Дисертацією є рукопис.

Розділ 1. Актуальні проблеми створення парентеральних лікарських засобів на основі глутамінової кислоти

Аналіз літературних даних за результатами численних рандомізованих клінічних досліджень показав, що суміш калію та магнію з глутаміновою кислотою виявляє більш виражений фармакологічний ефект у порівнянні з індивідуальним застосуванням металів або глутамінової кислоти, а також аналогічними солями аспарагінової кислоти. Крім того, калієва і магнієва солі глутамінової кислоти не мають тератогенних, мутагенних, канцерогенних, ембріотоксичних властивостей, не виявляють алергізуючого та імунотоксичного впливу на організм. Сорбітол є енергетичним компонентом, має виражені фармакотерапевтичні ефекти, підвищує фармакокінетичні характеристики лікарських форм, до складу яких він входить, а також при його застосуванні не виникає гіперглікемічний ацидоз, який зустрічається у випадках інфузійного введення глюкози. Існуючий взаємозв'язок метаболізму магнію і калію, а також роль цих іонів у механізмі збудження і скорочення міокарда обумовили доцільність комбінованого застосування препаратів калієвої і магнієвої солей глутамінової кислоти у терапії серцево-судинних захворювань.

На підставі вивчення даних літературних джерел встановлено, що вітчизняна фармацевтична промисловість не задовольняє потреби системи охорони здоров'я у препаратах, що є переносниками іонів та сприяють покращенню метаболізму в організмі людини. При всій необхідності та актуальності розвитку досліджень у визначеному напрямку виникають проблеми фармацевтичного характеру. Зокрема, відсутня стабільна при зберіганні субстанція калію глутамінату, не вивчено вплив інших важливих інгредієнтів на процес солеутворення калію глутамінату. Зважаючи на це, показана важливість розробки терапевтично активного складу та технологічних параметрів парентерального розчину, що містить іони калію, магнію, глутамінату, сульфату і сорбітол під умовною назвою „Каглутамагол”.

Проаналізовано вплив різноманітних чинників (температури, кисню, режимів стерилізації, багатокомпонентності розчину) на процеси розкладу парентеральних розчинів. Показано, що для стабілізації даної лікарської форми можуть бути використані ряд методів, зокрема, корекція режиму стерилізації, обґрунтований підбір та введення до складу препарату стабілізаторів, застосування газового захисту. Проведений аналіз літературних джерел показав, що на якість парентеральних розчинів впливають також таро-закупорювальні засоби (марка скла флаконів чи ампул, гума корків, полімерні матеріали) та правильний підбір вторинного пакування, що захищає готову лікарські форму від негативного впливу навколишнього середовища. Проте в доступній літературі ми не знайшли результатів всебічного вивчення процесів розкладу, стабілізації і технології виготовлення розчинів для парентерального введення, що містять неорганічні компоненти у поєднанні з амінокислотами та енергетичним субстратом, яким є сорбітол, а також стабільності зазначених парентеральних розчинів при тривалому зберіганні у скляній тарі, виготовленій з різних марок скла. Відсутність таких даних потребує проведення всебічного наукового пошуку оптимальної технології створення вітчизняного лікарського засобу для парентерального введення на основі глутамінової кислоти з основними життєво необхідними катіонами та енергетичним компонентом.

Розділ 2. Об'єкти та методи дослідження

При розробці парентерального лікарського засобу під умовною назвою «Каглутамагол» були враховані основні вимоги, що висуваються до лікарської форми та технологічних процесів, а саме:

- стабільність, стерильність, пірогенність, аномальна токсичність та відсутність механічних включень;

- оптимальність, надійність та відтворюваність технологічного процесу;

- можливість використання типового технологічного оснащення, яким забезпечені підприємства вітчизняної фармацевтичної галузі.

Забезпечення системного та всебічного виконання основних вимог до якості парентеральних розчинів дозволить отримати лікарський засіб з очікуваними фізико-хімічними та терапевтичними властивостями. Для вирішення поставлених завдань наукового пошуку нами розроблена програма дослідження, що складається з таких етапів:

- обґрунтування складу комбінованого лікарського засобу, що містить іони калію, магнію, глутамінату, сульфату і сорбітол, прогнозування її фармакотерапевтичної дії;

- вибір оптимальної концентрації діючих і допоміжних речовин;

- проведення комплексних фізико-хімічних, технологічних та біологічних досліджень парентерального розчину;

- розробка основних критеріїв та методик контролю якості запропонованого препарату; створення проекту аналітичної нормативної документації;

- розробка складу і раціональної технології виготовлення досліджуваного лікарського засобу;

- визначення стабільності і терміну придатності парентерального розчину;

- проведення фармакокінетичних досліджень.

Виконання запропонованої нами програми досліджень передбачало визначення оптимальної концентрації діючих і допоміжних речовин, а також обґрунтування раціональної технології його виробництва і стандартизацію готового лікарського засобу. Обрана тактика проведення наукових досліджень забезпечила отримання високоефективного, безпечного та якісного лікарського засобу.

З метою оцінки якості досліджуваного парентерального розчину нами використовувалися загальноприйняті методи аналізу, що були адаптовані для даного лікарського засобу. Ідентифікацію іонів калію та магнію проводили за вимогами Державної фармакопеї України (ДФУ). Для ідентифікації кислоти глутамінової використовувався метод тонкошарової хроматографії по реакції з нінгідрином, сорбітолу - за реакцією з реактивом Неслера. Для кількісного визначення калію глутамінату використовувався метод алкаліметрії за вільною карбоксильною групою шляхом титрування розчином натрію гідроксиду, іонів магнію - метод комплексонометрії, сорбітолу - метод рефрактометрії. Органолептичний метод застосовувався з метою визначення прозорості, ступеня забарвлення та номінального об'єму розчину, а також для контролю на відсутність механічних включень. Потенціометричний метод використаний для визначення рН розчину. Осмолярність досліджуваного розчину визначалася за вимогами ДФУ. За допомогою фармакопейних біологічних методів проведено визначення стерильності, пірогенності та аномальної токсичності парентерального розчину в ампулах і флаконах. Метод атомно-абсорбційної спектрометрії застосовувався для визначення іонів магнію у плазмі та еритроцитах кроликів; метод атомно-емісійної спектрометрії - для визначення іонів калію у плазмі та еритроцитах кроликів.

Статистичну обробку отриманих результатів досліджень проводили згідно з вимогами ДФУ за допомогою методів математичної статистики.

Розділ 3. Дослідження впливу основних технологічних чинників на стабільність парентерального розчину «Каглутамагол»

Склад парентеральної лікарської форми, що розроблялася, був визначений соціальним замовленням Інституту геронтології АМН України та кафедрою анестезіології та інтенсивної терапії НМАПО імені П.Л. Шупика. Він містить 5% розчин калію глутамінату, з додаванням 3,0 г магнію сульфату та 5,0 г сорбітолу у 100 мл готового розчину. У результаті експерименту встановлена оптимальна кількість кислоти глутамінової і калію гідроксиду з метою отримання однозаміщеної солі та досягнення рН 6,5-8,0. Експериментально доведено, що магнію сульфат і сорбітол практично не впливають на реакцію середовища як до теплової стерилізації, так і після неї. рН отриманого розчину до стерилізації становив 7,2, після стерилізації - 7,3, але змінювались показники світлопропускання і ступеня забарвлення.

В подальшому проводилось вивчення кінетики розкладу парентерального лікарського засобу «Каглутамагол» для встановлення закономірностей зміни фізико-хімічних параметрів з метою використання цих даних при розробці технології виготовлення. У результаті вивчення кінетики розкладу визначені константа зміни світлопропускання, період напіврозкладу та енергія активації і встановлено, що зміна світлопропускання досліджуваного розчину проходить за рівнянням першого порядку. Визначення параметрів кінетики розкладу показало, що температура і кисень повітря впливають на руйнування розчину «Каглутамагол». Тому в подальших технологічних експериментах вивчався вплив різних газових фаз, температури і антиоксидантів на стабільність розчину «Каглутамагол».

Оскільки до складу розчину входить амінокислота і сорбітол, які піддаються розкладу під дією температури і кисню повітря, при розробці технології на стадії приготування використовували газовий захист і антиоксиданти. Для вивчення впливу газової фази на хімічну стабільність розчину «Каглутамагол» були виготовлені дві серії цього розчину. Перша серія виготовлялась в середовищі атмосферного повітря, друга - в присутності вуглекислого газу. Розчини піддавали тепловій стерилізації. У результаті експерименту встановлено, що серія, яка виготовлена у середовищі вуглекислого газу, менше піддавалася розкладу під дією температури. Проте, використання газового захисту не дозволяє повністю загальмувати термодеструкцію розчину, що пояснюється неповним видаленням кисню з розчину. Тому виникла необхідність у введенні до складу створеного парентерального розчину антиоксиданту. У своїх дослідженнях для запобігання окисненню калію глутамінату та сорбітолу в розчині використовувалися сполуки, що містять сірку (натрію метабісульфіт, натрію сульфіт), а також динатрію едетат. За результатами вивчення фізико-хімічних показників парентерального розчину «Каглутамагол» встановлено, що найкращим антиоксидантом є натрію сульфіт. Для визначення оптимальної концентрації антиоксиданту проводилось вивчення комплексного впливу натрію сульфіту та газової фази. З цією метою виготовлявся ряд серій парентерального розчину. Перша, друга серії були виготовлені без натрію сульфіту, третя-восьма - з додаванням 0,08, 0,1 та 0,12% натрію сульфіту. Перша, третя, п'ята та сьома серії розливались у середовищі повітря, інші чотири - у середовищі вуглекислого газу. Після чого кожна серія піддавалася стерилізації.

Критеріями якості до і після стерилізації були такі показники: забарвлення, запах, рН розчину, коефіцієнт світлопропускання. Ступінь забарвлення і запах визначали органолептично. Результати досліджень наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Фізико-хімічні показники парентерального розчину «Каглутамагол» залежно від виду газової фази і наявності антиоксиданту

Примітка. Кількість вимірів n=5, Р=95%.

За органолептичними властивостями всі розчини до стерилізації були прозорі, безбарвні або з ледь помітним жовтуватим забарвленням і без запаху. Розчини, що були виготовлені у середовищі повітря без стабілізатора, після стерилізації набували жовтого забарвлення і специфічного запаху. Найбільша зміна світлопропускання спостерігалася у першій та третій серіях при обраному режимі стерилізації. Серед розчинів, які були виготовлені без додавання антиоксиданту, найменша зміна фізико-хімічних показників під час стерилізації відбувалася при використанні вуглекислого газу. Розчини четвертої, п'ятої, шостої, сьомої та восьмої серій після стерилізації залишалися прозорими і безбарвними. Світлопропускання розчинів цих серій становило 99,5-100% і практично не залежало від складу газової фази. Коливання значень рН у всіх досліджуваних серіях не перевищувало 0,2 одиниці, тому даний показник не є визначальним у оцінці якості досліджуваних серій.

Мінімальна зміна критеріїв якості спостерігалася при використанні антиоксиданту натрію сульфіту в концентрації від 0,1% навіть без газового захисту. Однак, для вивчення хімічної стабільності розчину «Каглутамагол» та оцінки ефективності способу приготування цього розчину в середовищі повітря та вуглекислого газу ми використовували зберігання при підвищених температурах. За експериментальними даними встановлено, що використання газового захисту не дає суттєвого підвищення фізико-хімічної стабільності розчину «Каглутамагол». Таким чином, натрію сульфіт в концентрації 0,1% має виражений стабілізуючий ефект навіть без вуглекислого газу, а різниця у показниках світлопропускання з розчином, що був виготовлений з використанням газового захисту, становить лише 0,2% і рН розчину знаходиться в межах допустимого діапазону. Це дає можливість приготувати розчин як в умовах підприємств фармацевтичної промисловості, так і аптек, де відсутня можливість виготовлення у середовищі інертних газів.

З метою розробки науково обґрунтованої технології розчину для парентерального застосування ми вивчали стабільність даної лікарської форми залежно від режиму стерилізації. Критеріями якості розчину до і після стерилізації були фізико-хімічні (забарвлення, запах, рН розчину, світлопропускання) та біологічні (стерильність) показники. Результати вивчення режиму стерилізації препарату представлені в табл. 2.

Таблиця 2

Вплив режиму стерилізації на фізико-хімічні показники парентерального розчину «Каглутамагол»

Примітка. Кількість вимірів n=5, Р=95%.

Як видно з даних табл. 2, розчини обох серій були безбарвні і без запаху, у них майже не відбувалася зміна рН середовища. Основні фізико-хімічні показники розчинів при обох режимах стерилізації статистично не відрізнялися між собою (Р=95%). Таким чином, усі досліджені режими придатні для стерилізації парентерального лікарського засобу. Проте необхідно враховувати, що найбільш вживаним і найменш затратним за часом є фармакопейний метод стерилізації при 121 ^оС протягом 8 хвилин. Тому нами обрана термічна стерилізація препарату в первинному пакуванні, що відповідає вимогам ДФУ.

Одним із джерел нестабільності розчинів та механічних забруднень може бути таро-закупорювальний матеріал, а саме флакони чи ампули, корки, особливо після стерилізації. Тому нами були проведені дослідження впливу скла флаконів та ампул різних марок вітчизняного і зарубіжного виробництва на якість отриманого парентерального розчину. При цьому досліджувалося скло таких марок: УСП-1 (Полтавський завод медичного скла), НС-1, НС-2 (Росія) - для флаконів; УСП-1, НС-1 і НС-3 - для ампул. При вивченні впливу скла флаконів на якість і стабільність парентерального розчину «Каглутамагол» за допомогою методик «прискореного старіння» встановлено, що найбільш стабільним був розчин, який зберігався у флаконах, виготовлених зі скла марки НС-2. У ньому визначена найменша константа швидкості реакції (1,5041*10^-8 сек^-1) і, відповідно, найбільший період напіврозпаду (4,607*10⁷ сек). Найменш стабільним розчином став розчин, виготовлений у флаконах зі скла марки НС-1. Його константа швидкості реакції майже у два рази вища, а період напіврозпаду у 1,85 рази менший, ніж у розчині із флаконів зі скла марки НС-2.

Найкращі показники якості і стабільності досліджуваного розчину в ампулах були зафіксовані у тарі зі скла марки НС-3. В даному розчині спостерігалася найменша константа швидкості реакції (3,8977*10^-9 сек^-1) і, відповідно, найбільший період напіврозпаду (1,778*10⁸ сек). Найменш стабільним розчином став розчин, виготовлений в ампулах зі скла марки НС-1. Його константа швидкості реакції більш ніж у чотири рази вища, а період напіврозпаду у 3,9 рази менший, ніж у розчині із ампул зі скла марки НС-3. Таким чином, у результаті експериментальних досліджень визначено, що найбільш придатною тарою для виготовлення парентерального розчину «Каглутамагол» є флакони зі скла марки НС-2 і ампули зі скла марки НС-3.

Нами було також проведено визначення осмолярності парентерального розчину «Каглутамагол» згідно з вимогами ДФУ. Теоретична осмолярність була розрахована за концентрацією основних інгредієнтів, кількістю часток, що дисоціюють, а також з урахуванням їх молекулярних мас. Практичне визначення осмолярності проводили кріоскопічним методом за допомогою автоматичного цифрового осмометра ОМКА-1Ц-01 (Росія).

Розділ 4. Розробка науково обґрунтованої технології та встановлення термінів придатності досліджуваного розчину

Відповідно до сучасних вимог випробовування на світлостабільність є обов'язковою частиною визначення оптимальної технології виготовлення та умов зберігання парентеральних розчинів. Дослідження готової лікарської форми «Каглутамагол» проводили на серіях препарату, що знаходився під дією прямого сонячного світла у первинному пакуванні (ампулах та флаконах), потім у вторинному пакуванні (картонних коробках) (табл. 3).

Таблиця 3

Зміни фізико-хімічних показників розчину «Каглутамагол» при дії прямого сонячного опромінення (n=5, Р=95%)

Примітка: І. 1 - розчин у первинному пакуванні (флакони); 2 - розчин у первинному пакуванні (ампули); 3 - розчин у вторинному пакуванні (флакони); 4 - розчин у вторинному пакуванні (ампули). ІІ. (+) - прозорий; (-) - наявність опалесценції в розчині.

З даних табл. 3 видно, що світло каталізує руйнування досліджуваного розчину у первинному пакуванні, що виявляється в зміні ступеня забарвлення розчину і зниженні показника світлопропускання. Це свідчить про більший розклад опроміненого розчину на відміну від захищених від дії світла лікарських форм (серія 3, 4 - константа швидкості розкладу 9,0519*10^-9 і 6,2618*10^-9 сек^-1). Відповідно, період напіврозпаду у розчинах серії 3 і 4, які були захищені від впливу сонячного опромінення картонною тарою, становив 7,6558*10⁷ сек. та 11,0672*10⁷ сек. У лікарських формах, що зазнали сонячного опромінення без використання захисту, розрахований період напіврозпаду був у 21-25 разів менший у порівнянні з найбільш стабільним розчином «Каглутамагол» у ампулах, захищених картонною тарою. Таким чином, якість препарату у вторинному пакуванні практично не змінюється, що вимагає включення до технологічного процесу стадії пакування готових лікарських форм у картонну тару і зберігання у захищеному від світла місці.

Важливим показником безпеки парентеральних лікарських засобів є відсутність механічних включень, видимих неозброєним оком, що досягається за допомогою методу фільтрації. З метою встановлення взаємного впливу та сумісності розчину «Каглутамагол» і фільтруючих матеріалів нами було проведено вивчення фільтрів, що випускаються вітчизняними і зарубіжними виробниками. При цьому використовувалося чотири групи фільтрів: на основі нейлону (виробництво фірми «Pall»), на основі нітрату целюлози та суміші ацетату і нітрату целюлози (виробництво фірм «Millipore», «MS Sartourius»), а також на основі капрону (виробництво фірм «Міфіл») з розміром пор від 0,45 до 1,0 мкм для проведення попередньої фільтрації і 0,2 мкм для проведення фінішної фільтрації. У результаті проведених досліджень встановлено, що при контакті з усіма зазначеними вище фільтруючими матеріалами не спостерігалося погіршення якості препарату. Крім того, матеріали цих типів фільтрів відповідають досліджуваному розчину за діапазоном рН, витримують термічну стерилізацію та не призводять до забруднення готового розчину сторонніми частками.

На підставі проведених технологічних, фармако-технологічних, хімічних, фізико-хімічних і біологічних досліджень були встановлені показники якості парентерального розчину та внесені до проекту аналітичної нормативної документації (АНД) і технологічного регламенту. Допустимі межі та методики їх контролю відповідали вимогам ДФУ або Європейської Фармакопеї. Проект АНД на досліджуваний розчин включав такі розділи: «Склад», «Специфікація» (опис; ідентифікація; прозорість; ступінь забарвлення; механічні включення; рН; речовини, що виявляються нінгідрином; об'єм, що витягається; стерильність; пірогенність; аномальна токсичність; кількісне визначення), «Термін зберігання», «Умови зберігання».

На основі проведених досліджень щодо вибору оптимального складу розчину «Каглутамагол», його режиму стерилізації, даних по вивченню кінетичних процесів розкладу та стабільності парентерального розчину нами була розроблена технологічна схема виготовлення досліджуваного розчину, що відповідає вимогам Настанови 42-01-2003 (рис. 1).

Запропонована технологія виготовлення парентерального розчину «Каглутамагол» в умовах аптеки практично не відрізняється від промислового виробництва. Але більш придатною первинною тарою для виготовлення розчину «Каглутамагол» в умовах аптеки є флакони зі скла марки НС-2. Крім того, відмічена обмеженість використання інструментальних методів аналізу і біологічних випробовувань якості кінцевого продукту.

Згідно розробленого нами складу та технологічної схеми виготовлення розчину для парентерального застосування було досліджено промислові серії розчинів з метою встановлення їх терміну придатності при основних режимах зберігання, що регламентовані ДФУ. Аналіз закладених на зберігання зразків препарату здійснювали за показниками розробленого проекту АНД, зазначеного вище. Через кожні 3 місяці визначали фізико-хімічні показники (опис, прозорість, кольоровість, світлопропускання, рН розчину, ідентифікація, механічні включення, кількісний вміст діючих речовин), а біологічні - через шість місяців. Встановлено, що при вказаних умовах зберігання усі серії досліджуваних розчинів мали стабільні фізико-хімічні характеристики відповідно до проекту АНД. Препарат дає чітко позитивні реакції ідентифікації. рН, прозорість, ступінь забарвлення, світлопропускання знаходяться в межах норм допустимих відхилень.

Кількісний вміст діючих речовин знаходиться у межах помилки виміру протягом не менше, ніж 2 років зберігання. Відповідно, досліджувані розчини можуть зберігатися при звичайних температурних умовах без критичного зниження основних фізико-хімічних та біологічних показників протягом визначеного терміну зберігання.