Разработка методологии и технологии создания лечебных текстильных и гидрогелевых аппликаций для направленной местной доставки лекарств при лучевой терапии онкологических заболеваний (теория и практика)

В некоторых случаях при длительном использовании текстильных салфеток (до 24 часов), в связи с тем, что массоперенос лекарственных препаратов происходит лишь во влажном состоянии, возникает задача их дополнительного увлажнения. Для определения условий эксплуатации салфеток нами были проведены эксперименты по исследованию зависимости скорости массопереноса 5-фторурацила, десорбирующего из лечебной аппликации в коллагеновую мембрану - из текстильного материала, который дополнительно увлажняли, в некоторых - закрывали пленкой для предотвращения высыхания. Затем определяли константу массопереноса 5-фторурацила в модель кожи (табл.1). Полученные результаты влияют на методику использования салфетки, т.е. при наложении текстильной аппликации, если она высохла, требуется дополнительно ее увлажнение.

Таблица 1.

Влияние дополнительного смачивания аппликаций на массоперенос 5-фторурацила из текстильного материала в многослойную коллагеновую мембрану, Т=30 мин

Как уже говорилось, массоперенос ЛП из салфетки во внешнюю среду изучали вначале при моделировании внешней среды водой и другими жидкостями (например, физиологический раствор, раствор липовенозы), коллагеновыми мембранами, затем - биологическими тканями (опытные животные) и далее - проводили клинические испытания на пациентах (по разрешению Минздравсоцразвития). Изучение массопереноса ЛП 5-ФУ из текстильных аппликаций в опухоли различного гистогенеза, перевитые опытным животным (мышам, крысам), подтвердили возможность направленной доставки ЛП из текстильной аппликации в опухоли, о чем можно судить по эффективности действия цитостатика (наблюдалась регрессия опухоли). Следовательно, препарат диффундирует направленно к клеткам опухоли и под действием фермента тимидинфосфорилазы, содержащегося в них, за счет превращений образуется метаболит 5-ФУ с цитостатическими свойствами. Исследуемые салфетки не вызывали у животных- опухоленосителей сколько-нибудь серьезных проявлений местного или общего токсического эффекта. Эти данные показали правильность и целесообразность создания текстильных аппликаций с импрегнированным ЛП 5-фторурацилом для местной направленной доставки ЛП к опухолевой ткани, что затем было подтверждено результатами клинических испытаний, проведенными в ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена, РОНЦ им. Н.Н.Блохина, МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского и других онкологических клиниках. Длительные исследования показали их эффективность при лечении опухолей на различных стадиях, удобство применения. Технология создания салфеток «Колетекс», позволяющая вводить высокие дозы препарата - цитостатика и обеспечивающая достижение эффекта пролонгации массопереноса лекарства во внешнюю среду (поврежденные ткани, опухоль) позволила получить эффект регрессии опухоли при сохранении качества жизни пациентов, возможность использования подобного лечения в амбулаторных условиях, в перерывах между сеансами лучевой терапии.

После проведения лабораторных экспериментов, позволивших выбрать текстильную основу для салфетки с 5-ФУ, концентрации препарата и полимера, был разработан окончательный технологический регламент получения текстильных салфеток с 5-ФУ и разработаны и утверждены технические условия на изделие медицинского назначения - салфетки «Колетекс» с 5-фторурацилом (торговое название «Колетекс - 5-Фтур» ТУ 9393-007-58223785-2005, согласованные далее в ФГУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора и получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на производство, продажу и применение на территории Российской Федерации салфеток «Колетекс-5-фтур» с 5-фторурацилом (РУ № ФСР 2009/06167), а затем сертификат соответствия (РОСС RU.ИМ08.В09594). На основании проведенных клинических испытаний разработаны и утверждены Министерством Здравоохранения Московской Области рекомендации для врачей (пособия) «Аппликационное применение 5 - фторурацила при лучевой терапии местнораспространенных форм злокачественных новообразований» и «Лучевое лечение злокачественных опухолей кожи».

Для лечения внутриполостных новообразований, когда аппликационное подведение препаратов с помощью текстильных салфеток не пригодно (например, в гортани, в прямой и толстой кишке, в гинекологии и т.д.), по рекомендации медиков в качестве самостоятельного лечебного средства было решено использовать печатную гидрогелевую композицию, которая раньше применялась для нанесения на текстильный материал. При таком использовании гидрогелевой печатной композиции с 5-фторурацилом к ней предъявляются специфические технологические и медицинские требования. Исходя из приведенных нами совместно с врачами экспериментов, предложено готовить полимерную основу с тиксотропностью 75-98% (информация о значении данной реологической характеристики представлена выше) и вязкостью 2,4 - 12,0 Па·с (в зависимости от области введения - проктология, урология, гинекология и др.). Выбранные реологические характеристики композиции при адресной доставке ЛП позволяют существенно снизить вводимую больным концентрацию лекарств по сравнению со стандартными (перорально, инъекционно) методами подведения, т.к. в этом случае композиция вводится направленно и располагается локально по отношению к очагу поражения (опухоль, прилежащие ткани). Эксперименты, проведенные совместно с врачами ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, а затем анализ большого количества композиций с одинаковой концентрацией лекарственного препарата, но с различной вязкостью (за счет различного процентного содержания полимера - загустителя) позволили подобрать требуемую по технологическим и медицинским показаниям вязкость, которая достигается при введении необходимой концентрации полимера альгината натрия. В дальнейшем, при использовании вновь поступающих на производство партий природного продукта альгината, вязкость композиции подбиралась экспериментально под ранее одобренный врачами вариант, а именно 2,6 Па•с, и контролировалась на специально созданном нами приборе, имитирующем нагрузку при введении композиции в полости через шприц Жане. Созданный гидрогелевый материал с 5-фторурацилом (торговое название «Колегель» с 5-фторурацилом) прошел токсикологические и технические испытания. Их положительные результаты позволили провести исследования по применению гидрогелевой композиции у больных, имеющих злокачественные опухоли, расположенные в полости, в частности, в прямой кишке. Эффективность разработанного гидрогелевого материала с 5-фторурацилом оценивалась по возможности его накопления в опухолевых тканях в заранее известной по медицинским показаниям эффективной для лечения концентрации, которой нам следовало добиться при использовании гидрогелевой композиции при лечении больных раком прямой кишки в отделении проктологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Параллельно спектрофотометрически для сравнения соответствия концентрации ЛП в опухоли при различных способах введения по специально разработанной совместно с НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН методике, учитывающей содержание урацила в здоровых тканях, нами оценивалась концентрация 5-фторурацила в опухолевых тканях пациентов, получавших препарат стандартными способами - перорально (таблетки «Кселода») или инъекционно. В качестве примера в табл. 2 приведены значения концентраций препарата, извлеченного из биопробы для 6-ти онкологических больных в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Таблица 2.

Концентрация 5-фторурацила в опухолевых тканях, мкг/мл

Исследовались образцы опухолевых тканей, удаленные во время операции. Из данных таблицы 2, следует, что происходит массоперенос ЛП из гидрогелевой композиции в биологические ткани, и концентрация 5-фторурацила в опухолевых тканях при введении препарата с помощью гидрогелевой композиции сопоставима с концентрацией лекарства, вводимого стандартными способами (перорально в виде Кселоды и инфузно), вызывающими снижение качества жизни пациентов за счет нарастания токсичности (изменение показателей крови, тошнота, рвота и т.д.). Различия в значениях связаны со структурой и расположением опухоли, возрастом и состоянием пациента и т.д. Данное исследование доказало, что в опухолевых тканях происходит накопление ЛП и это открывает возможности применения гелевой композиции с 5-фторурацилом и как с цитостатиком, и как с радиомодификатором для эффективного менее токсичного лечения онкологических больных методом лучевой терапии.

Результаты клинических испытаний подтвердили, что предложенный способ введения 5-фторурацила эффективен: в опухоли достигается необходимая по медицинским показаниям концентрация 5-фторурацила и, в отличии от стандартных способов введения ЛП, не страдают от токсического действия цитостатика внутренние органы человека (желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), почки, и т.д.). После проведения экспериментов, был разработан технологический регламент получения гидрогелевых аппликаций с 5-ФУ и разработаны и утверждены технические условия, получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на производство, продажу и применение на территории Российской Федерации гидрогелевых салфеток «Колетекс-5-фтур» с 5-фторурацилом, а затем сертификат соответствия.

Раздел 2.3 главы 2 посвящен разработке аппликационных текстильных и полимерных материалов с радиосенсибилизирующими свойствами с электронно-акцепторным соединением (ЭАС) метронидазолом (МЗ) ((1-(-Оксиэтил)-2-метил-5-нитроимидазол). Имитируя действие кислорода, но при этом медленно метаболизируясь, ЭАС диффундирует во все участки опухоли, в т.ч. лишенные кровеносных сосудов (это специфика опухолевых тканей), проникает в более отдаленные гипоксические (обедненные кислородом) зоны, что приводит при облучении к образованию свободных радикалов и синглетного кислорода, которые разрушают опухолевые клетки.

Из литературных данных и совместной работы с клиницистами было известно, что для получения необходимого эффекта концентрация метронидазола в опухолевых тканях должна составлять не менее 150-200 мкг/г. Эти значения могут быть превышены (в опухоли), однако они не должны быть превышены в крови (и моче), иначе пациент окажется под токсическим воздействием данного препарата. Важно, в течение какого времени будет сохраняться требуемая концентрация; это время связано с возможностью проведения лучевой терапии и во многом определяет методики проведения облучения. Требуемая концентрация лекарства может быть достигнута при пероральном приеме больным до 40-60 таблеток препарата, что очень тяжело переносится за счет возникающей токсичности, вызывает необходимость использовать противорвотные средства, снижает качество жизни пациента, приводит к высокой концентрации препарата в крови (до 50%). При создании аппликационных лечебных материалов с препаратом радиосенсибилизатором МЗ и разработки технологии изготовления композиции с этим препаратом было необходимо определить концентрацию компонентов в композиции, наносимой на текстильный материал и, в частности, метронидазола, обеспечивающую в дальнейшем необходимую для эффективного лечения концентрацию лекарственного препарата в очаге поражения. Выбор концентрации препарата (препаратов) обусловлен следующими параметрами: разрешенной для использования дозой, рекомендованной по медицинским показаниям, токсикологическими испытаниями, медико-биологическими испытаниями, экспериментальными данными, полученными в клинике при проведении испытаний. В работе решалась задача: определить (подобрать) такую концентрацию лекарственного препарата в текстильном материале, чтобы при определенном времени наложения салфетки (так называемое время экспозиции) в опухолевых тканях была достигнута требуемая концентрация (не менее 150 - 200 мкг/г) и чтобы она сохранялась в течение нужного времени, т.е. чтобы опухоль была «подготовлена» к облучению и раковые клетки находились в наиболее подверженном гибели состоянии. В процессе работы были оценены эти параметры. Для определения эффективности использования текстильных салфеток с МЗ в качестве радиосенсибилизатора проводилась оценка скорости массопереноса лекарства из салфетки во внешнюю среду, т.е. скорость десорбции препарата в очаг поражения и факторов, влияющих на этот показатель (свойства текстильного материала, выбор полимеров и т.д.).

При изучении массопереноса МЗ из текстильной аппликации в кожу и в более глубокие области опухоли для экспериментальной оценки скорости диффузии ЛП была использована методика коллагеновых мембран. Так как метронидазол малорастворимый препарат, в лечебную композицию с МЗ, наносимую на текстильный материал для создания салфетки, дополнительно был введен диметилсульфоксид (ДМСО), способствующий проникновению некоторых веществ (лекарственных препаратов, БАВ) в кожу. При оценке скорости диффузии ЛП за различные промежутки времени, составляющие мембрану пленки разделялись на отдельные слои. Эксперименты подтвердили, что при введении ДМСО в полимерную композицию с МЗ (в концентрации 2 масс.%), массоперенос МЗ в опухолевые ткани увеличивался на 15 - 20% (рис. 8).

Рис. 8. Массоперенос метронидазола в модельную среду (коллагеновая мембрана) из текстильной салфетки в присутствии ДМСО и без него. Текстильный материал - трикотажное полотно ПФ-2, полимер-загуститель - альгинат натрия, печать через сетчатый шаблон 20 меш.

Из диаграммы, представленной на рис. 9 следует, что за 24 часа метронидазол (концентрация ЛП на салфетке составляла 10 мг/см2 ) доходит до 20 слоя мембраны (~ 1,4 см), а через 36 часов - до 25 слоя мембраны (~ 1,75 см). Это свидетельствует о том, что он принципиально способен проникать даже в неповрежденную кожу и накапливаться в опухоли, что в дальнейшем подтвердилось при проведении медико-биологических испытаний (рис.10), когда у больных после аппликации текстильной салфетки с МЗ врачами удалялись опухолевые ткани, в которых нами определялась концентрация ЛП.

Рис. 9. Массоперенос метронидазола в модельную среду (коллагеновая мембрана). Текстильный материал - трикотажное полотно ПФ-2, полимер-загуститель - альгинат натрия, печать через сетчатый шаблон 20 меш.

Из данных, приведенных на рис.10, видно, что при подведении МЗ в аппликационной форме (с помощью разработанных нами текстильных аппликаций), он накапливается в опухолевых тканях до концентрации, достаточной для проявления сенсибилизирующего эффекта (688 мкг/г), а в сыворотке крови наблюдаются небольшое содержание препарата, что не способствует разносу токсичного лекарства по организму.

Рис. 10 . Концентрация метронидазола в опухоли (плоскоклеточный рак языка III - IV ст.) и сыворотке крови в зависимости от способа введения 1- per os (таблетки); 2 - внутриопухолевый (инъекционный); 3 - аппликационный с помощью салфеток «Колетекс» с метронидазолом

При использовании МЗ в виде таблеток (традиционная методика) ЛП определяется в сыворотке крови даже в большей степени, чем в опухолевых клетках. При инъекционном введении препарата непосредственно в очаг поражения в начальный момент времени концентрации МЗ сопоставимы с концентрациями при аппликационном введении, но уже через 30 - 60 мин. препарат из опухоли выходит и переходит в кровоток, что не позволяет добиться пролонгации в содержании МЗ и в течении длительного времени проводить сеанс лучевой терапии. Важно, что концентрация ЛП поступает из текстильного материала и удерживается в опухолевых тканях пролонгированно до 3-х дней после наложения аппликации (через 3 суток концентрация МЗ 274 мкг/г), что позволяет упростить методику облучения больного. При инъекционном и пероральном введении этот эффект не достижим.

После разработки технологического регламента получения текстильных салфеток «Колетекс» с метронидазолом и проведения всех испытаний были разработаны и утверждены технические условия на изделие медицинского назначения - салфетки «Колетекс» с метронидазолом (торговое название «Колетекс-М» ТУ 9393-009-58223785-2005), согласованные далее в ФГУ «ВНИИИМТ» Росздравнадзора и получено разрешение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на производство, продажу и применение на территории Российской Федерации салфеток «Колетекс-М» с метронидазолом (РУ № ФСР 2008/03047), а затем сертификат соответствия (РОСС RU. ИМ08.В09486).

Как и в случае с лекарственным препаратом 5-фторурацилом, для введения метронидазола в полости было предложено использовать печатную композицию, которая раньше применялась для нанесения на текстильный материал по технологии печати. В основе композиции - гидрофильный гель на основе биополимера-полисахарида альгината натрия и лекарственный препарат - сенсибилизатор метронидазол. При нанесении на кожу или слизистую салфетки или геля с изучаемым препаратом (концентрация одинакова) массоперенос лекарства из геля происходит быстрее и в большей степени, т.к. отсутствует затормаживающее действие текстильного материала по отношению к препарату, находящемуся в его структуре (его макропорах), и скорость массопереноса ЛП зависит от скорости набухания и биодеградации полимера. Это подтверждают и данные, представленные на рис. 11. При наложении салфетки препарат проникает за 300 мин через 11 слоев, при нанесении геля - через 14 слоев. Эти же закономерности подтверждают медико-биологические исследования, проведенные совместно с отделением проктологии ГУ Российского Онкологического Научного центра им. Н.Н.Блохина (руководитель - д.м.н., проф. Ю.А.Барсуков).

Рис. 11. Кинетика массопереноса ЛП метронидазола в слои коллагеновой мембраны (в качестве салфетки использована салфетка «Колетекс-М» с альгинатом натрия и МЗ; в качестве геля - полимерная композиция (альгинат натрия и МЗ); СМЗ=const)

Наша задача заключалась в создании полимерной гидрогелевой композиции с МЗ с заранее заданными свойствами, т.е. при применении которой в опухолевых тканях обеспечивалась бы нужная по медицинским показаниям концентрация лекарственного препарата, а именно не менее 150 - 200 мкг/г.

Для решения указанной задачи нами были приготовлены композиции из альгината натрия (4 - 6 масс%) с введенным в него ДМСО (2%) и метронидазолом в концентрациях 4, 7 и 9 масс%, которые затем вводили ректально больным с помощью шприца Жане. Вязкость композиций была подобрана нами и составляла 2,6 Па•с. Композиция после введения удерживалась пациентами в полости (прямой кишке) 3,4,5,6 часов, после чего следовала проводимая хирургами-онкологами операция по удалению опухоли и затем нами спектрофотометрически определялась концентрация препарата в опухолевой ткани. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Содержание метронидазола в тканях опухолей прямой кишки (мкг МЗ/ г опухоли) в зависимости от концентрации метронидазола в композиции (альгинат натрия, метронидазол, ДМСО)

Из представленных данных следует, что для достижения радиосенсибилизирующей дозы МЗ в опухоли его концентрация в гидрогелевой композиции при внутриректальной экспозиции 5 часов должна быть 9 масс%. Созданный гидрогелевый материал (торговое название «Колегель» с метронидазолом) прошел успешные медико-биологические, токсикологические и технические испытания. Исходя из полученных данных, в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН была создана программа лечения больных раком прямой кишки с включением в схему предоперационного облучения разработанного нами полимерного материала с метронидазолом, вводимого ректально. Использование гидрогелевого материала с метронидазолом в программе полирадиомодификации доказало свою эффективность. Так, при применении в комбинированном лечении гидрогеля с МЗ в качестве радиомодификатора при лучевой терапии достоверно удалось повысить показатель пятилетней безрецидивной выживаемости до 92,2% по сравнению с группой больных, получающих только термолучевую терапию - 67,4%.

С целью усиления противоопухолевого эффекта и повышения эффективности лучевой терапии в работе сделана попытка подвести оба радиомодификатора МЗ и 5-ФУ вместе, направленно, непосредственно к очагу поражения с помощью текстильной салфетки или непосредственно гидрогелевой композиции (загустки), наносимой на ТМ по технологии печати. После доставки препарата к опухолям, находящимся в полостях (гинекология, прямая кишка и т.д.) с помощью гидрогелевой композиции и экспликации в течении 3-5 часов (время связано с медицинскими показаниями) следует облучение больного в соответствии с программой лучевой терапии. Предполагалось повысить эффективность применения этих препаратов за счет разнонаправленности их действия как модификаторов: 5-ФУ действует на изменение клеточного цикла, а МЗ - как ЭАС.

Спектрофотометрически нами была изучена возможность взаимодействия этих препаратов в смеси и подтверждено отсутствие взаимодействия, т.е. свойства (подлинность) лекарств при таком применении остаются без изменений.

Исходя из результатов, полученных при проведении исследований совместно с медиками РОНЦ им. Блохина РАМН, была разработана программа трехкомпонентной полирадиомодификации (патент РФ № 2008120585 от 26.05.2008 г. «Способ лечения рака прямой кишки»; Заявка на получение патента на изобретение «Способ лечения рака прямой кишки» № 2010105640 от 18.02.2010 г.) с внутриректальным направленным подведением к опухоли «Колегеля» с 5-фторурацилом и «Колегеля» с метронидазолом.

Раздел 2.5. главы 2 посвящен разработке технологии и на ее основе ассортимента лечебных аппликационных текстильных материалов с ЛП - фотосенсибилизаторами для фотодинамической терапии (ФДТ) - одного из направлений лучевой терапии. По согласованию с медицинскими соисполнителями в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) рассматривали отечественные препараты метиленовый синий (краситель), фотосенс и аласенс. Принцип действия этих препаратов заключается в образовании под действием лазерного излучения (600 - 800 нм) синглетного кислорода и радикалов, которые (при нахождении этих ЛП в опухолевой ткани) разрушающе действуют на опухоль. Из указанных препаратов наиболее интересным, современным, является аласенс (5-аминолевулиновая кислота), который приобретает свою активность непосредственно в очаге поражения (опухоли), т.к. за счет ферментов претерпевает ряд превращений, приводящих к образованию его активного метаболита Протопорфирина IX, выделяющего при облучении синглетный кислород и активные радикалы. В отличии от красителя метиленового синего и фотосенса для аласенса (за счет его неактивной формы) не характерна фототоксичность, связанная с накоплением препаратов в кожных покровах и последующей фотосенсибилизацией под действием дневного света, снижающей качество жизни больных.

Методология создания лечебных аппликаций для ФДТ соответствовала описанной ранее. В качестве основной технологической операции для нанесения ЛП на ТМ была выбрана текстильная печать. Из текстильных материалов рассматривались нетканые льновискозное и хлопковискозное полотна и трикотажное ПФ-2.

На первом этапе необходимо было установить, не снижает ли использование технологии печати и иммобилизации ЛП на ТМ с помощью альгината натрия фотоактивности ЛП. Для этого ЛП метиленовый синий, нанесенный вместе с полимером альгинатом натрия на текстильный материал по технологии печати, экстрагировали из водной среды с ТМ и помещали в лунки плоскодонного микропланшета с культурой раковых клеток Нер2 (клетки эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека Нер2). Параллельно в сравнительных опытах использовалась субстанция (в форме порошка) метиленового синего. Из данных, представленных в табл. 4, видно, что при концентрациях ЛП метиленового синего 5 мкг/мл и выше количество погибших раковых клеток при ФДТ (облучении лазером, л=664 нм) увеличилось на 30-35%, по сравнению с необлученными. Количество погибших клеток, т.е. эффективность препарата, существенно зависит от концентрации ЛП. Полученные результаты, позволяют заключить, что метиленовый синий, экстрагированный с текстильного материала, и субстанция метиленового синего обладают сравнимой цитостатической и фотоиндуцированной специфической активностью относительно клеток в культуре, то есть иммобилизация метиленового синего на текстильном материале с помощью полимеров-загустителей в использованных условиях не изменяет (не снижает) его действия

Таблица 4.

Влияние субстанции ЛП - красителя метиленового синего и его иммобилизованной на ТМ формы на рост культуры клеток Нер2 после облучения светом и без светового воздействия

Влияние текстильного материала на массоперенос ЛП фотосенс изучали в модель неповрежденной кожи - многослойную коллагеновую мембрану. Из рис. 12 следует, что если в начальные моменты времени скорость и глубина массопереноса фотосенса в коллагеновую мембрану из всех полимерных матриц (текстильных, гидрогелевой) примерно одинаковы, то после 45 мин. эксперимента наблюдается более глубокое проникновение ЛП в слои мембраны из гидрогелевой композиции. Это соответствует закономерностям, полученным нами в данной работе при исследовании других ЛП.

Рис. 12. Массоперенос ЛП Фотосенс из различных текстильных и гидрогелевой аппликации в многослойную коллагеновую мембрану в зависимости от времени экспозиции, СЛП=const

Такая же закономерность получена при изучении массопереноса ЛП аласенса, однако в этом случае изучался массоперенос препарата из текстильного и гидрогелевого (альгинатного) материалов непосредственно в кожу добровольца методом флуоресценции (рис.13). Использование этого метода для оценки массопереноса аласенса через кожу пациента-добровольца связано с тем, что, как указано выше, препарат проявляет фотоактивность только под воздействием ферментов организма, переходя в соответствующее количество Протопорфирина IX (PP IX), способного образовывать при облучении синглетный кислород и радикалы. Поэтому традиционными спектрофотометрическими методами изучить кинетику накопления аласенса невозможно.

Рис. 13. Массоперенос ЛП аласенса из гидрогелевого и текстильного материала в кожу пациентов-добровольцев

Массоперенос аласенса из текстильной аппликации изучали методом флуоресценции в модели биоткани, в качестве которой использовали 10%-ный раствор липовеноза (жировая эмульсия на основе соевого масла, хорошо моделирующая биологическую ткань), соответствующий оптическим свойствам кожи, и кожу предплечья пациента-добровольца (in vivo), на которую накладывали аппликацию с ЛП.

Рис. 14. Влияние состава композиции, наносимой на текстильный материал, на кинетику накопления Протопорфирина IX в биоткани (неповрежденная кожа внутренней стороны предплечья добровольца), облучение при л = 532 нм

Оценка спектров флюоресценции неинвазивным спектрофотометрическим методом в течение различного времени экспликации доказала факт направленной десорбции препарата из салфетки и накопления в коже и позволила по значениям интенсивности флюоресценции, соответствующей кинетике накопления PP IX (по калибровочной кривой), оценить влияние загустителя и ТМ на полноту и скорость накопления аласенса. Из рис. 14 следует, что через 4-6 часов после наложения салфетки на кожу достигается концентрация ЛП, необходимая для проведения ФДТ (по данным врачей), через 8 часов кривая накопления PP IX выходит на равновесие. Равновесные значения сохраняются еще в течение 3 часов. Эти результаты важны для разработки методики лечения и определения времени, в течение которого больной (важно, что его даже можно переводить со стационарного на диспансерное лечение) может получать ФДТ. Представляют интерес данные по влиянию полимера-загустителя на массоперенос ЛП в кожу добровольца. На примере ЛП аласенса показано, что интенсивность флуоресценции, а значит, и концентрация препарата в коже, при использовании смеси полимеров - загустителей в соотношении альгинат натрия: сукцинат хитозана - 70:30 выше, чем при использовании только альгината (рис.14). Это соответствует выводам из ранее проведенных с другими ЛП экспериментов.

Клинические испытания позволили сделать вывод, что ни у одного из пациентов, подвергнувшихся ФДТ с подведенными с помощью салфеток аласенсом и фотосенсом, не проявлялась фототоксичность, не выявлялись ни системные, ни тяжелые локальные побочные эффекты, что подтвердило целесообразность и эффективность применения лечебных текстильных салфеток с лекарственными препаратами - сенсибилизаторами в фотодинамической терапии.

В разделе 2.6. главы 2 представлены результаты работы, направленной на создание лечебных материалов на текстильной и биополимерной основе для профилактики и лечения лучевых поражений. Лучевые поражения здоровых тканей, попадающих в зону облучения при лучевой терапии онкологических больных, являются частым сопутствующим заболеванием. Оно не только снижает качество жизни больных и требует специального медикаментозного лечения, но в ряде случаев при наличии симптомов этого заболевания приходится полностью прекращать лучевую терапию, несмотря на то, что пациент не получил нужную для лечения дозу. Это отрицательно сказывается на результатах лечения и прогнозе к выздоровлению. Поэтому разработка лечебных материалов для предотвращения и лечения лучевых (и постлучевых, возникающих в течение 6 месяцев после облучения) поражений и способов доставки, содержащихся в них лекарств непосредственно к очагам поражения, очень актуальны, причем важна направленная (например, в полости) местная (при лечении опухолей, например, молочной железы) доставка лекарств, учитывая локальность лучевого повреждения, высокую медикаментозную насыщенность и ослабленность иммунитета этого контингента больных. Согласно литературным данным и клиническому опыту, лучевые поражения (в т.ч. ожоги) возникают в результате свободнорадикальных процессов в организме, поэтому для их лечения рекомендовано применение препаратов с антиоксидантными свойствами. Кроме того, необходима регенерация тканей и, в ряде случаев, использование анальгетиков для снижения болей. На основании совместной работы с медицинскими консультантами для разработки материала с радиопротекторными свойствами выбор пал на три отечественных препарата, обладающих антиоксидантной активностью (деринат - дезоксирибонуклеат натрия, продукт, получаемый из молок осетровых рыб; мексидол - 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат; прополис - природный антиоксидант) и лидокаин, обладающий анальгезирующим действием. Используя для создания лечебных материалов технологию печати, мы предполагали, что для регенерации тканей будет использован загуститель печатной композиции альгинат натрия (о его лечебных свойствах нами говорилось выше). Разработанные материалы должны обладать радиопротекторными свойствами (за счет антиоксидантов) и регенерирующими (за счет лечебных свойств альгината). Текстильная матрица (стерильная) должна закрывать поврежденную поверхность, не прилипать к ней (за счет антиадгезионных свойств биополимера альгината натрия), к тому же альгинат, используемый в виде гидрогеля, закрывая повреждения в полостях, будет проникать в ткани, выравнивая их сложную структуру. Для того чтобы оценить антиоксидантную активность выбранных препаратов во внешней среде и скорость их массопереноса из текстильной и полимерной матрицы, необходимо было охарактеризовать свойства внешней среды с точки зрения наличия в ней свободных радикалов (другие свойства в данном эксперименте не анализировались).

Анализ литературных данных, а также результатов экспериментов в лаборатории окисления органических соединений ИХФ РАН Благодарим старшего научного сотрудника лаборатории окисления органических соединений И.Ф.Русину, оказавшую большую помощь в проведении и осмыслении этой части работы. по хемилюминесцентным измерениям количественного изменения эндогенных антиоксидантов в плазме крови пациентов (25 чел.), рассматриваемых как отклик на различную дозу медикаментозного воздействия, позволил нам оценить сумму свободных радикалов (RO2)) во внешней среде - «ране». Так, в норме среднестатистическое содержание эндогенных антиоксидантов составляет RO2)N =18,6х10-6 моль/мл плазмы крови. При патологии это значение уменьшается на два-три порядка. Если принять, что при патологии эндогенные антиоксиданты полностью расходуются на подавление спонтанного выброса радикалов в раневой экссудат, то при этом возникает квазистационарная концентрация патогенных радикалов в ране порядка (10-6 10-9 моль/л). По порядку эта величина как оценочное значение соответствует литературным данным.

В качестве модельной реакции, имитирующей «рану» с точки зрения радикального процесса, была выбрана хемилюминесцентная модель (ХЛ-модель) низкотемпературного инициированного окисления кумола при Т=37С. В этом случае стационарная концентрация перекисных радикалов обеспечивается стандартным инициатором - - азо-бис-изобутиронитрилом (АИБН). При этом генерация радикалов в реакции соответствует генерации патогенных радикалов в «ране» как ответ на повреждение. В качестве растворителя использовали ацетонитрил и хлорбензол в соотношении 1:1. Ацетонитрил как бы выполнял роль раневого экссудата и способствовал набуханию биополимера на образце текстильного материала и массопереносу ЛП в объем ХЛ-модели из текстильной аппликации. Массоперенос ЛП из ТМ регулировался скоростью набухания материала и биополимера-альгината натрия, как и во всех описанных ранее ситуациях, градиентом концентрации ЛП - внешняя среда, растворимостью ЛП и скоростью его «уноса» во внешнюю среду (кровь, лимфу), что способствовало сдвигу концентрационного равновесия ЛП между внешней средой (раной) и салфеткой и десорбции ЛП во внешнюю среду.

Взаимодействие кумолперекисных радикалов с мексидолом и их расходование приводит к дополнительной десорбции ЛП из салфетки в объем модельной реакции помимо описанного действия ЛП в «ране». Это обстоятельство качественно отличает ХЛ-модель от других, где не принималась во внимание кинетика расходования ЛП в «ране» по радикальному механизму, а учитывались только в возможной степени свойства среды и унос ЛП и альгината из раны лимфой и кровью. В данном эксперименте мы осознанно пренебрегли влиянием на процесс массопереноса таких свойств, как реальный состав внешней среды, в том числе белковый, его вязкость и др. Еще раз следует подчеркнуть, что объектом нашего изучения являлось только изменение антиоксидантных свойств системы при введении в рану текстильной салфетки, содержащей мексидол.

Приготовленные образцы текстильных салфеток с нанесенным по технологии печати ЛП мексидолом размера (0,5х0,5) см2 помещались в термостатируемую ячейку барботажного типа с реакционной смесью (кумол 50%, растворитель ацетонитрил (ACN) 25% и хлорбензол (ХБ) 25%, АИБН - инициатор, обеспечивающий скорость инициирования (Wi) при 37 С, Wi = 1x10-1 Мс-1). Таким образом, была составлена модельная ХЛ - реакция, имитирующая «рану» с точки зрения радикального процесса. Затем по мере непрерывного выдерживания текстильных образцов при строго фиксированной температуре Т=37, С = const проводилось количественное измерение остаточного содержания мексидола в образцах с интервалом выдержки 0,5 ч. Одновременно по одной и той же кинетической кривой рассчитывалась эффективная константа скорости взаимодействия мексидола с кумолперекисными радикалами (К7), характеризующая антирадикальную активность препарата. Значения константы К7 для всех рассматриваемых препаратов были измерены предварительно для определения устойчивости лечебного действия мексидола в процессе всего эксперимента (табл. 5). Различия в значениях К7 прополиса связаны с отличиями в партиях этого природного вещества.

Таблица 5.

Значения антирадикальной (антиоксидантной) активности лекарственных препаратов методом хемилюминисценции на модельной реакции инициированного окисления кумола (50%) , инициатор - АИБН

Анализ значений кинетики массопереноса мексидола из салфетки во внешнюю среду модельной ХЛ-реакции при Т=37С позволяет сделать вывод, что содержание антиоксиданта на текстильной аппликации уменьшается за 11 часов с 8,2·10-3 до 0,19 ·10-3 М/см2 .

Возможность измерения константы К7 для субстанции ЛП мексидола одновременно с измерением в одном и том же опыте содержания антиоксиданта-мексидола в образце текстильной салфетки показало, что во всем диапазоне измерений в течение 700 минут (более 11 ч.) выдержки образцов в ХЛ-модели «раны» с антирадикальной активностью мексидола, характеризуемая К7, практически не менялась и оставалась в пределах (1,3 - 2,3 ) 10-4 (Мс )-1 , что говорит о сохранении антиоксидантной активности мексидола. Антиоксидантная активность мексидола, импрегнированного в полимерную матрицу, осталась на уровне клинической эффективности. Далее удерживать салфетку на патологическом участке не целесообразно, что необходимо учитывать при разработке методов применения разработанных нами материалов. Установление экспоненциальной зависимости выхода антиоксиданта во внешнюю среду в зависимости от времени выдержки салфетки с лекарственным препаратом позволяет проводить количественное прогнозирование срока лечебного действия при изменении концентрации мексидола в текстильной салфетке. Присутствие альгината в системе практически не влияет на значения К7 (2,50· 10-4 и 2, 48·10-4 соответственно).

Для разработки технологии получения текстильных материалов с антиоксидантами необходимо было изучить не только стабильность антиоксидантной активности мексидола и влияние полимера-загустителя, но и влияние на нее технологических операций. Поэтому мы провели работы по измерению антиоксидантной активности мексидола, входящего в лечебные салфетки различного срока хранения, сравнивая константы К7 (1 месяц - К7=1,79, 6 месяцев - К7=1,72, 14 месяцев К7=1,76). Значения К7 характеризуют высокую устойчивость в течение 14 месяцев как препарата мексидола, так и его в образцах текстильных салфеток, т.е. сохранность их лечебных свойств в течение 14 месяцев. Измерение значений К7 при различных дозах г-стерилизации показало, что при облучении в пределах 6 - 25 кГр существенных изменений К7 не наблюдается.

Для создания аппликационных материалов для профилактики и лечения постлучевых поражений при проведении лучевой терапии кроме мексидола были использованы (см. табл. 5) антиоксидант дезоксирибонуклеат натрия и природный антиоксидант прополис. Они, как и другие лечебные материалы, были созданы с использованием технологии текстильной печати. Все эти материалы прошли токсикологические, предварительные технические и клинические испытания. Клиническое использование текстильных и гидрогелевых материалов с ЛП - антиоксидантами показало их хорошую переносимость и высокую эффективность в профилактике лучевых реакций, выраженность которых снизилась на 17-35%, а их наступление отодвинулось на 10-18 дней, что обеспечило возможность проведения лечения без перерыва, изменилась структура местных лучевых реакций кожи и слизистых оболочек в сторону снижения степени их выраженности.

После успешного проведения всех испытаний были получены разрешительные документы Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на промышленный выпуск и широкое клиническое применение, для салфеток «Колетекс» с мексидолом «Колетекс-Мекс» (РУ № ФСР 2010/08237 от 21.07.2010 г.); для салфеток «Колетекс» с дезоксирибонуклеатом натрия «Колетекс-АДН» (РУ № ФСР 2007/01003 от 26.11.2007 г.); для салфеток «Колетекс» с прополисом «Колетекс-СП-1» (РУ № ФСР 2010/08188 от 07.07.2010 г.) и для материалов гидрогелевых «Колегель» с деринатом «Колетекс-гель-ДНК» и с деринатом и лидокаином «Колетекс-гель-ДНК-Л» (РУ № ФСР 2007/00894 от 15.10.2007 г.). На все изделия получены сертификаты соответствия.

В третьей главе приведены методики, использованные в исследованиях, в т.ч. разработанные с участием автора, а также описаны объекты исследования.

Основные результаты и выводы по работе

1. На основании анализа литературных данных, теоретических и экспериментальных исследований разработана научно обоснованная универсальная технология создания текстильных и гидрогелевых материалов с местным направленным лечебным действием введенных в них ЛП для проведения эффективной лучевой терапии онкологических больных.

2. В соответствии с технологическими и медицинскими требованиями для создания текстильных аппликаций по технологии текстильной печати обоснован выбор нетканых полотен из целлюлозных (хлопковых, льняных, вискозных) волокон и трикотажных полотен из смеси волокон (хлопковых и полиэфирных), обеспечивающих комплекс необходимых свойств и дополнительные возможности для создания депо лекарств. Показано, что выбор текстильного материала как основы для аппликации зависит от вида заболевания, области наложения аппликации и необходимой концентрации вводимого лекарственного препарата.

3. Установлено влияние компонентов лечебной композиции на высвобождение лекарственных препаратов из текстильного и гидрогелевого материалов и выявлены закономерности процесса межфазного массопереноса лекарственных препаратов из лечебных аппликационных материалов к очагу поражения, что позволяет прогнозировать их накопление в опухолевых тканях.

4. В результате проведения комплексных исследований реологических свойств гидрогелевых композиций на основе биополимеров-полисахаридов альгината натрия, хитозана, натриевой соли сукцината хитозана и их смесей выбраны наиболее эффективные для использования в качестве основы лечебных композиций полимеры и их оптимальные концентрации.

5. На основе научно-обоснованной технологии получения лечебных материалов созданы лечебные изделия с прогнозируемыми свойствами для направленной доставки лекарств при лучевой терапии онкологических больных. Проведены в модельных и биологических средах исследования по изучению влияния на высвобождение препарата из лечебного текстильного и гидрогелевого аппликационных материалов во внешнюю среду (организм) следующих факторов: свойств текстильных материалов (волокнистого состава, структуры материала и т.д.), природы и концентрации биополимеров-загустителей и лекарственных препаратов, возможности взаимодействия компонентов в композиции. Проведенные исследования привели к созданию материалов с заданными свойствами.

6. Предложено использовать в качестве биополимера-загустителя альгинат натрия (в случае использования 5-фторурацила в качестве радиомодификатора) и смесь полимеров альгината натрия и сукцината хитозана (масс.%) 70:30 в случае использования 5-фторурацила в качестве цитостатика, а текстильные основы аппликаций выбирать в зависимости от области наложения аппликации (молочная железа, кожа, вагина и т.д.), учитывая установленные зависимости межфазного массопереноса 5-фторурацила во внешние модельные среды от состава и свойств текстильной матрицы и биополимеров-загустителей.

7. Экспериментально доказано, что межфазный массоперенос 5-фторурацила и метронидазола из гидрогелевой аппликации обеспечивает накопление в опухоли указанных препаратов, соответствующее требованиям при их стандартном инъекционном и пероральном введении, что достоверно подтверждает возможность направленного введения лекарств с помощью разработанных материалов.

8. Экспериментально установлено соответствие между концентрацией радиосенсибилизатора метронидазола в биополимерной композиции и его концентрацией в опухолевых тканях при ректальном введении, позволившее научно обосновать состав и время экспликации гидрогелевой аппликации при лечении опухолей прямой кишки и достичь в опухолевых тканях необходимой по медицинским показаниям концентрации лекарства.

9. Разработана и научно-обоснована оригинальная методика спектрофотометрического определения цитостатика 5-фторурацила в опухолевых тканях, позволившая определить концентрацию ЛП в композиции, обеспечивающую после введения пациенту требуемую для лечения концентрацию в органе поражения.

10. Доказано отсутствие химического взаимодействия между препаратами-радиомодификаторами 5-фторурацилом и метронидазолом методом спектрофотометрии, а также установлен факт ускорения их массопереноса и увеличение концентрации в модельных средах каждого их них при совместном введении, что позволило с целью повышения эффективности лечения и снижения токсичности совместить при использовании эти два препарата различного модифицирующего действия.

11. Разработаны аппликационные текстильные материалы с антиоксидантами деринатом, прополисом и мексидолом с целью защиты неповрежденных тканей от лучевого воздействия и лечения лучевых реакций. Впервые проведено моделирование внешней среды с точки зрения ее радикального состава, позволившее определить антиоксидантную активность указанных препаратов. С помощью метода хемолюминисценции (на примере мексидола) доказано, что текстильный материал (основа аппликации), и биополимер-загуститель не снижают антиоксидантной активности ЛП. Установлена зависимость изменения антиоксидантной активности ЛП от времени, позволившая разработать методику применения текстильных аппликаций.

12. Доказано отсутствие влияния текстильной печати как способа иммобилизации на текстильном материале лекарственного препарата - фотосенсибилизатора (на примере красителя метиленового синего) на его фотодинамическую и цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам в сравнении с субстанцией лекарства. Установлено, что иммобилизация лекарства на текстильном материале по технологии печати не изменяет его цито- и фотоактивности, что позволяет рекомендовать для создания аппликаций с фотосенсибилизатором эту технологию.

13. На основании изучения кинетики высвобождения препаратов-фотосенсибилизаторов из текстильной и гидрогелевой аппликации методом лазерной спектроскопии обоснованы состав лечебной композиции и время наложения аппликаций пациенту при фотодинамической терапии. По значениям интенсивности флуоресценции оценено (на примере препаратов аласенса и фотосенса) накопление ЛП в коже пациента - добровольца, влияние свойств текстильной основы и биополимеров-загустителей на массоперенос в организм фотосенсибилизаторов из текстильных и гидрогелевых аппликаций.

14. На основании разработанной технологии создан ассортимент лечебных текстильных материалов (торговое название «Колетекс»®) с лекарственными препаратами - модификаторами 5-фторурацилом и метронидазолом, усиливающими лечебный эффект при проведении лучевой терапии, и антиоксидантами и иммуномодуляторами мексидолом, деринатом, прополисом для профилактики и лечения постлучевых реакций у онкологических больных.

15. Создан ассортимент лечебных гидрогелевых материалов (гидрогелевых аппликаций, торговое название «Колегель»®) с лекарственными препаратами - модификаторами (радиосенсибилизаторами) 5-фторурацилом и метронидазолом, антиоксидантом деринатом и биологически активным веществом прополисом. Разработаны составы полимерных композиций, использующихся самостоятельно в лечебных целях и служащих «депо» ЛП при массопереносе его во внешнюю среду (в организм).

16. Разработаны, прошли токсикологическую экспертизу, клиническую апробацию и разрешены Минздравсоцразвития РФ для промышленного выпуска и широкого клинического применения лечебные текстильные и гидрогелевые аппликации с использованием цитостатика и радиомодификатора 5-фторурацила, радиосенсибилизатора метронидазола, антиоксидантов мексидола, дезоксирибонуклеата натрия (дерината) и прополиса при проведении лучевой терапии.

17. Получены сертификаты соответствия на созданные изделия - салфетки «Колетекс»® и гидрогели «Колегель»®.

По теме диссертации опубликованы следующие работы

Статьи в журналах, включенных в список ВАК

1. Коровина М.А. Опыт применения 5-фторурацила при аппликационном подведении к коже и слизистым при лечении постлучевых осложнений у больных злокачественными новообразованиями женской половой сферы / А. М. Сдвижков, А. Е. Иванов, Н. Д. Олтаржевская, М. А. Коровина // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1999. - № 2. - С. 49.

2. Коровина М. А. Новые лечебные материалы для онкологии / М. А. Коровина, Н. В. Левшова, Е. К. Кротова, Н. Д. Олтаржевская // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1999. - № 2. - С. 51.

3. Коровина М. А. Противоопухолевая активность 5-фторурацила при его трансдермальном введении с помощью салфеток «Колетекс» / Л. П. Вартанян, Н. Д. Олтаржевская, С. Ф. Вершинина, Г. Ф. Гарнаева, Ю. И. Пустовалов, М. А. Коровина // Вопр. онкологии. - 2001. - Т. 47, № 4. - С. 472 - 474.

4. Коровина М. А. Текстильные материалы для лечения трофических язв / М. А. Коровина, Н. В. Левшова, Н. Д. Олтаржевская //Текстил. химия. - 2002. - Спец. вып. - С. 67 - 73.

5. Коровина М. А. Повышение эффективности протонной лучевой терапии онкологических заболеваний при использовании лечебных аппликационных материалов «Колетекс» /Г. Д. Монзуль, М. А. Коровина, Н. Д. Олтаржевская // Паллиативная медицина и реабилитация . - 2002. - №2 / 3. - С. 84 - 85.

6. Коровина М. А. Текстиль и медицина. Перевязочные материалы с пролонгированным лечебным действием / Н. Д. Олтаржевская, М. А. Коровина, Л. Б. Савилова // Рос. хим. журн. - 2002. - Т.XLVI, ч.1. - С. 133 - 141.

7. Коровина М. А. «Колетекс» - новый отечественный перевязочный материал пролонгированного лечебного действия / Н.Д.Олтаржевская М.А. Коровина, В.В.Кузнецов// Вестн. последипломного медицинского образования. - 2002. - № 1. - С. 40 - 41.

8. Коровина М. А. Использование салфеток «Колетекс» с 5-фторурацилом в лечении базальноклеточного рака кожи лица / В. В. Кузнецов, Н. Д. Олтаржевская, М. А. Коровина // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2003. - № 2. - С. 83- 84.

9. Коровина М. А. Применение лечебных материалов «Колетекс» в онкологии и лучевой терапии / Н. Д. Олтаржевская, М. А. Коровина, Г. Е. Кричевский, П. Ю. Поляков // Мед. физика. - 2003. - № 4 (20). - С. 22-32.