Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

03.00.20 - біотехнологія

УДК 579.841:577.114

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук

ВДОСКОНАЛЕННЯ ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ ЕТАПОЛАНУ НА СУМІШІ РОСТОВИХ СУБСТРАТІВ

Лащук Надія

Володимирівна

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біотехнології мікробного синтезу Національного університету харчових технологій Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Пирог Тетяна Павлівна, Національний університет харчових технологій, завідувач кафедри біотехнології мікробного синтезу.

Офіційні опоненти: доктор технічних наук, професор Маринченко Віктор Опанасович, Національний університет харчових технологій, кафедра біотехнології продуктів бродіння, екстрактів та напоїв.

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Пасічник Лідія Анатоліївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного Національної академії наук України, відділ фітопатогенних бактерій.

Захист відбудеться «10» грудня 2008 р. об 1300 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 Національного університету харчових технологій за адресою: м. Київ, 01033, вул. Володимирська, 68, аудиторія А-311.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету харчових технологій за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 68.

Автореферат розісланий «_____» листопада 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат технічних наук, доцент Бублієнко Н.О.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Упродовж останніх 2030 років мікробні екзополісахариди (ЕПС) - високомолекулярні екзогенні полімери вуглеводної природи є об'єктом інтенсивних теоретичних і прикладних досліджень (Kumar, 2007). Здатність розчинів мікробних ЕПС до гелеутворення, емульгування, суспендування, змінення реологічних характеристик водних систем зумовили широке використання цих біополімерів у нафто- і гірничовидобувній, текстильній, харчовій, фармацевтичній, хімічній промисловості, сільському господарстві і медицині. Мікробні ЕПС мають ряд переваг перед полісахаридами рослинного походження. Так, ці біополімери можна отримувати в потрібних об'ємах незалежно від пори року і кліматичних умов. Економічна доцільність використання мікробних ЕПС зумовлена їх позаклітинною природою і високою продуктивністю синтезу на дешевих субстратах. На відміну від хімічних полімерів (поліакриламіду) мікробні ЕПС стійкі до температурної, окисної, механічної деструкції, але піддаються біологічній деградації і є нетоксичними, що робить екологічно безпечним їх застосування, наприклад, у нафтодобуванні.

Актуальність проблеми. Попередні дослідження (Пирог, Коваленко, 2003) показали можливість інтенсифікації синтезу мікробного екзополісахариду етаполану (продуцент Acinetobacter sp. B-7005) на суміші енергетично нерівноцінних ростових субстратів (етанол+глюкоза). Розроблена авторами технологія одержання етаполану в умовах міксотрофного росту продуцента дала змогу підвищити майже у 1,51,8 раза кількість синтезованих ЕПС (до 9,0 г/дм3) і вихід ЕПС від субстрату порівняно з культивуванням бактерій на моносубстратах. Проте ця технологія передбачала культивування Acinetobacter sp. В-7005 на середовищі з високим вмістом солей (11 г/дм3), що суттєво знижувало її ефективність.

Слід зазначити, що промислове виробництво мікробних полісахаридів в Україні до теперішнього часу не реалізовано, а факторами, які стримують впровадження технологій мікробних ЕПС є високі витрати на біосинтез (сировина, енергетика), а також на виділення та очищення цільового продукту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт кафедри біотехнології мікробного синтезу Національного університету харчових технологій за темами "Розробка та удосконалення мікробіологічних та біохімічних процесів в біотехнології та охороні навколишнього середовища" (20012005 рр.) та "Розроблення новітніх біотехнологій у мікробіологічній, фармацевтичній, харчовій промисловості та охороні довкілля" (20062010 рр.), а також у рамках проекту Міністерства освіти і науки України "Розробка наукових основ інтенсифікації синтезу вторинних метаболітів в умовах міксотрофного росту бактерій" (20042006 рр.), № державної реєстрації 0104U000440.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у дослідженні регуляції синтезу етаполану на суміші ростових субстратів і встановленні умов культивування Acinetobacter sp. В-7005, що забезпечують максимальну конверсію вуглецю субстратів в ЕПС в умовах міксотрофного росту продуцента на дешевому середовищі мінімального складу.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі завдання:

– встановити причини лімітування метаболізму у процесі вирощування Acinetobacter sp. В-7005 на суміші етанолу і глюкози та розробити підходи до їхнього усунення;

– дослідити можливість заміни глюкози і етанолу у змішаному субстраті на дешевші субстрати (мелясу та ацетат і/або фумарат, відповідно);

– встановити закономірності синтезу етаполану на суміші енергетично дефіцитних субстратів;

– розробити шляхи інтенсифікації синтезу етаполану на змішаних С2С6-субстратах та встановити механізми, що забезпечують підвищення синтезу ЕПС в умовах міксотрофного росту продуцента на суміші енергетично нерівноцінних і енергетично дефіцитних субстратів;

– розробити технологічну та апаратурну схеми одержання різних товарних форм етаполану на суміші ростових субстратів.

Об'єкт дослідження - штами Acinetobacter sp. В-7005 і В-7005 (1НГ), мікробний полісахарид етаполан.

Предмет дослідження - процес синтезу етаполану на суміші енергетично нерівноцінних та енергетично дефіцитних субстратів.

Методи дослідження - мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні, хімічні.

Наукова новизна роботи. Розроблено підходи до регуляції і визначено шляхи управління процесом біосинтезу етаполану на суміші енергетично нерівноцінних і енергетично дефіцитних ростових субстратів.

Встановлено, що «вузьким» місцем метаболізму у процесі культивування Acinetobacter sp. В-7005 на суміші етанолу і глюкози є асиміляція ацетату - реакція, що каталізується ацетил-КоА-синтетазою, є швидкість-лімітувальною. Показано можливість часткового усунення лімітування С2-метаболізму шляхом зниження початкової концентрації глюкози і етанолу в середовищі з наступним їх дробним внесенням у процесі культивування Acinetobacter sp. В-7005 і використання посівного матеріалу, вирощеного на етанолі або ацетаті.

Вперше показано можливість підвищення синтезу етаполану на суміші енергетично дефіцитних субстратів (ацетату і глюкози). За наявності ацетату натрію у змішаному субстраті активність ацетил-КоА-синтетази і ключового ферменту глюконеогенезу фосфоенолпіруватсинтетази (ФЕП-синтетази) були у 10 раз, а показники синтезу етаполану у 2 рази вищими порівняно з ацетатом калію, що може свідчити про участь Na+ у створенні іонних градієнтів на мембрані, необхідних для генерації енергії протонрушійної сили і забезпечення активного транспорту ацетату у клітини Acinetobacter sp. В-7005.

Встановлено можливість використання меляси - відходу цукрового виробництва як енергетично дефіцитного субстрату в умовах міксотрофного росту продуцента етаполану на суміші ростових С2С6-субстратів.

Показано, що інтенсифікація синтезу етаполану на суміші енергетично нерівноцінних і енергетично дефіцитних С2С6-субстратів зумовлена індукцією глюконеогенезу, про що засвідчило зниження активності ізоцитратдегідрогенази, підвищення активності ферментів анаплеротичних шляхів (гліоксилатного циклу і піруваткарбоксилазної реакції), а також ФЕП-синтетази .

Встановлено можливість інтенсифікації синтезу етаполану на суміші енергетично нерівноцінних С4С6-субстратів (фумарату і глюкози). У результаті теоретичних розрахунків енергетичних потреб синтезу ЕПС і біомаси встановлено оптимальне молярне співвідношення фумарату і глюкози (4:1, відповідно), що забезпечує максимально повну трансформацію вуглецю обох субстратів у ЕПС.

Практичне значення одержаних результатів. На основі досліджень регуляції синтезу етаполану розроблено технологію одержання цього ЕПС на суміші ростових енергетично дефіцитних С2С6-субстратів, яка порівняно з вихідною має такі переваги: 1) використання дешевих доступних джерел вуглецевого живлення (ацетату і меляси замість етанолу і глюкози, відповідно); 2) виключення з середовища джерела мінерального азоту; 3) зниження загального вмісту солей у середовищі більш, ніж у чотири рази (з 11 до 2,5 г/дм3). Реалізація даної технології дає змогу суттєво знизити собівартість етаполану в результаті зниження витрат на приготування поживного середовища.

Технологія синтезу етаполану на суміші ростових субстратів захищена двома патентами України на корисну модель (№ 19138, опубл. 15.12.2006, Бюл. №12; № 25947, опубл. 27.08.2007, Бюл. № 13) і апробована у дослідно-промислових умовах ВАТ «Стиролбіотех».

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Експериментальна робота виконана особисто здобувачем. Автором проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, узагальнено отримані експериментальні дані, проведено порівняльний аналіз з відомими літературними даними. Здобувачем самостійно встановлено причини лімітування метаболізму у процесі культивування продуцента етаполану на суміші ростових С2С6-субстратів і розроблено шляхи їхнього усунення; досліджено закономірності синтезу ЕПС на суміші енергетично дефіцитних субстратів, проведено теоретичний розрахунок оптимального співвідношення концентрацій фумарату і глюкози у середовищі культивування продуцента і підтверджено його експериментальними даними, обґрунтовано і експериментально підтверджено можливість заміни глюкози у змішаному субстраті на дешевший субстрат мелясу. Планування основних напрямків роботи, обговорення результатів та підготовка публікацій за результатами досліджень проходили за участю наукового керівника д.б.н., проф. Т.П. Пирог.

Визначення активності ключових ферментів С2С6-метаболізму, а також швидкості окиснення субстратів інтактними клітинами бактерій здійснено спільно з к.б.н. Ю.В.Корж (Інститут мікробіології і вірусології НАН України), яка є співавтором наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на Х зїзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004); ІІ і ІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції "Біотехнологія. Освіта. Наука" (Львів, 2004; Харків, 2006); І, ІІ і ІІІ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2005, 2006, 2007), Міжнародній науковій конференції «Мікробні біотехнології» (Одеса, 2005), Міжнародній науково-практичній конференції «Перспективы и проблемы развития промышленной биотехнологии в рамках единого пространства стран СНГ» (Мінськ-Нароч, 2005), IX Міжнародній науково-технічній конференції "Нові технології та технічні рішення в харчовій та переробній промисловості: сьогодення і перспективи" (Київ, 2005); VI Національному з'їзді фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України” (Харків, 2005), 71-й, 72-й і 73-й наукових конференціях молодих вчених, аспірантів та студентів Національного університету харчових технологій (Київ, 2005, 2006, 2007); 10-й Міжнародній Пущинській школі-конференції молодих вчених "Биология - наука ХХІ века" (Пущино, 2006); Міжнародній науковій конференції "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Мінськ, 2006, 2008); IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), Міжнародній конференції «Modern problems of Microbiology and Biotechnology» (Одеса, 2007), Міжнародній науковій конференції «Биология: теория, практика, эксперимент» (Саранськ, Росія, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 30 наукових праць, із них - 8 статей, 6 з яких у фахових виданнях, 2 патенти України на корисну модель та 20 тез доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 138 сторінках машинописного тексту і складається із таких структурних частин: „Вступ”, „Огляд літератури” (2 розділи), „Результати досліджень” (8 розділів), „Обговорення”, „Висновки”, „Список використаних джерел”, який містить 181 посилання (з них 92 іноземних авторів), „Додатки”. Робота містить 34 таблиці та 9 рисунків.

2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розділ 1. Мікробний екзополісахарид етаполан: технології біосинтезу, регуляція фізико-хімічних властивостей і практичне використання

Представлено дані про фізико-хімічні властивості властивості комплексного мікробного полісахариду етаполану (хімічний склад, структура, молекулярна маса, реологічні властивості), а також характеристику штаму-продуцента і його таксономічний статус. Проаналізовано переваги і недоліки розроблених раніше технологій одержання етаполану на різних вуглецевих субстратах (етанол, вуглеводи, суміш ростових С2С6-субстратів), наведено дані про практичне використання етаполану у нафтовидобувній, хімічній, харчовій промисловості і сільському господарстві.

Розділ 2. Інтенсифікація росту мікроорганізмів на суміші субстратів

Наведено основні положення концепції допоміжного субстрату та сутність енергетичної класифікації субстратів Бабеля (поділ субстратів на енергетично надлишкові та енергетично дефіцитні). Описано типи трансформації мікроорганізмами суміші ростових та неростових субстратів (міксотрофія, диауксія, неростове окиснення, кометаболізм, синтаболізм). Представлено дані про використання змішаних субстратів з метою інтенсифікації синтезу біомаси.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 3. Матеріали та методи досліджень

Об'єкти досліджень. Основним об'єктом досліджень був штам Acinetobacter sp. 12S - продуцент комплексного екзополісахаридного препарату етаполану (Гринберг и др., 1992), депонований у Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України за номером В-7005. Для проведення ензиматичних і полярографічних досліджень використовували також мутантний штам Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, і який був одержаний раніше за допомогою нітрозогуанідинового мутагенезу з вихідного штаму (Пирог и др., 2000).

Культивування бактерій. Культивування бактерій здійснювали в колбах на качалці (220 об/хв) при 30 С упродовж 16120 год на рідких мінеральних середовищах № 1ч12, які різнилися між собою загальним вмістом солей, молярністю буферу, природою і концентрацією джерела азоту, концентрацією катіонів калію К+. Як базове використовували середовище 1 такого складу (г/дм3): KH2PO4 6,8; КOH - 1,8; КCl - 1,4; NH4NO3 - 0,6; MgSO4 7H2O - 0,4; CaCl2 2H2O - 0,1; FeSO4 7H2O - 0,001. Склад і характеристика середовищ № 2ч12 наведено у табл. 1.

У середовища додатково вносили 0,5 % (об'ємна частка) дріжджового автолізату та 0,00030,0009 % (масова частка) пантотенату кальцію (вітамін В5).

Як джерело вуглецю і енергії використовували моносубстрати (етанол, глюкоза, сахароза, фруктоза, меляса, ацетат калію, ацетат натрію, фумарат калію, фумарат натрію) у концентрації 13 % , а також суміш субстратів (етанол і глюкоза у молярному співвідношенні 3:1; фумарат і глюкоза у молярному співвідношенні 2:1; 3:1; 4:1; 5:1; 6:1, етанол і меляса, ацетат і глюкоза, ацетат і меляса). За заміни у змішаному субстраті етанолу (0,51,0 %, об'ємна частка) і глюкози (0,51,0 %, масова частка) на ацетат і мелясу відповідно їхня концентрація була еквімолярна за вуглецем концентрації етанолу і глюкози.

Фумарат калію і натрію вносили у середовище культивування бактерій у вигляді 10 %-них, ацетат калію і натрію - 20 %-них розчинів.

Кислотне оброблення меляси з метою гідролізу сахарози проводили наступним чином: до 100 г меляси додавали дистильовану воду до кінцевого об'єму 200 см3, в отриманий розчин вносили 20 см3 1 н H2SO4, після чого стерилізували при 112 оС упродовж 30 хв. В одному з варіантів досліду використовували мелясу, яку після стерилізації нейтралізували 10 % розчином КОН.

Таблиця 1 Характеристика середовищ для вирощування Acinetobacter sp. В-7005

Примітки:

1. Середовища №2ч12 містили (г/дм3): MgSO4 7H2O - 0,4; CaCl2 2H2O - 0,1;

FeSO4 7H2O - 0,001;

2. Початкове значення рН середовищ становило 6,87,0;

3. "" - немає (компонент відсутній).

Як посівний матеріал використовували добову культуру, вирощену на МПА або змішаному агаризованому середовищі (МПА та сусло-агар у співвідношенні 1:1), а також культуру з експоненційної фази росту (1624 год росту), вирощену на мінеральних середовищах 1ч12 з різними джерелами вуглецю: 0,5 % етанолу за присутності або відсутності ацетату натрію (0,1%); 0,5 % глюкози; 0,7 % ацетату натрію; 0,8 % ацетату калію; 0,5 % меляси (масова частка за вуглеводами); 0,7 % фумарату натрію; 0,8 % фумарату калію.

Кількість посівного матеріалу становила 5 % від об'єму середовища.

Параметри росту і синтезу етаполану. Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на абсолютно суху вагу клітин у відповідності з калібрувальним графіком. Питому швидкість росту культури та ефективність трансформації вуглецю субстратів в ЕПС (вихід ЕПС від субстрату, ЕПС-синтезувальна здатність) розраховували за загальноприйнятими методами (Перт, 1978). Кількість синтезованих полісахаридів встановлювали ваговим методом (Williams, Wimpenny, 1978) та за концентрацією вуглеводів, що визначалась колориметричним методом за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою (Dubois et al, 1956).

Концентрацію етанолу в культуральній рідині визначали за методом газо-рідинної хроматографії. Концентрацію глюкози аналізували за глюкозооксидазним методом (Лукомская, Городецкий, 1961), пірувату за методом, описаном у роботі (Sloneker, Orentas, 1962), ацетату - ензиматичним методом з використанням ацетакінази (Криштаб, Соколов, 1985), фумарату за методом Штотца (Пятницкий, и др., 1949).

Аналіз активності ферментів. Визначення активності ферментів здійснювали в безклітинних екстрактах: клітини Acinetobacter sp. В-7005 (1НГ) руйнували ультразвуком (УЗ), одержаний дезінтеграт центрифугували, супернатант використовували як безклітинний екстракт. Для одержання безклітинних екстрактів бактерії вирощували до середини експоненційної фази росту. У разі одержання безклітинних екстрактів Acinetobacter sp. В-7005 культуральну рідину, що містить бактеріальні клітини та ЕПС, попередньо обробляли УЗ (для розщеплення високомолекулярних ЕПС на низькомолекулярні фрагменти), центрифугували, осад клітин тричі відмивали від залишків середовища та ЕПС і здійснювали ті ж самі операції, як і для штаму В-7005 (1НГ).

Ключові ферменти С2-метаболізму. Активність алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1) та ацетальдегіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4) визначали за присутності етанолу й ацетальдегіду відповідно за відновленням НАД+ і НАДФ+ при 340 нм. Активність ацетаткінази (КФ 2.7.2.1) і ацетил-КоА-синтетази (КФ 6.2.1.1) встановлювали за утворенням ацетилфосфату і ацетил-КоА відповідно, які при взаємодії з гідроксиламіном утворюють ацетилгідроксамат. Продукт реакції ацетилгідроксамату з хлорним залізом визначали спектрофотометрично при 540 нм.

Ферменти анаплеротичних реакцій. Активність ізоцитратліази (КФ 4.1.3.1) встановлювали за швидкістю утворення, а малатсинтази (КФ 4.1.3.2) - за швидкістю поглинання фенілгідразону гліоксилату при 324 нм. Активність піруваткарбоксилази (КФ 6.4.1.1) визначали за швидкістю утворення оксалоацетату і окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з малатдегідрогеназою.

Ферменти циклу трикарбонових кислот. Активність піруватдегідрогенази (КФ 1.2.2.2) визначали за присутності пірувату за відновленням НАД+ при 340 нм. Активність аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3) встановлювали за присутності цис-аконітату за відновленням НАДФ+ при 340 нм. Активність малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37) визначали за відновленням НАД+, а ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42) - за відновленням НАДФ+ при 340 за присутності малату і ізоцитрату відповідно. Активність 2-оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2) встановлювали за відновленням НАД+ при 340 нм за присутності 2-оксоглутарату та коензиму А. Активність сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.1) визначали за відновленням дихлорфеноліндофенолу за присутності феназинметасульфату при 600 нм. Активність фумарази (КФ 4.2.1.2) аналізували за утворенням фумарату з малату при 250 нм.

Ферменти глюконеогенезу. Активність фосфоенолпіруватсинтетази (КФ 2.7.9.2) аналізували за швидкістю утворення пірувату, яку визначали за окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з лактатдегідрогеназою. Активність ФЕП-синтетази аналізували також колориметрично за зниженням концентрації пірувату в реакційній суміші (реакція з динітрофенілгідразином) при 445 нм.

Активність ферментів (нмоль•хв-1мг-1 білка) у безклітинних екстрактах визна-чали при температурі 2830 оС, оптимальній для росту Acinetobacter sp. В-7005. Вміст білка в безклітинних екстрактах визначали за Brаdford.

Визначення швидкості окиснення субстратів інтактними клітинами. Швидкість окиснення субстратів інтактними клітинами штаму Acinetobacter sp.

В-7005 (1 НГ) встановлювали за швидкістю поглинання кисню у реакційній суміші полярографічним методом за допомогою електроду закритого типу на полярографі ППТ-1.

Дослідження реологічних властивостей розчинів етаполану. Реологічні властивості розчинів етаполану оцінювали за зміненням їх в'язкості за присутності 0,1 М КCl, при рН 44,5 (за умови переведення ЕПС в Н+-форму), у системі Cu2+-гліцин. В'язкість розчинів етаполану вимірювали на скляному капілярному віскозиметрі Оствальда при 20 С.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за Лакіним (1990) Достовірність результатів досліджень оцінювали згідно t-критерія Стьюдента при 5%-му рівні значущості.