масло, полифторуглеводород, гексахлорбутадиен и др.), приготовленную пасту сдавливают между двумя пластинками из NaCl (или КВг) и помещают в спектрофотометр для измерения. Во второй канал прибора помещают слой иммерсионной жидкости между пластинками NaCI (или КВг); б) диски с КВг: навеску твердого вещества (1--3 мг) тщательно смешивают в вибромельнице или в ступке со спектроскопически чистым бромидом калия (150--200 мг) и смесь прессуют при давлении 7,5--10 т/см² в течение 2--5 мин под вакуумом 2--3 мм рт. ст.

Спектр полученного образца снимают относительно воздуха или относительно диска, приготовленного из чистого КВг, помещенного во второй канал прибора.

2. Жидкие вещества: тонкую пленку жидкости зажимают между пластинками из NaCI (или КВг) или используют кюветы с малой толщиной слоя (0,01--0,05 мм). Во второй канал прибора помещают чистую пластинку NaCI (или КВг) удвоенной толщины или соответствующие пустые кюветы.

3. Растворы: раствор исследуемого образца (жидкого или твердого) в подходящем органическом растворителе (обычно используемые концентрации приблизительно 0,5-- 1,5%) вводят в кювету с толщиной слоя 0,1--1 мм. Спектр раствора снимают относительно чистого растворителя.

Спектр поглощения тесно связан со строением исследуемого вещества. Применение инфракрасных спектров для исследования строения веществ основано главным образом на использовании характеристических полос поглощения (полосы, связанные с колебаниями функциональных групп или связей в молекулах). Такими характеристическими полосами поглощения обладают группы --ОН, --NH₂, --МО₃, =С==0, --C=N и др.

Молекулу вещества можно рассматривать как систему соответствующих атомов, которые находятся в строго определенном энергетическом состоянии. Из всего спектра, попадающего на молекулу излучения, она поглощает волны той длины, которые могут изменить ее энергетическое состояние.

Энергия, полученная молекулой, может быть потрачена на изменение электронного состояния атомов (при этом спектр будет относиться к ультрафиолетовой и видимой областям) или на изменение колебательной и вращательной энергии.

Таким образом, поглощение инфракрасного излучения веществом связано с колебаниями атомов в молекулах, а значит, с изменением длин химических связей, соединяющих атомы.

Все колебания связанных атомов подразделяют на два основных типа: валентные и деформационные. При валентных колебаниях изменяются в основном длины связей, а углы между ними остаются почти неизмененными. В случае деформационных колебаний, наоборот, изменяются главным образом углы между связями.

Сопоставление ИК-спектров рекомендуется начинать с анализа характеристических полос, которые обычно хорошо проявляются на спектрах и лишь при их совпадении сопоставляют низкочастотную область.

Для низкочастотного интервала 1350--400 мл^-1 характерен специфический набор полос, который называют областью «отпечатков пальцев».

Полное совпадение полос поглощения в ИК-спектрах свидетельствует об идентичности вещества. Полиморфные модификации одного и того же вещества могут давать различные спектры. В этом случае для проверки идентичности сопоставляют спектры их растворов или, растворив каждое вещество в одном и том же растворителе, упаривают растворитель досуха и сравнивают спектры твердых остатков.

Инфракрасный спектр веществ в значительной степени зависит от физического состояния исследуемого образца, от концентрации соединений.

Метод ИК - спектроскопии используется для определения содержания в пищевых продуктах витаминов: А, К, К₁, К₂, В₁, В₂, В₆, С, никотиновой кислоты, токоферолов, каротина и т.д.

1.2 Пламенная спектроскопия

Описанные ранее спектральные методы анализа позволяют определить концентрацию в основном органических веществ.

Расширение познаний в области физиологической роли минеральных элементов, их каталитического воздействия на ферментативные процессы выдвинуло насущную потребность в разработке и применении аналитических методов количественного определения отдельных минеральных элементов, включая и микроэлементы. Одним из методов, позволяющих определить количество минеральных элементов, является пламенная спектрофотометрия.

Принцип метода пламенной спектрофотометрии заключается в следующем: атомы веществ, испаряемые в пламени, испускают или поглощают свет определенной длины волны.

Пламенная спектрофотометрия поваляет определить количество элементов в веществе. по интенсивности определяемых линий в спектре. Различают также атомную эмиссионную и атомную абсорбционную спектрофотометрию. Эмиссионная и атомно-абсорбционная пламенная спектрометрия применяется для качественного и количественного определения химических элементов в различных объектах: пищевых продуктах, реактивах, воде, биологических жидкостях и др.

В основе эмиссионной пламенной спектрометрии лежит использование спектров испускания возбужденных атомов или молекул определяемых элементов. При создании атомного облака в пламени некоторые атомы возбуждаются и переходят на более высокие энергетические уровни. Когда эти атомы возвращаются на нижние (основные) энергетические уровни, то энергия, полученная атомами, испускается (спектр испускания).

Принцип эмиссионной пламенной спектрометрии заключается в следующем: анализируемый раствор распыляется в виде аэрозоля в пламени горелки, работающей на горючем газе. При воздействии температуры пламени происходит ряд сложных физических и химических процессов: испарение растворителя из капель аэрозоля, испарение твердых частиц, диссоциация молекул, возбуждение атомов и возникновение характеристического излучения атомов.

Излучение определяемого элемента отделяется от постороннего с помощью светофильтра или монохроматора, попадает на фотоэлемент и вызывает фототок, который измеряется с помощью гальванометра, электронного потенциометра и других приборов. Количественное определение элемента по методу эмиссионной пламенной спектрометрии основано на функциональной зависимости интенсивности спектральной линии (I) и концентрации элемента в растворе (с). Прямая пропорциональность между (I) и (с) имеет место лишь в определенной для данного элемента области концентрации. При этом линейную зависимость (I) от (с) может нарушать самопоглощение, ионизация, образование газообразных или трудно диссоциирующих в пламени соединений.

Принцип атомно-абсорбционной спектрометрии заключается в следующем: резонансное излучение от лампы с полым катодом проходит через пламя, в которое распыляется анализируемый раствор пробы. Излучение попадает на входную щель монохроматора, установленного таким образом, что из спектра выделяется только резонансная линия определяемого элемента, интенсивность которой измеряется фотоэлектрическим способом. Измеряют уменьшение интенсивности резонансной линии вследствие поглощения ее атомами определяемого элемента, принимая интенсивность ослабленной линии за 100%. Величина поглощения резонансного излучения пропорциональна числу атомов, находящихся в поглощающем слое. Зависимость между ослаблением интенсивности излучения источника света (I) и концентрацией вещества (с) может быть выражена уравнением:

I=I₀·I^kcl

где I₀ -- интенсивность резонансного излучения; I-- интенсивность излучения, прошедшего поглощающий слой; k -- коэффициент поглощения света в центре линии поглощения; с -- концентрация поглощающего компонента; l -- толщина поглощающего слоя.

Погрешность определения элемента в методе атомно-абсорбционной пламенной спектрометрии могут вызывать: ионизация исследуемых атомов при температуре пламени, образование стойких химических соединений в пламени, неселективное поглощение света и другие факторы.

Число возбужденных атомов увеличивается с ростом температуры, которая зависит в основном от теплотворной способности создающего пламя газа. В используемых фотометрических методах применяется в основном пламя следующих газовых смесей (таблица 1)

Таблица 1

Состав и температура газовой смеси

Состав газовой смеси	Температура, °С
Светильный газ + воздух	1840
Ацетилен + воздух	2250
Ацетилен + кислород	3050
Водород + кислород	2680
Ацетилен + закись азота	2955

Для анализа пищевых продуктов наибольшее развитие приобрел метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии.

ААС широко используют для определения в пищевых продуктах ряда жизненно важных элементов (Na, К, Mg, Са, Си, Zn, Sn, P, V, Se, Cr, Mo, Mn, Fe, Co и Ni) и некоторых токсичных металлов (Cd, Hg, В, Pb, Sb, As и др.). В последние годы значительно повысились требования к быстроте, чувствительности и точности таких анализов, и ААС становится одним из основных методов аналитического контроля в данной области.

Из-за большого разнообразия пищевых проб и форм нахождения в них химических элементов следует обратить внимание на два важных момента: на представительность аналитических проб и на возможность потерь летучих элементов в процессе подготовки пробы. Распределение микроэлементов в различных биологических органах и тканях или между жидкой (водной), жировой и твердой фазами консервированных продуктов часто весьма неравномерно, и это следует иметь в виду при отборе проб и подготовке их к анализу. Некоторые элементы, например, ртуть в рыбе, хром в пивных дрожжах или сахарах и др. находятся в форме летучих соединений и могут легко теряться при применении традиционных методов подготовки проб (иногда даже при высушивании).

При сухом озолении (включая и анализ в графитовой печи) некоторых проб с большим содержанием хлоридов -- животные жиры, соленые и консервированные продукты и т. п. -- возможны потери летучих соединений Си, Ag, Zn, Cd, Hg, В, Sn, Pb, Sb, As, Se и Cr. Для проверки возможных потерь при озолении лучше использовать метод тефлонового автоклава или другую общепринятую методику, а не метод добавок, так как добавки обычно вводятся в химической форме, не соответствующей форме определяемого элемента в анализируемой пробе.

Для анализа большинства пищевых продуктов приходится проводить их предварительное озоление сухим или мокрым способом.

Подготовленный раствор озоленной пробы вводится в пламя горелки и образует атомный пар. Стандартные растворы определенных концентраций металла готовят в том же растворителе, что и анализируемый образец. Концентрации должны быть приравнены к ожидаемым концентрациям в рабочем растворе. Если абсорбция стандартов линейно зависит от концентрации, то график строится по показателям для трех стандартных растворов. Если рабочая кривая не линейна, то для определения концентрации с желаемой точностью необходимо использовать больше стандартов. Так как рабочая кривая может меняться в зависимости от условий эксперимента, ее следует проверять перед каждой новой серией анализов. Атомная абсорбция применима для анализа в пищевых продуктах большого числа металлов, концентрация которых в исследуемом растворе находится на уровне 1 мкг/мл (кобальт, никель, свинец, хром, стронций и т.д.).

1.3 Люминесцентный анализ

В настоящем разделе рассмотрен широко применяемый при анализе пищевых продуктов метод, основанный на фотолюменисценции исследуемого вещества, энергия которого возбуждается ультрафиолетовым светом.

Под люминесцентным анализом понимается совокупность методов анализа, основанных на явлении люминесценции - свечения вещества, возникающего после поглощении им энергии возбуждения.

Люминесценцией называют свечение атомов, ионов, молекул и других более сложных частиц вещества, которые возникают в результате перехода в них электронов при возвращении из возбужденного состояния в нормальное.

Кроме люминисцентного существуют родственные ему атомно-флуоресцентный и рентгеновский флуоресцентный виды анализа.

Свечение, возникающее под действием световых лучей оптического диапазона ультрафиолетовых и видимых частот, носит название фотолюминесценции, которая в зависимости от вида возбужденного уровня и времени пребывания в нем подразделяется на флуоресценцию и фосфоресценцию.

Молекулы вещества, поглощая энергию ультрафиолетового света, переходят в возбужденные энергетические состояния Е₀. Поглощенная молекулой энергия может быть частично израсходована на безызлучательные переходы (например, на увеличение энергии колебательных и вращательных движений, т.е. перейти в тепловую) и при обратном переходе из возбужденного в основное состояние Е₀ молекула излучит квант с меньшей энергией. При этом наблюдается свечение вещества в более длинноволновой области (обычно видимой).

Кратковременную люминесценцию, затухающую сразу после прекращения ее возбуждения, называют флуоресценцией, а длительную, продолжающуюся некоторое время после возбуждения, - фосфоресценцией. Временных границ между этими видами люминесценции точно указать невозможно, тем не менее, принято считать, что флуоресценция характеризуется временем между актами поглощения и излучения кванта света ф10^-10 с.

Флюоресценция - это вид собственного свечения вещества, которое продолжается только при облучении. Если источник света устранить, то свечение прекращается мгновенно.

Фосфоресценция - собственное свечение вещества, которое продолжается после отключения возбуждающего света.

Для исследования пищевых продуктов используется явление флюоресценции. С помощью люминесцентного анализа можно обнаружить в исследуемом образце присутствие вещества в концентрации 10^-11 г/мл.

Спектр люминесценции является индивидуальной характеристикой вещества. Эффективность преобразования возбуждающего спектра в люминесцентное свечение характеризуется энергетическим и квантовым выходом люминесценции.

Энергетический выход представляет собой отношение излучаемой веществом энергии люминесценции E_л к энергии поглощенного света E_n

В_эн=Е_л/Е_n

Квантовый выход - это отношение числа излучаемых квантов N_л к числу поглощаемых квантов N_n

В_кв=N_л/N_n

Учитывая, что энергия кванта = hv, энергия N квантов Е= Nhv, тогда связь между В_эн и В_кв, выразится:

B_эн=N_лh н/N_nh н_п=В_кв(н_л/н_n) (1)

Энергетический выход люминесценции при возбуждении возрастает пропорционально длине волны возбуждающего света, затем остается постоянным и после достижения некоторой граничной длины волны резко падает (закон Вавилова).

Рис. 1 Спектры поглощения и люминисценции вещества

В люминесцентном анализе о количестве вещества судят по интенсивности люминесценции I_л, которая пропорциональна числу излучаемых квантов, а их количество прямо пропорционально концентрации вещества с-k коэффициент пропорциональности): I_л=kc

На снижение интенсивности люминесценции влияют такие факторы, как повышение температуры, изменение состава среды и вида растворителя, присутствие веществ - "тушителей" (галогены, Fe³,⁺ Cu²⁺). Процессы, ведущие к снижению выхода люминесценции, называются тушением люминесценции.

Различают две группы люминесцентных методов:

методы обнаружения;

физико-химические методы.

Люминесцентные методы обнаружения, в основном, используются как качественные экспрессные тест-методы, т.к. они не требуют количественных измерений. В этой группе выделяют люминесцентный видовой и сортовой анализ, люминесцентную диагностику, люминесцентную дефектоскопию, люминесцентную микроскопию.

К группе физико-химических методов относят методы по определению качественного и количественного состава продуктов, структуры и свойств отдельных компонентов. В этой группе выделяют качественный люминесцентный анализ, с помощью которого устанавливают качественный состав исследуемого продукта, строение и свойства отдельных компонентов; количественный люминесцентный анализ, в задачи которого входит определение количественного содержания в продуктах отдельных компонентов или соотношение составных частей продукта.

Как качественный, так и количественный люминесцентный анализ широко применяется при исследовании пищевых продуктов благодаря своей высокой точности, чувствительности и воспроизводимости полученных результатов.

Это особо важно при работе с малыми количествами вещества.

Количественный люминесцентный анализ позволяет определить концентрацию исследуемого вещества в растворе по интенсивности люминесценции. Техника количественного анализа основана на том, что при небольшом содержании флуоресцирующего вещества в растворе существует пропорциональная зависимость между яркостью свечения и концентрацией вещества в пробе. Наиболее удобно проводить сравнение по интенсивности люминесценции раствора неизвестной концентрации с эталонным раствором. По концентрации вещества в стандартных растворах рассчитывают содержание вещества в пробах.

Люминесцентный анализ нашел широкое применение при исследовании пищевых продуктов. Установлено, что начало гниения бобов, белой и красной капусты, огурцов на ранней стадии можно определить по изменению цвета и интенсивности флуоресценции. Люминесценция свежего, лежалого и портящегося зерна различна. Метод позволяет обнаружить на ранних стадиях заболевания картофеля и отличать подмороженные клубни, имеющие белесовато-голубое свечение в ультрафиолете. Присутствие личинок гельминтов в мясе может быть обнаружено по их характерному розовому свечению в ультрафиолетовых лучах, а кишечная палочка обнаруживает себя свечением в зеленовато-желтых тонах. Широко используется метод при определении белков, которые светятся благодаря содержащимся в них ароматическим аминокислотам, так созревание сырного теста изменяет цвет флуоресценции от серо-синего до фиолетового. Свежие куриные яйца имеют интенсивно красную флуоресценцию, цвет которой при хранении меняется на голубой.

Спектральные люминесцентные характеристики используются для идентификации жиров, а по изменению положения максимума спектров люминесценции жиров судят о степени их окисления. Топленые животные жиры не флуоресцируют, маргарин светится в голубом диапазоне, а коровье масло в канареечно-желтом. Свечение молока от здоровых коров имеет флуоресценцию ярко желтого цвета, а молоко коров с больным выменем, молоко с добавлением соды или 15 % воды флуоресцирует в бледно-желтых тонах. Кобылье молоко флуоресцирует в синей области спектра.

По цвету люминесценции устанавливается сорт муки и наличие в ней примесей, - чем больше в ней отрубей, тем выше интенсивность синего свечения. Подробно разработаны методы качественного и количественного анализа для определения ряда витаминов (тиамина, рибофлавина, фолиевой кислоты).

Преимущества и недостатки флуориметрии по сравнению со спектрофотометрией.

Благодаря тому, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации вещества, во флуориметрах используется сравнительно простая электроника. Спектрофлуориметрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры поглощения регистрировать очень трудно. Чувствительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, усиливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хорошей спектральной селективностью, поскольку благодаря стоксовому сдвигу можно использовать два монохромотографа один настроенный на длину волны возбуждающего света, другой на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюветы сравнения, но надо иметь калибровочную кривую.

Основная трудность, возникающая при флуориметрических измерениях,- это тушение флуоресценции, когда энергия возбуждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения.

2. Хроматографические методы исследования

Хроматографией называется процесс разделения смесей веществ, основанный на количественных различиях в поведении разделяемых компонентов при их непрерывном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянно направленные движения.

Задача, с которой аналитикам постоянно приходится сталкиваться при исследовании биологических соединений, - это их выделение и очистка. Одним из наиболее удобных методов разделения является хроматографический метод, с помощью которого можно разделять как большие (несколько граммов), так и малые (пикограммы) количества материала.

Хроматография является одним из наиболее эффективных и универсальных физико-химических методов разделения и анализа сложных смесей веществ. Она используется в разных областях исследования и за последнее время с большим успехом применяется при изучении состава и качества пищевых продуктов. Хроматографические методы незаменимы при оценке пищевых продуктов, имеющих очень сложный химический состав, т.к. позволяет проводить трудноосуществимые, а в ряде случаев невыполнимые другими методами разделения при высокой степени их точности и быстроте проведения анализа. Именно хроматографические методы позволили необычайно расширить исследования во всех областях товароведения пищевых продуктов:

- при изучении их химического состава, пищевой полноценности и прогнозирования стойкости в хранении;

- при определении аромата и запаха;

- при определении добавок в пищевые продукты;

- при установлении остаточных количеств ядохимикатов в пищевых продуктах;

- при исследовании различных пленочных и упаковочных материалов.

2.1 Классификация хроматографических методов анализа

В основу классификации методов хроматографии могут быть положены различные характерные признаки процесса:

В зависимости от цели проведения хроматографического процесса различают аналитическую, препаративную и промышленную хроматографию. Аналитическая хроматография предназначена, для определения концентрации компонентов в анализируемой смеси. Препаративная хроматография применяется для выделения веществ в лабораторных условиях. Промышленная хроматография используется для получения чистых компонентов в значительном количестве.

В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают: проявительный (элюентный), фронтальный и вытеснительный методы анализа.

Элюентный анализ заключается в том, что смесь переносится через сорбционный слой потоком вещества (элюентом), сорбирующегося хуже любого из компонентов смеси.

Фронтальный анализ состоит в непрерывном пропускании исследуемой смеси через слой сорбента.

Вытеснительный анализ состоит в переносе разделяемой смеси потоком вещества, сорбирующегося лучше из компонентов смеси.

В зависимости от природы процесса, обуславливающего распределение компонентов между подвижной и неподвижной фазами, различают распределительную, ионообменную, адсорбционную и молекулярно-ситовую хроматографию.

Распределительная хроматография основана на различной растворимости разделяемых компонентов в пленке жидкой фазы (неподвижная фаза)

В ионообменной хроматографии используются различные константы ионообменного равновесия (между двумя фазами).

Адсорбционная хроматография основана на различной адсорбируемости компонентов на данном сорбенте в данных условиях. В зависимости от способов оформления процесса различают колоночную и плоскостную хроматографию.

В колоночной хроматографии процесс ведут в насадочной или капиллярной хроматографической колонке, в последнем случае метод называется капиллярной хроматографией. Насадочную колонку заполняют адсорбентом. При капиллярной хроматографии адсорбентом или носителем, покрытым слоем нелетучей жидкости, служит внутренняя стенка колонки.

Плоскостная хроматография осуществляется на плоскости и включает хроматографию на бумаге и тонкослойную хроматографию.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую и жидкостную хроматографии.

Газовой хроматографией называют метод, в котором подвижной фазой является газ (или пар). Существуют различные варианты хроматографии. В газо-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый адсорбент. Разделение осуществляется вследствие различной адсорбируемости компонентов смеси. В газо-жидкостной хроматографии неподвижная фаза - жидкость, внесенная в инертный носитель. Разделение осуществляется в следствии различной растворимости компонентов пробы в жидкости или различной стабильности образующихся комплексов. Газовая хроматография на модифицированном сорбенте основана на том, что неподвижной фазой служит твердый адсорбент, модифицированный небольшим количеством жидкости. В этом случае играют роль как адсорбция на твердом веществе, так и растворимость в модифицирующей жидкости.

Жидкостной хроматографией называют метод, в котором подвижной фазой является жидкость. Имеются различные варианты этого метода. В жидко - жидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость. В жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижная фаза представлена твердым адсорбентом.

В настоящее время широко распространены газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография (хроматография высокого давления).

Как газовая, так и ВЭЖХ являются вариантом колоночной хроматографии.

2.2 Устройство хроматографических колонок

В хроматографической колонке происходит разделение компонентов смеси на отдельные зоны. В хроматографической практике используются два основных типа хроматографических колонок: насадочные и капиллярные. Насадочные колонки можно подразделить на препаративные (диаметр более 10 мм), аналитические (диаметр 3--6 мм) и микронасадочные (диаметр 0,5--2,0 мм). Длина колонок с насадкой 0,8--10 м. Капиллярные колонки (диаметр 0,2--0,6 мм) обычно используются без насадки. Роль насадки (твердого носителя) в этих колонках выполняют внутренние стенки колонки, на которые наносится пленка неподвижной жидкой фазы. Длина капиллярных колонок 20-- 100 м. Колонки помещают в термостаты, температура в которых поддерживается с точностью до ±0,05--0,5° С. Наиболее широко распространено воздушное термостатирование с принудительной циркуляцией.

Успех анализа в значительной степени зависит от способности хроматографической колонки надежно разделять анализируемую смесь. Разделительная способность колонки по отношению к данной смеси обусловлена рядом факторов: природой и качеством неподвижной фазы (распределением частиц адсорбента, равномерностью их упаковки в колонке, их удельной поверхностью, размером пор), длиной и диаметром колонки, температурой колонки и ее распределением вдоль колонки, скоростью потока элюента и распределением элюента вдоль колонки.

Согласно теории Мартина и Синджа, для описания процесса разделения веществ по слою сорбента в хроматографической колонке последняя мысленно разбивается на ряд последовательных элементарных участков -- «тарелок», (подобно ректификационной колонке) - слоёв, на каждом из которых происходит единичный акт адсорбции-десорбции, при условии отсутствия диффузионного переноса анализируемого вещества. Поэтому теория Мартина и Синджа получила название теории тарелок.

В основе ее лежат предположения, что хроматографируемое вещество проходит каждую тарелку прерывными порциями, переносимыми потоком носителя, и что на каждой тарелке между неподвижной фазой -- сорбентом и подвижной фазой -- носителем успевает установиться равновесие. Каждая новая порция носителя, подаваемая на первую тарелку, приводит к новому распределению вещества между подвижной и неподвижной фазами, причем часть вещества переносится на следующую тарелку. На ней также устанавливается равновесие и происходит перераспределение вещества между фазами и перенос его на последующие тарелки. Вследствие этого с каждой новой порцией носителя концентрация вещества на первой тарелке падает, а на последующих возрастает.

В результате такого перемещения и перераспределения хроматографируемое вещество оказывается на нескольких тарелках, причем на средних его концентрация максимальна по сравнению с соседними тарелками. Таким образом вещество «размывается» по нескольким тарелкам, причем чем большее число тарелок занято веществом, тем сильнее размывание. Следовательно, число тарелок, занимаемых данным компонентом, служит мерой эффективности колонки.

Высота тарелки вычисляется по формуле:

Н, (1)

где Н -- высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ)

L -- длина хроматографической колонки;

N -- эффективность хроматографической колонки в теоретических тарелках.

Единичный акт удерживания состоит из двух стадий:

1) адсорбции молекулы адсорбата на поверхность адсорбента;

2) десорбции молекулы адсорбата с поверхности адсорбента.

Рис. 2 Модель хроматографической колонки,

L - длина колонки; H - высота ВЭТП; 1,2…., n номер тарелки; N - общее количество тарелок.

Общий процесс удерживания молекулы анализируемого вещества на одном адсорбционном слое характеризуется временем удерживания вещества AT на одном адсорбционном слое.

2.3 Термины и определения, применяемые при проведении хроматографических методов анализа

СОРБЕНТ -- твердое вещество, жидкость или их смеси, способные поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемые в хроматографии в качестве неподвижной фазы.

АДСОРБЕНТ -- твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы, пары или растворенные вещества. Адсорбентом заполнена хроматографическая колонка, в которой, в свою очередь, происходит разделение смеси веществ на отдельные компоненты.

ЭЛЮАТ -- раствор, выходящий из хроматографической колонки.

ХРОМАТОГРАММА -- графический результат хроматографи-ческого процесса. Хроматограммой (с точки зрения аппаратурного оформления) можно назвать зависимость отклика детектора хроматографа от времени при прохождении элюата через ячейку детектора. Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы (рис. 2). Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрациии компонента в элюате.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из хроматографической колонки, заполненной определенным адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава. В совокупности с расходом элюента w (мкл/мин., мл/мин.) хроматографическая система дает УСЛОВИЯ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ.

...