Зміни кальцієвого гомеостазу в нервових клітинах при розвитку діабетичних нейропатій

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміни кальцієвого гомеостазу в нервових клітинах при розвитку діабетичних нейропатій

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Епідеміологічні дослідження, проведені в ряді країн світу за останнє десятиріччя, показали, що цукровий діабет на сьогоднішній день становить медіко-соціальну проблему, а по своїй чинності займає третє місце після серцево-судинних та онкологічних захворювань (Балаболкін, 1994, Єфімов та Скробонська, 1998). Відмічено зростання процентного співвідношення хворих як на інсулінзалежний (ІЗЦД), так і на інсуліннезалежний (ІНЦД) цукровий діабет серед населення європейських країн, що серед інших факторів пояснюється підвищенням в популяціях носіїв генів, сприятливих до розвитку цукрового діабету, збільшенням виявлення цукрового діабету (за рахунок покращення діагностики переважно ІНЦД) та суттєвого збільшення тривалості життя хворих на цукровий діабет, за рахунок покращення його лікування (Єфімов, 1989, Старкова, 1992). Відповідно, через вищезазначені фактори одне з центральних місць у дослідженнях механізмів розвитку цукрового діабету та можливостей фармакологічного впливу на його перебіг посіли питання вивчення механізмів розвитку ускладнень цукрового діабету, які багатьма дослідниками розгядаються як безпосередній прояв хвороби (Єфімов, 1989; Levy, 1994; Stevens et al., 1995). Особливу увагу серед них привертають діабетичні нейропатії, як внаслідок важкості клінічного перебігу, так і внаслідок складності підбору адекватної патогенетичної терапії. Розповсюдження цієї патології зростає від 7% серед хворих з тривалістю цукрового діабету до 1 року до 50% у хворих з тривалістю цукрового діабету більше 25 років (Pirart, 1978, Vinic et al., 1992). В той же час не всі ланки патогенезу діабетичних нейропатій на сьогодняшній день повністю розкрито. За даними Єфімова та Скробонської (1998), дистальна сенсорно-моторна нейропатія є однією з найбільш розповсюджених форм цієї патології. Основні риси, що властиві цій формі діабетичної нейропатії - порушення швидкості проведення імпульсів та збудливості нервових клітин, розвиток больового синдрому та гіперестезій, парастезій, дізестезій, що змінюються втратою больової чутливості - без сумніву вказують на те, що однією з патогенетичних ланок їх розвитку є порушення йонного гомеостазу, в тому числі йонного кальцієвого гомеостазу, оскільки іони Са2+ необхідні клітинам для регуляції їх росту, процесів диференціювання та здійснення своїх функцій, причому спектр їх дії надзвичайно широкий (Коstyuk, 1992, 1998; Фролькіс, 1993).

Єдиної думки стосовно характеру змін кальцієвого гомеостазу у відповідних нервових структурах при діабетичній дистальній сенсорномоторній нейропатії на сьогодні нема. Так, відповідно до даних Green et al. (1990) при діабетичних нейропатіях відмічається переважно зниження рівню Са2+ в нервових клітинах, в той час як Hall et al. (1994) відмічали підсилення кальцієвих струмів в сенсорних нейронах при цукровому діабеті. Нез`ясовано, наскільки зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу можуть співпадати з такими при інших поскладненнях цукрового діабету, відрізнятись в залежності від типу діабету та змінюватись в залежності від продовженості захворювання. Найменш вивченим залишається ранній період розвитку діабетичних сенсорних полінейропатій; чи можуть на цих етапах зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу мати суттєве значення - залишається незрозумілим. Дослідження цієї ланки патогенетичних механізмів розвитку діабетичної нейропатії має допомогти у розв`язанні питання про можливості фармакологічного впливу на перебіг діабетичних нейропатій та питання підбору найбільш адекватного режиму інсулінотерапії для попередження прогресування діабетичної нейропатії.

Зв'язок роботи з науковими програмами та темами. Робота виконувалась в рамках планових тем відділу клінічної діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. Комісаренка АМН України та Міжнародного центру молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. Богомольця НАН України.

Мета роботи вивчення стану внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в нейронах різних ланок сенсорних шляхів на ранніх етапах розвитку діабетичної дистальної сенсорномоторної полінейропатії на тваринах з різними моделями цукрового діабету (стрептозотоцинового інсулінзалежного та генетично-детермінованого інсуліннезалежного) та з`ясування можливостей фармакологічної корекції його порушень.

Основні задачі дослідження:

1. Дослідити, чи розвивається сенсорномоторна полінейропатія у тварин з різними типами цукрового діабету, і якщо так, то які вона має характеристики.

2. Встановити, чи виникають зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу на ранніх етапах розвитку діабетичної сенсорномоторної полінейропатії, і якщо так, то які сенсорні шляхи переважно вражаються.

3. Дослідити, на яких саме ланках сенсорних шляхів ці зміни розвиваються і чи є відміни у змінах кальцієвого гомеостазу на різних ланках різних сенсорних систем.

4. Встановити, за рахунок ураження яких саме внутрішньоклітинних кальцій-регулюючих структур (систем мембранного транспорту, ендо-плазматичного ретикулуму, мітохондрій) виникають порушення кальцієвого гомеостазу.

5. Встановити, чи можуть такі порушення бути причиною суттєвих змін нейрональних функцій та розвитку ряду клінічних симптомів при діабетичній сенсорномоторній нейропатії.

6. Дослідити, чи залежить характер зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу від типу цукрового діабету.

7. Дослідити, чи можна впливати на зміни тих чи інших ланок внутішньоклітинного кальцієвого гомеостазу при наявності діабетичної полінейропатії в експериментальних умовах фармакологічними засобами та чи буде характер їх впливу аналогічний такому у здорових тварин.

8. Дослідити, який вплив на корекцію внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу на ранніх етапах розвитку діабетичної сенсорномоторної полінейропатії мають кальцієві блокатори групи дігідропіридинів при їх тривалому введенні піддослідними тваринами.

9. Дослідити, яке значення для корекції порушень кальцієвого гомеостазу може мати інсулінотерапія та її режим.

Наукова значимість і новизна отриманих результатів. Встановлено, що у піддослідних тварин в процесі розвитку діабетичної патології збільшується процентне співвідношення повільно-проводячих (ноціцептивних) аферентних нервових волокон відносно швидко-проводячих, що свідчить про суттєве ураження перших вже на ранніх етапах розвитку діабетичних полінейропатій.

Вперше встановлено, що на ранніх етапах розвитку діабетичних нейропатій виникає порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу на всіх ланках шляхів ноціцептивних чутливості, яке пов`язане переважно з метаболічними змінами, характерними для цукрового діабету, і може бути однією з провідних причин формування ряду симптомів діабетичної сенсорномоторної полінейропатії.

Показано, що порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в ноціцептивних нейронах має спільні риси на всіх ланках ноціцептивних нервових шляхів, в тому числі і на вищих їх ланках, які полягають у зміні кінетики кальцієвих сигналів у відповідь на збудження і, відповідно, зміні процесів виділення нейромедіаторів та процесів синаптичної передачі. В той же час, порушення, що виникають на кожній ланці аферентних шляхів, мають свої особливості.

Встановлено, що в процесі розвитку діабетичної полінейропатії вражаються як ноціцептивні, так і пропріоцептивні первинні сенсорні нейрони, причому характер зміни кальцієвих сигналів в них відрізняється; в ноціцептивних нейронах ці зміни більш суттєві. В той же час, на ранніх етапах розвитку діабетичної сенсорної полінейропатії не визначено суттєвих змін внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в пропріоцептивних нейронах вищих мозкових структур.

Вперше проведено порівняльний аналіз характеру полінейропатичних змін у тварин з інсулінзалежним та інсуліннезалежним типами цукрового діабету на ранніх етапах розвитку діабетичної сенсорномоторної полінейропатії. Встановлено, що визначені порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у ноціцептивних нейронах мають подібний перебіг, хоча і не співпадають повністю. У тварин з генетично-детермінованим діабетом в пропріоцептивних нейронах відповідних змін внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу не виявлено.

Вперше показано інтегративний характер порушень функції внутрішньоклітинних Са2+-акумулюючих структуру при цукровому діабеті: порушення кальцій-акумулюючої функції мітохондрій в первинних сенсорних нейронах та кальцій-акумулюючої функції кальцій-чутливого ендоплазма-тичного ретикулума у вторинних сенсорних нейронах.

Фармакологічний аналіз встановив суттєву зміну впливу дігідропіридинів на кальцієву сигналізацію ноціцептивних нейронів на всіх ланках сенсорних шляхів у тварин з діабетичною полінейропатією, що свідчить про наявність кількісних або якісних змін у функції різних типів потенціал-залежних кальцієвих каналів при цукровому діабеті та може бути однією з причин формування патологічних ритмів на рівні вищих мозкових структур.

Показано, що тривалий курс лікування німодіпіном у тварин з стрептозотоцин-індукованим діабетом впливає на зміни кальцієвої сигналізації в ноціцептивних нейронах неоднозначно. Але проводити повну аналогію між впливом німодіпіну на зміни кальцієвого гомеостазу у тварин та у хворих на цукровий діабет необхідно з обережністю.

Аналіз впливу інсулінотерапії на порушення внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу на ранніх етапах розвитку діабетичної сенсорномоторної полінейропатії показав, що у тварин з стрептозотоцин-індукованим діабетом повної компенсації визначених змін за допомогою моноінсулінотерапії досягти не можна, переважно через ураження кальцій-акумулюючих внутрішньоклітинних структур. Для досягнення максимально можливої корекції змін внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу необхідна стійка компенсація цукрового діабету.

Практичне значення роботи. Одержані результати розкривають можливі патогенетичні ланки розвитку діабетичної сенсорномоторної полінейропатії та ряду її симптомів, таких як больовий синдром, гіпералгезія, гіпер - та гіпоестезія, тобто симптомів, що переважають на ранніх етапах розвитку полінейропатії. Це дозволяє шукати нові засоби фармакологічного впливу на розвиток цього ускладнення цукровго діабету, враховуючи тип цукрового діабету.

Дослідження впливу інсулінотерапії на зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу дало додаткове обгрунтування необхідності досягнення у хворих на цукровий діабет стійкої компенсації захворювання для стабілізації перебігу діабетичної полінейропатії; для досягнення такої компенсації бажано вживання режиму інтенсивної інсулінотерапії. В той же час, одержані результати свідчать, що для компенсації виникаючих в процесі розвитку діабетичної полінейропатії порушень кальцієвого гомеостазу вживання лише інсулінотерапії недостатнє.

Дослідження терапії дігідропіридинами свідчать про неоднозначність результатів їх використання при ураженні нервових клітин при різних типах цукрового діабету, а також про недостатність використання німодіпіну як монотерапії при діабетичній полінейропатії.

Отримані результати вказують на необхідність цілеспрямованого пошуку комплексних засобів для ефективної стабілізації перебігу діабетичної полінейропатії з урахуванням необхідності компенсації визначених порушень кальцієвого гомеостазу, а також включення до терапевтичного комплексу препаратів, що впливають на порушення функції внутрішньоклітинних кальцій-акумулюючих стуктур.

Особистий внесок здобувача. Здобувач брав безпосередню участь у плануванні та проведенні всіх експериментальних досліджень, результати яких викладені в дисертації. Ним проведений повний аналіз отриманих результатів, їх статистична обробка, співставлення з існуючими даними наукової літератури та оцінка практичного значення проведених досліджень.

Здобувачем проведено співставлення отриманих результатів з клінічними проявами діабетичної дистальної сенсорномоторної полінейропатії, а також зроблено порівняльний аналіз даних експериментальних та клінічних досліджень інсулінотерапії та лікування дігідропіридинами на перебіг діабетичної сенсорної полінейропатії.

Апробація та публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 24 наукові роботи, з них 5 самостійних, в наукових журналах, наукових збірках та тезах конференцій, де роботи було прийнято на правах статтей.

Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на конференціях та симпозіумах:

1. I конгрес Федерації Європейських фізіологічних товариств, Маастріхт, Нідерланди, серпень 1995 р.

2. IV Міжнародний сімпозіум з діабетичних нейропатій, Амстердам, Нідерланди, липень 1997 р.

3. VI Міжнародна школа «Лекції з діабету у тварин», Копенгаген, Данія, липень 1997 р.

4. Міжнародна школа «Кальцієва сигналізація», Київ, червень 1997 р.

5. Річна конференція Британського фізіологічного товариства, Ліверпуль, Велика Британія, квітень 1998 р.

6. I з`їзд Українського товариства нейронаук, Київ, жовтень 1998 р.

7. Засідання відділу діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин та Семінар молекулярної фізіології Інституту фізіології, грудень 1998 - січень 1999 р.

8. Апробаційна комісія спеціалізованої вченої ради Інституту ендокринології та обміну речовин ім. Комісаренка АМН України, грудень 1998 р.

Обсяг та зміст дисертації

кальцій гомеостаз діабетичний полінейропатія

Дисертація викладена на 264 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, розділів «Матеріали та методи дослідження», «Власні результати» (7 підрозділів), «Обговорення результатів», висновків, показника літератури (392 джерел). Робота ілюстрована 18 малюнками, 14 діаграмами, 13 таблицями.

Об'єкти та методи досліджень

Моделі цукрового діабету зручні тим, що вони, хоча і не повністю відповідають таким у людей, загалом зберігають основні патогенетичні механізми розвитку захворювання та його поскладнень, дозволяють вивчити детально ряд механізмів, які не можна дослідити у клінічних умовах (наприклад, ряд метаболічних аспектів, внутрішньоклітинні зміни), більш детально обґрунтувати використання лікувальних препаратів, а також верифікувати загальні заключення та теорії, що отримуються при дослідницьких роботах у клініці. Тому ми вирішили звернутись до проведення ряду досліджень на експериментальних моделях цукрового діабету. Серед поскладнень, що можуть розвинутись у таких тварин, виявлені ретинопатія, нефропатія, елементи ангіопатії, а також діабетичні нейропатії.

Характеристика тварин, що використовувались у дослідах. Виходячи з даних літератури, нами при проведенні досліджень було використано декілька груп тварин: миші лінії AC57Black6 та щури лінії Wіstar, на яких моделювався стрептозотоциновий (СТЗ) діабет (модель ІЗЦД), і миші лінії db/db з генетично-детермінованим діабетом (модель ІНЦД). Використовувались контрольні групи тварин та тварини через 3 дні та 1-2 тижні після введення СТЗ (для перевірки безпосереднього впливу стрептозотоцину та впливу змін рівню глікемії на нервові клітини в процесі розвитку цукрового діабету) та тварини з розвинутим цукровим діабетом. Наявність цукрового діабету визначалась рівнем глікемії (вище 14 ммоль/л для СТЗ-індукованого та вище 10 ммоль/л для генетично-детермінованого діабету).

У мишей лінії АC57Black6 діабет модулювався шляхом п`яти послідовних внутрішньобрюшинних ін`єкцій СТЗ (сумарна доза 40 мг/кг). СТЗ вводився тваринам у віці 7-8 тижнів; в експеримент тварини брались у віці 12 тижнів. Щурам лінії Wistar СТЗ вводився одноразово, з розрахунку 60 мг/кг. Аналіз доз препарату та режим його введення проведено за даними літератури (Баранов, 1983, Западнюк та співавт., 1983, Балаболкін, 1984, Shafrir, 1990).

Миші лінії db/db з генетично-детермінованим діабетом брались у дослід у тому ж віці, що і миші лінії AC57Black6.

Мишам лінії AC57Black6 з СТЗ-індукованим діабетом проводилась інсулінотерапія на протязі тижня; лікування німодіпіном - на протязі 3 тижнів.

Під час проведення досліджень тварини утримувались на стандартній дієті, в однакових умовах; для спроб брались переважно самці (як більш чутливі до стрептозотоцину) однакових вікових груп.

Вимірювання глікемії проводились декілька разів, відповідно у контрольних тварин, через певний час після введення стрептозотоцину та безпосередньо перед взяттям у спробу для встановлення наявності розвинутого цукрового діабету. У кожну серію спроб тварини підбирались з близькими показниками глікемії. Кров для вимірювання забиралась з хвостової вени як у мишей, так і у щурів. Вимірювання проводились за допомогою глюкометру Reflolux S.F. (з паралельним контролем по кольоровій шкалі).

Визначення швидкості проведення нервового імпульсу по аферентним нервовим волокнам та визначення потенціалу дорзальної поверхні спинного мозку (ПДП). Тварини наркотизувались нембуталом 60 мг/кг внутрішньобрюшинно). Відведення потенціалів дорзальної поверхні (ПДП) спинного мозку проводилось на рівні L4-L5 за допомогою відвідного електроду. Референтний електрод вколювався у м`язи спини. Для посилення потенціалів використовувався підсилювач змінного струму з високим коефіцієнтом підсилення. Сиднічний нерв розміщувався на подразнюючі електроди з міжелектродную відстанню 1,5 мм.

Визначення рівню внутрішньоклітинного кальцію [Ca2+] i та кальцієвих сигналів в первинних сенсорних нейронах та мітохондріях. Для визначення [Ca2+] i в нейронах дорзальних гангліїв спинного мозку (ДГСМ) використовувались контрольні миші лінії AC57Black6, миші цієї ж линії через 3 дні та 1-2 тиждня після введення СТЗ та з розвинутим СТЗ-індукованим діабетом, а також миші лінії db/db. ДГСМ виділялись з спиномозкового каналу (попереково-крижової області) у стерильних умовах під мікроскопом. Виділені ганглії проходили стандартну ензиматичну обробку у охолодженому розчині Тіроде, що містив 1 мг/мл пронази (тип XIV, «Sigma», США). Після закінчення обробки клітини виділялись механічно та переносились на покривних шкельцях в експериментальну камеру з вмонтованим інвертованим флюорисцентним мікроскопом. Для проведення експерименту вживалась система швидкої аплікації розчинів під контролем ЕОМ (Usachev et al., 1993).

Внутрішньоклітинний вільний [Ca2+] i визначався стандартною методикою за допомогою кальцій-чутливого флюорисцентного барвника indo-1AM (у розчин також додавався детергент плюронік F-127). Флюорисценція розчину викликалась ультра-фіолетовим випромінюванням на довжині хвилі 360 нм, подвійна емісія вимірювалась на довжинах хвиль 395-415 та 490-510 нм; [Ca2+] i визначався по зміні співвідношення флюорисцентних сигналів в наведених діапазонах з використанням формули Grynkiewich et al. (1985). Обробка сигналів проводилась допомогою програмно-апаратного комплексу Win Tyda (Battelle, Germany).

Інтрамітохондріальний рівень Са2+ досліджували за кількістю його вивільнення з органел у цитозоль. Для цього у зовнішньоклітинний розчин Тіроде додавався мітохондріальний протонофор карбонілціанід m-хлорфенілгідразон (СССР).

Склад розчину Тіроде (мМ): NaCl-140, KCl-4, CaCl2-2, MgCl2 -2, EGTA - 0,5, HEPES/NaOH-10, pH - 7,3. Для деполяризації клітинної мембрани використовувались розчини Тіроде, в яких було проведене еквімолярне заміщення 50 мМ натрію калієм.

Визначення [Ca2+] i та кальцієвих сигналів у нейронах спинного мозку (вторинні сенсорні нейрони), нейронах мозочку, таламусу та кори великих півкуль. Для визначення [Ca2+] i використовувались контрольні щури лінії Wistar, а також тварини цієї ж лінії через 1-2 тижні після введення СТЗ та з розвинутим СТЗ-індукованим цукровим діабетом. Досліджувались не ізольовані нейрони, а зрізи відповідних вищих структур мозку. Тварини присиплялись нембуталом, 60 мг/кг.

Для виготовлення слайсів (зрізів) спинного мозку вирізалась його частина на рівні L5-L7. У холодному розчині Кребса на фосфатному буфері під мікроскопом проводилось препарування та очищення потрібного відділу. Розчин безперервно оксигенувався карбогеном (95% О2 + 5% СО2). Зрізи нарізались на вібротомі (товщина зрізу 300 мкм). Зрізи мозочку, таламусу та кори великих півкуль виготовлялись за аналогічною методикою з використанням розчину Рінгера.

Після інкубації та забарвлення виготовлені зрізи разом з предметним шкельцем переносились у експериментальну камеру, змонтовану на підставці флюорисцентного мікроскопу. Окремі клітини у зрізах візуалізувались за допомогою дістанційного водо-імерсійного об`єктиву. Визначення [Ca2+] i проводилось за допомогою флюорисцентного барвника фура-2AM. Для збудження барвника клітини освітлювались на хвилях 360 ± 5 нм та 390 ± 5 нм. Далі світло збудження збиралось на довжині хвилі 530 ± 10 нм. Рівні [Ca2+] i обчислювались також за формулою Grynkiewich et al. (1985).

Склад розчину Рінгера на фосфатному буфері (в мМ): NaCl - 125,0 KCl - 5,0 CaCl2-2,5, MgSO4-1,5, NaHCO3-25,0, KH2PO4-1,5, глюкоза - 10,0, рН 7,4.

Визначення [Ca2+] i в ендоплазматичному ретикулумі. Для визначення [Ca2+]і використовувались групи тварин, аналогічні таким при виготовленні мозкових зрізів. Виготовлення зрізів та їх забарвлення флюорисцентним барвником проводилось за аналогічною методикою. Для вимірювання вивільнення [Ca2+] i з внутрішньоклітинних депо зрізи переносились у розчин без CaCl2, в який додавалось 30 мМ кофеіну; вміст MgCl2 підвищувався до 3мМ з наступною додачею до розчину 1мМ EGTA.

Визначення активності Са2+ АТФази у гангліях дорзальних корінців, гомогенатах спинного та головного мозку. Для визначення Са2+-АТФазної активності використовувались аналогічні групи мишей. Тварини присиплялись ефіром. Вибраний спинний та головний мозок гомогенізували на холоду у шкляному гомогенізаторі (розчин для гомогенізації містив 250 мМ сахарози, 20 мМ тріс-Сl, при рН 7,5). Перед визначенням активності ензиму до гомогенату додавали розчин дігітоксину (кінцева концентрація 0,2%). Загальну АТФазну активність визначали у розчині наступного складу: тріс-Cl (pH 7,5)-50мМ, MgCl2-4мМ, CaCl2 -1мМ, АТФ-4мМ, оубаїн-0,15мМ. Активність Mg2+-АТФази визначали у тих же умовах, але в присутності ЕGТА. Вміст неорганічного фосфору визначали за Fiske & Subbarow (1955), вміст білку - за Lowry et al. (1951). Активність виражали у мікромолях вивільненого неорганічного фосфору на 1 мг білку в годину. Активність Са2+-АТФази вираховували по різниці між загальною АТФазною активністю та активністю Mg2+-АТФази.

Результати досліджень та їх обговорення

Швидкість проведення аферентних нервових імпульсів у піддослідних тварин. Однією з основних ознак розвитку дистальних діабетичних сенсорномоторних полінейропатій є зниження швидкості проведення нервового імпульсу по дистальних аферентних нервових волокнах. Наявність цього феномену підтверджується як в клініці (де він є діагностичною ознакою розвитку полінейропатій), так і в умовах експерименту за допомогою електроміографічних методик та транскутанного подразнення нервових волокон. В наших дослідженнях для визначення швидкості проведення нервового імпульсу по нервовим аферентним волокнам використовувалась стандартна методика відведення потенціалу дорзальної поверхні спинного мозку (ПДП), викликаного подразненням сідничного нерву. При монополярній реєстрації компонентний склад ПДП має трихфазний характер: швидкий компонент, що характеризує максимальну швидкість проходження аферентної хвилі (нервового збудження) під відвідним електродом, тобто початок та тривалість її перебігу; повільний негативний компонент (N1 та N2 хвилі), який відображає сумарну постсинаптичну активність нейронів більш поверхневих шарів дорзального рогу спинного мозку (ЗПСП) аферентами з різною швидкістю проведення і, нарешті, заключний електропозитивний компонент (Р хвиля), що виникає при переміщенні збудження у більш глибокі шари спинного мозку (мал. 1).

Отримані результати свідчать про те, що за відсутністі змін у максимальній швидкості проведення нервового збудження у тварин з цукровим діабетом на ранніх етапах розвитку захворювання, у них виявляються зміни, характерні для початкових етапів розвитку діабетичних сенсорномоторних полінейропатій. Збільшення тривалості швидкого позитивного компоненту свідчить про зміну процентного співвідношення нервових волокон з високою та низькою швидкістю проведення нервових імпульсів у бік збільшення відносної кількості останніх, що співпадає з даними Terenghi et al., (1994).

При дослідженні сумарної активності постсинаптичних елементів у дорзальному розі спинного мозку вивчались зміни повільних компонентів ПДП. Як у тварин з СТЗ-індукованим діабетом, так і у тварин з генетично-детермінованим діабетом відмічалось підвищення амплітуди N-хвилі, що свідчить про підсилення сумарної постсинаптичної активності нейронів дорзального рогу спинного мозку у цих мишей по відношенню до контрольних тварин. У тварин лінії db/db таке підвищення було менш значним, ніж у тварин з СТЗ-індукованим діабетом (р<0,05).

Тому в подальшому нами було проведено дослідження внутрішньо-клітинного кальцієвого гомеостазу на всіх ланках сенсорних нервових шляхів. При цьому досліджувався не лише базальний внутрішньоклітинний рівень [Ca2+] i але і кальцієві сигнали («кальцієві транзиєнти»), які характеризують процеси надходження (пікова амплітуда) та виведення (період термінації) Са2+ з клітин в процесі їх збудження.

Порушення функції первинних сенсорних нейронів дорзальних гангліїв спинного мозку. Нейрони в ДГСМ можна розділити на дві основні групи за розміром їх соми - великі та малі, що відповідно віддають аферентні волокна великого та малого діаметру (з високою та низькою швидкістю проведення нервових імпульсів). Нейрони великого розміру мають аксони типу Аab, проводять переважно пропріоцептивні та тактильні екстероцептивні аферентні сигнали, в той час як нейрони малого діаметру з аксонами типу Аd та С (немієлінізованими) передають переважно ноціцептивні та температурні сигнали. Крім того, ці дві групи нейронів у мишей відрізняються за своїми механізмами регулювання внутрішньоклітинного Са2+. У великих нейронах істотне значення має накопичення та наступне звільнення Са2+ системою ендоплазматичного ретикулуму (кальцій-індуковане звільнення), в той час як у малих нейронах цей механізм не функціонує (Shmigol et al., 1994).

Були використані контрольні миші АС57Black6, миші цієї ж лінії через 3 дні після введення СТЗ, миші з розвинутим СТЗ-індукованим діабетом та миші з генетично-детермінованим діабетом.

Середні рівні базального [Ca2+] i для вищезазначених груп тварин відповідно складали: 114,00 ± 4,49 нМ, 117,05 ± 6,77 нМ, 118,83 ± 8,64 нМ та 121,12 ± 4,85 нМ для ноціцептивних нейронів та 82,97 ± 6,36 нМ, 85,38 ± 7,43 нМ, 65,25 ± 4,86 нМ та 82,67 ± 3,90 нМ для пропріоцептивних нейронів. Як видно з наведених вище даних, у контрольних тварин відмічалась достовірна різниця між рівнем базового [Са2+] i в ноціцептивних та пропріоцептивних нейронах (р<0,05). Ця різниця зберігалась і у мишей обох ліній з цукровим діабетом. В той же час суттєвої різниці в базовому рівні [Ca2+] i. у ноціцептивних нейронах мишей з цукровим діабетом по відношенню до контрольних тварин визначено не було. Тільки у пропріоцептивних нейронах мишей з розвинутим СТЗ - індукованим діабетом відмічалась тенденція до зниження базового рівня [Ca2+] i (0,1>Р>0,05).

При дослідженні кальцієвих сигналів у нейронах ДГСМ, що викликались деполяризацією мембрани гострою аплікацією розчину з підвищеним вмістом КСl, вивчались їх пікова амплітуда та характеристики періоду термінації під впливом деполяризації клітинної мембрани, а саме час напівспаду кальцієвого сигналу та рівень залишкового кальцію. Рівень залишкового [Ca2+] i визначався відповідно до формули: R=(D [Ca2+] 60/D [Ca2+] peak) х100%, де D [Ca2+] 60 - це рівень Са2+ в клітині через 60 сек після припинення деполяризації мінус рівень Са2+ в спокої, а D [Ca2+] peak - це різниця між абсолютним значенням пікової амплітуди та рівнем Са2+ в спокої (Shmigol et al., 1995). Такий засіб виміру дозволяв порівнювати зміни рівню залишкового Са2+ у клітинах з різною амплітудою початкого кальцієвого сигналу.

Середні значення пікових амплітуд у ноціцептивних нейронах тварин з цукровим діабетом достовірно не відрізнялись від таких у контрольних тварин і становили 470 ± 97 нМ, 499 ± 88 нМ та 546 ± 89 нМ для контрольних тварин, мишей з розвинутим СТЗ-діабетом та мишей з генетично-детермінованим діабетом відповідно.

При дослідженні термінації кальцієвих транзиєнтів було встановлено, що у мишей як з СТЗ-індукованим, так і з генетично-детермінованим цукровим діабетом в ноціцептивних нейронах відмічається суттєве збільшення тривалості кальцієвих сигналів, переважно за рахунок залишкового підвищення рівня [Са2+] i на протязі десятків секунд після припинення деполяризації.

Підвищення залишкового [Ca2+] i стає найбільш значним при тривалості деполяризації 5,0 сек (Р<0,001) і зберігається навіть через 1 хвилину після закінчення деполяризації (мал. 4).

Роль мітохондрій в порушенні кальцієвої сигналізації в первинних сенсорних нейронах при діабеті. Подовженість кальцієвих сигналів та інші їх зміни можуть бути причиною потенціації синаптичної передачі таких сигналів на наступні нейрони ноціцептивної системи і виникнення клінічних симптомів нейропатій.

Механізмом такого явища має бути порушення клітинних механізмів, відповідальних за видалення Са2+ з цитозолю після різкого підвищення їх рівня підчас збудження клітини. Одним з компонентів таких порушень можуть бути зміни в мітохондріях. Останнім часом встановлено, що мітохондрії можуть ефективно поглинати ці йони з цітозолю завдяки активності уніпортерної системи їх внутрішньої мембрани. Ця система використовує протонний градієнт, що існує на внутрішній мембрані, для ефективного транспорту Са2+ в мітохондрії. Поряд з цим, мітохондріальна мембрана має також системи Ca2+/Na+ та Ca2+/H+ обмінників, що після закінчення збудження можуть вивільняти Са2+ назад у цитозоль. Для виключення мітохондріального накопичення Са2+ використовувалась дія протнофору СССР, що викликає дисипацію протонного градієнту на внутрішній мембрані. Така дія сама по собі майже не викликала підвищення базового рівню вільного Са2+ в цитозолі.

Дія СССР приводила до виразних двояких змін в характеристиках кальцієвих транзиєнтів, викликаних входом у клітину Са2+ через активовані мембранною деполяризацією кальцієві йонні канали: вона збільшувала пік цих транзиєнтів (за рахунок підвищення амплітуди та значного його подовження), в той же час скорочуючи залишкове підвищення цитозольного рівню Са2+. Ці зміни вказують на пригнічення СССР акумуляції Са2+ мітохондріями з цитозолю під час піка транзиєнта та наступного повільного вивільнення їх назад у цитозоль після припинення збудження. Висновок про те, що повільне вивільнення Са2+ назад у цитозоль після навантаження цими йонами мітохондрій назад у цитозоль здійснюється саме системами Ca2+/Na+ та Сa2+/H+ обміну, підтверджується його пригніченням специфічним інгібітором такого обміну тетрафеніл-фосфонієм (ТРР+).

Мітохондріальний протонофор СССР у нейронах тварин з СТЗ-індукованим діабетом, як і у нейронів контрольних тварин, викликав збільшення амплітуди та подовження часу півспаду викликаних мембранною деполяризацією кальцієвих транзиєнтів, але менш значне, ніж у контролі. У тварин з генетично-детермінованим діабетом підвищення амплітуди транзиєнтів взагалі було непомітним. Тривалість піку (що вимірювалась часом його напівспаду) в малих нейронах тварин з СТЗ-діабетом під СССР також збільшувався менш суттєво, ніж в аналогічних нейронах здорових тварин.

Ще більш істотно змінювався залишковий рівень цитозольного Са2+. Характерне для діабетичного стану тривале підвищення цього рівня в значній мірі усувалось на фоні дії протонофору. Відповідні статистичні дані про зміни кальцієвих сигналів в великих та малих нейронах сумовані на Табл.2.

Oдержані результати можуть вказувати на те, що захоплення йонів Са2+ мітохондріями під час СТЗ-індукованого діабету все ще має місце, але стає менш ефективним. Збільшене залишкове підвищення рівню Са2+ в цитозолі, особливо характерне для малих сенсорних нейронів у діабетичних тварин, на фоні дії СССР поверталось до рівня, характерного для нейронів контрольних тварин. Це дає підстави вважати, що в посиленні такого підвищення при діабеті певну роль грає саме затримане вивільнення Са2+ з мітохондрій.

При генетично-детермінованому діабеті нейрональні механізми, відповідальні за формування кальцієвих сигналів під час збудження клітини, в тому числі Са2+-акумулююча функція мітохондрій, також порушуються, але по іншому, ніж при ІЗЦД, викликаному введенням стрептозотоцину. Відсутність підвищення амплітуди кальцієвого транзиєнту під впливом прикладання мітохондріального протонофору СССР свідчить про те, що різниця щвидше всього полягає в змінах процесу накопичення Са2+ мітохондріями.

Для прямого дослідження змін викиду Са2+, попередньо накопиченого у мітохондріях, мітохондріальний протонофор СССР прикладався безпосередньо після виклику кальцієвого транзиєнту та відповідного поглинання йонів мітохондріями. Таке прикладання викливало появу масованого викиду Са2+ в цитозоль, пік якого в нейронах тварин з СТЗ-індукованим діабетом зменшувався у декілька разів (з 1423,3 ± 115,1 нМ до 58,0 ± 13,5 нМ у великих нейронах та з 1053,5 ± 105,4 нМ до 69,7 ± 11,4 нМ у малих, Р<0,001).

Одержані результати підтверджують зроблений вище висновок про те, що виникнення діабетичного стану погіршує накопичення йонів Са2+ у мітохондріях і особливо його викид назад у цитозоль системою йонних обмінників. Звичайно, інші компоненти механізму підтримання кальцієвого гомеостазу в нервових клітинах також можуть порушуватись при діабетичній патології.

Функнціонування систем активного трансмембранного транспорту Са2+. Суттєву роль у регуляції внутрішньоклітинного гомеостазу Са2+, в тому числі у відновленні базового рівню цих йонів після збудження, приймає активний транспорт їх через клітинні мембрани за допомогою кальцієвих АТФаз Р-типу. В ряді досліджень показано порушення активності Na+/K+-АТФази при різних поскладненнях цукрового діабету, в тому числі і при діабетичній полінейропатії (Kaur & Lackman, 1994; Ver et al., 1995).

В наших дослідженнях рівні глікемії у контрольної групи мишей лінії AC57Black6 становили 4.04 ± 0.17 ммоль/л, а у мишей з СТХ-індукованим та генетично-детермінованим діабетом вони відповідно зростали до 21.15 ± 0.50 та 11.45 ± 0.50 ммоль/л.

Активність Са2+-АТФази в гомогенаті спинного мозку у контрольної групи мишей становила 5,75 ± 0,70 мкМ Р/мг білка/год, а у мишей з СТЗ-індукованим діабетом складала 6,07 ± 0,9 мкМ Р/мг білка/год та у мишей з генетично-детермінованим діабетом 9.40 ± 1.51 мкМ Р/мг білка /год (Р<0,05).

Активність Сa2+-АТФази в гомогенаті головного мозку контрольної групи мишей становила 11,96 ± 2,37 мкМ Р/мг білка/год та 9,3 ± 1,4 мкМ Р/мг білка/год при СТЗ-індукованому цукровому діабеті; достовірної різниці виявлено не було. У мишей з генетично-детермінованим діабетом рівень активності у головному мозку також був підвищеним (14.83 ± 1.28 мкМ Р/мг білка/год).

В той же час слід відзначити широку варіабельність отриманих даних. У тварин лінії db/db великої ваги (біля 100 г.) з розвиненим ожирінням та великою тривалістю діабету ми отримали низькі показники АТФ-ази в препаратах спинного та головного мозку по відношенню до тварин віком 10-12 тижнів.

Таким чином, при розвитку обох типів цукрового діабету у піддослідних тварнин не відзначається достовірної зміни сумарної Са2+-АТФазної активності в тканині як спинного, так і головного мозку. Можливо, що визначення сумарної АТФазної активності, що включає активність як плазмалемальних, так і ендоретикулярних АТФаз, в данному разі є недостатньо чутливих методом, і відсутність змін в активності СEРКA може маскувати невеликі зміни активності ПMКA, і навпаки.

Кальцієва сигналізація в нейронах дорзального рогу спинного мозку при СТЗ-індукованому діабеті. Визначені вище глибокі зміни у кальцієвій сигналізації в первинних сенсорних нейронах, особливо значні у нейронах малого діаметру, що відповідають за передачу ноціцептивних сигналів, можуть приводити до значних змін у передачі нервової імпульсації до вищих мозкових структур, у першу чергу на нейрони дорзального рогу спинного мозку. Нейрони дорзального рогу, головним чином нейрони желатінозної субстанції, є вторинними сенсорними нейронами, що дають початок висхідним ноціцептиним шляхам і передають свої сигнали у відповідні структури головного мозку.

Як і у випадку первинних сенсорних нейронів, ми не визначили істотних змін базового рівню (рівню спокою) [Ca2+] i при порівнянні обох груп тварин. Цей рівень в даній серії становив 68 ± 15 нМ для нейронів контрольних тварин та 82 ± 17 нМ для нейронів тварин з СТЗ-індукованим діабетом.

Істотних змін пікових значень амплітуди транзиєнтів та швидкості їх наростання між нейронами обох груп тварин також не відмічено. Середнє значення амплітуди [Ca2+] i транзиєнтів становило 719 ± 132 нМ для контрольних тварин та 694 ± 155 нМ для діабетичних тварин. Постійна часу наростання цих транзиєнтів (яка визначалась за допомогою апроксимації моноекспоненціальною функцією) становила 3,0 ± 0,8 сек як для контрольних нейронів, так і для нейронів діабетичних тварин.

Основною відміною викликаних мембранною деполяризацією кальцієвих транзиєнтів в нейронах діабетичних тварин в порівнянні з нейронами контрольних було значне уповільнення виведення Са2+ з цитоплазми після закінчення стимуляції. В клітинах контрольних тварин рівень [Ca2+] i після припинення деполяризації (20 сек аплікації зовнішнього розчину з 50 мМ КСl) моноекспоненціально повертався до рівню спокою з постійною часу 8,0 ± 0,5 сек. На відміну від цього, в нейронах діабетичних тварин відновлення відбувалось більш складно; у всіх випадках можна було виділити другу, дуже повільну експоненціальну компоненту.

Постійні часу цих двох фаз процесу відновлення базового рівню [Ca2+] i в нейронах діабетичних тварин становили відповідно 7,2 ± 0,5 сек та 23,0 ± 0,6 сек. Рівень внутрішньоклітинного Са2+, що визначався через 90 сек після припинення стимуляції, був значно вищим, ніж його базовий рівень у контрольних тварин (Р<0,001). Діаграма змін відносного рівню залишкового кальцію у нейронах контрольних тварин та тварин через 1 та 7 тижнів після введення СТЗ, у порінянні до рівню глікемії, наводиться на мал. 8 (ліворуч). З наведеної діаграми видно, що зміни рівню залишкового Са2+ були пов'язані з ступенем розвитку цукрового діабету (рівнем гіперглікемії).

Кальцієві сигнали, викликані викидом Са2+ з ендоплазматичного ретикулуму при дії кофеіну. Однією з причин більш суттєвого порушення кальцієвої сигналізації в нейронах дорзального рогу може бути порушення вивільнення Са2+ з Са2+-чутливих депо ендоплазматичного ретикулуму. Експеримен-тальним методом активації системи такого вивільнення Са2+ є дія кофеіну безпосередньо на рецептори мембрани ендоплазматичного ретикулуму. Прикладання 30 мМ кофеіну до нейронів дорзального рогу в зрізах спинного мозку як контрольних, так і діабетичних тварин викликало транзиторне підвищення в них цитозольного рівню Са2+. Величина такого підвищення не змінювалась при 5-ти хвилинній суперфузії зрізів безкальцієвим розчином, що підтверджує надходження йонів саме з ЕР. Середні значення амплітуд цих реакцій становили 268 ± 29 нМ в контрольних клітинах, 149 ± 27 та 31 ± 9 нМ в нейронах через 1 та 7 тижнів після введенні СТЗ.

Вплив блокатора кальцієвих каналів ніфедіпіну на кальцієві сигнали в нейронах дорзального рогу. Для визначення ролі певних типів кальцієвих каналів у генерації кальцієвих сигналів в нейронах дорзального рогу нами був досліджений вплив на описані вище кальцієві транзиєнти блокатора кальцієвих каналів L-типу ніфедіпіну в концентрації 50-100 мкМ. Вплив цього блокатора перевірявся на нейронах контрольних тварин і тварин з СТЗ-індукованим діабетом.

Амплітуда викликаних деполяризацією транзиєнтів в нейронах контрольних тварин знижувалась під впливом ніфедіпіну від 719 ± 132 нМ до 556 ± 24 нМ В той же час у тварин з СТЗ-діабетом пригнічуюча дія ніфедіпіну значно посилювалась - від 694 ± 155 нМ до 278 ± 28 нМ, Р<0,001.

Таким чином, в генерації кальцієвих сигналів в досліджених нейронах істотну роль грають саме ніфедіпін-чутливі кальцієві канали; при розвитку СТЗ-індукованого діабету пригнічуючий ефект ніфедіпіну істотно посилюється, що може вказувати або на підвищення експресії відповідних каналів, або на підвищення ефективності дії на них вказаного блокатора.

Отримані дані свідчать про те, що зміни кальцієвого гомеостазу на рівні вторинних сенсорних нейронів спинного мозку є дуже значними. Змінюються головним чином механізми, що відновлюють базовий рівень Са2+ після його різкого підвищення у зв`язку із збудженням клітини і генерації в ній кальцієвих сигналів. Відповідно характеристики передачі нервового збудження при природній для нервової системи ритмічній імпульсації будуть також істотно порушуватись.

Кальцієва сигналізація в нейронах таламусу, мозочку та великих півкуль головного мозку при СТЗ-індукованому діабеті. В зв`язку з наведеними в попередніх розділах результатами було важливим з`ясувати, чи виникають індуковані діабетом зміни у кальцієвій сигналізації також у нейронах вищих мозкових структур, особливо у нейронах таламусу та сенсорної області кори великих півкуль, і таким чином встановити, наскільки такі зміни репрезентують загальні риси діабетичної патології.

Результати вказують на деяку тенденцію до збільшення амплітуди кальцієвих сигналів у кортикальних нейронів діабетичних тварин; але вона не була статистично значимою.

Час напівспаду викликаних мембранною деполяризацією кальцієвих сигналів у контрольних тварин був ідентичним в нейронах обох структур; він істотно не змінювався при розвинутому СТЗ-індукованому діабеті. Навпаки, залишкове підвищення [Ca2+] i було більш значним у тварин з цукровим діабетом (Мал. 9, Табл.3). Ці зміни були, однак, значно менш визначеними, ніж у периферичних нейронах.

Було також проведене дослідження дії різних блокаторів Са2+ каналів на нейрони контрольних та діабетичних тварин (табл. 4). У кортикальних нейронах спостерігалась статистично достовірна зміна в ефективності пригнічуючої дії Ni2+ та німодіпіну: викликаний німодіпіном ефект був більш інтенсивним у порівнянні з дією Ni2+, ефективність якої знижувалась. Такі порушення у діабетичних тварин можуть бути пов`зані зі змінами в експресії каналів L-типу та відповідно в співвідношенні різних типів потенціал-керованих Са2+ каналів.

Кальцієві сигнали, викликані в коркових та таламічних нейронах активацією пурінових рецепторів. Для таламічних та кортикальних нейронів характерною рисою є істотний прояв пурінергічних нейромедіаторних механізмів, що здійснюють свою дію через активацію за допомогою АТФ як йонотропних, так і метаботропних рецепторів (Lalo et al., 1998). Ми прослідкували також можливу зміну цих механізмів при СТЗ-індукованому діабеті (табл. 5).

У тварин з цукровим діабетом серед нейронів кори кальцієві транизиєнти виникали при дії АТФ переважно лише при наявності Са2+ у позаклітиннолму розчині. В безкальцієвому позаклітинному розчині вони були зареєстровані лише у 3х з 7 ми нейронів, тобто ймовірним механізмом генерації таких транзиентів була активація йонотропних рецепторів, в той час як функція метаботропних рецепторів, ймовірно, пригнічувалась.

Наведені вище дані вказують на те, що зміни внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації під час експериментально викликаного цукрового діабету охоплюють всю нервову систему, хоча інтенсивність таких змін суттєво відрізняється у нервових клітинах периферичних та центральних нервових структур. При цьому зміни у кальцієвій сигналізації в кортикальних нейронах можуть мати певне функціональне значення при інтегративній активності кортикальних клітин. Одержані в даному розділі результати дозволяють припустити, що з потенціал-керованих кальцієвих каналів більш вразливими при цукровому діабеті є дігідропіридин-чутливі канали L-типу; не викличена також можливість порушення в цих нейронах метаботропної активації InsР3-чутливих кальцієвих депо.

Кальцієві сигнали в гранулярних нейронах мозочку. Для порівнення змін функціональної активності нейронів ноціцептивних та пропріоцептивних структур ми також дослідили кальцієві транзиєнти, викликані деполяризацією мембрани, в гранулярних нейронах мозочку. Ці нейрони є місцем переключення сигналів, що поступають переважно від пропріоцептивних аферентів через спино-церебелярні шляхи. При цьому нами не було виявлено в цих нейронах достовірних змін у піковій амплітуді та часу термінації таких транзиєнтів (що визначались через 60 сек після термінації деполяризації).

Прикладання кофеїну також не викликало суттєвих змін кальцієвих транзиєнтів у більшості гранулярних нейронів як контрольних, так і діабетичних тварин на відміну від ноціцептивної системи. Отже при СТЗ-індукованому діабеті відмічається певне ураженння лише периферичних пропріоцептивних структур.

Вплив інсулінотерапії на кальцієві сигнали в нейронах тварин з експериментальним діабетом. Для більш детального вивчення механізмів описаних вище змін кальцієвого гомеостазу в нервових клітинах важливо було визначити, яку роль в розвитку цих феноменів грає саме діабетична гіперглікемія і наскільки вони можуть бути зворотними при її компенсації. З цією метою ми досліджували вплив введення піддослідним тваринам інсуліну.

Дія інсуліну була перевірена на нейронах ДГСМ. Оскільки істотні зміни кальцієвих сигналів спостерігались головним чином в нейронах малого діаметру, то виміри проводились саме на нейронах цієї групи. Як вже відзначалось, пікова амплітуда кальцієвих сигналів, що викликались деполяризацією мембрани клітин прикладанням гіперкалієвого розчину (50 мМ), при індукції діабетичного стану не виявляла достовірних змін. В даній серії спроб їх середні пікові величин складали у контрольних тварин 468 ± 63 нМ і у діабетичних 451 ± 52 нМ. Рівень глюкози у діабетичних тварин сягав 16,4 ± 0,8 мМ (у контрольних тварин він був 5,83 ± 0,7 мМ). Після щоденних одноразових введень інсуліну (1 од/кг ваги) цей рівень знижувався до 8,04 ± 0,56 мМ. Тривалої компенсації у тварин досягти не вдалось. Після такої терапії пікова амплітуда кальцієвих сигналів дещо зростала (до 530 ± 65 нМ).

Найбільш істотними зміни при інсуліновій терапії спостерігались у кінетичних характеристиках кальцієвих сигналів малих (ноціцептивних) нейронів. Під впливом інсулінотерапії час спаду дещо зростав, хоча і не до таких значень, які характерні для нейронів контрольних тварин (в контролі 7,2 ± 1,6 сек, при діабеті 4,1 ± 0,7 сек, після інсулінотерапії 6,3 ± 1,5 сек). Відмічалась також тенденція до нормалізації залишкового рівню Са2+. Після 5-секундної деполяризації у даної групи тварин в контролі він становив 6,8 ± 0,9% пікового значення кальцієвого сигналу, при діабеті 17,1 ± 2,9%, а після інсулінотерапії 13,5 ± 2,2% пікового значення (0,05<Р<0,1).

Оскільки істотним фактором, що впливає на часові характеристики кальцієвих сигналів, є Са2+-акумулююча функція мітохондрій, ми проаналізували також її можливі зміни при введенні діабетичним тваринам інсуліну. В контрольних умовах використання СССР пригнічувало поглинання Са2+ з цитозолю мітотохондріями. В умовах діабету цей вплив СССР значно послаблювався, що може вказувати на наявність діабетичного пригнічення поглинаючої функції мітохондрій, а після інсулінової терапії майже повністю відновлювався. Так, час напівспаду Са2+ сигналу зростав під впливом СССР у нейронах «нелікованих» тварин з СТЗ-індукованим діабетом до 26,8 ± 2,0 сек, в той час як після введення інсуліну він становив 16,3 ± 2,0 сек (Р<0,001).

Характерне для діабету тривале залишкове підвищення рівню [Ca2+] i, як це було показано вище, при виключенні Са2+-акумулюючої функції мітохондрій дією протонофору істотно зменшується, що свідчить про роль уповільненого викиду Са2+ з мітохондрій у такому підвищенні. Попереднє введення тваринам з СТЗ-індукованим діабетом інсуліну дещо відновлює її. На фоні інсулінотерапії у малих нейронів до дії СССР залишкове підвищення становило 12,9 ± 3,1%, а після дії 9,8 ± 1,8% (P<0,01).

Таким чином, інсулінотерапія сприяє частковій нормалізації внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу у ноціцептивних нейронах, але не нормалізує повністю Са2+-акумулюючу функцію мітохондрій. Можливо, що під впливом інсулінотерапії не нормалізуються також зміни якихось інших факторів, що регулюють внутрішньоклітинний кальцієвий гомеостаз (наприклад, активність Са-АТФаз).

Вплив тривалого введення німодіпіну експериментальним тваринам. Хронічне введення тваринам блокаторів потенціал-залежних кальцієвих каналів також може бути фактором впливу на характеристики кальцієвих сигналів в збудливих клітинах; воно має також широке клінічне застосування (Skattebol et al., 1989; Triggle, 1994). Тому здавалось необхідним проаналізувати можливі впливи введення блокатора дігідропіридінового ряду німодіпіну на знайдені нами зміни обміну Са2+ йонів в нервових клітинах при експериментальному діабеті.

Щоденне пероральне введенні на протязі 3х тижнів німодіпіну (40 мг/кг ваги) здоровим тваринам показало, що в характеристиках кальцієвих транзиєнтів виникають певні зміни. При такому застосуванні німодіпіну значення пікової амплітуди кальцієвих транзиєнтів у контрольних тварин, що викликались 5-ти секундною деполяризацією мембрани, дещо зростало (до 528 ± 55 нМ порівнюючи з 468 ± 63 нМ до застосування). Час напівспаду кальцієвих сигналів, зареєстрованих в нейронах контрольних тварин, що отримували німодіпін, істотно не змінювався і становив 6,9 ± 1,7 сек. Разом з тим, залишкове підвищення рівню Са2+ в цитозолі через 60 сек після припинення деполяризації мало тенденцію до збільшення (13,03 ± 3,09% порівнюючи з 6,83 ± 0,85% в нейронах тварин, що не отримували німодіпін).

Результати викладених в даному розділі експериментів дозволяють припустити, що саме гиперглікемія при розвитку цукрового діабету є ведучими факторами у викликаних діабетичною патологією змінах нейрональної кальцієвої сигналізації. Про це свідчить про те, що відновлення нормоглікемії шляхом введення інсуліну супроводжується тенденцією до відновлення нормальних характеристик кальцієвих сигналів. Разом з тим, таке відновлення є все ж неповним; слід відзначити, що нейропатичні зміни у хворих на діабет так само є дуже стійкими і практично не можуть бути відновленими однією інсулінотерапією.