Вдосконалення технології мікробного екзополісахариду етаполану на суміші ростових субстратів

20. Пирог Т.П. Особливості синтезу екзополісахариду етаполану на суміші енергетично дефіцитних С2-С6-субстратів / Т.П. Пирог, Н.В. Висятецька, Ю.В. Корж // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовтня 2006 р. - Харків, 2006. - C. 168-169.

21. Пирог Т.П. Синтез екзополісахариду етаполану на суміші енергетично дефіцитних С2С6-субстратів / Т.П. Пирог, Н.В. Висятецька, Ю.В. Корж // Мікробні біотехнології: наук. конф., 11-15 вересня 2005 р. - Одеса, 2005. - С. 203.

22. Висятецька Н.В.* Деякі закономірності синтезу мікробного полісахариду етаполану на суміші С4С6-сполук / Н.В. Висятецька, Т.П. Пирог // Молодь та поступ в біології: ІІІ Міжн. наук. конф., 2327 квітня 2007 р. - Львів, 2007. - C. 337-338.

23. Vysyatetskaya N.* Regulation of the metabolism under mixotrofic growth conditions of Acinetobacter sp. IMV B-7005 оn a mix of C2C6-compounds / N. Vysyatetskaya*, T. Pirog // Modern problems of Microbiology and Biotechnology: Int. conf. 2831 May, 2007 Odesa, 2007. - P. 115.

24. Пирог Т.П. Синтез экзополисахарида этаполана при культивировании Аcinetobacter sp. ИМВ В-7005 на смеси фумарата и глюкозы / Т.П. Пирог, Н.В. Высятецкая*, А.А. Иванушкина // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Межд. научн. конф., 26 июня 2008 г. Минск, 2008. - С. 221-223.

25. Пирог Т.П. Интенсификация синтеза экзополисахарида этаполана на смеси ростовых субстратов / Т.П. Пирог, Н.В. Высятецкая* // Биология: теория, практика, эксперимент: Межд. научн. конф., декабрь 2008 г. Саранск, Россия, 2008. С. 201204.

* прізвище Лащук змінювалось на Висятецька.

АНОТАЦІЯ

Лащук Н.В. Вдосконалення технології мікробного екзополісахариду етаполану на суміші ростових субстратів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Національний університет харчових технологій МОН України, Київ, 2008.

Дисертацію присвячено вдосконаленню технології мікробного екзополісахариду (ЕПС) етаполану (продуцент - Acinetobacter sp. В-7005) на суміші ростових субстратів.

Встановлено можливість усунення лімітування С2-метаболізму за умов росту продуцента на незабуференому середовищі з етанолом і глюкозою підвищенням у ньому концентрації активаторів ацетил-КоА-синтетази, використанням інокуляту, вирощеного на С2-сполуках, дробним внесенням субстратів. Показано, що глюкоза (енергетично дефіцитний субстрат) і етанол (енергетично надлишковий субстрат) можуть бути замінені на дешевші мелясу і фумарат, відповідно.

Вперше показано можливість інтенсифікації синтезу етаполану на суміші енергетично дефіцитних С2С6-субстратів (ацетат і глюкоза, ацетат і меляса) і розроблено технологію ЕПС, яка дає змогу (порівняно з вихідною) знизити витрати на сировину для одержання 1 кг етаполану у 3,5 раза. Розроблено технологічну і апаратурну схеми одержання трьох товарних форм етаполану, що відрізняються ступенем очищення ЕПС.

Ключові слова: екзополісахариди, вдосконалення технології, інтенсифікація синтезу, енергетично нерівноцінні субстрати, суміш субстратів.

Лащук Н.В. Усовершенствование технологии микробного экзополисахарида этаполана на смеси ростовых субстратов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Национальный университет пищевых технологий МОН Украины, Киев, 2008.

Диссертация посвящена усовершенствованию технологии микробного экзополисахарида (ЭПС) этаполана (продуцент Acinetobacter sp. В-7005 ) на смеси ростовых субстратов.

Показана возможность устранения лимитирования С2-метаболизма при выращивании Acinetobacter sp. В-7005 на смеси этанола и глюкозы. Культивирование бактерий на незабуференной среде с этанолом и глюкозой сопровождалось снижением рН до 5,64,7, обусловленным накоплением ацетата (2545 мМ), снижением концентрации биомасы и ЭПС. Уменьшение содержания нитратно-аммонийного источника азота в среде до 0,3 г/дм3 и замена его на нитратный, повышение концентрации пантотената кальция до 0,0009 %, катионов калия и магния до 100 и 510 мМ соответственно, использование посевного материала, выращенного на ацетате или этаноле, снижение начальной концентрации этанола и глюкозы до 0,250,5 % с последующим дробным их внесением порциями по 0,25 % в процессе культивирования бактерий дало возможность предупредить накопление ацетата в культуральной жидкости и реализовать без снижения показателей синтез этаполана на незабуференной среде.

Показана возможность замены глюкозы при культивировании Acinetobacter sp. В-7005 на смеси С2С6-соединений на более дешевый субстрат мелассу. Наиболее высокие показатели синтеза ЭПС наблюдались при условии кислотной обработки мелассы, наличии в среде факторов роста (дрожжевого автолизата и пантотената кальция), отсутствии минерального источника азотного питания и использовании посевного материала, выращенного на ацетате. В таких условиях культивирования бактерий на смеси этанола (0,75 % по объему) и мелассы (0,75 мас. % по углеводам) количество синтезированных ЭПС достигало 10 г/дм3, ЭПС-синтезирующая способность - 5 г ЭПС / г биомассы, виход ЭПС от субстрата - 74 %, что в 1,31,5 раза выше, чем при выращивании на мелассе. Увеличение синтеза ЭПС на мелассе, а также смеси этанола и мелассы при использовании инокулята, выращенного на С2-субстратах (по сравнению с применением посевного материала, полученного на среде с мелассой) обусловлено индукцией глюконеогенеза, о чем свидетельствовало снижение активности изоцитратдегидрогеназы, повышение активности ферментов глиоксилатного цикла и ключевого фермента глюконеогенеза фосфоенолпируватсинтетазы.

Установлена возможность интенсификации синтеза этаполана на смеси фумарата (энергетически избыточный субстрат) и глюкозы (энергетически дефицитный субстрат). Введение фумарата натрия (калия) в среду с глюкозой в молярном соотношении 4:1 дало возможность увеличить количество синтезированных ЭПС в 1,32,2 раза, их выход по отношению к биомассе - в 1,32 раза по сравнению с выращиванием на моносубстратах. Максимальная трансформация углерода обоих субстратов в ЭПС (до 53 %) наблюдалась при соотношении углерод/азот в среде культивирования, равном 70,5, и использовании посевного материала, выращенного на моносубстрате глюкозе.

Впервые показана возможность интенсификации синтеза этаполана на смеси энергетически дефицитных ростовых субстратов (ацетат+глюкоза). При росте бактерий на смешанном субстрате оба субстрата потребляются одновременно, причем ацетат поглощается путем активного транспорта с использованием энергии протондвижущей силы. При наличии ацетата натрия в смешанном субстрате активность ацетил-КоА-синтетазы и ключевого фермента глюконеогенеза фосфоенолпируватсинтетазы были более, чем в 10 раз, а показатели синтеза этаполана почти в 2 раза выше по сравнению с ацетатом калия. Эти результаты могут свидетельствовать об участии Na+ в создании ионных градиентов на мембране, необходимых для генерации энергии протондвижущей силы. Одновременное функционирование глиоксилатного цикла и пируваткарбоксилазной реакции, повышение активности изоцитратлиазы, малатсинтазы и фосфоенолпируватсинтетазы свидетельствуют об усилении глюконеогенеза и изменении направленности процессов биосинтеза на смеси ацетата и глюкозы в сторону образования углеводов по сравнению с выращиванием Acinetobacter sp. В-7005 на соответствующих моносубстратах.

На основе экспериментальных данных разработана технология получения этаполана на смеси ростовых субстратов, которая (по сравнению с исходной) имеет такие преимущества: 1) использование дешевых и технологичных субстратов (ацетат натрия и меласса вместо этанола и глюкозы, соответственно); 2) низкое содержание солей в среде культивирования (2,5 г/дм3); 3) высокий выход ЭПС от субстрата (до 7075 %); 4) получение этаполана в виде трех товарных форм (постферментационная культуральная жидкость, сухой неочищенный этаполан, сухой очищенный етаполан) в зависимости от области его применения. Разработанная технология дает возможность снизить в 3,5 раза стоимость сырья для получения 1 кг этаполана.

Технология синтеза этаполана на смеси ростовых субстратов защищена двумя патентами Украины на полезную модель (№ 19138, 2006 г.; № 25947, 2007 г.) и апробирована в опытно-промышленных условиях ОАО «Стиролбиотех».

Ключевые слова: экзополисахариды, усовершенствование технологии, интенсификация синтеза, энергетически неравноценные субстраты, смесь субстратов.

Lazchuk N.V. Improvement of microbial ethapolan exopolysaccharide technology on the mixture of growth substrates. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.20 - biotechnology. - National University of Food Technologies under the Ministry of Education and Science of Ukraine, Kiev, 2008.

The thesis is devoted to improvement of microbial ethapolan exopolysaccharide (EPS) (producer - Acinetobacter sp. B-7005) technology on the mixture of growth substrates.

The possibility to eliminate C2-metabolism limitation under cultivation of the producer on non-buffered medium with ethanol and glucose by increasing acetyl-CoA-synthetase activators concentration, by using inoculum grown on C2-compounds and by fractional substrates supply has been shown. It has been established that glucose (energy deficient substrate) and ethanol (energy excessive substrate) can be substituted with cheaper molasses and fumarate, respectively.

For the first time ability to intensify ethapolan synthesis on mixtures of energy deficient С2??С6-substrates (acetate and glucose, acetate and molasses) has been demonstrated as well as EPS technology has been developed, which allows (compared to the initial one) to reduce costs for raw materials to obtain 1 kg of ethapolan as much as three and a half times. Technological and equipment scheme has been developed in order to produce three forms of ethapolan, which differ in the degree of EPS purification.

Key words: exopolysaccharides, technology improvement, synthesis intensification, energy unequal substrates, substrates mixture.

Размещено на Allbest.ru