Физико-химические методы определения стероидных гормонов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оглавление

• Введение
• Глава 1. Стероидные гормоны. Общая характеристика
• Глава 2. Основы химии стероидных гормонов
• 2.1 Андрогенные гормоны
• 2.2 Эстрогенные гормоны
• 2.3 Гестагенные гормоны
• Глава 3. Физико-химические методы анализа препаратов стероидных гормонов
• 3.1 Методы УФ-спектрофотометрии, основанные на собственном поглощении
• 3.2 УФ-спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на химических реакциях
• 3.3 Инфракрасная спектрофотометрия
• 3.4 ЯМР-спектроскопия
• 3.5 Колоночная хроматография

3.6 Методы ТСХ, УФ- спектрофотометрии и фотоколориметрии в фармакопейном анализе лекарственных средств

Заключение

Литература



Введение

Стероидные гормоны (СГ) -- группа физиологически активных веществ (половые гормоны, кортикостероиды и др.), регулирующих процессы жизнедеятельности у животных и человека.

СГ - один из главных классов гормональных соединений всех видов позвоночных и многих видов беспозвоночных животных. Они являются регуляторами фундаментальных процессов жизнедеятельности многоклеточного организма - координированного роста, дифференцировки, размножения, адаптации, поведения.

У позвоночных стероидные гормоны синтезируются из холестерина в коре надпочечников, клетках Лейдига семенников, в фолликулах и желтом теле яичников, а также в плаценте.

Характерная особенность синтеза СГ -- ряд последовательно протекающих процессов гидроксилирования молекул стероидов, происходящих в митохондриях и микросомах.

Они содержатся в составе липидных капель в цитоплазме в свободном виде. В связи с высокой липофильностью стероидные гормоны относительно легко диффундируют через плазматические мембраны в кровь, а затем проникают в клетки-мишени.

Действие стероидных гормонов на клетки-мишени осуществляется, главным образом, на уровне регуляции транскрипции генов. Оно опосредуется образованием комплекса гормона со специфическим регуляторным белком - рецептором, узнающим определенные участки ДНК в генах, регулируемых данным гормоном.

Таким образом, рецепторы всех стероидных гормонов - лиганд-зависимые факторы транскрипции. Для них характерно значительное сходство аминокислотных последовательностей, идентичная доменная структура и сходный механизм действия. Данные вещества являются очень важной частью в организме, так как выполняют множество функций. Одной из наиболее важной функцией, является регуляция периода беременности у женщин, а так же регуляция углеводного и водно-солевого обмена в организме. У мужчин, благодаря стероидам происходят такие процессы как: эякуляции и сперматогенез.

Данные вещества участвуют во многих процессах в организме. С каждым годом, в медицине, обнаруживаются функции, за которые отвечают СГ. Многогранность в функциональности этих гормонов объясняется тем, что это результат взаимодействия данных гормонов со многими различными рецепторами в организме.

О том, что при помощи СГ можно лечить различного рода недуги, поведал всему миру всем известный ученый Джеймс Райт. Именно он стал первым человеком, который начал изучать воздействие определенного количества этих препаратов на организм при наличии у человека того или иного заболевания.

Вследствие своей многофункциональности, использование их в медицине в качестве средств лечения каких либо заболеваний очень широко. Они по-разному используются в медицине - в первую очередь, как противовоспалительные и противозачаточные средства.

К гормонам коркового слоя надпочечников относятся такие гормоны как кортикостероиды: гидрокортизон, кортизон, кортикостерон, преднизолон, прегнан.

К половым гормонам мужчин относятся: андростерон, тестостерон, метилтестостерон.

К женским половым гормонам относятся: эстрон, эстрадиол, эстриол, этинилэстрадиол.

В данный момент существует множество препаратов СГ, поэтому анализ их качества является весьма актуальной проблемой.

Цель: Дать обзор физико-химических методов качественного и количественного определения стероидов. Основной упор делается на обзор методов количественного определения всех важных групп стероидов.

Задачи:

1. Рассмотреть методы идентификации стероидных гормонов.

2. Определение стероидов физико-химическими методами в фармакопейном анализе ЛС.



Глава 1. Стероидные гормоны. Общая характеристика

Стероидные гормоны являются производными ряда углеводородов, главным образом, прегнана, антростана, эстрана:

Они сходны между собой по химической структуре. Отличие от андростана состоит в том, что прегнан имеет в структуре этильный радикал, а эстран - ароматическое ядро и у него отсутствует одна метильная группа.

Основой структуры является циклопентанпергидрофенантрен:

Метильные группы, присоединенные к стероидному циклу в положении 10 и 13, называются ангулярными. Радикал R и атомы водорода (в положении 8, 9, 14) ориентированы в пространстве в цис- или транс-положении. Условно принято считать, что ангулярные метильные группы расположены над плоскостью чертежа (это обозначают сплошной линией). Если другие заместители находятся в цис-положении, т. е. в одной плоскости с ангулярными группами (в-конфигурация), то их также обозначают сплошной линией, а если в транс-положении (б-конфигурация), то пунктирной линией.

К числу производных прегнана относятся кортикостероиды и гестагенные гормоны, производными андростана являются андрогенные гормоны, а эстрана -- эстрогенные гормоны.

Классификация:

Производные прегнана:

· гестагенные гормоны (гормоны желтого тела) и их синтетические аналоги: прогестерон, прегнин, норэтистерон (норколут), медроксипрогестерона ацетат (депо-провера);

· кортикостероиды: дезоксикортона ацетат (дезоксикортикостерона ацетат), кортизона ацетат, гидрокортизон, преднизолон, фторзамещенные вещества (дексаметазон и др.).

Производные андростана:



· Андрогенные гормоны и полусинтетические производные, обладающие анаболическим действием (анаболические стероиды): тестостерона пропионат, метилтестостерон, метандиенон (метандростенолон), метандриол (метиландростендиол), нандролона фенилпропионат (феноболин),нандролона деканоат (ретаболил), ципротерона ацетат (андрокур), пипекурония бромид.

Производные эстрана:

· эстрогенные гормоны: этинилэстрадиол, эфиры эстрадиола.[8]



Глава 2. Основы химии стероидных гормонов

2.1 Андрогенные гормоны

Андрогенные гормоны вырабатываются мужскими половыми железами (тестикулами) в период половой зрелости.

В химическом отношении эти вещества являются производными андростана:

Физические свойства

Белые с желтоватым оттенком мелкокристаллические порошки, не растворимые в воде, растворимы в спирте, хлороформе и маслах.

Химические свойства и методы анализа

1. Для идентификации веществ используют общегрупповую реакцию на стероидный цикл с кислотой серной концентрированной: метилтестостерон и метиландростендиол образуют желто-оранжевое окрашивание с характерной флуоресценцией, метандростенолон - красное окрашивание.

2. Для обнаружения кетогруппы в 3 положении (тестостерона пропионат, метилтестостерон, метандростенолон) проводят общие реакции образования оксимов, гидразонов, изоникотиноилгидразонов, фенилгидразонов:



3) Спиртовые группы (тестостерона в 17в положении, метилтестостерона в 17в положении, метандростендиола - 3в, 17вположении, метандростенолона в17в положении) обуславливают реакции образования сложных эфиров, которые имеют характерные температуры плавления:

4) Тестостерона пропионат можно идентифицировать по сложноэфирной группировке:

а) по реакции гидролиза с последующей проверкой температуры плавления выделяющегося тестостерона (Т. пл. 150-156 ^оС):

б) по гидроксамовой реакции:

Хранение

Андрогенные и анаболические стероидные препараты хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре, предохраняя от действия света и влаги.

2.2 Эстрогенные гормоны

стероидный гормон фотоколориметрический

Эстрогенные гормоны вырабатываются в фолликулах.



Они являются производными эстрана (кольцо А - ароматическое):

Известны три природных эстрогенных гормона:

Одним из основных эстрогенов является эстрадиол. Эстрадиол имеет два гидроксила: в 3-м положении - фенольный и в 17-м положении - спиртовой. В качества лекарственного средства применяется эстрадиола дипропионат. В этой форме вещество более устойчиво и оказывает пролонгированное действие.

Наряду с этим препаратом применяется синтетический аналог с этинильной группой (не гормон, но обладает эстрогенной активностью) - этинилэстрадиол. Выпускается в таблетках по 0,00001 и 0,00005 г. Применяется при гипофункции яичников как средство заместительной терапии, а также входит в состав оральных контрацептивных средств (вместе с гестагенами).

Физические свойства

Белые, слегка желтоватого цвета мелкокристаллические порошки, очень малорастворимые в воде, растворимы в спирте и в щелочах, так как являются фенолами. За счет ароматического кольца А поглощают в УФ-области спектра (max = 280 нм).

Химические свойства и методы анализа

Подлинность вещества устанавливается общей цветной реакцией на стероидный цикл с конц. H2SO4: этинилэстрадиол дает оранжево-красную окраску с желтовато-зеленой флуоресценцией; местранол - кроваво-красное окрашивание с аналогичной флуоресценцией.

Эстрадиола дипропионат под действием конц. H2SO4 гидролизуется с образованием пропионовой кислоты. Последующее нагревание в присутствии этанола ведет к образованию этилового эфира пропионовой кислоты, имеющего характерный запах:

Ароматическое кольцо А в стероидном цикле имеет фенольный гидроксил и его можно идентифицировать по реакциям:

а) электрофильного замещения (бромирование, нитрование, образование азокрасителя, ауринового красителя). Например, азокраситель получают путем сочетания фенола с солью диазония (получают из сульфаниловой кислоты) в щелочной среде. Образуется раствор темно-красного цвета.

Эта реакция применяется для количественного определения этинилэстрадиола в таблетках:

С реактивом Марки (формальдегид в конц. серной кислоте) образуется ауриновый краситель, окрашенный в малиновый или фиолетовый цвет;

б) по реакции солеобразования и комплексообразования с солями тяжелых металлов, например с FeCl3;

в) образования сложных эфиров, например, с бензоилхлоридом, которые имеют характерную температуру плавления:

Эстрадиола дипропионат идентифицируют по образованию эстрадиола (Т.пл. 173-179 ^оС) после щелочного гидролиза с последующей очисткой его от примесей.

Для идентификации используют ИК- и УФ-спектры лекарственных веществ стероидной природы.

Для доказательства этинильной группы в структуре этинилэстрадиола применяется реакция с AgNO3. Этинилэстрадиол количественно определяют методом косвенной нейтрализации, также как прегнин.

Хранение

Список Б. Этинилэстрадиол хранят в хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, а эстрадиола дипропионат в сухом, защищенном от света месте.

2.3 Гестагенные гормоны

В основе химического строения лежит углеводород прегнан (С = 21):

В ГФ включены препараты естественного гормона прогестерона и его полусинтетического аналога прегнина. Прогестерон может быть получен из гормонов желтого тела свиней и полусинтетическим способом из саласодина как промежуточный продукт синтеза кортизона.

Белые с желтоватым оттенком мелкокристаллические порошки, практически нерастворимые в воде, растворимы в маслах и хлороформе. Оба вещества имеют общий хромофор: карбонильная группа в 3-м положении и двойная связь в положении 4-5. За счет этого хромофора они поглощают в УФ-области спектра и имеют max = 240 нм + 2 нм.

Метод УФ-спектрофотометрии применяется для оценки качества лекарственных веществ по величине удельного показателя поглощения (Е ^1%1см), в частности для количественного определения веществ относительно стандартных образцов.

Прогестерон и прегнин обладают оптической активностью, так как содержат центры хиральности. В оценке качества предусмотрено определение удельного вращения.

Химические свойства и методы анализа

1. Концентрированная кислота серная является общим внутригрупповым специфическим реактивом, подтверждающим наличие стероидного цикла. При взаимодействии с ней образуются окрашенные в желтый (прогестерон) или малиновый (прегнин) цвет флуоресцирующие растворы. Специфичность данной реакции низкая. Для более надежной идентификации веществ применяют ИК-спектроскопию.

2. Гестагенные гормоны содержат в 3-м положении карбонильную группу, поэтому способны к взаимодействию с аминопроизводными, образуя окрашенные продукты или продукты с характерными температурами плавления (подлинность).



Эти продукты могут служить гравиметрической формой для количественного определения (прогестерон в масляном растворе).

Реакцию образования оксима ГФ рекомендует для испытания подлинности прегнина (Т.пл. - 226-232 ^оС):

Прогестерон и прегнин отличаются по заместителям в 17-ом положении. Прогестерон содержит ацетильный фрагмент. При нагревании с иодом в щелочной среде образуется желтый осадок с характерным запахом: - иодоформ (СНI3).

Для прегнина отличительной особенностью строения является наличие этинильной группы (остаток ацетилена), который сохраняет кислотные свойства и взаимодействует с серебра нитратом:



Кислота азотная выделяется в количестве, эквивалентном прегнину, что может использоваться для количественного алкалиметрического определения:

HNO3 + NaOH ?NaNO3 + H2O

Хранение и применение

Лекарственные вещества светочувствительны, поэтому их хранят в темном месте в хорошо укупоренной таре, по списку Б.

Прогестерон и прегнин применяют в качестве гестагенных препаратов при нарушениях функции яичников, связанных с недостаточностью желтого тела.

Прогестерон назначают в виде 1% или 2,5%-ных растворах в масле для инъекций. Прегнин в 5-6 раз менее активен, чем прогестерон, но, в отличие от него, сохраняет активность при пероральном введении, особенно при подъязычном применении.[10]



Глава 3. Физико-химические методы анализа препаратов стероидных гормонов

Физико-химические методы широко используются на всех этапах фармакопейного анализа лекарственных веществ группы, в частности, для подтверждения подлинности производных циклопентанпергидрофенантрена (стероидных гормонов). Современная НД широко использует метод ИК-спектроскопии, позволяющий дать объективную оценку подлинности сложных по химической структуре лекарственных веществ группы. Полученный ИК-спектр препарата, снятый в вазелиновом масле или после прессования в таблетках с бромидом калия сравнивают с ИК-спектром ГСО, полученным в тех же условиях, или с рисунком ИК-спектра, прилагаемым к ФС. Таким образом, подтверждают подлинность большинства стероидных гормонов.

Помимо ИК-спектроскопии для установления подлинности и проведения испытаний на посторонние примеси ФС рекомендуют метод ТСХ и ВЭЖХ.

С помощью хроматографии в тонком слое определяют подлинность и доброкачественность лекарственных средств в случае присутствия в них близких по структуре посторонних примесей, являющихся полупродуктами или побочными продуктами синтеза.

Так, метод ТСХ рекомендован ФС для испытания подлинности тестостерона пропионата путем сравнения с ГСО. Методом ТСХ подтверждают подлинность ретаболила, дексаметазона, прогестерона, медроксипрогестерона ацетата в их лекарственных формах - идентификацию проводят по величине R_f в сравнении со стандартным образцом.

Методом ТСХ на пластинах Силуфол, Сорбфил, Кизельгель и других устанавливают во всех лекарственных веществах наличие примесей посторонних стероидов. При проведении подобных испытаний на пластину помимо исследуемого раствора наносят стандартные образцы, содержащие различные количества стероидов, примеси которых подлежат определению. Состав элюента нормируется частными ФС на препараты. Обнаружение зон примесей обычно проводят в УФ-свете с длиной волны 254 и 365 нм. В некоторых случаях зоны обнаруживают специальными реагентами: фосфорномолибденовой кислотой (при определении примесей в кортикостероидах, феноболине); толуолсульфоновой кислотой (примеси в андрокуре) и т.д. При проведении подобных определений стандарты примесей наносят количественно, чтобы было возможно сделать заключение о наличии примесей в испытуемом препарате и об их содержании. Суммарное содержание примесей в каждом конкретном препарате нормируется частной ФС, но, как правило, оно не должно превышать 2-4 %.

Для количественного определения стероидных гормонов ФС рекомендуют метод УФ-спектрофотометрии. Все изучаемые природные гормоны и их синтетические аналоги из группы кортикостероидов, гестагенных и андрогенных гормонов обладают свойством селективного поглощения УФ-излучения при 238-2422 нм, обусловленного наличием в структуре их молекул 4-3-оксогруппы. Максимум поглощения эстрогенных гормонов за счет ароматического кольца наблюдается при 280 нм. В качестве растворителей для стероидных гормонов чаще всего применяют 95 % этиловый или метиловый спирт, для эстрогенов - раствор натрия гидроксида.

Подлинность лекарственных средств группы устанавливают по наличию характерного максимума поглощения в УФ-спектре при указанной в ФС длине волны. Метод неспецифичен и его обычно сочетают с ТСХ-определениями.

Расчет количественного содержания лекарственного вещества выполняют по удельному показателю поглощения или сравнением с оптической плотностью ГСО. Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах или граммах проводится по формулам (1-3).



(1)

где: Ах - оптическая плотность исследуемого раствора,

W - объем мерной колбы, используемой для приготовления раствора, мл;

V - объем аликвоты исходного раствора, мл;

а - навеска анализируемого образца, взятая для приготовления исходного раствора,

I - толщина кюветы, см.

(2)

где Р - в зависимости от вида лекарственной формы, общий объем, общая масса ЛФ или средняя масса таблетки, капсулы и т.д.

(3)

где: А и Аст - соответственно оптическая плотность анализируемого и стандартного раствора;

W - объем мерной колбы, используемой для приготовления раствора, мл;

а - величина навески, г;

V - объем аликвоты, взятый для приготовления фотометрируемого раствора, мл.

Условия спектрофотометрического определения некоторых лекарственных веществ из группы стероидных гормонов приведены в таблице 1.

Определение количественного содержания стероидных соединений может быть также выполнено фотоколориметрически. Предварительно на определяемое вещество действуют одним из реагентов, используемых в качественном анализе и позволяющих получить растворимый продукт взаимодействия с устойчивой окраской.

Таблица 1. Спектральная характеристика лекарственных веществ

Лекарственное вещество	Растворитель	Максимум поглощения, лmaxнм.	Удельный показатель поглощения
Дезоксикортикостерона ацетат	Этанол	241	430-450
Кортизона ацетат	Этанол	238	390
Гидрокортизона ацетат	Этанол	241	395
Преднизолон	Метанол	242	400-430
Дексаметазон	0,1М р-р NaOH	241	383
Метилтестостерон	Этанол	241	540
Метандростенолон	Этанол	245	516
Феноболин	Этанол	240	430
Андрокур	Метанол	282	414
Этилэстрадиол	Этанол	280	65-69
Местранол	Этанол	279	59-64

3.1 Методы УФ-спектрофотометрии, основанные на собственном поглощении

Наиболее характерными стероидными гормонами, которые обладают собственным поглощением, используемым в количественном анализе, являются б,в-ненасыщенные кетоны, сопряженные диены и соединения, содержащие фенольное кольцо А.

б,в-Ненасыщенные кетоны

Наиболее часто встречающиеся сопряженные кетогруппы -- это Д⁴-3-кето- и Д^1,4-3-кетогруппы с максимумом поглощения в этанольной среде соответственно при 240 и 244 нм и молярным коэффициентом поглощения примерно 17000. На рис.1 представлены два характерных спектра поглощения, а также спектр менее важного Д⁴'⁶-3-кетопроизводного.

Как показано на рис.1, спектры Д⁴-3-кето- и Д^1,4-3-кетостероидов имеют большое сходство; единственное существенное их отличие состоит в наличии плеча в спектре последнего в области 266 нм. Это позволяет проводить их одновременное определение в соизмеримых количествах в бинарных смесях методом отношений оптических плотностей. Менее сложный случай представляет одновременное определение Д^4,6-3-кето-и Д^4,6-3-кетостероидов по их поглощению при 238 и 280 нм. При больших длинах волн можно определять следовые количества продуктов разложения типа Д^4,6-3-кетосоединений в спиронолактонах.

Рис.1. УФ - Спектры ненасыщенных 3 - кетостероидов в метаноле

Помимо простых случаев анализа промышленных кетостероидов в массе продукта непосредственное спектрофотометрическое измерение возможно только при анализе некоторых не слишком сложных лекарственных дозированных форм (см. различные фармакопеи), проб воздуха и т. п. Однако, как правило, спектрофотометрическое определение осложняется мешающим влиянием сопутствующих компонентов или основы образца. В таких случаях следует пользоваться методами измерения при разных длинах волн, избирательной экстракцией, хроматографическими методами разделения или, возможно, методом с применением борогидрида натрия.

Спектрофотометрические методы имеют еще большее значение после проведения предварительного хроматографического разделения. Спектрофотометрия в УФ-области -- идеальный способ контроля за выходом конъюгатов кетостероидов при элюировании и для их определения после разделения на хроматографической колонке. Реже спектрофотометрические методы определения применяются после разделения методом тонкослойной хроматографии и элюирования пятна; в этих случаях обычно проводят колориметрическое измерение.

Для определения Д⁴- и Д^1,4-З-кетостероидов в растворах при ферментации, масляных препаратах для инъекций, мазях [1] и низкодозированных таблетках [2] Гёрёг предложил дифференциальный спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении этих производных борогидридами щелочных металлов до соответствующих спектрально неактивных 3-оксипроизводных.

Рис. 2



Если в кювету сравнения поместить раствор восстановленного Д⁴-3-кетостероида (1 мг кетостероида и 0,1 г борогидрида натрия растворяют в 10 мл метанола и через 15 мин разбавляют метанолом до 100 мл), а в рабочую кювету -- раствор не восстановленного соединения с той же концентрацией, то разность оптических плотностей при 240 нм отвечает содержанию ненасыщенного кетона. Конечно, этот метод дает приемлемые результаты, только если сопутствующие компоненты и неизвестные примеси, дающие фоновое излучение, не реагируют с борогидридом натрия и, следовательно, дифференциальный спектр смеси при длинах волн выше 230 нм идентичен истинному спектру чистого кетостероида. Это иллюстрируется рис. 1, на котором представлены спектры метанольного экстракта масляного препарата для инъекций, содержащего прогестерон и бензоат эстрадиола; кривая 1 - это суммарный спектр двух стероидов, бензилового спирта (в качестве стабилизирующего агента) и небольшого количества масла, соэкстрагирующего с исследуемыми компонентами. Кривая 2 представляет дифференциальный спектр, почти идентичный спектру прогестерона, что указывает на устранение влияния поглощения всех других компонентов.

Рис. 3. УФ - спектры метанольных экстрактов масляных препаратов для инъекций, содержащих прогестерон и бензоат эстрадиола



Спектрально неактивные в этой области Д⁵⁽¹⁰⁾-3-кетоны спектрофотометрически можно определять, измеряя поглощение соответствующего Д⁴-3-кетона, поскольку первые можно легко перевести в последний путем кислотного или щелочного катализа [реакция (4)]. Определение норэтинодрела обычно проводят после выдерживания реакционной смеси в течение 1 ч или кипячения в течение 5 мин с 0,5 М соляной кислотой. Каталитическое действие гидроксид-иона в этой реакции примерно в 300 раз эффективнее, чем иона водорода. Поэтому при комнатной температуре даже при 0,01 М концентрации гидроксида натрия в течение 1 ч происходит количественное превращение, что позволяет проводить избирательное определение норэтинодрела в отдельных противозачаточных таблетках методом дифференциальной спектрофотометрии.

Рис. 4

3,5-Диены

Как видно из рис.4, незамещенные 3-алкоксипроизводные (енольная форма простых эфиров) и 3-ацилоксипроизводные (енольная форма сложных эфиров) обладают высоким светопоглощением.



Рис. 5

Поскольку все они являются производными Д⁴-3-кетонов [реакция (5)], а последние в свою очередь -- продуктами разложения енольных простых и сложных эфиров, Д⁴-3-кетоны могут оказаться потенциальными примесями. Это осложняет определение енольных форм эфиров, потому что все эти соединения имеют весьма схожие спектры (см. рис. 2 и 3).

Рис. 6. УФ - Спектры 3,5 - диенов в метаноле



Как видно из реакции (5), Д⁴-3-окси-, а также ацилоксипроизводные можно превратить в 3,5-диены путем катализируемого кислотами удаления воды или карбоновых кислот, и, следовательно, по поглощению образующихся 3,5-диенов можно определить эти спектрально-неактивные производные. Используя соляную кислоту в качестве катализатора, можно определить диацетат этинодиола даже в отдельных таблетках [2].

Из 3-б-эпимеров вода удаляется примерно в пять раз быстрее, чем из Зв-эпимеров.

Фенольное кольцо А

На рис. 7 представлены четыре характеристических спектра эстрогенов, содержащих фенольное кольцо А (в форме свободного фенола, фенолят-иона, простого эфира и сложного эфира). Эти спектры очень характеристичны, но из-за несколько низкой интенсивности поглощения к использованию УФ-спектрофотометрии для количественных определений нужно подходить с большой осторожностью, поскольку возможности непосредственного измерения без предварительного разделения или введения поправки на поглощение фона очень ограниченны.

Рис. 7. УФ-Спектры стероидов, содержащих фенольное кольцо А [(растворитель - смесь метанола с водой (4:1)]



Приведем один из многочисленных примеров, когда УФ-спектрофотометрию использовали для количественного определения после хроматографического разделения. Так, Шрёдер и др. проводили разделение эстрона, эстрадиола, эквилина и эквиленина на пластинке, покрытой силикагелем, после кислотного гидролиза их сульфатов и экстракции свободного фенола хлороформом. Первые три соединения экстрагируют 1 %-ным водным раствором гидроксида натрия и измеряют поглощение их ионных форм при 296 нм, а присутствующий в низких концентрациях эквиленин экстрагируют метанолом и измеряют его поглощение при 231 нм, когда чувствительность измерения намного выше.

В некоторых методиках, предложенных для определения эстрогенов, проблемы, связанные с поглощением фона, были решены с привлечением химических или математических методов. В большинстве из них описывается определение малых количеств эстрогенов в присутствии больших количеств кетостероидов, когда малоинтенсивные полосы кетостероидов, обусловленные п--р-переходами, мешают определению. Для анализа противозачаточных таблеток, в которых соотношение кетостероидов и эстрогенов не очень велико, достаточно использовать один из вариантов метода базисной линии, как это сделали Кий и Шрофф и Гродски. В последней работе авторы повысили избирательность измерения, применив селективную экстракцию эстрогенов метилциклогексаном. Бруннер и Кунц [3] описали метод определения местранола в различных смесях, сочетающий разделение колоночной хроматографией и УФ-спектрофотометрическое измерение с поправкой на поглощение холостого раствора.

При определении примесей эстрогенов в 19-норстероидах отношение кетостероид/эстроген обычно составляет от 100 до 10000. Столь малые количества эстрогенов нельзя определить даже с помощью метода базисной линии, поскольку поглощение фона больше поглощения определяемых компонентов. Для решения этой проблемы Легран и др. восстанавливали кето-группу кетостероидов борогидридом калия в щелочном растворе метанола, что привело к почти полному устранению поглощения фона. Остаточное поглощение фона можно легко учесть, используя метод базисной линии. Этот метод позволяет определить до 0,01 % эстрогенов в 19-норстероидах. По сути дела тот же метод использован в работе Бестоу и рекомендован Британской фармакопеей [4] для определения местранола в противозачаточных таблетках Гёрёг и Чизер упростили этот метод, заменив борогидрид калия борогидридом натрия и исключив гидроксид натрия, что позволило сократить время реакции с 6,5--18 ч до 15 мин.

Наличие батохромных и гиперхромных сдвигов в спектрах чистых эстрогенов в щелочной среде (около 0,2 М гидроксида натрия; см. рис. 7) открывает новые возможности для их селективного определения.

Селективность и чувствительность измерения поглощения щелочных растворов эстрогенов относительно раствора холостого опыта увеличиваются по сравнению с селективностью и чувствительностью измерения поглощения нейтрального раствора, на чем в фармакологии основано несколько методик определения стероидов.

Избирательность измерения можно увеличить еще больше, поместив в кювету сравнения раствор исследуемого материала в недиссоциированной форме с такой же концентрацией. В этом варианте дифференциального спектрофотометрического метода устраняется мешающее влияние поглощающих неионизированных веществ. Метод, рекомендуемый фармакопеей XX США для определения валерата эстрадиола в масляных препаратах для инъекций в отсутствие кетостероидов, можно использовать для анализа препаратов для инъекций с высоким содержанием стероида (выше 10 мг/мл), если в кювету сравнения помещать кислый (0,02 М), а в рабочую кювету -- сильнощелочной (0,6 М) раствор. Гёрёг повысил избирательность этого метода, используя раствор с рН 9 (боратный буфер) в качестве раствора сравнения (фенольная оксигруппа еще не ионизирована), создавая в растворе пробы 0,2 М концентрацию щелочи и предварительно восстанавливая кетостероиды борогидридом натрия. В этом варианте удалось полностью устранить мешающее влияние примесей, поглощение которых изменяется как в интервалах рН 2--9, так и при концентрации щелочи 0,2--0,6 М; окисление Д⁴-3-кетонов кислородом воздуха в щелочной среде также не оказывает мешающего влияния. Измерение разности оптических плотностей при 300 нм позволяет проводить количественный анализ низкодозированных препаратов для инъекций даже в присутствии больших количеств кетостероидов.

При помощи дифференциального спектрофотометрического метода, проводимого в щелочной среде, можно определять свободные эстрогены и их сложные эфиры (последние в щелочной среде быстро гидролизуются). Простые эфиры, конечно, не вступают в реакцию, но их фенольные производные реакционноспособны, что позволяет селективно определять их примеси.

(8)

Как видно из уравнения (8), в метанольной среде в присутствии соляной кислоты 10в-окси-4-ен-3-кетоны (примеси 19-нор-4-ен-3-кетонов) можно количественно перевести в соответствующее фенольное производное простого эфира. С помощью этой реакции и вышеупомянутого спектрофотометрического метода определения стероидов фенольного типа Гёрёг определил следовые количества таких веществ.



3.2 УФ-спектрофотометрические и колориметрические методы, основанные на химических реакциях

В ранний период развития химии стероидов (до распространения хроматографических методов, особенно газовой хроматографии) они (вместе с флуориметрией) были единственными достаточно чувствительными и селективными методами определения стероидов. С введением в аналитическую химию стероидов более селективных и чувствительных газохроматографических, радиоаналитических и других методов значение колориметрических методов несколько упало, но они до сих пор главенствуют в фармацевтическом анализе стероидов и сохраняют до некоторой степени свое значение в биоклиническом анализе.

Большинство статей по применению колориметрических методов анализа половых гормонов посвящено определению соединений, содержащих кетогруппы или фенольное кольцо А.[7]

Определение кетостероидов

Некоторые (амины, гидразины и производные гидразидов) из реагентов, используемых для колориметрического определения кетостероидов, содержат --NH₂-гpyппy, реагирующую с карбонильной группой с образованием продуктов конденсации типа =C=N--.

Другая часть колориметрических методов основана на реакциях активной метиленовой группы, расположенной рядом с кетогруппой, с реагентами типа ароматических ди- и тринитропроизводных (диэтилоксалата, 2,6-ди-трет-бутил-n-крезола и т. п.).

Имеется еще несколько реагентов, используемых в других (иногда не совсем ясных) реакциях.

Здесь будут обсуждаться только два важнейших метода: метод с использованием гидразида изоникотиновой кислоты (ГИН) и метод Циммермана (с использованием 1,3-динитробензола).

При обработке ненасыщенных кетостероидов с помощью ГИН Эрколи и др. наблюдали возникновение желтой окраски, которую Умбергер использовал в аналитических целях. Этот метод основан на реакции конденсации между кетогруппой и гидразидной группой реагента (0,05 %) в метаноле, содержащем 0,007 М соляной кислоты.

(9)

Максимум поглощения протонированной желтой формы продукта конденсации ⁴-3-кетостероидов лежит около 380 нм (11000--12000). При комнатной температуре реакция заканчивается через 20 мин. Более низкой реакционной способностью обладают Д^1,4-З-кетоны. По методике Рида и Уолтерса необходимо нагревание в течение 1 ч при 50 °С. Как сообщали Кавина и др., другая возможность заключается в использовании более концентрированного реагента (0,8 %-ный ГИН примерно в 0,1 М соляной кислоте) при комнатной температуре и продолжительности реакции 2--3 ч. Максимум поглощения Д⁴'⁶-3-кетонов и Д¹'⁴-3-кетонов находится между 405 и 415 нм, молярный коэффициент поглощения равен 16 500--18 500. Различие в реакционной способности Д⁴-3-кето- и Д^1,4-3-кетостероидов позволяет проводить обнаружение и даже полуколичественное определение первых в присутствии последних.

Преимущество метода с использованием ГИН заключается в том, что окраска мало зависит от замены растворителя. Введение этанола или еще лучше хлороформа в реакционную смесь позволяет без затруднений анализировать масляные препараты для инъекций без предварительной экстракции. Лишь в случае низкодозированных препаратов для инъекций рекомендуется хроматографическое отделение кетостероидов от масла на колонке, заполненной флорисилом.

Помимо анализа различных препаратов для инъекций метод с использованием ГИН был с успехом применен Bу для определения прогестинов в противозачаточных таблетках. Недавно описана методика анализа отдельной таблетки, согласно которой для отделения прогестина от основы таблетки целесообразно хроматографирование на микроколонке; таким образом можно свести к минимуму объем элюента (хлороформа), что позволяет определить в одной таблетке до 0,35 мг норэтистерона.

Метод с использованием ГИН легко поддается автоматизации; эта возможность была реализована для анализа таблеток и препаратов для инъекций [5].

ГИН-Метод в настоящее время является самым распространенным стандартным методом определения кетостероидов в готовых лекарственных формах. Помимо анализа готовых лекарственных форм он применяется и для анализа стероидов в массе фабричного продукта. Для решения более сложных задач (разделение и количественная оценка содержания компонентов в смесях или получение достоверных данных в присутствии продуктов разложения) его часто применяют в сочетании с бумажной, колоночной и тонкослойной хроматографией и элюированием пятна.

Хотя ГИН-метод находит применение главным образом в фармакологии, Мацуи и Такахаши использовали его для определения кетостероидов в биологических объектах, а именно для контроля за ферментативным превращением тестостерона и его конъюгатов в соответствующие 4,5-дигидропроизводные, не реагирующие с ГИН.

В то время как главной областью применения ГИН-метода является фармацевтический анализ, другой метод, выбранный для подробного обсуждения -- реакция Циммермана,-- в настоящее время используется почти исключительно в клиническом анализе для определения 17-кетостероидов в моче.

17-Кетостероид реагирует по своей активной метиленовой группе при С-16. Образующийся на первой стадии реакции бесцветный промежуточный продукт дегидрируется под действием 1,3-динитробензола в окрашенный мезомерный анион, изображенный на схеме (10).

(10)

Необходимым условием протекания реакции является удобное стерическое расположение кетогруппы по соседству с метиленовой группой. Так, например, 3-кетостероиды (в том числе Д⁴-3-кетостероиды) и 21-незамещенные 20-кетостероиды дают положительную реакцию, тогда как Д^1,4-З-кетостероиды (не имеющие активной метиленовой группы) и стерически экранированные 6-, 7-, 11- и 12-кетостероиды не вступают в нее.

Основные цели оптимизации условий заключаются в стабилизации интенсивности окраски и характера спектра и в повышении чувствительности и правильности метода.

Максимум поглощения дегидроэпиандростерона в различных реакционных условиях находится около 520 нм. Молярный коэффициент поглощения в первоначальной методике (реакция в этаноле в смеси с 1,3-динитробензолом и водным раствором гидроксида калия) составляет около 15 000. Введение пиридина в реакционную смесь его до 21 000. Во многих случаях, даже в современных автоматических методах, приходится использовать условия, при которых чувствительность гораздо ниже.

Основные трудности связаны с тем, что для полного протекания реакции (10) необходима сильнощелочная среда, а в таких условиях окраска недостаточно устойчива. Было предпринято несколько попыток решить эту задачу, в частности используя органические основания типа гидроксида бензилтриметиламмония или соответствующего метоксипроизводного вместо гидроксида калия или экстракцией окрашенного продукта реакции органическими растворителями типа эфира, хлороформа и т. п.

По-видимому, наиболее существенным практическим усовершенствованием реакции Циммермана за последнее время было предложенное Эпштейном и использованное другими авторами введение водных растворов. По методике с использованием водных растворов для приготовления реагента из 1,3-динитробензола в качестве растворителя берут 5 %-ный водный раствор детергента гиамина 1622 (хлорид диизобутилфеноксиэтоксиэтилдиметилбензиламмония). Как только раствор, содержащий пробу, и этот реагент сильно подщелачивают 10 М водным раствором гидроксида калия, быстро развивается окраска по реакции Циммермана и продукт сразу же осаждается из раствора совместно с большей частью избытка реагента, вследствие чего удается избежать его разложения. Реакция протекает 15 мин при комнатной температуре, после чего можно проводить измерения. Для этого мутный раствор разбавляют таким же объемом 2,5%-ного раствора гиамина 1622 с целью солюбилизации осадка или проводят экстракцию окрашенного продукта эфиром из сильнощелочного раствора.

Существенным недостатком всех вариантов метода Циммермана является заметное поглощение холостой пробы и появление фона в спектре, обусловленные присутствием посторонних компонентов. Частично их влияние можно уменьшить, используя особо чистые реагенты и растворители (это не необходимо при проведении водного варианта метода). При анализе биологических объектов помимо фона в спектре следует еще учитывать поглощение матрицы. Поэтому часто прибегают к алгебраическим поправкам. Наиболее известна поправка Аллена, для получения которой измеряют оптическую плотность в максимуме и при двух других длинах волн, а затем по уравнению (11) вычисляют исправленную оптическую плотность для исследуемого и холостого растворов:

(11)

где -- длина волны в максимуме поглощения, а Д обычно составляет 60 нм.

Фелдкамп и др. тщательно исследовали обоснованность введения такой поправки и пришли к выводу, что ею можно успешно пользоваться, только если спектры стандартного раствора и пробы различаются не очень сильно.

Наконец, остается упомянуть, что оба варианта метода Циммермана, водный и неводный, могут быть автоматизированы.

Фенольное кольцо А

Методы колориметрического определения эстрогенов, основанных на реакциях фенольного кольца А.

Эти прямые более или менее стехиометрические, но в основном не очень чувствительные методы имеют ограниченное применение, и их практическое значение обычно исчерпывается анализом лекарственных препаратов.

Гораздо большее значение, как в фармацевтике, так и в биомедицине имеют нестехиометрические, но очень чувствительные методики, основанные на реакциях с реагентами, содержащими большие количества сильных кислот, в основном серной кислоты.

Самый простой реагент -- это сама серная кислота. Она используется главным образом для идентификации стероидных гормонов (и не только эстрогенов, но и стероидов других классов). Это очень важный способ их качественного анализа, поскольку он часто позволяет обнаруживать большие различия между близкими по структуре стероидами, УФ-спектры которых в этаноле практически не отличаются.

С точки зрения количественного анализа гораздо более важны методы, в которых используется разбавленная серная кислота; в качестве разбавителей обычно применяется этанол или метанол. Главная область применения этих реагентов -- фармацевтика, поскольку их высокая чувствительность позволяет проводить анализ низкодозированных таблеток, содержание этинилэстрадиола и местранола в которых нельзя определять менее чувствительными УФ-спектрофотометрическими методами. Серная кислота в сочетании с этанолом была использована рядом авторов для указанной выше цели, а также при контроле ферментации. На рис.12 представлены спектры этинилэстрадиола и норгестрела в смеси серная кислота--этанол в соотношении 65:35 (по объему).

Рис.12. Спектры активных компонентов противозачаточных таблеток в смеси серной кислоты и этанола в соотношении 65:35 (по объему)



Спектры снимали через 20 мин после начала реакции при комнатной температуре; они сохраняются неизменными в течение нескольких часов. Очевидно, различия между спектрами делают возможным одновременное определение обоих стероидов, что было использовано при анализе отдельных противозачаточных таблеток. Вероятно, устойчивость окраски сильно зависит от чистоты этанола и серной кислоты, используемых в анализе.

Вероятно, наиболее широко распространенным реагентом для определения этинилэстрадиола и местранола в таблетках является смесь серная кислота--метанол в соотношении 7:3 (по объему). Этот реагент, обеспечивает устойчивую и очень интенсивную окраску для двух упомянутых выше соединений (макс = 540 нм, =34000) с необычайно высокой избирательностью. Эстрон, эстрадиол и т. п., не содержащие 17-этинильной группы, не дают такой окраски, что указывает на необходимость наличия в молекуле стероида одновременно фенольного кольца А и 17-этинил-17-оксигруппы. В первоначальном варианте методики окраска проявлялась в процессе экстракции эстрогенов и самого реагента из их раствора в петролейном эфире.

Несмотря на удовлетворительные чувствительность и селективность реакции с участием реагентов, содержащих разбавленную этанолом или метанолом серную кислоту, и на простоту методики, в биомедицине гораздо чаще применяются более длительные двухстадийные реакции, обладающие еще большей чувствительностью и селективностью, с участием реагентов, содержащих серную кислоту, воду и добавки. Одно время эти реакции лежали в основе стандартных методик фармацевтического анализа. На первой стадии этих методик, основанных на классической методике Кобера, эстроген нагревают примерно с 65 %-ной (по объему) серной кислотой, содержащей немного фенола, до образования желтого продукта (_макс450 -- 500 нм). На второй стадии смесь разбавляют водой до 40-- 50 %-ной концентрации серной кислоты и снова нагревают. При этом окраска переходит в розовую (505 -- 555 нм). Для разных эстрогенов молярный коэффициент поглощения составляет от 40 000 до 50 000.

Вместо самого фенола на первой стадии реакции были опробованы и его производные. Из них в настоящее время повсеместно применяется гидрохинон. Состав реагента Брауна зависит от определяемого эстрогена. Он содержит 2 г гидрохинона на 100 мл разбавленной серной кислоты, 66 %-ной (по объему) для эстрона, 60 %-ной для в-эстрадиола и 76 %-ной для эстриола. Определяемый эстроген обрабатывают 3 мл соответствующего реагента при 100 °С в течение 20 мин, охлаждают, разбавляют водой (0,5 мл в случае эстрона, 0,2 мл в случае в-эстрадиола и 1 мл для эстриола) и нагревают еще 10 мин. По уравнению Аллена, вычисляют исправленную оптическую плотность [см. уравнение (11)]. Длины волн соответственно равны 480, 513 и 546 нм.

3.3 Инфракрасная спектрофотометрия

В классический период развития химии стероидов инфракрасная спектроскопия была наиболее мощным средством установления структуры стероидных соединений и даже в наши дни остается одним из наиболее важных методов в этой области.

Наряду с применением ИК-спектроскопии для идентификации стероидов и установления их структуры этот метод имеет важное значение для распознавания полиморфных модификаций, часто встречающихся у стероидных гормонов.

По сравнению с этими областями ИК-спектрофотометрия как метод количественного анализа стероидов имеет меньшее значение. Тем не менее, по этому вопросу опубликовано большое количество статей, начиная с раннего периода развития анализа стероидов и до последнего времени.

Большим преимуществом ИК-спектрофотометрии по сравнению с УФ-спектрофотометрией является то, что спектры даже в наименьшей степени замещенных производных относительно богаты характерными полосами поглощения, что позволяет анализировать даже сложные смеси стероидов без какого-либо предварительного разделения. Однако метод ИК-спектрофотометрии имеет и определенные недостатки. Чувствительность его чрезвычайно мала: значения молярных коэффициентов поглощения полос, наиболее часто используемых в количественном анализе стероидов, составляют всего 50--300. Кроме того, из-за отсутствия полностью прозрачных растворителей толщина кюветы должна быть гораздо меньше, чем при УФ-спектрофотометрических измерениях (обычно она не превышает 0>5 мм). Это значит, что концентрация измеряемого раствора в большинстве случаев должна составлять несколько процентов.

Другая трудность заключается в том, что оптические плотности, на определении которых основаны количественные измерения, нельзя измерить непосредственно; их можно оценить по спектрам, используя метод базисной линии. Поэтому методы ИК-спектрофотометрии характеризуются меньшей правильностью и более низкой воспроизводимостью, чем методы УФ-спектрофотометрии.

Хотя спектры твердых веществ, полученные методами ИК-спектрофотометрии на таблетках из бромида калия и тонких поверхностных пленках, а также методом инфракрасной отражательной спектроскопии, нашли применение в количественном анализе, в большинстве случаев рекомендуется использовать спектры растворов.

Наиболее употребительным растворителем является хлороформ, однако описано также применение тетрахлорида углерода и дисульфида углерода. В ближней инфракрасной области можно использовать и другие растворители, например пиридин.



3.4 ЯМР-спектроскопия

ЯМР-Спектроскопия обладает исключительно высокой избирательностью, но очень низкой чувствительностью, поэтому для выполнения определений требуется, по меньшей мере, несколько миллиграммов вещества. Этот недостаток, конечно, не позволяет использовать его в количественном биоклиническом анализе, но не исключает его применения в фармацевтическом анализе стероидов.

Например, Авдович и др. определяли содержание местранола в массе фабричного продукта, регистрируя его спектр в дейтеропиридине (дифенилуксусная кислота применялась в качестве внутреннего стандарта) и измеряя интенсивность линии протонов метокси- и этинильной групп. Та или другая из этих групп отсутствует в потенциальных примесях местранола (эстроне и этинилэстрадиоле), поэтому метод достаточно селективен. Те же авторы предложили определять А^1,4-3-кетостероиды в лекарственных препаратах по линии С-1 протона.

Описанные выше и аналогичные им методики можно рассматривать в качестве оригинального практического приложения ЯМР-спектроскопии в довольно узкой области анализа стероидов. ЯМР-Спектроскопия никогда не заменит существующие стандартные методы, однако в отдельных случаях уникальная селективность этого метода облегчает решение гораздо более сложных задач.

В качестве примера можно привести методику одновременного определения изомеров эстрадиол-3-метилового эфира, предложенную Хойером.

При гидрировании тем или иным способом 3-метокси-1,3,5(10),8,9-эстра-тетраен-17в-ола(I) по Д⁸-двойной связи продукт реакции может содержать небольшие количества исходного вещества, три изомера метилового эфира эстрадиола [«природного»3-метокси-8бН,9аН-1,3,5(10)-эстратриен-17в-ола(II), 3-метокси-8бН,9бН-1,3,5(10)-эстратриен/17в-ола(III) и 3-метокси-8вН,9вН-1,3,5-(10)-эстратриен-17в-ола(IV)] и 3-метокси-1,3,5(10),6,8(9)-эстрапентаен-17в-ола(V). На химический сдвиг ангулярной 13-метильной группы влияет наличие протонов в положениях 8 и 9, а также их конфигурация; следовательно, возможно одновременное определение этих соединений.

Как видно из табл. 2, химические сдвиги 13-метильных групп соединений I, II, III + IV и V в дейтеробензоле в качестве растворителя достаточно хорошо разрешены (спектры сняты на приборе, работающем на частоте 100 МГц); следовательно, их можно избирательно определить по соответствующей интегральной интенсивности. Что касается соединений III и IV, то можно определить лишь их сумму, но сами изомеры можно разделить методами газовой хроматографии.

Табл. 2. Химические сдвиги 13-метильной группы в спектрах продуктов восстановления 3-метокси-1,3,5 (10),8(9)-эстратетраен-17в-ола в различных растворителях

3.5 Колоночная хроматография

Хотя колоночную хроматографию нельзя рассматривать как прямой метод количественного анализа стероидов.

В большинстве упомянутых публикаций колоночная хроматография использована для определения стероидов в сложных биологических объектах, но она широко применяется и для разделения стероидов в лекарственных препаратах.

Поскольку стероиды -- это соединения средней полярности, для их разделения применяется широкий круг адсорбентов и систем растворителей.

...