Физико-химические методы определения стероидных гормонов

Все адсорбенты, предложенные в классический период развития хроматографии стероидов, такие, как силикагель, кизельгур, оксид алюминия и силикат магния (флорисил), используются и до сих пор. Чтобы добиться разделения родственных стероидов или выделения всех стероидов из сложных смесей, адсорбенты часто пропитывают солями серебра. Например, Пеннер для выделения хингестанола и продуктов его разложения из сезамового масла в качестве адсорбента использовали флорисил, обработанный аммиачным раствором нитрата серебра, и в качестве элюента этанольный раствор хлорида аммония.

Ионообменная хроматография пригодна не только для разделения кислых стероидов, как, например, эстрогенов и их производных, она широко применяется для выделения (или, как часто говорят, экстракции) нейтральных стероидов из биологических проб. Для этих целей почти всегда используется стиролдивинилбензольная смола амберлит XAD-2. Например, Эггер и др. выделяли стероиды, содержащиеся в моче, непосредственно после их ферментативного гидролиза на колонке размером 600x20 мм, заполненной XAD-2 и промытой 5%-ным водным раствором хлорида натрия. Стероиды вымывали из колонки метанолом; полученный раствор пригоден для установления профиля концентраций стероидов методом капиллярной газовой хроматографии.

Наиболее важным моментом в развитии колоночной хроматографии стероидов в последнее десятилетие следует считать введение гель-проникающей хроматографии, которая сейчас чаще всего применяется при подготовке биологических проб для количественного анализа методами газовой хроматографии, радиоиммунными методами и др. Первоначально использовали (а часто используют и сейчас) полидекстрановые гели, например сефадекс G-25 и G-10, но впоследствии было найдено, что путем уменьшения их полярности, например связывая свободные оксигруппы сефадекса G-25 с образованием оксипропилпроизводных, можно добиться лучших результатов. Для разделения и очистки стероидов разной полярности чаще всего применяют сефадекс LH-20.

(19)

Сефадекс LH-20 особенно удобен при разделении стероидов с близкой полярностью. На рис.19 приведен характерный пример -- кривая элюирования восьми эстрогенов, взятая из статьи Лисбоа и Страсснера.

Для разделения менее полярных стероидов в последние годы все шире и шире используются оксиалкоксипропилпроизводные сефадекса LH-20 (липидекс). На рис. 20 показано разделение стероидов на короткой колонке, заполненной липидексом.

В отдельных случаях с особой целью были получены специальные производные сефадекса LH-20. Аксельсон и Сьявалл описали избирательную сорбцию слабоосновных метоксимов стероидов на сульфоэтил-LН-20 и разделение стероидов на нейтральную и фенольную фракции на триэтиламиноокси-лропилоксилалкил-сефадексе LH-20.

Рис. 20. Разделение стероидов на небольшой колонке (8 см*0,4 см) с липидексом

Столь же общеупотребительным является диэтиламиноэтильное производное сефадекса (DEAE-сефадекс) для разделения кислых стероидов.

Недавно группой исследователей под руководством Адлеркройца показана возможность комбинированного использования нейтральной и ионообменной колонок, заполненных сефадексом. При установлении профиля концентрации стероидов, содержащихся в моче (в основном эстрогенов), они применяли сефадекс G-25 для разделения стероидов и сефадекс LH-20, а также ОН^- и ОАс^-формы DEAE-сефадекса А-25 в качестве анионообменника для очистки и фракционирования стероидов; кроме того, описано применение колонки с липидексом 5000 для очистки триметилсилилированных стероидов перед их количественным определением методом газожидкостной хроматографии.

Наиболее важными причинами необычайно быстрого распространения и высокой популярности в аналитической химии стероидов колонок, заполненных сефадексом, являются низкие и воспроизводимые значения холостых опытов, хорошая воспроизводимость объемов элюирования и высокий процент выделения.

Распределительная жидкость-жидкостная хроматография использовалась уже в ранний период развития хроматографии стероидов и все еще применяется в настоящее время, особенно в фармацевтике. В качестве неподвижной фазы на носителях диатомитах (в основном целите 545) служат различные полярные растворители, как, например, вода, водный раствор гидроксида натрия, формамид, этиленгликоль, ацетонитрил и т. п., а подвижной фазы -- несмешивающиеся с ними неполярные растворители. В качестве примера можно упомянуть колонку, заполненную целитом и с ацетонитрилом в качестве подвижной фазы, описанную Грэхемом и др. Получены параметры удерживания 44 стероидов при элюировании н-гептаном и хлороформом; эту систему успешно применяли для решения различных задач разделения, в том числе разделения эфиров тестостерона и свободного тестостерона с последующим количественным анализом элюатов методами УФ-спектрофотометрии или колориметрии. К одному из последних достижений в распределительной колоночной хроматографии стероидов относится разработка химически связанной обращенной фазы с группами C₁₈(Sep-Pak) (Хейккинен и др.) для экстракции эстрогенов мочи и (Шеклтон и др.) извлечения других стероидов. Из специальных хроматографических методов отметим гель-фильтрацию для определения свободных прогестерона, тестостерона и эстрадиола в плазме. Введение многоколоночных и многодетекторных систем, автоматизация и применение ЭВМ значительно повысили роль колоночной хроматографии в анализе многочисленных многокомпонентных смесей стероидов.[6]

3.6 Методы ТСХ, УФ-спектрофотометрии и фотоколориметрии в фармакопейном анализе лекарственных средств

Идентификация метилтестостерона и метандростеналона в смеси методом ТСХ.

Методика. На линию старта хроматографической пластинки марки Сорбфил-УФ-254 размером 510 см наносят 0,01 мл 0,1 % стандартных растворов препаратов в этаноле и смесь веществ. Хроматографируют восходящим методом в системе растворителей гексан-ацетон 7:3. Когда фронт растворителя поднимется на 8 см, пластину вынимают и сушат на воздухе. Детекцию пятен проводят в УФ-свете или опрыскиванием пластины 10 %-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в ацетоне. После обработки пластину нагревают в сушильном шкафу при 110-120С в течение 1-2 мин. Идентификацию индивидуальных веществ в смеси проводят, рассчитывая и сравнивая величину R_f зон метилтестостерона и метандростенолона в смеси и стандартах.

Определение посторонних стероидных примесей в гидрокортизона ацетате методом ТСХ.

Методика. На линию старта пластинки «Сорбфил-УФ-254» размером 815 см наносят 0,01 мл 0,01 % раствора (100 мкг) субстанции гидрокортизона ацетата в смеси 95 % спирт-хлороформ (1:1); 0,005 мл (0,5 мкг); 0,01 мл (1мкг); 0,015мл (1,5кг) и 0,02мл (2мкг) растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) гидрокортизона и гидрокортизона ацетата.

Хроматографируют восходящим методом в камере со смесью растворителей хлороформ - метиловый спирт - вода (95:5:0,2). Длина пробега растворителя - 13 см. Высушенную на воздухе пластинку просматривают в УФ-свете при 254 нм.

Пятна посторонних примесей на хроматограмме испытуемого препарата сравнивают по величине и интенсивности окраски с пятнами СОВС: пятно примеси гидрокортизона сравнивают с пятном СОВС гидрокортизона, пятна других возможных примесей сравнивают с пятнами СОВС гидрокортизона ацетата. Суммарное содержание примесей не должно превышать 4 %.

Приготовление растворов СОВС. 0,01 г гидрокортизона (стандарт) и 0,01 г гидрокортизона ацетата растворяют в 70 мл смеси 95 % спирт-хлороформ (1:1) в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора той же смесью растворителей до метки и перемешивают.

Подтверждение подлинности дексаметазона в лекарственной форме «Раствор дексаметазона 0,1 % (глазные капли)» методом ТСХ.

Состав:

Дексаметазона натрия фосфата в пересчете на дексаметазон 0,1 г

Вспомогательные вещества:

Воды для инъекций до 100 мл

Методика. 0,005 мл препарата (5 мкг в пересчете на дексаметазон) наносят на линию старта пластинки Сорбфил UV-254 размером 510 см. Рядом наносят 0,005 мл 0,13 % раствора свидетеля - дексаметазона натрия фосфата (5 мкг в пересчете на дексаметазон). Пластинку высушивают на воздухе 10 мин. Хроматографируют в системе: н-пропиловый спирт (ТУ 6-09-4344-77, х.ч.) - аммиака раствор концентрированный (7:3). Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, подсушивают на воздухе в течение 10 мин и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм. Основное пятно на хроматограмме испытуемого препарата должно находиться на уровне основного пятна на хроматограмме раствора свидетеля - дексаметазона натрия фосфата.

Количественное определение дексаметазона в глазных каплях

Состав:

Дексаметазона натрия фосфата в пересчете на дексаметазон 0,1 г

Вспомогательные вещества

Воды для инъекций до 100 мл

Количественное определение.

0,5 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл. Доводят объем раствора до метки 0,1М раствором натра едкого, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 241 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 0,1М раствор натра едкого.

Содержание дексаметазона натрия фосфата в пересчете на дексаметазон в 1 мл препарата вычисляют по формуле (4):

(4)

где: А - оптическая плотность спектрофотометрируемого раствора препарата, см-1.

383 - удельный показатель поглощения дексаметазона при длине волны 241 нм, ( Е, см %)-1.

Содержание С22Н28FNа2О8Р (дексаметазона натрия фосфата) в пересчете на дексаметазон в 1 мл препарата должно быть от 0,0009 до 0,0011 г.

Количественное определение преднизолона в таблетках по 0,001 г и 0,005 г

Методика. Точную навеску растертых в порошок таблеток, содержащую около 0,001 г преднизолона, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 25-30 мл 95 % спирта, встряхивают в течение 5-6 мин, доводят до метки 95 % спиртом и снова перемешивают, фильтруют в сухую колбу, отбрасывая первые 10-15 мл фильтрата; 25 мл фильтрата вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят 95 % этанолом до метки, перемешивают и измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 242 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, применяя в качестве контрольного раствора 95 % этанол. Повторяют такое же измерение с 0,001 % раствором РСО преднизолона.

Содержание преднизолона должно быть 0,0009-0,0011 г или 0,0045-0,0055 г в пересчете на среднюю массу одной таблетки. Расчет проводят по формуле (5):

(5)

где: F - рефрактометрический фактор определяемого ингредиента;

с1 - концентрация сопутствующего ингредиента, %;

F1 - рефрактометрический фактор сопутствующего вещества;

V - объем растворителя, взятый для приготовления ЛФ, мл;

a - навеска ЛФ, взятая для анализа, г

Следует отметить, что содержание сопутствующих веществ в этой формуле (с₁, с₂ и т. д.) должно быть выражено в %.

Количественное определение преднизолона и преднизолона ацетата в мази.

Методика. К точной навеске мази, которая содержит около 0,0025 г преднизолона (или преднизолона ацетата), приливают 10 мл горячего 95 % этанола, перемешивают и фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию повторяют тремя порциями по 10 мл горячего этанола. После охлаждения до комнатной температуры фильтрат доводят до метки 95 % этанолом и перемешивают. 10 мл полученного раствора вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят до метки 95 % этанолом, перемешивают и измеряют оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 242 нм, применяя в качестве нулевого раствора 95 % этанол.

Повторяют такое же измерение с 0,001 % раствором РСО преднизолона (или преднизолона ацетата) в 95 % спирте. Расчет проводят по формуле (6).

где: V - объем растворителя, использованного для растворения вещества, мл;

Р - средняя масса анализируемого порошка, г;

а - навеска лекарственной формы, г.

Количественное определение метилтестостерона в таблетках по 0,005 г

Методика. Около 0,05 г растертых в порошок таблеток (точная навеска) помещают в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки 95 % этанолом и встряхивают в течение 5 мин. Фильтруют в сухую колбу через беззольный фильтр, отбрасывая первые 10-15 мл фильтрата. Вносят пипеткой 5 мл фильтрата в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем до метки 95 % этанолом и измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 241 нм в кювете с толщиной слоя 1 см; нулевой раствор - 95 % этанол.

Расчет проводят по формуле (7). Значение удельного показателя поглощения метилтестостерона, Е=540 (табл. 1).

Содержание метилтестостерона должно быть 0,0045-0,0055 г в пересчете на среднюю массу одной таблетки. [4]

Заключение

Стероидные гормоны являются производными ряда углеводородов, главным образом прегнана, андростана, эстрана.

Они сходны между собой по химической структуре. Отличие от андростана состоит лишь в том, что прегнан имеет в молекуле этильный радикал, а эстран -- ароматическое ядро и у него отсутствует одна из метальных групп.

Структурной основой стероидных гормонов является гидрированный скелет углеводорода циклопентанпергидрофенантрена.

Метильные группы, присоединенные к стероидному циклу в положениях 10 и 13, называются ангулярными. Радикал R и атомы водорода (в положениях 8, 9, 14) ориентированы в пространстве в цис- или транс-положении. Условно принято считать, что ангулярные метильные группы расположены над плоскостью чертежа (это обозначают сплошной линией). Если другие заместители находятся в цис-положении, т. е. в одной плоскости с ангулярными группами (Р-конфигурация), то их также обозначают сплошной линией, а если в транс-положении (а-конфигурация), то пунктирной линией.

К числу производных прегнана относятся кортикостероиды и гестагенные гормоны, производными андростана являются андрогенные гормоны, а эстрана -- эстрогенные гормоны.

При испытании на подлинность для подтверждения стероидного цикла в молекулах широко используют реакцию образования окрашенных и флуоресцирующих веществ при действии концентрированной серной кислотой. б-кетольную группу открывают за счет проявления восстановительных свойств кетогруппу обнаруживают реакцией образования кетоксимов при взаимодействии с гидроксиламином, а также гидразонов -- с фенилгидразином и другими гидразинами и гидразидами. Ряд перечисленных химических реакций применяют для количественного определения стероидных гормонов и их аналогов фотоколориметрическими методами. Испытания на подлинность и количественное определение выполняют также методом УФ-спектрофотометрии.

Литература

1. Gorog S.J. Pharm. Sci., 1968, v. 57, p. 1737.

2. Carignan G., Lodge B.A., J. Pharm. Sci., 1980, v. 69, p. 1453. 129b. Carignan G., Lodge B.A., Skakum W. Can. J. Pharm. Sci., 1980, v. 15, p. 10.

3. Ермакова В.К., Дозорова И.И., Шашкина Л.Ф. Хим. фарм. ж., 1977, т. II, с. 132.

4. Практикум по фармацевтической химии: методическое пособие по специальности 060108 «Фармация» / сост. А.И. Сливкин, Т.А. Брежнева, Е.Ф. Сафонова. - Воронеж : Воронежский государственный университет, 2006. - 129 с.

5. Дудко В.В. Д 814 Химический анализ лекарственных веществ: учебное пособие / В.В. Дудко, Л.А. Тихонова. - Томск. - СибГМУ, 2009. - 52 с.

6. Гёрёг Ш.Г. Количественный анализ стероидов: Пер. с англ.--М.: Мир, 1985.--504 с, ил.

7. Дедов И.И. Проблема химии гормонов и клиническая эндокринология / И.И. Дедов / Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 2005. - Т.XLIX, №1. - С.8-10.

8. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: учебник по фарм. химии для студ. фарм. вузов и фак. / В.Г. Беликов. В 2 ч.: - Пятигорск: Пятигорская гос. фарм. акад., 2003. - 713 c.

9. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии : учеб. пособие для студ. фарм. вузов и фак. / Э.Н. Аксенова и др. - М. : Медицина, 2001. - 379 с.

10. Анализ лекарственных смесей : учеб. пособие для студ. фарм. ин-тов и фарм. фак. мед. вузов / А.П. Арзамасцев и др. - М. : Компания Спутник, 2000. - 275 c.

11. Государственная фармакопея Союза Советских социалистических республик / М-во здравоохранения СССР; редкол.: М.Д. Машковский (гл. ред.) и др. - 10-е изд. - М.: Медицина, 1968. - 1035 с.

12. Антипов Е. Стероиды в жизни человека / Е. Антипов // The Chemical Journal. -2009.-С.39-41.

13. Карцова Л.А. Влияние организованных сред на хроматографическое и электрофоретическое определение лекарственных препаратов в биологических объектах / Л.А. Карцова, Е.Г. Стрельникова // Журн. аналит. химии. - 2009. - Т. 64, №2. - С 172-179.

Размещено на Allbest.ru