Регуляторний природний пептидний комплекс нирок: отримання, фізико-хімічні властивості, зв'язок з головним комплексом гістосумісності, імунобіологічні ефекти та розробка фармакологічної речовини

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ”Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Спеціальність - 14.03.08 - імунологія та алергологія

РЕГУЛЯТОРНИЙ ПРИРОДНИЙ ПЕПТИДНИЙ КОМПЛЕКС НИРОК: ОТРИМАННЯ, ФІЗИКО-ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ, ЗВ'ЯЗОК З ГОЛОВНИМ КОМПЛЕКСОМ ГІСТОСУМІСНОСТІ, ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ЕФЕКТИ ТА РОЗРОБКА ФАРМАКОЛОГІЧНОЇ РЕЧОВИНИ

КАЙДАШЕВ ІГОР ПЕТРОВИЧ

Київ - 1999

ВСТУП

Актуальность теми. Прогрес імунології як фундаментальної медико-біологічної науки відмічен суттєвим розвитком знань про роль імунної системи в забезпеченні життєдіяльності організму [Вершигора А.Е., 1989; Бутенко Г.М., 1998; Paul W.E. et al., 1984].

Обмін інформацією між клітинами спеціалізованих тканин та органів та клітинами імунної системи відбувається, по-перше, за рахунок прямого контакту між імуноцитами та клітинами на ґрунті рецепторної взаємодії, по-друге, шляхом надходження у зовнішньоклітинне середовище внаслідок секреції або руйнації клітин речовин, які змінюють функціональний стан імуноцитів [Акмаев И.Г., 1997; Беклемишев Н.Д., 1998; Paul W.E. et al., 1984].

В основі інформаційних подій, що мають місце при контакті лімфоцитів та антигенпрезентуючих клітин, покладено взаємодію між Т-клітинним рецептором та антигенним пептидом, який презентується молекулами головного комплексу гістосумісності (ГКГС) [Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., 1998].

Те що молекули ГКГС І класу транспортують на клітинну мембрану пептидні фрагменти абсолютно всіх білків, які синтезуються у клітині, забезпечує імунну систему засобом контролю клітинного вмісту,здійснює маніфестацію нових чужорідних продуктів, детекцію білків, які звичайно не експресуються.

Молекули ГКГС ІІ класу разом із зв'язаними пептидами спрямовують CD4-позитивні Т-клітини за двома функціональними шляхами: по-перше, ці клітини "допомагають" іншим антигенспецифічним лімфоцитам диференціюватися та активуватися (тобто реалізують хелперну функцію); по-друге, вони атакують чужорідний антиген, презентований ГКГС ІІ-позитивними клітинами або прямо, або за допомогою неспецифічних клітин - макрофагів, гранулоцитів (індукторна функція).

Одночасно, функціональний стан імуноцитів регулюється речовинами, які надходять з спеціалізованих клітин та органів. Серед цих речовин, що отримали назву ендогенних імуномодуляторів [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А., 1992] значне місце посідають пептидні та поліпептидні речовини. Серед них найбільш вивченими є поліпептидні фактори росту (епідермальний фактор росту, фактор росту тромбоцитів, трансформуючі фактори росту тощо), інтерлейкіни, гормони тімуса, фактори некрозу пухлин, інтерферони [Калюнов В.Н. и соавт., 1998].

Питання взаємовідносин клітин спеціалізованих тканин та органів з імуноцитами (взагалі з імунними органами) набуло відомості та актуальності завдяки роботам А.Г.Бабаєвой зі співавт. (1975, 1985). Був сформований окремий напрямок досліджень - імунологія репаративних процесів. В основі цих досліджень було покладено гіпотезу, що певна кількість вільного антигена тканини, що надходить у кров, стимулює продукцію лімфоцитів, які здатні брати участь в регенераторних процесах тканини як за фізіологічних умов, так і під час пошкодження органів. Такий процес передбачає існування механізму зворотнього зв'язку за фізіологічних умов в організмі під час нормального функціонування органів.

Цей напрямок досліджень набув подальшого розвитка в роботах С.І.Рябова з співавт. (1989), які продемонстрували що для нормального відновлення структури та функцій нирок потрібна участь особливої популяції тимоцитів, яка має фермент термінальну дезоксинуклеотіділ трансферазу (ТДТ-позитивні клітини) та гормонів тимуса. Одночасно, результати їх дослідів висунули питання про речовини нирок, які беруть участь в інформуванні імунної системи, зокрема тимоцитів, про зміну морфофункціонального стану нирок.

Таким чином, за даними літератури невідомо про власну біологічну активність пептидів, зв'язаних з молекулами ГКГС, непов'язану з презентацією антигена та значення цих пептидів в патогенезі захворювань. В той же час пептиди, які транспортуються молекулами ГКГС на зовнішньоклітинну мембрану, несуть специфічну для кожного вида клітин інформацію про внутріклітинний синтез та процесінг білків. Ці нез'ясовані факти разом з відомостями про тісний зв'язок між системою імунітета та захворюваннями нирок висунули необхідність вивчення цієї проблеми.

Зв'язок роботи з науковими програмами.

Наведені в роботі результати досліджень є самостійним фрагментом досліджень за темою МОЗ України "Проведення доклінічних іспитів та вивчення основних механізмів дії нових лікарськіх засобів, видобутих з тваринної сировини для лікування аутоімунних, травматичних та онкологічних захворювань організму" (N 0195U026214), "Роль дисбалансу пептидергічної системи регуляції в розвитку типових патологічних процесів та шляхи її відновлення інформаційними молекулами поліпептидної природи" (Шифр теми ФК 91.70) N UA01001570Р, ДКНТ України "Роль дисбалансу систем поліпептидної регуляції в розвитку патологічних станів, зв'язаних з дією несприятливих факторів зовнішнього середовища і шляхи їх корекції препаратами поліпептидної природи" N 0193U007913, ініціативної науково-дослідної роботи "Вивчення зв'язку аутоімунних захворювань нирок та центральної нервової системи з молекулами головного комплексу гістосумісності першого класу" N держреєстрації 0195U026216.

Мета та задачі дослідження.

Метою цієї роботи стало визначення імунобіологічних ефектів та зв'язку з молекулами головного комплексу гістосумісності природного пептидного комплексу нирок для розробки нової лікарської речовини.

У відповідності з метою роботи були висунуті наступні задачі:

1. Розробити спосіб екстракції пептидного комплексу з тканин нирок, охарактеризувати його за фізико-хімічними властивостями.

2. З'ясувати зв'язок пептидного комплексу нирок з молекулами ГКГС І та ІІ класів.

3. Вивчити дію пептидного комплексу тканин нирок на показники імунітету, неспецифічної резистентності, гемостазу та перекисного окислення ліпідів за фізіологічних умов.

4. Вивчити дію пептидного комплексу тканин нирок в умовах розвитку патологічних станів пов'язаних з аутоімунним пошкодженням нирок в ізольованому та комбінованому варіантах та за умов алотрансплантації нирок.

5. Виявити специфічні та неспецифічні риси дії пептидного комплексу нирок в порівнянні з пептидним комплексом іншого органу.

6. Визначити можливість зв'язування пептидів нирок з іншими пептид-транспортуючими молекулами.

7. Вивчити загальний план структурної організації пептидного комплексу нирок, синтезувати його штучні аналоги та дослідити їх терапевтичний ефект за умов експериментальної аутоімунної патології нирок.

Наукова новизна.

Вперше розкрита імунобіологічна активність пептидів головного комплекса гістосумісності, яка відкриває нові шляхи патогенетичної терапії аутоімунних захворювань, дає можливість корегувати процеси регенерації тканин.

Показано, що пептиди головного комплексу гістосумісності мають власну біологічну активність, не обмежену презентацією антигенів. Такий пептидний комплекс здатен модулювати активність лімфоцитів периферійної крові (переважно, Т-клітин) та викликати морфофункціональну перебудову в тимусі. В умовах експериментальної аутоімунної патології нирок пептидний комплекс забезпечував відновлення імунологічної толерантності та морфофункціонального стану нирок. Показана участь інтерлейкіна-2 у реалізації ефектів пептидного комплекса.

Вперше вивчено загальний план структурної організації пептидного комплексу нирок, на основі якого синтезовано три штучних пептида-аналога, які мають різного ступеня вираженості терапевтичний ефект за умов експериментальної аутоімунної патології нирок.

Практична цінність роботи.

Винайдений спосіб екстракції біологічно активних пептидів з тваринної сировини може бути використаний для створення нових лікарських препаратів. Природний пептидний комплекс нирок має виражену терапевтичну активність при експериментальній аутоімунній патології нирок, що відображає перспектив-ність його використання як лікарської речовини.

Розроблено практичний підхід до синтеза пептидів-аналогів природних пептидних сумішей, які зберігають більшість властивостей сумішей. Синтезовано три пептида, які мають значну терапевтичну активність при аутоімунній патології нирок, що можуть розглядатись як потенційні лікарські речовини.

Впровадження наукових розробок.

Частина результатів використовується у навчальному процесі на кафедрах нормальної фізіології, мікробіології та імунології, загальної фармакології Української медичної стоматологічної академії.

Наведені в роботі результати досліджень лягли в основу створення нової пептидної лікарської речовини "Нефролат" за темою МОЗ України "Проведення доклінічних іспитів та вивчення основних механізмів дії нових лікарськіх засобів, видобутих з тваринної сировини для лікування аутоімунних, травматичних та онкологічних захворювань організму" (N 0195U026214).

Запропонований спосіб екстракції пептидного комплексу з тваринних тканин успішно використаний для інших тканин, що дало змогу створити нові лікарські речовини "Вермілат" (Патент України N5743), який вже проходить першу фазу клінічних випробувань та комплекс пептидів підшлункової залози (Рішення про видачу патенту 94052070 від 23.03.1995).

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових результатів, що виносяться на захист.

Автором дисертації розроблено програму досліджень, особисто виконані усі фізико-хімічні, імунологічні, цитохімічні, біохімічні, гістологічні та статистичні дослідження. Дисертантом проведено самостійно аналіз всього отриманого фактичного матеріала, розроблено основні положення та висновки роботи. Особлива подяка співробітникам Центральної науково-дослідної лабораторії Н.О.Бобровій, О.В.Бобовіч, О.О.Гейко та асистенту кафедри нормальної фізіології Української медичної стоматологічної академії Л.Е.Весніной за технічну допомогу. Синтез пептидів-аналогів виконано доктором S.Stevanovich в лабораторії проф. H.G-.Rammensee (Німецький центр досліджень рака, м.Гейдельберг) за що приносимо подяку.

Апробація. Головні положення дисертаційного дослідження доповідались та обговорювались на научно-практичної конференції "Поиск новых лекарственных средств и их использование в клинике" (Чіта, 1990); міжвузівській конференції молодих вчених "Фізіологія та патологія перекисного окислення ліпідів, гемостаза та імуногенеза" (Полтава, 1990-1997); YІ з"їзді фармакологів УРСР (Харків, 1990); ХІІІ з'їзді Українського фізіологічного товариства (Харків, 1990); Всесоюзній конференції молодих вчених 225 років І ММІ (Москва, 1990); науковій конференції молодих вчених і спеціалістів (Донецьк, 1990); Всесоюзній конференції "Физиология и патология гемостаза" (Полтава,1991); YI Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992); Міжнародному сімпозіумі "Пептидные биорегуляторы-цитомедины" (Санкт-Петербург, 1992); Міжнародному сімпозіумі "Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе" (Київ, 1993); Республіканській науковій конференції "Актуальні питання екогенетики та імунології" (Полтава, 1994); IY конференції "Биоантиоксидант"(Москва, 1993); Міжнародному сімпозіумі "Физиология и патология гемостаза" (Сімферополь, 1994); І Національному з'їзді фармакологів України (Полтава,1995); І Конгресі федерації Європейського фізіологічного товариства (Маастріх, 1995), на засіданні лабораторії прикладної імунології Німецького центру досліджень раку (Гейдельберг,1994), І Національному конгресі з клінічної імунології та алергології (Алушта, 1998), Симпозіумі з біохімії та молекулярної біології (Йена, 1998).

Публікації.

За темою дисертації надруковано 35 робіт.

Обсяг роботи.

Дисертацію викладено на 258 сторінках друкованого тексту і вона складається з вступу, огляду літератури, глави "Матеріали та методи досліджень", 6 глав власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури та додатку.

Робота містить 36 таблиць, 21 малюнків і 42 мікрофото. Список літератури містить 125 вітчизняних робіт і 118 робіт іноземних авторів.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ. Експериментальна частина досліджень виконана на 184 білих щурах лінії Wistar, 12 морських свинках, 52 білих мишах, 30 золотистих хом'яках та 4 кролях.

Лабораторних тварин утримували в умовах віварію на стандартному раціоні харчування у відповідності з "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)".

Частина спостережень була проведена на крові 20 донорів і крові 15 хворих на хронічний гломерулонефрит на базі відділення нефрології Полтавської обласної клінічної лікарні.

Об'єктами досліджень були кров, плазма, сироватка крові експериментальних тварин,а також кров і сеча здорових донорів та хворих.

Для вирішення поставлених задач були відтворені наступні експериментальні моделі.

Гострий стрессвідтворювалиувигляді гострого емо-ційно-больового стресу очікування за методикою [Disiderato O., McKinnon J.R.,1974]. Суть методики полягає в поданні електричних розрядів на лапки щурів у випадкові відрізки часу, що примушує тварин постійно змінювати місце знаходження. Тваринам дослідні речовини (пептидний комплекс нирок та церулоплазмін) вводили за 2 години до початку стреса та одразу після нього. Забій тварин проводили за 2 години після стресу.

Аутоімунний нефрит у тварин індукували під час введення суспензії аутологічної нирки в повному ад'юванті Фрейнда ("Реакомплекс", Чита) триразово на протязі трьох тижнів [Kment A. et al., 1976]. Для чого готували водно-сольовий екстракт коркової речовини нирок, змішували його з ад'ювантом 1:1 до утворення стійкої емульсії. Емульсію вводили підшкірно з розрахунку 0,5 мл на тварину. За тиждень після останньої імунізації починали експериментальну терапію пептидним комплексом нирок в дозі 0,1 мг/кг.

Полікомпонентна імунопатологія відтворювалась введенням тваринам суспензії аутологічної нирки в аутологічній сироватці [Шерматов Х.Х., Брысин В.Г., 1988]. Щурів імунізували введенням препарату 0,5 мл на тварину п'ятикратно з інтервалом 3 дні підшкірно в область черева. За тиждень після останньої імунізації починали експериментальну терапію пептидним комплексом нирок в дозі 0,1 мг/кг.

Унілатеральна нефректомія з алостатичною трансплантацією нирки виконувалась таким чином. У щурів-самців лінії Wistar вагою 180-200 г під гексеналовим наркозом видаляли праву нирку, потім алогенну нирку вміщували у великий сальник, трансплантат нирки декапсулювали. Переміщення трансплантатів і порівняння проводили між тваринами попарно, таким чином, щури в парі (тобто в контрольній та дослідній групах) відрізнялися за одними генами гістосумісності. Тварини контрольної групи отримували ін'єкції 0,2 мл стерильного фізіологічного розчину натрія хлориду, а дослідної - 0,1 мг/кг пептидного комплексу нирок. Першу ін'єкцію проводили одразу після операції. Функціональні і морфологічні зміни в паренхімі нирок оцінювали за 4 години, 1 та 4 доби після оперативного втручання. Діурез індукували введенням щурам в шлунок водопроводної води з розрахунку 5% від ваги тіла. Сечу збирали на протязі 2 годин в спеціальних клітках. В сечі та сироватці крові вивчали наступні показники: діурез, екскрецію білка, концентрацію та екскрецію креатиніну, натрію, калію, клубочкову фільтрацію, натрій-калієвий коефіцієнт сечі.

Внесення у кров хворих на гломерулонефрит пептидного комплексу нирок проводилось в дозі 10 мкг/мл в мінімальному об'ємі стерильного фізіологічного розчину та інкубації 30 хвилин. Контролем були проби, куди вносили лише розчинник.

Спектр пептидів нирок при патологіях досліджувався за допомогою оберненофазової високоефективної рідинної хроматографії.

Взаємодія пептидів з шаперонами Hsp70 досліджувалась таким чином. Виділення Hsp70 проводили з нирок мишей BALB/c [Udono H., Srivastava P.K.,1993]. Потім отриманий екстракт Hsp70 був двічі оброблений 10mM АТФ по 30 хвилин на патронах "Centricon-10". Екстракти пептидів, які були зв'язані з Hsp70, були зібрані та сконцентровані під вакуумом Speed Vac (Savant Instruments Inc., Farmingdale,NY) та перерозчинені в 0,1% розчині трофтороцтової кислоти (Fluka). Пептидні екстракти аналізували методом ВЕРХ на хроматографі SMART tm SYSTEM, LKB, "Pharmacia", Sweden. Потім до відмитих від АТФ вільних від зв'язаних пептидів молекул Hsp70 було добавлено пептидний комплекс нирок і після 30 хвилин інкубації незв'язані пептиди були відмиті 0,15М хлоридом натрія. Після чого було проведено екстракцію зв'язаних пептидів як описано вище.

Аналіз амінокислотних послідовностей пептидів проводили за методом Едмана на автоматичному секвенаторі 120А "Applied Biosystems" (США). При цьому цистеїн не модифікувався і тому не детектувався.

Дія окремих пептидних фракцій нирок на проліферацію клітин досліджувалась на спленоцитах мишей BALB/c. В 96-лунковий планшет з U-образним дном вносили суспензію спленоцитів в концентрації 400000 на лунку. Використовували середовище RPMI-1640 ("Gibco BRL", Шотландія) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (C.C.Pro GMBH,Німеччина). Проліферацію індукували додаванням конканаваліна А (КонА) до кінцевої концентрації 10 мкг/мл. З початком інкубації в лунки вносили пептидні фракції, за 48 годин - 0,5 мкКи ³Н-тімідіна в обсязі 50 мкл. Харвестер здійснювали за 72 години після початка інкубації в автоматичному режимі на скловолоконних фільтрах 1450-421 Printer Filtermat A з твердим сцинтілятором 1450-441 MeltiLex tm A та підрахунком на В-лічильникі MicroBeta tm ("Wallac Oy", Фінляндія).

Крім того, досліджено вплив окремих фракцій на інтерлейкін-2(ІЛ-2)-індуковану проліферацію клітин лінії CTLL (European Collection of Animal Cell Cultures, UK). Для культивування використовували середовище RPMI-1640 з 10% телячої сироватки з додаванням 10% двухдобового супернатанту КонА-індукованої суспензії спленоцитів. ³Н-тімідін та фракції вносили за наведеною вище схемою.

Біосинтез ДНК в тканинах досліджувався методом включення радіоактивної мітки ³Н-тімідіна.

Загальновизнані імунологічні методи докладно описані в цитованій літературі. Треба зупинитися лише на деяких маловідомих методиках. Т- і B-лімфоцити у тварин (білі щури та морські свинки) визначали методом розеткоутворення з аутологічними еритроцитами навантаженими антисироватками, що були отримані до тканин тимуса та лімфатичних вузлів [Binaghi R.A. et al.,1975].

Визначення мембранних маркерів лімфоцитів людей проводили методом непрямої флюоресценції з одночасним контролем в фазовому контрасті на мікроскопі "ЛЮМАМ-Р8" (ЛОМО, Росія). Використовували МКА LT3, LT4, LT8, LT22 та LT-DR виробництва Інститута імунології МОЗ Росії до CD3, CD4, CD8, CD22 та HLA-DR. Розраховували середній цитохімічний коефіцієнт.

Імунопероксидазне визначення локалізації імуноглобулінів в тканинах нирок проводили за допомогою анти-імуноглобулінових антитіл мічених пероксидазою.

Аутоантитіла до тканин нирок досліджували методом непрямої гемаглютинації з еритроцитами барана, навантаженими антигеном ниркової тканини [Фримель Г., 1987].

Аутоантитіла до сироваткового IgG досліджували методом непрямої гемаглютинації з еритроцитами барана, навантаженими препаратом IgG щурів ("Реакомплекс", Чита) [Фримель Г., 1987].

Для проведення гістологічних досліджень тканинний матеріал фіксували в 10% нейтральному формаліні та 2,5 % забуференому розчині глутарового альдегіду, потім за стандартними методиками заключали в парафін, зрізи забарвлювали гем-еозіном, по Малорі.

Враховуючи функціональну єдність основних систем резистентності крові було необхідним дослідити показники перекисного окислення ліпідів та гемостазу. Використані загальновизнані методики наведені у таблиці 1.

Таблиця 1. Використані загальновизнані методи дослідження

N п/п	Показники, що вивчалися	Субстрат	Автори методик
1	Т- і В-лімфоцити, Т-хелпери,Т-супресори, О-клітини	кров (люди)	Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990
2	Т- і В-лімфоцити	кров (тварини)	Binaghi R.A.,1975
3	Іммунофлюоресценція	кров, тканини	Фримель Г., 1987
4	Імуноглобуліни А,M,G	сироватка	Чернохвостова Е.В., 1975
5	НСТ -тест,	кров	Нагоев Б.С.,1983
6	ЛКБ-тест	кров	Пигаревский В.Е., 1978
7	Фагоцитоз	кров	Herscowitz H.B., 1981
8	Реакція бласттрансформації лімфоцитів	кров	Фримель Г.,1987
9	Кинетика накопичення МДА	кров	Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.,1972
10	Спонтанний гемоліз еритроцитів	кров	Спиричев В.Б. и др.,1979; Jager F.S. 1968
11	Дієнові кон'югати	плазма	Воскресенский О.Н.,Туманов В.А., 1982
12	СОД	кров	Брусов О.С.и др.,1976
13	Каталаза	кров	Архипова О.Г., 1988
14	Церулоплазмін	плазма	Колб В.Г. и др., 1982
15	Агрегація тромбоцитів	плазма	Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., 1971
16	Час рекальцифікації	плазма	Bergerhof H.D., Roka L. 1954
17	Протромбіновий час	плазма	Quick A.J. 1966
18	Тромбіновий час	плазма	Biggs R.M.,
19	Каоліновий час	плазма	Балуда В.П.и др.1980
20	Кефаліновий час	плазма	Баркаган З.С. 1975
21	АЧТЧ	плазма	Biggs M.,
22	Антитромбін-III	плазма	Hensen A.,
23	Фібриноген	плазма	Котовщикова М.А., Федорова З.Д., 1966
24	Фібриноліз еуглобулінів	плазма	Андреенко Г.В.

Отриманий цифровой матеріал був статистично оброблений на ПЕВМ IBM PC/AT-286 "Omega". Проводили обчислення середньої арифметичної (М), середньоквадратичного відхилення (m), помилки середньої арифметичної (м), вірогідність отриманих результатів оцінювали за коефіцієнтом Ст'юдента (t). Нормальність розподілу величин оцінювали за показниками P(t), Q(t), R(t), розрахованими за стандартною програмою мікрокалькулятора "Citizen-SRP-175". Частину даних обробляли з використанням дискрімінантного аналізу.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ. У відповідності з задачами роботи нами було розроблено метод екстракції біологічно-активних речовин з тканини нирок. В основу метода було покладено дослідження O.Rotzschke та K.Falk (1991), що до екстракції пептидів головного комплексу гістосумісності. Метод полягає в знежиренні та перміалізації мембран клітин коркової речовини нирок, екстракції органічною кислотою в присутності двохвалентних катіонів з наступною преципітацією пептидних речовин та їх очищенням.

Такий екстракт давав позитивну біуретову реакцію, мав спектр поглинання в УФ-області з максимумом 210-220 нм, характерний для пептидного зв'язку. Під час порівняння ВЕРХ-спектру отриманого екстракту з екстрактами, отриманими за методом O.Rotzschke та K.Falk (1991) знайдено збіжність цих пептидних сумішей для HLA-DR5 та DR1. Під час гель-хроматографії виявлено дві основні фракції з молекулярною масою 4 та 8 kD, електрофорез в поліакріламідному гелі виявив чотири основні фракції, однак, їх точну масу з'ясувати не вдалось.

Вивчення амінокислотного складу природнього пептидного комплексу нирок показало високу відносну кількість глутамінової, аспарагінової кислот, аргініну та лізіну. Ідентифікація деяких фракцій, які переважають у пептидному екстракті, показала наявність таких пептидів: іпсилон-ланцюг гемоглобіну (55-66, 56-66), альфа-ланцюг гемоглобіну (48-61), убіквітін (1-20). Найбільш цікава наявність фрагментів альфата іпсилон-ланцюгів гемоглобіна, тому що нирка в зрілому віці не продукує гемоглобін, тим більш іпсилон-ланцюг (продукується на початку ембріонального періода). Наявність в пептидному екстракті пептидів, що є фрагментами білків, які звичайно не експресуються, є характерною ознакою пептидів, зв'язаних з молекулами ГКГС [ Rudensky A. Yu. et al., 1991; Wilson I.A., Fremont D.H., 1993; Demotz S., 1993; Tsomides T.J.,Eison H.N., 1993]. Цей висновок підтверджується знайденою нами збіжністю хроматографічних спектрів природного пептидного комплексу нирок та пептидів, виділених з молекул ГКГС (переважно ГКГС І класу).

Таким чином, розроблений нами метод екстракції дозволяє одержувати пептидний комплекс, який наданий переважно пептидами головного комплексу гістосумісності.

Враховуючи, що пептиди ГКГС головним чином беруть участь в контакті та подальших реакціях між Т-клітинним рецептором та молекулою ГКГС, ми вивчили вплив отриманих нами пептидів на експресію деяких молекул на поверхні лімфоцитів.

Отримані результати свідчать, що пептидний комплекс володіє дозозалежною активуючою дією на Т-клітини, під його впливом спостерігалась зміна експресії специфічних рецепторів, їх перегрупування. Зростала експресія CD3, CD4 (підвищувалась кількість кепінгів, петчів), CD8 (характерно зменшення числа кластерів з міцною флюоресценцією). Пептидний комплекс нирок істотно не впливав на стан В-клітин (М-РУК та CD22-позитивних клітин).

Звертає на себе увагу незначне підсилення експресії HLA-DR, що може бути пояснено стабілізуючою дією пептидів на мембранні молекули ГКГС, що в ряді випадків розташовані на мембрані без антигенного пептида [ Schumacher T.N.M. et al., 1990], крім того ці автори показали можливість зв'язку між пептидом та "порожньою" молекулою ГКГС, як in vivo, так і in vitro. Кількість таких "порожніх" молекул під час патологічних процесів істотно зростає, нижче ми ще зупинимось на цьому питанні.

Під час дії пептидного комплексу ми не спостерігали сенсибілізації лімфоцитів і секреції цитокінів, здатних гальмувати міграцію лейкоцитів. На фоні попереднього кондиціювання клітин в присутності пептидного комплексу нирок введення мітогену ФГА більш інтенсивно гальмувало міграцію, чим у відсутності пептидів. Отже пептидний комплекс модулював відповідь лімфоцитів на ФГА.

Відомо, що процеси диференціровки Т-клітин відбуваються головним чином в тимусі, де внаслідок позитивної та негативної селекції відбираються необхідні клони Т-клітин [ Ярилин А.А., 1998;Hogquist K.A. et al., 1994; Nossal G.J.V., 1994]. В цих процесах не останню роль відіграють молекули ГКГС зі зв'язаними пептидами. Тому було цікаво дослідити як впливає пептидний комплекс нирок на морфофункціональний стан тимуса під час імунного відгука на тимусзалежний антиген (еритроцити барана).

Основні зміни локалізувалися в кортикомедулярній зоні. Під впливом пептидного комплексу в тканині тимуса з'являлися молоді тільця Гасаля, спостерігались кистоподібні утворення за рахунок епітеліальних клітин. Цитоз коркової речовини зменшувався. Ці зміни свідчать про активацію функціональних процесів в тимусі [ Белецкая Л.В., Гнездицкая Э.В., Беляєв Д.Л., 1986; Пучков В.Ф. и соавт., 1998], вихід клітин на периферію. Отже за фізіологічних умов пептидний комплекс нирок здатен активувати функціональні процеси в тімусі, можливо індукувати вихід лімфоцитів у кровообіг.

Важливим питанням було визначення антигенних та імуногенних властивостей препарату. Введення препарату тваринам не викликало розвитку реакцій гіперчутливості негайного типа, введення разом з повним ад'ювантом Фрейнда також практично не викликало сенсибілізації. Більш помітною була здатність пептидного комплексу індукувати синтез гомоцитотропних антитіл. Препарат практично не впливав на антитілогенез. Отже пептидний комплекс нирок виявляв слабкі антигенні властивості.

Співставлення результатів дослідження показників гемостазу та ПОЛ в серіях in vitro та під час введення здоровим тваринам допомогло визначити прямі та неспецифічні риси дії. До специфічного впливу пептидного комплексу нирок за нашими результатами можно віднести блокування тромбінової активності, та прискорення швидкості фібринолізу, можливо внаслідок активації плазміногену. Ці властивості пептидного комплексу збігаються з функціональними особливостями ниркового кровотоку. Дія препарату на процеси ПОЛ мала опосередкований характер.

Наступним кроком наших досліджень стало вивчення дії природного пептидного комплексу нирок за умов розвитку патогенних станів. В першій частині дослідів нас зацікавив вплив препарату під час типового патологічного процесу, який вливає на стан імунної системи (переважно Т-ланки) та систем, що нами ддосліджувались, але такий вплив не повинен бути пов'язаний із розвитком специфічних імунних реакцій. Патологією, яка відповідає всім цим крітеріям, та на сьогодні досить докладно вивчена, є стрес [ Меерсон Ф.З.,1986; Малышев В.В., Васильева А.С., Кузьменко В.В., 1997]. Найбільш важливою в медичному плані формою стресу є гострий емоційний стресс [Ведяев Ф.П., Воробьева Т.М.,1983]. Стресорна реакція супроводжується вираженими метаболічними змінами та пригніченням саме Т-ланки імунітету. Це супроводжується зниженням вмісту Т-клітин, пригніченням їх активності в тесті розеткоутворення та бласттрансформації [Суркина И.Д., 1981].

Як показали наші дослідження, пептидний комплекс нирок викликав відновлення показників клітинного імунітету - нормалізація вмісту Т- та В-клітин, їх здатності відповідати на КонА. Порівняння дії пептидного комплексу з дією антиоксидантного ферменту церулоплазміна дозволило виявити характерні ознаки впливу пептидного комплексу: блокування тромбінової активності, активація фібринолізу та переважний органоспецифічний вплив на процеси ПОЛ та активність ферментативних процесів в нирках.

Тимус разом з залозами внутрішньої секреції бере участь в адаптації організма до дії факторів довкілля [Меерсон Ф.З., 1986]. Виходячи з цього, було досліджено дію пептидного комплекса в умовах гострого ЕБС. Введення пептидного комплексу викликало виражену нормалізацію процесів імунітету, переважно гуморального: відновлювалась концентрація комплементу, імуноглобуліну G, концентрація аутоантитіл до тканини нирки та циркулюючі імунні комплекси.

Враховуючи значний вплив пептидного комплексу нирок на показники імунітету, зокрема, активність Т-клітин та функціональний стан тимуса, було цікавим дослідити його дію в умовах специфічної імунопатології нирок. Як експериментальну модель було використано нефрит Хеймана, який максимально наближений до мембранозної гломерулопатії у людей [Дранник Г.Н., 1989]. Антигени, відповідальні за розвиток нефриту Хеймана, розташовані в клубочковій базальній мембрані, щітковій каємці. Великий інтерес викликає наявність перехресно реагуючих антигенів в щітковій каємці канальців нирок та коркової речовини тимуса за даними Bakker W.W. та співавт. (1979). Патогенетична основа патології полягає в гранулярних відкладеннях імуноглобуліна G під епітелієм.

Під час введення пептидного комплексу нирок було зареєстровано істотні зміни показників імунітету у тварин з нефритом: зросло число лімфоцитів в крові, відновився знижений відсоток Т-клітин, коефіцієнт Т/В-клітини зріс з 0,8 до 1,3. Зменшився індекс стимуляції лімфоцитів КонА та нирковим антигеном до нормальних показників. Одночасно зменшився титр ниркових аутоантитіл, відновилась концентрація ЦІК, нормалізувалась функціональна активність фагоцитів.

Введення пептидного комплексу зменшувало кількість Т-клітин, інфільтруючих простори навкруги судин та канальців, та обсяг депозитів імуноглобулінів базальних мембран гломерул. Одночасно з цим ми спостерігали відновлення азотсекретуючої функції нирок.

Реакція тимуса здорових щурів на пептидний комплекс нирок полягала в підвищенні мітотичних процесів в корковій речовині зі зростанням числа лімфобластів та середніх лімфоцитів з підсиленням евакуації малих лімфоцитів з коркової до мозкової речовини і, можливо, далі за межі органу. За умов нефриту тимоцити залишали тимус на тлі зниженої мітотичної активності в корковій речовині та низької концентрації молодих форм (лімфобласти, середні лімфоцити), що свідчить про функціональне виснаження органу [Хмельницкий О.К., Белянин В.Л., Гринцевич И.И., 1983]. Застосування в цих умовах пептидного комплексу відновлювало мітотичну активність тимоцитів, кількість їх молодих форм і навіть ще більше підсилювало вихід малих лімфоцитів. Підвищення розміру ядер ретікуло-епітеліальних клітин дає змогу передбачити їх більшу функціональну активність під дією пептидного комплексу.

Отже, під час розвитку аутоімунного відгука на ниркові антигени (нефрит Хеймана) пептидний комплекс нирок знижував прояви аутоімунної відповіді, спрямованої на антигени нирки.

Такі зміни не можна пояснити імунодепресивним впливом пептидного комплексу нирок. Дослідження проведені in vitro та на здорових тваринах, і тих що підлягали стресу, не виявили імунодепресивної дії препарату. Отже, за умов аутоімунного нефриту пептидний комплекс блокував розвиток аутоімунної відповіді на антигени ниркової тканини, можливо шляхом відновлення імунологічної толерантності.

Імунологічна толерантність та процеси, які її підтримують мають різні рівні [ Ferber I. et al.,1994; Arnоld B., Schonrich G., Hammerling G.J., 1993 ], центральний - тимус, та декілька периферійних. Роботами цих авторів показано, що зрілі Т-клітини, які залишають тимус, залишаються чутливими до індукції толерантності. Ступінь толерантності при цьому визначається: 1) афінністю Т-клітинного рецептора, рівнем експресії Т-клітинного рецептора та допоміжніх молекул; 2) стадією розвитку Т-клітин. Т-клітини, щойно емігрувавші з тимуса, більш здатні до індукції толерантності, чим до активації (!). Отже рання експресія антигена веде до толерантності, а пізня - до аутоімунізації. Контакт між Т-клітинним рецептором та молекулой ГКГС зі зв'язаним пептидом може відбуватися традиційно, коли мігрує лімфоцит, і альтернативно - коли мігрує комплекс ГКГС-пептид, розташований на мембрані АПК. В той же час, Т-клітинний рецептор може взаємодіяти із розчиненим вільним пептидним антигеном, який спеціальним образом оброблений: має низьку молекулярну масу та фрагмент для зв'язування з рецептором.

Отже, враховуючи знайдені зміни в тимусі та на періферічних CD8-позитивних Т-клітинах (зменшення ступеня флюоресценції та кластерізації), можна вважати, що пептидний комплекс має двонаправлену дію, як на центральний, так і на периферійний рівні толерантності.

Для того щоб впевнитись у специфічності толерогенної дії пептидного комплексу нирок ми відтворили модель полікомпонентної імунопатології - одночасна імунізація нирковим антигеном і білками сироватки крові.

Отримані результати доводять, що за цих умов пептидний комплекс був здатний усувати явища сенсибілізації лімфоцитів до аутоантигенів нирок, але не виключав аутоімунної реакції до білків сироватки, тобто пептидний комплекс виказував специфічну толерогенну дію. Слід зауважити, що при цій патології терапевтична активність пептидного комплексу була менш виражена, чим при ізольованому нефриті.

В роботахB.Arnold та співавт. (1993-1994) демонструється, що периферійна толерантність більш наявно виявляється під час трансплантаційних експериментів. Крім того, трансплантація нирки в умовах аутоімунних захворювань нирки та її імунний захист після трансплантації мають значну важливість та практичну цінність [Дранник Г.Н., 1971, 1980; Barbara A. et al., 1997]. Як продемонстрували наші дослідження введення пептидного комплексу нирок в значному ступеню відвертало розвиток реакції відторгнення (зменшення лімфоїдної інфільтрації трансплантату) та нефриту в контрлатеральній нирці. В цій серії дослідів ми також спостерігали явище блокування відповіді лімфоцитів пептидним комплексом на антигени нирок, але не на мітоген.

Під час внесення у кров хворих на хронічний гломерулонефрит пептидний комплекс відновлював відсоток Е-РУЛ та Т-хелперів, знижував відповідно до нормальних значень М-РУЛ та активність фагоцитозу, нормалізував адгезійну здатність нейтрофілів (Е-РУН) та показники РБТЛ на КонА.

В піонерській роботі Sloan-Lancaster J. та співавт. (1993) доведено, що змінені ліганди Т-клітинних рецепторів на живих АПК можуть індукувати Т-клітинну анергію або гіперергію. Тому ми вирішили дослідити чи змінюється спектр природних пептидних речовин нирки під час розвитку патологічних процесів, зокрема при нефриті Хеймана. Було знайдено, що відтворення патології характеризується зникненням окремих фракцій та появою інших, нових, причому відносна питома вага значно змінена. Введення екзогенного пептидного комплексу викликало відновлення піків різної міри.

Таким чином, за умов патології змінюється спектр пептидів ГКГС, що цілком зрозуміло, тому що молекули ГКГС презентують фрагменти білків змінених або раніш не синтезованих, відображають обсяг синтезу білків внутрі клітини.

Отже, за допомогою таких пептидних фрагментів клітина здатна інформувати навколишнє оточення про свій функціональний стан.

Як показали наші дослідження, пептидний комплекс нирок являє складну багатокомпонентну речовину. Тому постало питання, чи однакова дія різних фракцій на процеси проліферації лімфоцитів. Було знайдено, що окремі хроматографічні фракції пептидного комплексу нирок здатні впливати на проліферацію мишиних спленоцитів та клітин лінії CTLL. Отже в паренхімі нирок містяться пептидні речовини здатні в фізіологічних умовах неспецифічно регулювати активність лімфоцитів, а при патології виступають вже як специфічні месенджери. Можливість існування такого процесу підкріплюється також даними про зміну співвідношення окремих фракцій пептидного комплексу при розвитку аутоімунної патології нирок.

Звертає на себе увагу відмінність дії одних і тих пептидних фракцій на лімфоцити, активовані мітогеном КонА та ендогенним ростовим фактором - ІЛ-2. Ймовірно відмінність полягає у впливі пептидів на характерні активаційні етапи Т-клітин [Бережная Н.М., Горецкий Б.А., 1992; Paul W.E. et al., 1984]. Вірогідно пункт дії отриманих пептидів слід шукати в каскаді реакцій, які спостерігаються слід за дією ІЛ-2, тобто ліганд-рецепторна взаємодія ростових факторів, синтез клітинних протоонкогенів і реципрокне індукування синтезу субодиниць рецептора ІЛ-2.

Таким чином, окремі пептидні фракції коркової речовини нирки здатні неспецифічно діяти на проліферацію непримірованих лімфоцитів, індуковану КонА та ІЛ-2. Найбільш чітка дія спостерігається при активації ІЛ-2. Можливо отримані пептиди діють на системи, які регулюють рост та проліферацію клітин, пов'язані з дією ростових факторів та клітинних протоонкогенів, здійснюючи за фізіологічних умов кооперацію між імуноцитами та клітинами нефрону, та реалізують процеси репарації та компенсації.

Виходячи з того, що досліджуваний пептидний комплекс нирок продемонстрував наявність специфічних та неспецифічних ефектів, постало питання чи відрізняються пептидні речовини екстраговані з нирок від пептидів отриманих з інших органів, та чи можна виділити органоспецифічні та неспецифічні фракції в їх складі.

Проведені дослідження дали змогу згрупувати пептидні комплекси за хроматографічними характеристиками таким чином: група паренхіматозних органів - селезінка, печінка, нирки; ендокринні залози - підшлункова залоза, тімус; окремо - пародонт.

Це може бути пов'язано із специфічним для кожного органу чи тканини етапами протеолітичного процесінгу білкових структур, котрий має місце або при деградації, або при посттрансляційної модифікації знов синтезованих білків. Цікаво, що три знайдені фрагменти гемоглобіну в якості С-кінцевої амінокислоти мають залишок лізіну. Це може свідчити за те, що ці фрагменти можуть бути утворені внаслідок обмеженого протеолізу молекул гемоглобіну, тому що відомо, що розщеплення молекул-попередників головним чином відбувається в районі локалізації лужних амінокислот - аргініна та лізіна. Вірогідно, такі властиві кожному органу або тканині пептидні молекули беруть участь як у міжклітинному сигналізуванні, так і між фізіологічно пов'язаними органами та системами.

Збіжність хроматографічних характеристик пептидних комплексів, екстрагованих з групи паренхіматозних органів, поставила питання про специфічність дії пептидного комплексу нирок.

Для з'ясування цього питання була проведена серія досліджень впливу пептидного комплексу печінки на деякі показники імунітету, гемостазу та неспецифічної резистентності організму в умовах норми та при розвитку аутоімунного нефриту.

Як показали дослідження, пептидний комплекс печінки підвищував рівень Еа-РУК. Вивчення впливу препарату на стан фагоцитарних реакцій виявило його дозозалежну активуючу дією за показниками НСТ-тесту та фагоцитарного індексу та блокуючу на активність лізосомальних катионних білків. При внесенні у донорську кров пептидний комплекс печінки гальмував процеси зсідання крові та фібринолізу, суттєво не впливав на показник тромбінового часу.

За умов розвитку нефриту Хеймана пептидний комплекс печінки не впливав на аутоімунну відповідь на тканинні антигени нирок.

Попередніми дослідами ми показали, що пептидний комплекс нирок впливав на процеси регенерації в нирках і за низкою показників виявляв органоспецифічні ознаки дії. Тому ми порівняли дію пептидних комплексів нирок та печінки на накопичення 3Н-тімідіну в органній культурі нирки, що відображує процеси біосинтеза ДНК.

Під час проведення дослідження ми з'ясували, що лише пептидний комплекс нирок вірогідно підсилював накопичення 3Н-тімідіну, це ще раз продемонструвало органоспецифічність впливу.

Таким чином, внаслідок проведених досліджень можливо виділити специфічні та неспецифічні риси дії пептидного комплексу нирок. До специфічних ефектів слід віднести: вплив на антигенспецифічну відповідь на ниркові антигени, здатність впливати на процеси ПОЛ та біосинтез ДНК в нирковій тканині, гальмування тромбінової активності та фібринолізу. До неспецифічних ефектів слід віднести: вплив на вміст Т-активних клітин та активність фагоцитозу, здатність впливати на процеси ПОЛ в крові.

Одним з ключових аспектів розуміння механізму дії пептидів, екстрагованих з тканин, є процес трансдукції пептидного сигналу. Взагалі, проблема полягає в пошуці мембранних структур, котрі здатні зв'язувати пептидні/поліпептидні молекули. Як приведено в літературному огляді, на роль пептидзв'язуючих молекул можуть претендувати: імуноглобуліни, молекули ГКГС, молекулярні шаперони та специфічні рецептори. Нашу увагу привернула група молекулярних шаперонів, по-перше, їх досить широкою специфічністю зв'язування, по-друге, їх не зрозумілою присутністю на зовнішньо-клітинних мембранах [DeNagel D.C., Pierce S.K.,1993].

Отримані нами результати демонструють, що молекули молекулярних шаперонів Hsp70, звільнені від ендогеннозв'язаних пептидів, здатні взаємодіяти з окремими фракціями пептидного комплексу нирок. Враховуючи, що в дослідженні ми використовували препарати Hsp70 не тільки мембранного пула, але і в значній мірі внутріклітинні, з вірогідністю можна стверджувати лише про факт взаємодії між молекулярними шаперонами Hsp70 та компонентами пептидного комплексу. Це дає підставу передбачати, що молекулярні шаперони Hsp70 можуть брати участь в реалізації пептидного сигналу.

Загальновизнаним підходом до вивчення біологічної активності пептидних сумішей є поетапне дослідження цілісної суміші з наступним вивченням окремих фракцій. Внаслідок виконання цієї програми досліджень отриманий результат дає змогу виділити декілька пептидів з визначеною біологічною активністю, як правило при цьому втрачаються властивості, що були притаманні цілісній суміші [Бойко С.С. и соавт.,1998; Гомазков О.А., 1995].

Нами був вибраний інший підхід, запропонований K.Falk та O.Rotzschke (1991) для вивчення пептидів зв'язаних молекулою ГКГС в кишені Бйоркмана. Коротко суть полягає в екстракції комплексу пептидів, хроматографічному аналізі і вивченню узгодженої послідовності пула пептидних фракцій.

Виконаний аналіз показав - залишками, що домінують, є валін, аспарагінова та глутамінова кислоти в позиції 2, лізін- в 3, аспарагінова кислота - в 4, і аргінін - в 6 позиції. Крім того, заслуговує обговорення переважне розташування проліна в 2 та 3 позиціях. Подібні результати були отримані також в роботі [Falk K., Rotzschke O.,1994] і розцінені як наслідок процесінгу пептидів, який не впливає на зв'язування з молекулами ГКГС.

Виходячи з аналіза амінокислотної послідовності пула пептидів нами була складена пошукова формула для з'ясування припускаємої послідовності в складі відомих білків. Такі послідовності були знайдені в складі аконітази (фермент цикла Кребса), кофіліну та дестріну (актін-зв'язуючі білки), попередників туморнекротичного фактору альфа, гастрину та релаксину, а також сорбіну (підсилює всмоктування води та натрія).

Наявність фрагментів цих білків дуже важлива, тому що наявність актіну, рівень натрія, є важливими факторами регенерації нефрону [Rosenberg M.E., Paller M.S.,1991].

Внаслідок пошуку та аналізу послідовностей реальних пептидів було складено формулу для синтеза пептидів-аналогів: в першій позиції знаходиться люба амінокислота (можливо пролін для захисту епітопа), в 2 позиції - глутамінова або аспарагінова кислоти, в 3 - лізін, в 4 - аспарагінова кислота або гістідін, в 5 - люба, в 6 - аргінін, в 7 - люба амінокислота. В якості любой кислоти частіш використовують неполярні незаряджені амінокислоти.

Отже, уявлялось реальним синтезувати реальну пептидну субстанцію на ґрунті знайденої формули, яка б володіла імунопротекторними властивостямит за умов імунопатології нирок. Були синтезовані таки пептиди: про-глу-ліз-асп-лей-арг-ліз (PEKDLRK), про-глу-ліз-асп-сер-арг-ліз (PEKDSRK), про-глу-лізасп-асп-арг-лей (PEKDDRL). Біологічна активність пептидів-аналогів досліджувалась нами на моделі аутоімунного нефриту Хеймана та порівнювалась з активністю природного пептидного комплексу нирок.

Вивчення показників імунітету, ПОЛ та АОФ, морфофункціонального стану нирок та тимуса довело, що найбільш активним синтетичним пептидом був PEKDLRK, ефекти якого наближалися до природного пептидного комплексу нирок і в ряді випадків перевершували його.

Нами було досліджено вплив синтезованих пептидів аналогів на деякі імунологічні показники під час введення у кров здорових донорів. Всі пептиди мали здатність знижувати відсоток Т-супресорі і відповідно підвищувати - Т-хелперів, найбільш активним виявився пептид PEKDSRK. Пептиди істотно не впливали на вміст Т- і В-клітин.

Синтетичні аналоги активували процеси фагоцитоза та кисеньактивуючу та протеолітичну функцію нейтрофілів, причому PEKDLRK найбільш підсилював кисеньактивуючу функцію нейтрофілів, а PEKDSRK найбільш істотно підсилював протеолітичну активність.

Ці дані добре узгоджуються з нещодавно продемонстрованими відомостями, що пептиди, які моделюють епітоп Т-клітинного розпізнавання, здатні відвертати розвиток аутоімунних захворювань [DeMagistris M.T. et al., 1992]. Потім синтетичний пептид, відповідаючий імунодомінантному епітопу віруса лімфоцитарного хоріоменінгіту був використаний для примірування та відновлення імунологічної толерантності in vivo у трансгенних мишей, у котрих епітоп віруса експресувався у підшлунковій залозі, відвертаючи пошкодження бета-клітин і розвиток діабету у таких мишей [Малыжев В.А.,1998; Aichele P. et al.,1994].

Під час внесення синтетичних пептидів у кров донорів отримані пептиди підвищували відсоток теофілін-резистентних клітин (Т-хелперів), знижують - теофілінчутливих, активують фагоцитарні функції.

Таким чином, отримані нами синтетичні пептиди, які моделюють природний пептидний комплекс нирок були здатні блокувати розвиток аутоімунного нефриту і виявляли риси потенційних фармакологічних речовин.

Сьогодні вже відомі лікарські речовини, які являють собою синтетичні пептиди, що моделюють структуру Т-клітинного епітопу. Класичним прикладом є кополімер 1, дію якого можна описати таким дослідом. У щурів індукували розвиток алергічного енцефаломієліту шляхом введення спинного мозку або синтетичних пептидів протеоліпідного білку р139-151 та 178-191. Кополімер 1 відвертав розвиток захворювання, блокував антигенспецифічну відповідь специфічних Т-клітинних ліній, але не впливав на поліклональну відповідь, викликану суперантигеном (ентеротоксин А). Кополімер 1 запобігав зв'язуванню р139-151 та р178-191 з молекулами МНС та,більш того, мог виштовхувати ці пептиди із зв'язуючого сайта МНС [Teitelbaum D. et al.,1996].

Такий блокуючий вплив на антигенспецифічну відповідь без інгібірування поліклональної відповіді ми спостерігали практично в усіх наших дослідах з пептидним комплексом нирок при імунній патології.

Сьогодні кополімер 1 вже успішно використовується в клінічній практиці для лікування розсіяного склерозу самостійно або в комбінації з ендогенними імуномодуляторами [Milo R., Panitch H., 1995].

Як відомо, імунна система має міцні функціональні зв'язки з іншими системами резистентності крові - коагуляційною та перекисним окисленням ліпідів разом із антиоксидантним захистом [Кузник Б.И. и соавт., 1989; Мищенко В.П. и соавт., 1982-1995; Дранник Г.Н., 1989], тому ми також дослідили і ці процеси.

Внесення пептидного комплексу у кров донорів, введення здоровим тваринам і тваринам з експериментальною патологією виявило такі основні риси дії - блокування зовнішнього шляху зсідання крові, блокування тромбінової активності та активація фібринолізу. Ці властивості пептидного комплексу дуже важливі з точки зору функціонального локального гемостазу [Kanfer A., 1984-1990].

Рівень ПОЛ та АОФ відображують функціональну активність та морфологічну цілісність клітин нирок вцілому [Роговой Ю.Е., Гоженко А.И., 1989; Iwasaki K.,1990; Dagget D.A. et al., 1997; Paller M.S.,1988].

В усіх серіях дослідів, де вивчали показники ПОЛ та АОФ, були знайдені суттєві зміни у хворих тварин. Введення пептидного комплексу нирок відновлювало ці показники до рівня здорових тварин. Ці зміни ми пов'язуємо з дією пептидного комплексу на функціональний стан клітин, яка непрямо відображується на показниках ПОЛ та АОФ.

Наступне питання, яке на наш погляд потребує обговорення, це те що при досить нетривалому терміні введення пептидного комплексу нирок ми спостерігали чіткий терапевтичний вплив та, в багатьох випадках, нормалізацію стану морфологічних структур нирки.

Ця проблема постала після аналізу літератури, присвяченої клінічній терапії розсіяного склерозу кополімером 1, де наведено дані щодо досягнення клінічного покращення при тривалому застосуванні препарату.

На наш погляд, це може бути пов'язано з двома причинами. По-перше, ефект після введення пептидів в експериментальних умовах відбувається швидче, внаслідок того, що експериментальна патологія чітко визначена, як правило моноетіологічна, з відомим патогенезом. Той же кополімер при експериментальному енцефаліті діяв набагато швидче, чим за клінічних умов [Teitelbaum D. et al., 1996]. Очевидно, що строки клінічного застосування досліджуваних нами речовин будуть більш тривалі. По-друге, нервова та ниркова тканини мають різні строки розвитку компенсаційних та адаптаційних реакцій, різні форми регенерації. Для нирок ці процеси відбуваються більш динамічно.

В нирках після дії пошкоджуючих факторів пристосувальні флуктуації функціональної активності та нормалізація порушених функцій забезпечується в рівній мірі за рахунок гіперплазії клітин та внутріклітинних регенераторних (гіперпластичних) процесів. Регенерація епітелія нирок вивчена недостатньо та практично виключно на тваринах, що ростуть весь період життя - щури та миші, тому ці результати треба дуже обережно екстраполювати на регенерацію нирок у інших ссавців та людей.

...