Основные теории патогенеза хронического панкреатита

Размещено на http://www.allbest.ru/

Основные теории патогенеза хронического панкреатита

Введение

За более чем столетнюю историю изучения патогенеза хронического панкреатита было выдвинуто множество гипотез патогенеза, ряд из которых был опровергнут со временем, другие были отчасти подтверждены клиническими и экспериментальными исследованиями и стали рассматриваться в качестве теорий. Однако все элементы патогенеза не ясны до сих пор. Возможно, это обусловлено множеством этиологических факторов развития панкреатита, часть из которых имеет различные патогенетические особенности, без учета которых выдвигались и опровергались гипотезы в 60-- 70-е годы прошлого века. Открытия последних 10 лет, в частности определение наследственного и аутоиммунного генеза заболевания, расширило наши представления о патогенезе ХП.

Большинство существующих в настоящее время теорий имеют многие общие элементы, различаясь отдельными аспектами патогенеза. В частности, многими исследователями признается патогенетическое значение внутрипротоковой гипертензии и интрадуктального образования белково-кальциевых преципитатов, однако механизмы их развития, по мнению разных авторов, отличаются. Несмотря на доминирующую длительное время гипотезу общего протока Е. Opie, модернизированную в дальнейшем в гидравлическую теорию, одной из первых экспериментальных моделей стала модель развития алкогольного ХП, о которой мы уже упоминали ранее, что отчасти было обусловлено широкой распространенностью панкреатитов алкогольной этиологии [58, 81, 157].

Французская школа добавила к данной теории новый патогенетический механизм поражения ПЖ, и появилась так называемая литостатиновая гипотеза развития ХП [210]. С позиций данной гипотезы, ХП -- это хроническое заболевание, сопровождающееся кальцификацией паренхимы ПЖ и появлением конкрементов протоковой системы, индуцированное алкоголем и/или генетически обусловленными дефектами литостатина -- белка, способного к солюбилизации кальция в панкреатическом соке. Однако в настоящее время не создано экспериментальных моделей, подтверждающих данную гипотезу [55]. Кроме того, существуют клинические [79] и биохимические факты [80], которые ставят под сомнение ее правоту. В течение многих лет одной из ведущих теорий патогенеза ХП была гидравлическая теория, доказанная на множестве экспериментальных моделей, в дальнейшем появились аутоиммунная теория и наследственные теории, о которых мы писали в предыдущей главе. Ниже будут кратко рассмотрим основные патофизиологические теории развития ХП, большинство из которых актуальны и в настоящее время.

поджелудочный железа фермент некроз

1. Теория общего протока

Теория общего протока, как мы уже указывали ранее, была предложена E. Opie в 1901 г. [185]. Причиной разработки данной теории послужило обнаружение конкремента в фатеровом сосочке у пациента, умершего от ОП. Было предположено, что анатомическая близость мест впадения желчного и панкреатического протоков в двенадцатиперстную кишку в силу разнообразных причин может способствовать рефлюксу желчи в ГПП и повреждению ПЖ детергентами, содержащимися в желчи. E. Opie предположил, что наличие длинного общего протока позволяет желчным камням проходить место соединения общего желчного и панкреатического протоков, вызывая обтурацию общего желчного протока в области сфинктера и заброс желчи в ГПП.

Теория общего протока была воспринята неоднозначно. Во-первых, в большинстве случаев общий желчный проток короткий, поэтому попавший в него конкремент будет блокировать оба протока. Во-вторых, давление в ГПП обычно выше, чем в общем желчном протоке, и поэтому в обоих случаях рефлюкс желчи в ГПП не должен происходить. В-третьих, существуют указания, что для развития ХП необходимы патологические изменения самой желчи [20, 44]. Точные механизмы, активирующие ферменты в клетках ацинусов при обструкции, не известны [50]. Возможно, при холелитиазе желчь содержит значительные количества продуктов ПОЛ, что и придает ей особые агрессивные свойства при рефлюксе в панкреатические протоки [29].

Наиболее вероятно, что билиарные конкременты блокируют только ГПП, что приводит к протоковой гипертензии и развитию ОП либо, при неполной обструкции,-- к развитию ХП. Затруднение оттока панкреатического секрета в этом случае может быть обусловлено именно мобильным («вентильным») конкрементом, провоцирующим периампулярное воспаление, отек и спазм сфинктера [50].

Далее мы перейдем к более обоснованной гидравлической теории патогенеза ХП, являющейся, по сути, прямым историческим «наследником» теории общего протока.

2. Гидравлические теории (теории обструкции протоков поджелудочной железы)

Многочисленные исследования обнаружили, что частичная обструкция панкреатических протоков в опытах на собаках [154, 205], крысах [189] и свиньях [197] приводила к повреждениям панкреатической паренхимы, весьма похожим на те, которые наблюдаются при ХП у человека. При этом хроническое злоупотребление алкоголем потенцирует повреждения ПЖ, ускоряет их начало и способствует их необратимости [232]. В результате дальнейших исследований было выявлено, что:

продолжительность обструкции протоков прямо коррелирует с тяжестью повреждений ПЖ;

протоковая обструкция потенцирует развитие конкрементов в протоковой системе более чем у половины экспериментальных животных;

полный блок ГПП приводит к развитию атрофии панкреатической паренхимы;

восстановление панкреатического оттока предотвращает образование конкрементов в протоках и гистологическую модификацию паренхимы ПЖ.

Таким образом, большинство исследователей стало представлять реализацию совокупности этиологических факторов ХП в патогенезе заболевания аналогично тому, как это происходит в эксперименте при блоке панкреатических протоков. Следует отметить, что панкреатостаз, действительно, облегчает осаждение кристаллов кальция в протоковой системе ПЖ с последующей кальцификацией белкового секрета, развитием вторичного блока и прогрессированием обструкции. Ацинарный комплекс при этом подвергается глубоким ультраструктурным изменениям, потенцируется воспалительный процесс с последующим развитием фиброза, вовлекающего все железистые элементы дистальнее места обструкции, что, естественно, сопровождается уменьшением синтеза пищеварительных ферментов.

В присутствии литогенных факторов, например алкоголя и курения, либо на фоне наследственной предрасположенности (низкий уровень литостатина, определенные мутации), процесс прогрессирования ХП может быть ускорен и проявляться ранним началом кальцификации, внешнесекреторной и инкреторной недостаточности ПЖ [231].

Обструкция может быть на уровне ГПП -- так называемая теория большого протока, либо на уровне более мелких протоков -- теория малых протоков.

Главной и наиболее частой причиной стриктуры может быть стеноз фатерова сосочка, возможно, вызванный билиарным литиазом, как и предполагал в начале прошлого столетия Е. Opie [186]. Другие возможные причины обструкции -- опухоли ПЖ (аденокарцинома, муцинозные опухоли, кисты, эндокринные опухоли), опухоли собственно фатерова сосочка, стеноз ГПП как следствие перенесенного некротизирующего панкреатита.

У больных НП блокада протоков ПЖ может вызывать очередную атаку панкреатита на фоне мутаций гена катионического трипсиногена, способствующих быстрому прогрессированию аутодеструкции ПЖ. У больных НП при наличии мутаций CFTR-гена заболевание может развиваться на фоне блокады протоков различного порядка слизистыми пробками.

Классическим и наиболее известным примером гидравлической теории малых протоков является теория Н. Sarles (теория интрадуктального литиаза, или теория нарушенной секреции) [209]. Согласно этой теории, алкоголь повышает содержание в панкреатическом соке белка и, таким образом, способствует увеличению вязкости панкреатического секрета. В этих условиях происходит преципитация белка во внутридольковых или вставочных протоках. Образовавшиеся камни (бляшки), содержащие различные протеины (ферменты, гликопротеины), кислые мукополисахариды, заполняют протоки. Развивается обструкция внутридольковых или вставочных протоков с последующим повреждением эпителия [128], его атрофией, развитием локального стеноза или образованием фиброзных рубцов. В ткани ПЖ, дренируемой поврежденными протоками, появляются паренхиматозные изменения, которые могут принимать форму кистозного перерождения или атрофии ацинарных долек. В конечном итоге прогрессирующий фиброз, начавшийся вокруг протока, распространяется на всю дольку, вызывает замещение ацинарной ткани и приводит к хроническому кальцифицирующему панкреатиту. Однако имеющиеся данные о том, что бляшки преимущественно состоят из десквамированного эпителия (а не протеинов), отчасти опровергают данную теорию [237].

Итак, вне зависимости от уровня блока и его исходного механизма, недостаточный отток панкреатического сока в сочетании с повышением концентрации белка и вязкости секрета приводит к преципитации белка с образованием «белковых пробок», которые частично или полностью вызывают закупорку различных отделов панкреатических протоков. Большое значение имеет увеличение рН панкреатического сока, наблюдаемое в большинстве случаев ХП, что приводит к снижению устойчивости ионов кальция в секрете ПЖ и тканевой жидкости. Таким образом, происходит более интенсивное образование карбоната и трехзамещенного фосфата кальция, вероятность выпадения которых в осадок возрастает в весьма значительной степени [17].

В условиях обструкции возникает компенсаторное расширение панкреатических протоков проксимальнее места их закупорки. В последующем при сохранении секреторной деятельности ПЖ панкреатический секрет инфильтрирует окружающую промежуточную ткань с формированием отека железы. В данной ситуации существенно нарушается метаболизм клеток органа: имеют место гипоксия и дезинтеграция клеток, увеличение количества внутриклеточного кальция, нарушение обмена адениловых нуклеотидов, активация процессов липолиза и высвобождение лизосомальных ферментов в цитоплазму, особенно в условиях внутриклеточного ацидоза. Важная роль отводится повышению проницаемости лизосомальных мембран, поскольку их лабилизация и выход лизосомальных ферментов в цитоплазму потенцируют реакции повреждения. Установлено, что лизосомальные гидролазы ацинарных клеток осуществляют интрапанкреатиче-скую активацию зимогенов, в частности трипсиногена. Трипсин, в свою очередь, может активировать другие предшественники ферментов ацинарных клеток [12, 18]. Из пораженных клеток выделяются гистамин и серотонин, резко усугубляющие патологический процесс. Под влиянием ингибирующих факторов аутолитические процессы могут купироваться, а патологический процесс завершается отечной формой панкреатита. В худшем случае под воздействием фосфолипазы, эластазы и трипсина начинается протеолитический некробиоз панкреоцитов. Из патологического очага в кровь и лимфу поступает значительное количество токсигенных полипептидов, липидов, панкреатических ферментов, биогенных аминов и других продуктов ферментативной аутоагресии, которые вызывают токсемию [16].

3. Дуоденопанкреатический рефлюкс

Полагают, что начальным этапом развития панкреатита является нарушение взаимоотношений между панкреатической секрецией, давлением в ГПП и двенадцатиперстной кишке. Повышение давления в просвете двенадцатиперстной кишки приводит к рефлюксу ее содержимого в ГПП с последующей активацией в нем протеаз, что может послужить толчком к развитию ОП и ХП [194]. В эксперименте на животных ОП вызывали путем образования петли Пфеффера из двенадцатиперстной кишки, внутри-=просветное давление в которой при этом превышало давление в ГПП, вследствие чего возникал рефлюкс дуоденального содержимого в проток. Было установлено, что в физиологических условиях у собак во время III фазы межпищеварительного комплекса и после кормления давление в двенадцатиперстной кишке может превышать давление в протоке поджелудочной железы. В это время небольшое количество (менее 1 %) дуоденального содержимого забрасывается в панкреатический проток [10].

Таким образом, хотя потенциальная возможность возникновения ОП в физиологических условиях существует, рефлюкс очень непродолжителен, незначителен по объему, и неизвестно, происходит ли при этом внутриротоковая активация протеаз. Кроме того, на протяжении большей части времени сфинктер панкреатического протока эффективно предотвращает рефлюкс дуоденального содержимого в проток. Однако, если давление в двенадцатиперстной кишке значительно превышает давление в ГПП (рвота) или отмечается на протяжении длительного времени (большое количество пищи, дуоденостаз, динамическая кишечная непроходимость и т. д.), возникновение рефлюкса и активация протеаз более вероятны, особенно в случае совпадения во времени повышения секреции панкреатических ферментов с рефлюксом. В подобной ситуации одновременное нарушение взаимоотношений между давлением в двенадцатиперстной кишке, давлением в ГПП и секреторной активностью ПЖ может являться фактором, предрасполагающим к ОП и ХП [10].

Нельзя не привести результаты исследований S. Navarro и соавт., представленные на Европейской гастроэнтерологической неделе в Мадриде, в которых измерялось внутрибрюшное давление у больных ОП. Было определено, что при увеличении внутрибрюшного давления на 1 мм рт. ст. риск развития тяжелого ОП возрастает в 2,23 раза. Была выявлена корреляционная связь между значением внутрибрюшного давления и тяжестью панкреатита, развитием бактериальных осложнений и летальных исходов. Достоверно более высокие цифры внутрибрюшного давления отмечены у больных, достоверно чаще нуждающихся в применении парентерального питания, антибактериальной терапии и хирургических вмешательствах [180].

4. Литостатиновая теория патогенеза хронического панкреатита

Открытие белка панкреатических камней -- литостатина, обнаруженного в панкреатическом соке и конкрементах ПЖ на рубеже 90-х годов прошлого века, привлекло внимание многих научных групп, занимающимися проблемами панкреатологии, в особенности проблемами обструктивных (на фоне панкреатолитиаза) и кальцифицирующих панкреатитов. Этот интерес был обусловлен выдвинутой гипотезой, основой которой стало предположение о способности литостатина ингибировать образование нерастворимых солей кальция в перенасыщенной кальцием среде [212, 251].

Одним из основных фактов, положенных в основу гипотезы, явилось обнаружение сниженных концентраций литостатина в панкреатическом соке у больных алкогольным ХП и у некоторых пациентов с неалкогольным ХП [179]. С учетом того, что панкреатическая жидкость содержит значительные количества кальция в сочетании с высоким уровнем бикарбонатов, а для ХП вообще характерна гиперсекреция кальция, вполне логичным выглядело предположение, что дефицит литостатина может играть важную роль в развитии конкрементов и кальцификации ПЖ [212]. Поскольку литостатин рассматривался как один из возможных стабилизаторов кальция в растворе, основная гипотетическая роль литостатина in vivo связывалась с ингибированием нуклеации, агрегации и образования кристаллов солей кальция в протоках ПЖ.

Вместе с тем, радиоиммунологический анализ с моноклональными антителами не позволил выявить существенной разницы в содержании литостатина в панкреатическом соке при с хроническом кальцифицирующем панкреатите по сравнению с контролем. Таким образом, было предположено, что концентрация литостатина в панкреатическом соке не имеет существенного значения для формирования преципитатов. Более важным является уменьшение возможностей его синтеза, т. е. общего пула литостатина в ПЖ б определенное время [217]. С патохимических позиций патогенез преципитации протеиново-кальциевых агрегатов рассматривался как результат снижения секреции литостатина в условиях повышенной потребности. Такие состояния возникают при усилении гидролиза белков в панкреатическом соке, индукции полимеризации белковых компонентов, появлении большого количества плохо растворимых белков, увеличении секреции кальциевых солей [29].

Следует отметить, что подобные литостатину белки обнаружены также в слюне и моче, т. е. это не уникальная способность панкреатического сока, а скорее общебиологическая закономерность [29].

В целом, литостатиновая теория может рассматриваться в качестве модификации рассмотренной выше теории малых протоков Н. Sarles {теория интрадуктального литиаза) [203], однако быстрая эволюция научных представлений в данной области, а также большое количество достаточно спорных и противоречивых исследований, недостаточная определенность и самого биологического значения литостатина позволили нам выделить эту теорию отдельно. На наш взгляд, анализ литературы, посвященной молекулярной биологии, функции и механизму действия литостатина, позволит читателю более объективно оценить реальное состояние проблемы и обоснованность данной теории в настоящий момент.

5. Молекулярная биология литостатина

Человеческий панкреатический литостатин кодируется Reg-геном (regenerating gene) [228], расположенным на коротком плече 2-й хромосомы в 2р12 [117] и состоящим из шести экзонов [242]. Литостатин -- растворимый гликопротеин, состоящий из 144 аминокислот с тремя дисульфидными мостиками, существующий в 11 изоформах (молекулярная масса 17-22 кДа) и составляющий от 5 до 10 % всех секретируемых ПЖ белков [89]. Литостатин S2-5 соответствует четырем изоформам, предотвращающим рост кристаллов кальция в растворе [62]. Негликозилированный литостатин S1 также выявляется в панкреатическом соке, собранном при отсутствии ингибиторов протеаз. Литостатин S1 был независимо обнаружен J. Gross и соавт. в человеческом [126] и бычьем [125] панкреатическом секрете и назван панкреатическим нитеобразующим (фибриллярным) белком из-за его способности формировать фибриллы при нейтральных значениях _РН.

Литостатин состоит из двух невзаимодействующих доменов: глобулярного С-терминального (аминокислотные остатки 14--144) и подвижного N-терминального (остатки 1 -- 13). С-терминальный домен содержит две главных а-спирали, шесть р-цепей, расположенных в двух антипараллельных р-слоях, и много петель. Отдельно от N-терминала в области С14-С25 расположен дисульфидный мост (рис. 3.1) [116].

Исторически литостатин С был первым выделен как главный белковый компонент панкреатического конкремента у больных алкогольным кальцифицирующим ХП и, следовательно, был назван белком панкреатических камней (PSP-белок) [88]. Он имеет ту же полипептидную цепь, что и литостатин SI. In vitro при гидролизе трипсином литостатина S2-5 получены литостатины HI (133 аминокислотный полипептид) и Н2 (N-терминальный 1--11 аминокислотный андекапептид) [87].

В целом, литостатин С, S1, и HI --различные названия, представленные в литературе и характеризующие один и тот же полипептид.

Следует отметить, что Reg-белок -- это еще одно название, предложенное для литостатина и характеризующее его в качестве продукта Reg-гена. Этот ген был впервые обнаружен в регенерирующей печени и регенерирующих островках ПЖ, не эквивалентных нормальным тканям [233]. Функция Reg-белка полностью не выяснена; считается, что он может стимулировать регенерацию и/или рост панкреатических (3-кле-ток [60].

Исторические обстоятельства открытия белков в панкреатических конкрементах повлияли на исследование их свойств. Более ранние работы были посвящены алкогольному кальцифицирующему ХП. Н. Sarles и соавт. [213] предположили, что литостатин способен в этом случае предотвращать внутрипанкреатическое камнеобразование, блокируя кристаллизацию кальция и «рост» конкрементов в протоках ПЖ.

Однако эта точка зрения со временем была оспорена, и специфика функциональной роли литостатина в предотвращении камнеобразования теперь подвергается сомнению [67, 90]. Существуют данные, что литостатин может даже способствовать выделению мелких кристаллов, легко вымываемых потоком панкреатического сока [114]. В дальнейшем были проанализированы различные аспекты этих противоречий: гипотетические функции литостатина (предотвращение осаждения карбоната кальция и ингибирование нуклеации и роста конкрементов в растворе) и возможное патогенетическое значение белка в развитии ХП.

6. Функции литостатина

Ингибирование образования кальциевых камней. J. P. Bernard и соавт. [62] предположили, что ингибирующая функция литостатина реализуется N-терминальным андекапептидом. Однако концентрация, в которой проявляет свою активность N-терминальный пептид или его синтетический

аналог, до сих пор не выяснена. J. P. Bernard и соавт. [62] наблюдали ингибирующий эффект различных концентраций как естественных, так и синтетических пептидов (1,2--5,9 и 3,0--9,0 мкмоль/л соответственно), ингибирующему действию литостатина S2-5 проявляет такую же активность (0,6--5,9 мкмоль/л). В то же время D. Bimmler и соавт. [67] наблюдали отсутствие какого-либо эффекта синтетического пептида даже при концентрации 243 мкмоль/л (тест на нуклеацию) или 81 мкмоль/л (тест на кристаллический рост). В другом исследовании [90] синтетический пептид был активен только при концентрации более 80 мкмоль/л. По данным S. Geider и соавт. [114], концентрация пептида должна была достигать 500 мкмоль/л, чтобы вызвать предотвращение кристаллообразования.

Противоречивость полученных данных вызвала оживленную дискуссию исследователей. D. Bimmler и соавт. [67] заявили, что различие между собственными данными и результатами J. P. Bernard и соавт. [62] может быть связано с дефектами дизайна исследования. Согласно мнению S. Geider и соавт. [114], размер андекапептида намного меньше, чем литостатина S2-5. Следовательно, для достижения активной концентрации и реализации его ингибирующего эффекта требуется большее количество молекул андекапептида (приблизительно в 100 раз больше), чем литостатина S2-5.

Было высказано мнение, что известный ингибирующий эффект литостатина был фактически реализован из-за присутствия высокой концентрации буфера Триса [90]. Действительно, в исследованиях М. de Reggi и соавт. буфер Триса при концентрации 1 ммоль/л полностью ингибировал формирование кристаллов из ионов Са²⁺. Поэтому ингибирование кристаллообразования кальция литостатином могло быть «побочным эффектом» типовой подготовки эксперимента. В дальнейшем было подтверждено, что низкие концентрации буфера Триса действительно ингибируют нуклеацию кальция и кристаллический рост, в соответствии с ингибирующими кривыми, первоначально приписанными литостатину [190].

По данным D. Bimmler и соавт. [67], рекомбинантный литостатин крысы обладал ингибирующей активностью в отношении осаждения кристаллов кальция. Однако при тех же самых условиях бычий трипсиноген и человеческий сывороточный альбумин также вызывал ингибирование выпадения кристаллов кальция, сопоставимое с таковым у литостатина. Кроме того, было показано, что NaCl, фосфаты и, в некоторой степени, трипсиноген и химотрипсиноген ингибируют рост кристаллов кальция [90]. L. Addadi и S. Weiner [54] также сообщили о существовании неспецифической функции ингибирования выпадения кристаллов кальция различными белками при концентрациях выше 0,5 мг/мл, как это было показано для литостатина.

Еще более интересным является эффект, выявленный S. Geider и соавт. [114], когда литостатин S2-5, напротив, потенцировал нуклеацию кристаллов кальция. По данным авторов, литостатин способствовал образованию множества микрокристаллов, не имеющих патологического значения, которые легко вымываилсь из протоковой системы ПЖ током панкреатического секрета.

Таким образом, биологические функции, первоначально приписанные литостатину, в настоящее время весьма дискутабельны.

В настоящее время существует несколько гипотез механизмов действия литостатина.

Гипотеза I. Литостатин связывает кальций. В экспериментах, выполненных с помощью литостатина, меченного радиоактивным ⁴⁵Са, было определено, что литостатин С имеет четыре эквивалентных и независимых кальцийсвязывающих участка. J. Lohse и R. Kraemer предположили, что связывание литостатина с кальцием, вероятно, изменяет физико-химические характеристики этого белка, ведя к формированию белковых пробок, предшествующих кальцификации, и объясняет присутствие протеинов во всех слоях панкреатических камней [162].

В то же время отсутствие кальция в центре некоторых панкреатических камней, отмеченное в исследованиях L. Multigner и соавт. [178] и С.S. Pitchumoni и соавт. [196], противоречит мнению о предположительном участии кальция в инициации камнеобразования. A. Mariani и соавт. [166] также определили, что полипептидные ядра рентгеннегативных камней не имеют в своей основе кальциевого ядра. Кроме того, L. Multigner и соавт. [177] указали, что препятствие выпадению кристаллов кальция литостати-ном С нельзя было бы объяснять исключительно фиксацией кальция к белку. Действительно, при концентрации литостатина С, которая полностью ингибирует кальцификацию, более 98 % ионов кальция остаются свободными [172, 177].

Возобновление интереса к механизму фиксации кальция к литостатину было обусловлено открытием у животных лектинов (фитогемагглютининов), гомологичных литостатину С (лектины -- белки, функционирование которых зависит от кальция) [191, 192], а также описанием способности литостатинов HI и S2-5 потенцировать образование кальций-бактериальных комплексов [144].

Помимо литостатина, к настоящему моменту известно девять белков семейства лектинов С-типа. Семь из этих белков имеют кальций-зависимую активность: в том числе эпидермальный фактор роста человека [122], человеческий тетранектин [148], человеческий сурфактант легких [129].

В заключение следует отметить, что анализ структуры литостатина не позволяет нам идентифицировать кальций-связывающие участки, которые можно считать ингибирующими осаждение кальция и кристаллический рост конкремента.

Гипотеза II. Адсорбция литостатина на кристаллах карбоната кальция (адсорбционная гипотеза). Теоретическая возможность адсорбции литостатина на кристаллах карбоната кальция была предложена в качестве механизма ингибирования камнеобразования. L. Multigner и соавт. [177] описали механизм камнеобразования, при котором данный белок мог иметь большее сродство к кристаллу, чем к свободным ионам кальция. Точно так же А. Саго и соавт. [88] на основе проведенных исследований заключили, что сродство литостатина выражено больше к кристаллам, чем к свободным ионам кальция. В дальнейшем была продемонстрирована возможность адсорбции литостатина S2-5 на поверхности предсформированного кристалла [62].

Н. Sarles и соавт. подтвердили возможность адсорбции N-терминального андекапептида к кристаллической поверхности. По мнению авторов, снижение уровня N-терминального андекапептида в панкреатическом соке пациентов в результате его разрушения и преципитации является одной из причин развития кальцифицирующего ХП [213].

Теоретические предпосылки возможности адсорбции литостатина и N-терминального пептида к кристаллм СаСО₃ вскоре стали предметом многих исследований.

Так, S. Geider и соавт., используя иммунофлюоресцентные методы [114], определили, что литостатин действительно адсорбируется на гранях кристалла относительно оси роста. Однако важно подчеркнуть, что эти эксперименты были выполнены в условиях индуцированного кристаллического роста. Поэтому результаты данного исследования не доказывают, что адсорбция литостатина на кристаллах -- это механизм ингибирования кристаллического роста in vivo, а только показывают возможность модификации кристаллической формы в присутствии этого белка.

Кроме того, было определено, что сродство литостатина к кристаллам карбоната кальция является даже более низким, чем у альбумина, а количество адсорбируемого литостатина и альбумина на единицу поверхности находятся примерно в одинаковом диапазоне [90]. Наконец, было доказано, что адсорбция литостатина на кристаллах карбоната кальция не намного выше, чем аморфного вещества, например стекла [190]. Эти наблюдения свидетельствуют не в пользу гипотезы адсорбции литостатина на кристаллах карбоната кальция как механизма элиминации кристаллов из протоковой системы ПЖ.

V. Gerbaud и соавт. [116] для изучения взаимодействия между кристаллами карбоната кальция и N-терминальным пептидом использовали молекулярное динамическое моделирование. Эти исследования показывают, что литостатин способен пространственно ориентироваться с кристаллами карбоната кальция и затем адсорбировать их. При этом, в дополнение к взаимодействию кристаллов с N-терминальным пептидом, биполярное распределение заряженных остатков в структуре С-концевого домена [64] может первоначально также играть роль в ориентации белка относительно кристаллической поверхности. Изучение кристаллографической структуры литостатина показало, что в С-терминальном домене кислые аминокислотные остатки расположены с одной и той же стороны молекулы, в двух отрезках, отделенных приблизительно на 6 А. Эта периодичность, аналогичная таковой для ионов кальция на нескольких кристаллические плоскостях, может позволять электростатически взаимодействовать между С-кон-цевым доменом и кристаллом.

Эта модель могла объяснять адсорбцию литостатина на кристалле кальция, но не доказывала функцию ингибирования кристаллизации или специфику адсорбции литостатина на кристалле [190].

В целом, ни одно из вышеупомянутых исследований не было способно четко прояснить функцию или механизм действия литостатина.

Для объективизации приведенной выше информации необходимо упомянуть и другие белки с известным или предполагаемым участием в процессе кристаллизации.

Бакуловирусный экспрессируемый рекомбинантный литостатин крысы также обладает ингибируюшей активностью в отношении осаждения, кристаллизации и роста кристаллов карбоната кальция. Было показано, что, в отличие от человеческого литостатина, только С-терминальный полипептид демонстрировал ингибирующий эффект в отношении нуклеации кристаллов кальция и кристаллического роста. Однако отмеченный эффект был менее выраженным, чем у молекулы литостатина человека. Ни N-терминальный андекапептид, ни его синтетический гомолог не имели подобного эффекта даже при более высоких концентрациях. Следует отметить, что другие белки, например бычий трипсиноген, человеческий сывороточный альбумин имели сопоставимый ингибиторный эффект. В силу этого специфика и физиологическое значение ингибирующей способности литостатина крысы в настоящее время подвергается сомнению [65, 66].

Антифриз-эффекторные белки. Многие из морских рыб, обитающих в полярных океанах и северных морях, защищены от низких температур и даже замораживания в ледяной морской воде так называемыми антифризбелками сыворотки крови, являющимися гликопротеинами. К настоящему времени идентифицировано четыре различных типа антифриз-белков. Предположительно эти макромолекулы связываются с поверхностью кристаллов льда, предотвращая их рост. Этот тип белков характеризуется высокой идентичностью аминокислотной последовательности (от 25 до 29 %) по отношению к человеческим литостатинам и гомологичны С-типу лектинов [100]. Исследования К.V. Ewart и соавт. показали, что связывающий лед участок антифриз-белков сельди соответствует кальций-связывающему участку лектинов С-типа [106].

Белки, потенциально управляющие минеральным ростом. Недавно был изолирован и выделен овоклеидин -- основной белок кальфицированного слоя яичной скорлупы [165], обладающий 30 % идентичной последовательностью с человеческим литостатином и состоящий из отдельного лектино-подбного домена С-типа. Функция овоклеидина пока еще не установлена, предположительно, он играет роль в формировании матрицы яичной скорлупы.

Перлюцин -- белок, выделенный из раковины моллюска Haliotis laevigata [243]; по своей аминокислотной последовательности он также принадлежит к группе лектинов, состоящих из единственного домена С-типа. Кальций-связывающий участок 2 полностью гомологичен таковому у литостатина, в то время как кальций-связывающие участки 1 и 3 имеют только несколько общих аминокислотных остатков. Перлюцин промотирует осаждение СаСО₃, в раковине моллюска, хотя авторы подчеркивают, что это может быть только одним из множества аспектов его функционирования.

Человеческий тетранектин (который содержит кальций-связывающие участки 1 и 2) также принадлежит к семейству лектинов С-типа, осуществляя роль белковой матрицы кости при минерализации [246]. Недавно было высказано мнение, что он играет ключевую роль в росте этих и ремоделировании костной и мышечной тканях [142].

Панкреатит-ассоциированный белок синтезируется и секретируется в ПЖ, по своей аминокислотной последовательности весьма близок литостатину (идентичность --43 %, подобие -- 54 %). Панкреатитассоциированный белок соответствует основным характеристикам лектинов. Функция панкреатит-ассоциированного белка остается неизвестной, хотя сообщается, что секреция литостатина и панкреатит-ассоциированного белка увеличиваются в ответ на повреждение pancreas [190].

В семействе лектинов С-типа только эти два белка (и их гомологи) расщепляются трипсином на участке между аргинином и изолейцином с образованием по существу нерастворимых нитеобразных структур (фибрилл). Это, вероятно, и составляет наиболее важную их общебиологическую особенность.

Недавно было предположено, что именно эти плотные экстрацеллюляр-ные фибриллярные комплексы, сформированные в условиях секреторного напряжения ПЖ, обеспечивают защиту внутриполостного матрикса и осуществление полноценной регенерации протоковых структур [60п].

Существуют данные, что на ранних стадиях болезни Альцгеймера отмечается повышенная секреция как литостатина, так и панкреатит-ассоциированного белка, что также подтверждает предположение о тесной функциональной взаимосвязи этих двух полипептидов [121].

Недавно появилась альтернативная гипотеза камнеобразования, утверждающая, что механизм взаимодействия литостатина с кальцием не имеет принципиального значения, хотя этот белок и играет существенную роль в образовании внутрипротоковых преципитатов [147]. Гипотеза основана на результатах приведенных ниже исследований. Во-первых, стало известно, что при добавлении трипсина к секрету ПЖ отмечается трансформация растворимых изоформ литостатина S2-5 в нерастворимую фибриллярную изоформу S1 [149].

Во-вторых, у больных ХП чистый панкреатический секрет обладает небольшой протеолитиче-ской активностью [57, 115, 201, 234]. В-третьих, было выявлено, что в центре панкреатических камней помимо непременного содержания литостатина часто выявляется трипсин [136]. В связи с этим оправданной выглядит точка зрения, что при внутрипротоковой активации трипсиногена растворимые изоформы литостатина S2-5 могут конвертироваться в нерастворимую форму Sic последующим его осаждением в конкременте [147].

При использовании электронной микроскопии была оценена локализация литостатина в конкрементах (применялась методика иммунного окрашивания с добавлением коллоидного золота; рис. 3.2). Частицы золота, указывающие на наличие литостатина, были равномерно распределены от центра к периферии конкремента [147]. В более ранних работах, было определено, что трипсиноген располагался более плотно в центре конкремента, чем по периферии [136].

Судя по плотности распределения частиц золота, вовлечение трипсиногена на начальном этапе формирования конкремента кажется более интенсивным, чем на последующих этапах. С другой стороны, вовлечение литостатина, вероятно, достаточно постоянно в течение всего периода камнеобразования. В физиологических условиях литостатин, как, впрочем, и другие белки панкреатического сока, возможно, и играет ингибирующую роль в отношении осаждения карбоната кальция. При патологии, когда происходит локальная активация пищеварительных зимогенов [115, 201, 234], литостатин может играть литогенную роль, заключающуюся в преобразовании протеазами растворимых форм белка S2-5 в нерастворимую форму S1. Данная гипотеза представляется более обоснованной, чем предполагаемая ранее ингибирующая роль литостатина в нуклеации и осаждении кристаллов кальция. Однако, в свете представленных данных, остается неясным, какой же все-таки белок является наиболее важным для преципитации и камнеобразования.

В этом разделе мы рассмотрели основные работы по механизму действия литостатина. Результаты этих исследований достаточно противоречивы, однако самые современные данные не подтверждают мнения о значительной роли литостатина в ингибировании роста кристаллов кальция в протоковой системе ПЖ [54, 67, 190]. N-терминальный андекапептид, скорее всего, не обладает функциями цельного белка и не ингибирует кристаллизацию in vivo. Литостатин тропен к адсорбции на кристаллах кальция, хотя эта особенность неспецифична и характерна для других белков, секретируемых ПЖ. Установленный факт, что литостатин может адсорбироваться на кристаллах карбоната кальция и ингибировать их рост, не исключает и другую его биологическую роль.

Приведенные факты подтверждаются данными сравнительной биологии, включая информацию о белках, только недавно идентифицированных. Примечательно, что несколько белков, выделенных с литостатином, также предположительно играют регуляторную роль в процессах кристаллизации. Обширный перечень названий литостатина (литостатин, белок панкреатических камней, панкреатический фибриллярный белок, белок) отражает различные обстоятельства идентификации литостатина, а также меняющиеся предположения о его функции. Кроме того, тот факт, что Regген экспрессируется в разнообразных тканях человека, в том числе в тех, где отсутствует карбонат кальция, предполагает плейотропность этого гена [242].

Все это определенно говорит о том, что дискуссия относительно биологической роли литостатина остается открытой.

7. Теория первичного клеточного повреждения (теория активации ферментов)

Данная теория основана на предположении, допускающем возможность прямого патологического воздействия на клетки экзокринной паренхимы [72]. При этом первичное клеточное повреждение приводит к индукции активности внутриклеточных лизосомальных ферментов и липидпероксидазы, увеличению количества свободных радикалов кислорода. В этих условиях становится возможной преждевременная активация панкреатических проферментов. Данные предположения косвенно подтверждаются результатами исследований, в которых в панкреатическом соке были найдены сцингибиторы протеаз, способные связываться и трипсинами в панкреатическом соке у больных ХП, что в целом предполагает возможность частичной активации зимогенов in situ [171].

Действительно, были созданы экспериментальные модели ОП, в которых продемонстрировано, что активация пищеварительных ферментов могла происходить внутри ацинарных клеток [153, 204, 207, 241]. Так, нарушение нормального процесса секреции в ацинарных клетках ПЖ рассматривалось в качестве начального механизма в патогенезе ОП. Во многих экспериментальных моделях ОП на животных, в том числе при сверхмаксимальной стимуляции церулеином [141, 241] и обструкции ГПП [160, 208], демонстрировался блок физиологической секреции зимогенов в просвет ацинусов. Оказалось, что пищеварительные ферменты и лизосомальные гидролазы мигрируют в базолатеральную часть ацинарнои клетки. Таким образом, на ранних стадиях ОП, вызванного стимуляторами секреции, отмечается контакт пищеварительных проферментов и лизосомальных гидролаз в пределах большой цитоплазматической вакуоли [153, 204, 207, 241].

В пищевых моделях вакуоли являлись результатом слияния зимогенных гранул и лизосом. Данный механизм был назван кринофагией. С другой стороны, в церулеин-индуцированном ОП вакуоли образовывались и в результате кринофагии, и как исход дефекта нормальных механизмов сортировки, при которых происходило отделение лизосомальных гидролаз от пищеварительных зимогенов в процессе внутриклеточного транспорта [153, 204, 207, 241]. Этот механизм слияния зимогенных гранул и лизосомальных гидролаз мог закончиться активацией пищеварительных ферментов.

Действительно, было определено, что лизосомальный фермент катепсин В способен активировать трипсиноген in vitro [ПО, 123] в экспериментальной модели [124]. Трипсин, в свою очередь, активирует все остальные зимогены пищеварительных ферментов. Таким образом, феномен слияния зимогенных гранул и лизосом может завершиться интравакуольной активацией пищеварительных энзимов. Кроме того, существуют экспериментальные данные, что ингибирование катепсина В предотвращает активацию трипсиногена и уменьшает выраженность развития ОП у мышей с удаленным геном, кодирующим катепсин В [130, 238].

Одним из важных элементов теории является обнаруженная С. Figarella и соавт. повышенная активность лизосомальных ферментов в панкреатическом соке [108], что позволило предположить возможность внутрипротоковой активации трипсиногена. Сторонниками этой теории было даже высказано предположение, что протеиновые «камни», являющиеся, по сути, белковыми преципитатами, могут частично разрушаться трипсиногеном [109], но это было опровергнуто Н. Sarles [210].

В целом активация панкреатических ферментов рассматривается как результат взаимодействия между гидролазами и зимогенами. Активированные ферменты приводят к разрушению клеток паренхимы, прогрессирующему фиброзу и развитию обструкции, вторичной по отношению к процессам развития локального фиброзирования [152].

Необходимым моментом для реализации механизма первичного повреждения является «поломка» механизмов самозащиты ПЖ (продукция слизи протоковыми клетками, их «паркетообразное» расположение, дефицит внутритканевых ингибиторов протеаз), так как на неповрежденную ткань ферменты не действуют [9, 14].

8. Теория аутоактивизации трипсиногена

В последнее время появились вполне обоснованные сообщения, что теория активации ферментов (теория слияния зимогенных гранул и лизосом) доказана только в экспериментальных моделях на грызунах [188, 238] и ни в коей мере не может быть интерпретирована по отношению к человеку. Кроме того, на данный момент не проведено исследований, подтверждающих наличие такого механизма у человека [112]. В связи с вышесказанным, было предположено, что процесс аутоактивации трипсиногена -- это уникальная особенность человеческого трипсиногена [248, 249]. Безусловно, на возникновение этой теории оказали влияния научные открытия в области мутаций генов катионического трипсиногена и ПИТ.

Согласно данной теории, активация трипсиногена происходит обычным путем при низких значениях рН и становится патологической только при блоке секреции. Как известно, в норме фракция человеческого трипсиногена активируется трипсином, который может катализировать каскад активации трипсиногена и всех других проэнзимов. Этот процесс регулируется по крайней мере двумя различными линиями защиты. Первая -- ПИТ, о котором мы говорили в прошлой главе [250].

Когда уровни активированного трипсина остаются низкими, ПИТ ингибирует активность трипсина, предотвращая тем самым дальнейшую аутоактивацию трипсиногена и других проферментов в пределах ПЖ. В случае чрезмерной активации трипсиногена ПИТ-ингибирующая способность истощается и запускается каскад активации пищеварительных ферментов трипсином.

Вторая линия защиты представлена непосредственно трипсином. Действительно, для предотвращения неконтролируемой активации ферментов трипсин и трипсиноподобные ферменты, посредством механизма обратной связи, гидролизуют связь, соединяющую две шаровидных области трипсина в R122H. Это заканчивается необратимой инактивацией трипсина и предотвращает последующую активацию проферментов.

В недавних работах D. С. Whitcomb и соавт. [247] предполагают, что именно преждевременная активация трипсина играет основную роль в развитии панкреатита у человека. Как мы указывали в предыдущей главе, было идентифицировано две мутации трипсиногена, препятствующие инактивации трипсина у больных НП [247].

Вследствие чрезмерной активации трипсиногена мутированный участок R122H трипсина изменен, и поэтому трипсин не может быть инактивиро-ван, что может привести к запуску каскада активации ферментов, аутоде-струкции паренхимы ПЖ и, в конечном итоге, к панкреатиту. Кроме того, поскольку частота мутаций ПИТ в общей популяции превышает 2 %, они определенно связаны с НП и ХП [195]. Сторонники данной гипотезы [195] предполагают, что мутации ПИТ видоизменяют течение заболевания, возможно, понижая порог для реализации других генетических факторов, факторов окружающей среды, но не являются непосредственной причиной заболевания.

9. Теория активации хемокинов

Эта теория также основана на предположении, допускающем возможность прямого патологического воздействия на ациноциты, и практически является логичным продолжением теории первичного клеточного повреждения, возникшей в результате исследований последних лет.

Согласно этой теории, независимо от этиологии панкреатита, первичные патофизиологические механизмы происходят на уровне ацинарных клеток. Первичное повреждение ацинарных клеток приводит к интрапанкреатической активации трипсиногена и блоку секреции ферментов. В дальнейшем очень быстро (в пределах нескольких минут) происходит выделение радикалов кислорода [120, 181], приводящее к оксидативному стрессу, повреждению мембран клеточных органелл и мембран самих ациноцитов. Запущенный механизм перекисного окисления липидов приводит к истощению внутриклеточных антиоксидантных систем, уменьшению содержания глутатиона и витаминов А, Е, С, перемещения ядерного фактора каппа В (NF-kappa В) в ядра [175].

Ядерное перемещение NF-kappa В ярко продемонстрировано в нескольких моделях экспериментального ОП, вызванного, например, церулеином [127], таурохолатом [240], перевязкой терминального отдела холедоха (модель билиарного ОП) [103].

В пределах ядра NF-Kappa В индуцирует транскрипцию нескольких генов-мишеней. В пределах первых 30 мин процесс заканчивается внутриклеточной транскрипцией хемокинов -- моноцит хемотаксического белка 1 (МСР-1), интерлейкина 8 (IL-8), интерферон индуцирующего белка 10 и т. д. [91, 131, 240]. В пределах следующего часа происходит транскрипция провоспалительных цитокинов -- IL-1, фактора некроза опухоли альфа (TNF-oc), IL-6 и межклеточных молекул адгезии [252]. В результате экспрессии и выброса ациноцитами хемокинов, молекул адгезии, провоспалительных цитокинов происходит активация и интрапанкреатическая инвазия моноцитов, макрофагов, Т-лимфоцитов и полиморфно-ядерных нейтрофилов, которые уже экспрессируют собственные провоспалительные медиаторы, включая хемокины, цитокины, оксид азота, эластазу и т. д.

Прогрессирующий внутрипанкреатический провоспалительный каскад может активировать печеночные купферовские клетки. Эти печеночные макрофаги являются главными системными источниками провоспалительных цитокинов, стимулирующих ответный системный воспалительный синдром и полиорганную недостаточность. В экспериментальной модели ОП блокада печеночных купферовских клеток уменьшает плазменные уровни провоспалительных цитокинов, развитие острого респираторного дистресс-синдрома и связанной с ним смертности [118, 119].

У пациентов с ОП возможна вторая волна воспалительного повреждения, в частности вторичный инфекционный фактор, являющийся другим источником воспалительных медиаторов, которые усиливают системный воспалительный синдром ответа и могут также привести к смерти (гипотеза «второго удара») [71, 173].

Однако существуют экспериментальные исследования, в которых показано, что одно только перемещение NF-kappa В не способно стимулировать активацию трипсиногена [139]. Поэтому высказывается предположение, что интрапанкреатическая транскрипция провоспалительных цитокинов, вероятно, все-таки является неспецифической реакцией на активацию трипсиногена, внутрипротоковую гипертензию, оксидативный стресс, ишемию и т. д. [92].

10. Соотношение некроза и фиброза в контексте теории об аутодеструщии поджелудочной железы

Как уже упоминалось ранее, соотношение некроза и фиброза в развитии ХП было подробно изучено еще в 1946 г. М.W. Comfort и соавт. [84]. Согласно их представлениям, образующиеся при ОП воспалительные медиаторы вызывают некроз ПЖ; в дальнейшем по мере подключения иммунных механизмов, нарушения окислительных процессов, ишемии процесс становится персистирующим (хроническим), приводящим к фиброзным изменениям в ПЖ [29, 158]. Действительно, большинство этиологических факторов возникновения ХП, соответствуют таковым при ОП. К настоящему моменту многие панкреатологи пришли к выводу, что острый и хронический панкреатиты -- это фазы одной болезни [9, 51, 68]; т. е. панкреатит - единый воспалительно-дегенеративный патологический процесс [1, 9, 20, 32, 49, 78].

М.W. Comfort и соавт. [84], выдвигая собственный механизм патогенеза ХП, в большей степени опирались на гипотезу Н. Chiari, который еще в 1896 г. предложил рассматривать ОП как комплекс клинических проявлений, развившихся вследствие самопереваривания ПЖ [83], т. е. разрушения ткани ПЖ ее собственными пищеварительными ферментами. Так, трипсиноген, химотрипсиноген, проэластаза и профосфолипаза А под действием различных факторов (эндо- и экзотоксинов, инфекционных агентов, ишемии, прямой травмы и др.) активируются в ПЖ, а не в двенадцатиперстной кишке. Активированные протеолитические ферменты, особенно трипсин, не только переваривают ткани ПЖ и окружающих органов, но могут активировать эластазу и фосфолипазу, которые способны разрушать мембраны клеточных мембран. Развиваются отек, повреждение сосудов, интерстициальное кровотечение, коагуляционный и жировой некроз. Повреждение ацинарных клеток приводит к дальнейшему высвобождению зимогенов, которые также каскадно активируются. Кроме того, активирование и высвобождение медиаторов воспаления (брадикинины, гистамин) также потенцируют отечные изменения. Таким образом, наступает последовательность событий, кульминацией которых служит развитие острого некротизирующего панкреатита. Далее при благоприятном исходе формируется фиброз, свойственный уже ХП.

Несмотря на то что к настоящему моменту механизм интрапанкреати-ческой активации трипсина детально не установлен, существует общее мнение, что именно несвоевременная активация трипсина -- инициирующий момент в патогенезе ОП [133, 141, 209, 226, 227].

11. Теория о первично- и вторично-рецидивирующих формах хронического панкреатита

Эта теория была разработана в Омской государственной медицинской академии и по существу является комбинацией из всех вышеуказанных теорий. С рядом положений данной теории можно не соглашаться, однако, на наш взгляд, в ней предпринят принципиально верный подход -- проведен анализ современных теорий патогенеза ХП, имеющиеся противоречивые данные разведены в две принципиально различные формы заболевания для каждой из которых удалось объединить универсальные патологические механизмы.