Дія на віруси імунодефіциту людини і грипу нових поверхнево-активних речовин та їх імуноад’ювантні властивості

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

03.00.06 - Вірусологія

Дія на віруси імунодефіциту людини і грипу нових поверхнево-активних речовин та їх імуноад'ювантні властивості

Криворутченко Юрій Леонідович

Київ 2000

Дисертацією є рукописом.

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського Міністерства охорони здоровя України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Кривошеїн Юрій Семенович

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, член-кор. НАНУ, професор Дяченко Наталія Сергіївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, відділ молекулярної біології вірусів, завідуюча відділом;

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Київська Медична Академія послядипломної освіти ім. П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра вірусології, професор кафедри;

доктор медичних наук, професор Виноград Іван Андрійович, Львівський НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України, лабораторія арбовірусних інфекцій, завідуючий лабораторією.

Провідна установа: НДІ епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського, відділ загальної вірусології, МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться “ 5 ” жовтня 2000 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 при Національному медичному університеті ім. О.О. Богомольця МОЗ України за адресою: 03057, м.Київ-57, пр. Перемоги, 34, медико-профілактичний корпус, аудиторія № 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України за адресою: 03057, м. Київ-57, вул. Зоологічна, 3.

Автореферат розісланий “ 14 ” липня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, д. мед. н., професор Яворовський О.П.

1. Загальна характеристика роботи

вірус імунодефіцит грип мірамістин

Актуальність теми. Поверхнево-активні речовини (ПАР) є великим класом природних і синтетичних речовин з дифільною структурою молекул (А.А. Абрамзон, 1979). Тривалий час ПАР використовуються в медицині (К.Ф. Блинова, Г.П. Яковлева,1990; Д. Шилд та ін., 1976). В останні роки значно виріс інтерес до адювантів, які належать до ПАР (I. Azuma,1992; F.R. Vogel,1995).

Кінець ХХ століття ознаменувався ускладненням епідемічної ситуації. Важлива роль у цьому належить синдрому набутого імунодефіциту людини та грипу (Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, 1992; І.А. De Вruijn еt al., 1997; Д.К. Львов та ін., 1998).

Після 1980 р. активізувались дослідження по розробці нових препаратів на основі ПАР ефективних і безпечних вакцин та нових індивідуальних засобів запобігання зараження (D.Gold, 1997; R.Pauwels, E.De Clercq, 1996). Тривалий час як ад'юванти для вакцин використовували сполуки алюмінію (алюм), які мають низку вад: індукція синтезу ІgЕ, алергійних реакцій тощо (J.С. Сох, A.R. Coulter, 1992; N.K. Veien et al., 1986). Створені експериментальні вакцини, які включають нові ад'юванти: мурамілпептиди (похідні МДП) та сапоніни (R. Bomford et al., 1992; M. Levi et al., 1993; F.R. Vogel, 1995). В анти-ВІЛ вакцинах був використаний мурамілпептид МТР-РЕ, який має характеристики ПАР (S. Abrignani et al., 1990; N.L. Haigwood et al., 1992). Проте, можливість використання мурамілпептидів у людей не визначена остаточно. Деякі з них посилюють експресію ВІЛ-1. Разом з тим, описані адювантно-активні похідні МДП, які не активують ВІЛ-1 (R. Schreck et al., 1992). Зясування структурно-функціональних залежностей для мурамілпептидів може усунути перешкоди на шляху впровадження у клінічну практику адювантів на їх основі.

Сапоніни належать до природних ПАР. Деякі із них мають адювантні властивості (G.L. Mulira et al., 1988; F.R. Rurangirwa et al., 1987). Окремі сапоніни пригнічують репродукцію вірусів (О.А. Плясунова та ін., 1992; M. Amoros et al., 1987). Адювантні та антивірусні властивості дотепер реєстрували у різних речовин. Проте, схожість хімічних структур адювантно-активних сапонінів та глікозидів з антивірусною дією дозволяє припустити, що серед сапонінів можуть бути знайдені речовини, які будуть поєднувати ці якості.

Детергенти використовують для отримання вакцин і діагностичних тест-систем (I.A. De Bruijn et al., 1997; J.S. Guy et at., 1992). Сьогодні інтенсивно розробляються нові мікробіциди зовнішнього застосування для профілактики венеричних захворювань і ВІЛ-інфекції (А.И.Милявский та ін., 1996; К.Mayer et al., 1998; A.T.Profy et al., 1998). Більшість таких препаратів належить до ПАР (R. Pauwels, E.De Clercq, 1996). Катіонний сурфактант мірамістин є антисептиком широкого спектру дії та рекомендований для профілактики і лікування венеричних захворювань (Ю.С.Кривошеин та ін., 1996; А.П. Рудько та ін., 1996). Оцінка дії мірамістину на ВІЛ-1 може вияснити можливості його використання для індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами.

Вибраний напрямок дослідження здійснювався відповідно до плану НДР кафедри мікробіології та ЦНДЛ Кримського державного медичного університету, реєстраційний номер 01.91.0009707. Окремі фрагменти роботи виконувались згідно із тематикою проекту “Використання поверхнево-активних речовин як засобів дезінфекції ВІЛ-вмісного матеріалу, а також препаратів для індивідульної профілактики ВІЛ-інфекції” (тема № 211), яка фінансувалась Міністерством охорони здоров,я України у рамках конкурсних наукових програм у 1991-1993 рр., а також міжнародного гранта “Immunoadjuvant and HIV-1 modulating properties of new synthetic muramylpeptides and purified saponins” (№ INTAS-UA 95-55), який отримав фінансування за результатами конкурсу 1995 р. Автор був відповідальним виконавцем теми № 211 та гранта INTAS-UA 95-55.

Мета і завдання дослідження. Мета-оцінити дію на віруси імунодефіциту людини і грипу, а також імуноад'ювантні властивості різних ПАР, які розроблені в Україні; проаналізувати структурно-функціональні характеристики та експериментально обґрунтувати їхнє застосування в профілактиці ВІЛ-інфекції та при створенні тест-систем для діагностики грипу.

Для досягнення вказаної мети були поставлені завдання:

1. Проаналізувати ефективність солюбілізації дезінтегроном-О поверхневих глікопротеїдів різних вірусів грипу.

2. Створити за допомогою дезінтегрону-О субвірусні продукти і на їх основі розробити універсальні тест-системи для діагностики грипу.

3. Проаналізувати інактивацію вірусу імунодефіциту людини 1 типу детергентами мірамістином і дезінтегроном-О.

4. Порівняти ефективність впливу мірамістину на вільний ВІЛ-1 та ВІЛ-інфіковані клітини.

5. Виявити вплив на віруліцидну активність мірамістину сорбції ВІЛ на тканину та наявності у вірусовмісному матеріалі сироватки крові.

6. Вивчити імуноад'ювантні властивості та вплив на репродукцію ВІЛ-1 сапонінiв із Hedera taurica Carr. (таурозидів). Проаналізувати їх структурно-функціональні характеристики.

7. Вивчити імуноад'ювантні властивості та вплив на репродукцію ВІЛ-1 гідрофобізованих аномерних похідних МДП. Проаналізувати їх структурно-функціональні характеристики.

Обєкт дослідження. Віруси грипу, ВІЛ-1, детергенти, сапоніни із Hedera taurica carr. (таурозиди), гідрофобізовані похідні МДП.

Предмет дослідження. Руйнування вірусів грипу детергентами, отримання за їх допомогою субвірусних продуктів і моноклональних антитіл. Інактивація детергентами ВІЛ-1. Вплив на репродукцію ВІЛ-1 таурозидів і похідних МДП, їх імуноад'ювантні властивості.

Методи дослідження. За допомогою фізико-хімічних і імунологічних методів проводили дослідження ізоляції компонентів вірусів грипу, моноклональних антитіл та розроблених на їх основі тест-систем. Імунологічні методи використовували для аналізу адювантних властивостей таурозидів і похідних МДП. Вірусологічні методи застосовували для вивчення впливу ПАР на репродукцію ВІЛ-1.

Наукова новизна отриманих результатів.

1. Встановлено, що дезінтегрон-О руйнує оболонку вірусів грипу з усуненням основної частини глікопротеїдів, а отримані за його допомогою субвірусні продукти зберігають нативні властивості і можуть використовуватись для створення противірусних моноклональних антитіл різної специфічності (захищені авторськими свідоцтвами на винаходи).

2. Вперше у дослідах in vitro охарактеризована властивість катіонного детергенту мірамістину інактивувати віруси імунодефіциту людини 1 типу. Продемонстровано, що мірамістин пригнічує інфекційність позаклітинного вірусу, а також знищує ВІЛ-інфіковані клітини в концентрації 100 мкг/мл і є одним із найбільш активних антисептиків з анти-ВІЛ властивостями.

3. Вперше досліджено вплив амфотерного детергенту дезінтегрону-О на ВІЛ-1 інфіковані лімфобластоїдні клітини. Встановлено, що дезінтегрон-О поступається мірамістину і не може бути рекомендований для профілактики ВІЛ-інфекції.

4. Вперше продемонстровано, що присутність у вірусовмісному матеріалі сироватки крові та сорбція ВІЛ-1 на тканину (батист) перешкоджають реалізації віруліцидної дії мірамістину. Встановлені концентраційні залежності ефектів.

5. Вперше виявлені дія на ВІЛ-1 та ад'ювантні властивості тритерпенових сапонінів із кримського плюща Hedera tаurica Carr. (таурозидів). Охарактеризована залежність вказаних характеристик від хімічної будови глікозидів. Встановлено, що таурозиди збільшують гуморальну імунну відповідь на глікопротеїди ВІЛ-1. Продемонстровано, що таурозид І дозозалежно пригнічує репродукцію вірусу (захищено патентом на винахід Російської Федерації; отримана пріоритетна довідка НДЦПE України за заявкою № 960625 19/4 (7035) від 25.06.96).

6. Вперше доказано, що дія на ВІЛ-1 та ад'ювантні характеристики мурамілпептидів залежать від конфігурації їхнього аномерного центру.

7. Вперше встановлено, що -бутил-МДП за імуноад,ювантними властивостями переважає фосфат алюмінію і не активує репродукцію ВІЛ-1 in vitro. Препарат може бути віднесений до кандидатів на роль безпечного ад,юванту для вакцин проти СНІДу.

Практичне значення роботи.

1. Виявлено, що дезінтегрон-О солюбілізує основну частину глікопротеїдів вірусів грипу і звільняє від них вірусні серцевинні частки. Субвірусні продукти, які утворювались при обробці дезінтегроном-О, зберігали нативність і були використанi для отримання гібридних культивованих клітин мишей-продуцентів моноклональних антитіл до гемаглютиніну і М-білка вірусу грипу А (авторські свідоцтва СРСР № 1479510, опубл. 15.05.89, Бюл. №18-8 с. і №1652340, опубл. 30.05.91, Бюл. № 20-6 с.).

2. Розроблені імунофлуоресцентна та імунопероксидазна тест-системи для виявлення вірусів грипу А. Вони грунтуються на застосуванні моноклональних антитіл до М-білка вірусу грипу,

отриманих у результаті імунізації мишей субвірусними частками, звільненими від глікопротеїдів за допомогою дезінтегрону-О.

3. Виявлено та проаналізовано зниження інфекційності вірусу імунодефіциту людини 1 типу внаслідок дії катіонного детергенту мірамістину. Отриманий результат свідчить про те, що мірамістин є одним із найбільш ефективних віруліцидних антисептиків і може бути рекомендований для індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції у формі 0,01% водного розчину, що випускається тепер (препарат “Септиком”).

4. Встановлено дозозалежне пригнічення віруліцидної активності мірамістину сироваткою крові, що обмежує сферу ефективного застосування профілактичних препаратів типу “Септиком” випадками, при яких концентрація білка у ВІЛ-вмісному матеріалі не перевищує 0,9мг/мл.

5. Розроблена експериментальна модель оцінки впливу біологічно-активних речовин на розвиток вірусів імунодефіциту людини in vitro, яка ґрунтується на використанні коефіцієнту репродукції.

6. Запропоновано спосіб стимулювання гуморальної та клітинної імунної відповіді, який ґрунтується на тому, що як адюванти можуть використовуватися тритерпенові глікозиди із рослин роду Hedera L. (Пат. 2127605 Росія, 6 А 61К 39/39,С 07 Н 15/256. Спосіб стимулювання гуморальної та клітинної імунної відповіді на цільовий антиген / Криворутченко Ю.Л., Гришковець В.І., Ан-дроновська І.Б., Кривошеїн Ю.С. (Україна).-Заява 22.05.96; Опубліков. 20.03.99; Бюл.; № 8.-14 с.).

7. Матеріали дисертації були впроваджені на кафедрі органічної хімії Таврійського національного (Сімферопольського державного) університету для розробки стратегії цілеспрямованого створення нових ад'ювантів із заданими властивостями на основі МДП і таурозидів (отримано акт впровадження).

8. Матеріали дисертації були впроваджені у лабораторії вірусів імунодефіциту НДІ вірусології РАМН, Москва, для проведення контрольованої інактивації ВІЛ при постановці експериментів in vitro (отримано акт впровадження).

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на конференціях: республіканська “Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы” (28-29 травня, 1990), Алушта, Україна; International Conference on Medical Biotechnoloqy, Immunization and AIDS (June, 1991), Lenindrad, Russia; Перша Національна науково-практична конференція з проблем ВІЛ/СНІД (січень, 1995, Київ, Україна); III Російський національний конгрес “Человек и лекарство” (квітень 1996) Москва, Росія; ХVIII International Carbohydrate Symposium (21-26 July, 1996), Milano, Іtaly; International Conference on Natural Products and physiologically Active Substances (Nov 30-Dec 6, 1998), Novosibirsk, Russia.

Публікації. По темі дисертації опублікована 31 робота, в тому числі 22 статті в наукових журналах та збірниках наукових праць, 6 публікацій у матеріалах і тезах конференцій, отримано 2 авторських свідоцтва і 1 патент на винахід.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу; 6 глав, які включають огляд літератури, опис методики, матеріалів і методів, результатів проведених власних досліджень, аналізу, узагальнень та їх обговорення, висновків і списку літератури. Дисертація викладена на 272 сторінках комп'ютерного тексту, вміщує 12 таблиць і 22 малюнка. Бібліографічний покажчик вміщує 421 джерело літератури.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи. Використовували віруси грипу А/WSN/33(H1N1), А/Чилі/1/83(H1N1), А/Японія/1/57(H2N2), А/Х-79(Н3N2), А/Ленінград/385/ 80(Н3N2), RСА/Міссісіпі/1/85(Н3N2), А/Філіппіни/2/82(Н3N2), А/СРСР(Н3N2), В/Ленінград/489 (НВО “Восток”, Омутнінськ; НДІ грипу МЗ РФ). Віруси імунодефіциту людини: ВІЛ-1 III В та ВІЛ-1 BRU були отримані із НДІВ і НДІВП. ВІЛ-1 LAI був наданий ШІКІЗ. Віруси грипу вирощували на курячих ембріонах. ВІЛ-1 культивували на перещеплюваних культурах клітин ліній МТ-4, Jurkat-tat і ТНР-1. Використовували комерційні живильні середовища, препарати і пластиковий посуд.

Вивчали анти-ВІЛ дію катіонного детергенту мірамістину і амфотерного ПАР дезінтегрону-О, синтезованих у НВО “ІСНА” (Київ). Ефективність солюбізації глікопротеїдів вірусів грипу дезінтегроном-О зіставляли з дією детергентів виробництва Calbiochem, USA: цвіттергента 3-14, нонідета Р-40, тритонів Х-100 і -114, твінів -20 і -80, октилглікозиду; а також малгофену (JAF, USA) і N-лаурилу-саркозилу натрію (Sigma, USA).

Дослідили сапоніни із кримського плюща Hedera taurica Carr: таурозид Н2, таурозид І і таурозид St-К. Були вивчені МДП та його 7 аномерних похідних: N-2-O-(бутил-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл]-L-аланіл-D-ізоглютамін (-бутил-МДП); N-[2-O-(гептил-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл]-L-аланіл-D-ізоглютамін (-гептил-МДП); N-[2-O-(холестерил-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл]-L-аланіл-D-ізоглютамін метиловий ефір (-холестерил-МДП); N-[2-O-(додецил-2-дезокси-2-додеканоїламіно--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл-L-аланіл-D-ізоглютамін (-додецил-МДП); N-[2-O-(R,S)-2,3-дидодецилоксипропіл-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл-D-лактоїл-L-аланіл-D-ізоглютамін (-G27-МДП); N-[2-O(бутил-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл-L-аланіл-D-ізоглютамін (-бутил-МДП); N-2-O-(бутил-2-ацетамідо-2,3-дидезокси--D-глюкопіранозид-3-іл)-D-лактоїл-L-аланіл-D-ізоглютамініл-(N--дезоксихоліл)-L-лізін метиловий ефір (МДП-холіл). Сапоніни та мурамілпептиди були отримані у Сімферопольському державному університеті (В.І.Гришковець, 1992).

Солюбілізовані дезінтегроном-О глікопротеїди вірусу грипу ізолювали за допомогою ультрацентрифугування. За допомогою реакції радіальної імунодифузії (ОРІД) проводили кількісне визначення гемаглютиніну вірусу грипу (Д.Шилд та ін., 1976.). Концентрацію білка визначали за Лоурі (O.H.Lowry et al., 1951), а активність нейрамінідази за методом Амінофф (D.Aminoff, 1961). Реакцію гальмування гемаглютинації (PГГА) проводили у мікроваріанті (В.М.Никитин, 1982).

Антигенність гемаглютиніну, виділеного за допомогою дезінтегрону-О, досліджували шляхом імунізації білих безпородних мишей. Гемаглютинін вірусу А/Чилі вводили внутрішньочеревно двічі, 30 мкг білка/введення, з інтервалом у 30 днів. Через 6 днів після реімунізації брали кров і за допомогою РГГА визначали титри антигемаглютинінових антитіл (Ю.С. Кривошеин та ін., 1990).

Для створення гібридних клітин-продуцентів моноклональних антитіл (МкА) до М-білка вірусу грипу був виділений концентрат субвірусних часток вірусу А/Ленінград. Субвірусні частки отримували обробленням віріонів 1% дезінтегроном-О з вилучанням глікопротеїдів за допомогою електрофорезу (И.А.Попов та ін., 1992). Субвірусними частками імунізували мишей лінії ВАLВ/с (И.А.Попов та ін., 1991). Злиття клітин селезінки імунізованих мишей з клітинами мієломи Х63-Аg8.653 проводили за допомогою 45% поліетиленгліколю ПЕГ-1500 (R.L.Davidson, P.S.Gerald, 1976). Гібридоми клонували та супернатанти тестували на наявність противірусних антитіл за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА) і РГГА (D.J.Mason et al., 1982). На основі МкА до М-білка були розроблені імунофлуоресцентна та імунопероксидазна тест-системи для виявлення вірусів грипу (А.А.Бакова та ін., 1994, 1995). Кон'югати МкА отримували відповідно з флюоресцеїну ізотіоціанатом (ФІТЦ) і пероксидазою хрону (Г.Фримель, 1987).

Вплив ПАР на ВІЛ-інфіковані клітини визначали за зниженням інфекційності заражених та інкубованих (10 хв., 37С) у присутності детергентів клітин. Після відмивання від ПАР їх співкультивували з інтактними клітинами протягом 10-30 днів. Про розвиток ВІЛ-інфекції в культурах судили по виявленню вірусних антигенів у культуральній рідині (КР) за допомогою ІФА, виявленню ВІЛ-позитивних клітин в імунофлуоресцентному тесті (ІФ) та життєздатності клітин (С.С.Маренникова та ін., 1989).

Вплив сироватки крові плода (ембріональної) корів (ЕСК) на анти-ВІЛ властивості мірамістину оцінювали шляхом інкубування інфікованих клітин з ПАР у присутності різних концентрацій сироватки з подальшим відмиванням клітин та їх співкультивуванням з інтактними клітинами протягом 7-21 діб.

Вивчення дії мірамістину на ВІЛ-1, сорбований на батистових тест-об,єктах (БТО), проводили відповідно до вимог методичних рекомендацій за визначенням віруліцидної активності препаратів, 1974. Супернатант із вмістом 10 і 104 ТСІD-50 інкубували з БТО. Потім БТО 10 хв. (200С) інкубували з мірамістином на безсироватковому середовищі. Далі заливали нейтралізатор (50% ЕСК) для інактивації ПАР. БТО ретельно струшували зі скляними кульками і супернатант вносили в інтактні культури клітин. За їхнім станом спостерігали 12-18 діб.

Для вивчення дії ПАР на позаклітинний ВІЛ-1 використовували КР із вмістом вірусу 104-105 ТСІD-50. КР інкубували з розведеннями мірамістину при 370С, 15 хв. ПАР інактивували 25% ЕСК. Вірусовмісний матеріал титрували і його розведення інкубували з інтактними клітинами (1,5 години, 370С). Далі клітини відмивали і співкультивували з інтактною культурою до 30 днів. Оцінювали життєздатність клітин і за допомогою ІФА визначали концентрацію ВІЛ р24 у КР (V.A.Sundqvist et al., 1989).

Імуномодулюючі властивості сапонінів і мурамілпептидів досліджували за допомогою чотиразової внутрішньом'язової імунізації мишей ВАLВ/с рекомбінантним ВІЛ-1 gр160 (1 мкг rgр160/ уведення, MicroGeneSys, CT) у суміші з 100 мкг/уведення досліджуваної речовини. На 14, 40 і 62 дні проводили бустерні реімунізації. У контролях тваринам вводили адсорбований на гелі фосфату алюмінію (алюм) rgр160. Через 10 днів після кожної реімунізації брали кров і визначали антитіла проти gр160 і gр120 за допомогою ІФА (R.Viscidi et al., 1990). Через 10 днів після останньої реімунізації вилучали селезінки і проводили тест на проліферацію клітин у присутності rgр160 (B.Vaslin et al., 1994). Реакцію враховували по включенню у Т-клітини 3Н-тимідину.

У роботі досліджували вплив сапонінів і мурaмілпептидів на репродукцію ВІЛ-1. До клітин Jurkat-tat одночасно додавали КР із вмістом 20 ТСІD-50 ВІЛ-1 LAI і розведення реагентів, які вивчались. На 3, 7, 11 і 14 дні культивування визначали концентрації життєздатних клітин і рівень ВІЛ-1 р24 у КР (IФА). Для реєстрації результатів використовували коефіцієнт репродукції (КР). Його розраховували як відношення концентрації р24 у КР (нг/мл) до числа життєздатних клітин (млн/мл). Середнє значення КР у контрольних культурах (ВІЛ вносили без реагентів, що вивчалися) брали за 100%. КР у дослідах виражали у відсотках за відношенням до контролів.

Додатково анти-ВІЛ активність речовин визначали за допомогою індексу селективності (IS). IS розраховували як відношення концентрації препарату, яка спричиняє 50% зниження життєздатності клітин, до концентрації, яка на 50% пригнічує репродукцію ВІЛ (О.А. Плясунова та ін., 1992). Отримані результати обробляли статистично з використанням критеріїв Стюдента на комп'ютері ІВМ-PC-AТ (686) (Г.Ф. Лакин, 1990).

Вплив дезінтегрону-О на віруси грипу і його використання для створення засобів діагностики грипу.

У роботі були зіставлені активності дезінтегрону-О і ПАР, що традиційно використовуються для руйнування вірусів. За допомогою ОРІД було показано, що дезінтегрон-О і малгофен ВС-720 інтенсивно солюбілізують гемаглютиніни різних вірусів (табл.1).

Таблиця 1 Детергентна солюбілізація гемаглютиніну різних вірусів грипу, яка досліджувалась за допомогою ОРІД

Детергент	Діаметр кілець преципитації (у мм, Мm), які утворюються при дезінтеграції вірусів детергентами у 1% концентрації
	В/Ленінград/489	А/Філіппіни/ 2/82 (Н3N2)	A(Чилі)1/83 (Н1N1)
Дезінтегрон-О	7,270,01	7,680,03	8,170,05
Малгофен ВС-720	7,250,02	7,620,04	8,010,03
Цвіттергент 3-14	1,260,01	7,890,03	8,080,01
N-лаурил-саркозил натрію	1,070,03	7,670,03	7,760,03

Цвіттергент 3-14 і N-лаурил-саркозил натрію активно вилучали гемаглютиніни із вірусів грипу типу А, проте були малоактивні у відношенні до вірусу В/Ленінград. Таким чином, дезінтегрон-О, який активно солюбілізує гемаглютиніни вірусів грипу типів А і В, можна віднести до універсальних ПАР.

На вірусі А/Чилі було продемонстровано, що солюбілізований дезінтегроном-О гемаглютинін зберігає антигенність. При імунізації мишей таким білком (вміст глікопротеїду 93%) індукція антитіл була вищою, ніж при імунізації віріонами: обернені титри у РГГА 122,735,8 і 40,08,0 відповідно (Р 0,05).

На вірусах RCA/Міссісіпі та А/СРСР було встановлено, що дезінтегрон-О вилучає із віріонів 73,8-89,2% гемаглютиніну і 43,7-81,5% нейрамінідази (табл.2). Він за активністю був близьким до цвіттергенту 3-14 і октилглікозиду, хоча останній слабо солюбілізував ферментативно-активну нейрамінідазу.

Таблиця 2 Відносна солюбілізація глікопротеїдів вірусів грипу різними детергентами

Детергент	Частки (у % за відношенням до вмісту в віріонах) Гемаглютиніну (ГА) і нейрамінідази (НА), Солюбілізованих 1%-ними сурфактантами із вірусів:
	RCA/Міссісіпі/ 1/85 (Н3N2)	А/СРСР/(H3N2)
	ГА	НА	ГА	НА
Дезінтегрон -О	73,824,06	43,730,16	89,161,90	81,470,35
Нонідет Р-40	51,046,15	21,520,87	57,003,62	56,521,55
Тритон Х-114	54,706,27	31,221,09	61,692,39	50,991,42
Тритон Х-100	55,453,87	34,170,80	59,943,40	56,101,05
Твін-20	10,041,78	4,510,96	23,841,41	3,500,24
Твін -80	0,800,05	1,500,08	4,461,32	3,610,49
Цвіттергент 3-14	77,6013,63	39,550,86	87,082,08	79,820,73
Октилглікозид	81,123,66	18,150,29	65,641,42	6,453,75

Підтвердження ефективного вилучання із віріонів глікопротеїдів за допомогою дезінтегрону-О було отримано при створенні моноклональних антитіл до гемаглютиніну і М-білка вірусу грипу А/Ленінград. У першому випадку за допомогою ПАР був виділений ізольований гемаглютинін, у другому концентрат субвірусних часток. У результаті імунізації мишей субвірусними частками, при злитті спленоцитів тварин із мієломними клітинами утворювались 397 гібридомних колоній. Вірусоспецифічні антитіла секретувались 41 клоном, і лише 2 клони секретували МкА, які реагували в РГГА. Звичайно при імунізації суцільним вірусом гібридоми спрямовані майже виключно проти гемаглютиніну (С.С.Ямникова та ін., 1983). Отриманий результат вказував на наявність гемаглютиніну у субвірусних частках у слідовій кількості.

Оскільки МкА до М-білка були поліспецифічні, їх використовували для розробки діагностичних імунофлуоресцентної (ІФ) і імунопероксидазної (ІП) тест-систем для виявлення вірусів грипу. З цією метою були відібрані МкА Д8. До того ж намагались встановити, будуть МкА, отримані на оброблений дезінтегроном-О антиген, реагувати з М1 білком вірусу грипу, який знаходиться в інфікованих клітинах. Кон'югати МкА-ФІТЦ використовували для виявлення специфічних антигенів у клітинах хоріоналантоїсної оболонки курячих ембріонів, інфікованих вірусами грипу А/WSN, А/Японія та А/Ленінград. В ІФ МкА Д8 детектували М1-білок усіх указаних вірусів. Кон'югати виявляли специфічну локалізацію М1-білка в навколоядерному просторі і на цитоплазматичній мембрані клітин. Одержані результати збігаються з даними інших авторів, які зазначали, що забарвлення за допомогою флуоресціюючих МкА до М1 білка пов'язано з ядрами клітин (D.Bucher et al., 1989; G.L. Smith et al., 1987). Селективне забарвлення субклітинних структур, які містять детермінанти М-білка, значно спрощує інтерпретацію результатів у порівнянні з традиційними варіантами ІФ, в яких використовують поліклональні антитіла. У цих випадках спостерігають неспецифічну флуоресценцію клітин плоского епітелію та лейкоцитів (Г.И. Карпухин, 1986). Переваги використання флуоресціюючих МКА стимулювали розробку ІП тесту, придатного для лабораторій, які не оснащені люмінесцентними мікроскопами (M. Waris et al., 1990). Як і при ІФ, за допомогою мічених пероксидазою хрону МкА Д8 виявлялось специфічне забарвлення цитоплазматичної мембрани і перинуклеарної ділянки інфікованих клітин.

Таким чином, у результаті застосування МкА, одержаних при імунізації тварин віріонним матриксним білком, обробленим дезінтегроном-О, за допомогою ІФ та ІП тестів удається виявляти антигенні детермінанти М1-білка різних вірусів грипу типу А. Характерна внутрішньоклітинна локалізація детектованого вірусного матеріалу значно полегшує інтерпретацію результатів дослідження. Вказані тест-системи на основі МкА до М-білка Д8 можуть бути рекомендовані до впровадження в практичну діяльність як універсальні способи діагностики грипу.

Вплив детергентів на віруси імунодефіциту людини.

У роботі було досліджено вплив мірамістину на ВІЛ-1 і ВІЛ-інфіковані клітини. Його властивості зіставляли з дією детергенту дезінтегрону-О. Мірамістин мав цитотоксичність у мінімальній концентрації 0,9 мкг/мл, а дезінтегрон -22,0 мкг/мл. Вивчення дії детергентів було розпочато з аналізу впливу мірамістину на ВІЛ-інфіковані клітини. Передбачалось, що після інкубації клітин із детергентом від надлишку ПАР можна буде позбавитись шляхом відмивання клітин центрифугуванням. Вдалось добитись тривалого спостереження за культурами після додавання до них інфікованих клітин, оброблених ПАР у концентраціях до 100 мкг/мл включно. Проте, при збільшенні концентрації детергенту клітинні культури передчасно гинули. Було встановлено, що у дозах 10-30 мкг/мл детергент мало впливає на внутрішньоклітинний вірус.

Застосування 50 мкг/мл ПАР спричиняло до двотижневої затримки розвитку вірусу в культурах, після чого розпочиналась його активна репродукція. У дозах 75 і 100 мкг/мл мірамістин повністю пригнічував інфекційність вірусу. Вплив різних концентрацій ПАР на ВІЛ-інфіковані клітини принципово відображає картина, яка складалась на 18 день спостереження. Вона залишалась без суттєвих змін до 34 діб.

На клітинах Jurkat-tat було встановлено, що дезінтегрон-О інактивує внутрішньоклітинний ВІЛ-1 у мінімальній концентрації 12,5 мг/мл, яка значно вище відповідної дози мірамістину і ноноксинолу-9 (N-9). N-9 є лідером серед сурфактантів, які застосовуються для індивідуальної профілактики венеричних захворювань, та пригнічує інфекційність ВІЛ-1 у концентрації 0,5мг/мл (E.L.Gollub, Z.Stein, 1992; R.Pauwels, E.De Clercq, 1996; B.Polsky et al., 1988). Мабуть, дезінтегрон-О не варто розглядати як потенційний засіб індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції.

Продовження досліджень мірамістину вимагало застосування нейтралізатора, що пригнічує активність ПАР. До того ж, було необхідно оцінити вплив на дію мірамістину властивих організму факторів, інгібуючих інші хлорвмісні антисептики. До таких препаратів належить хлоргексидин. Як і мірамістин, він має сильну бактерицидну дію (Ю.С.Кривошеин, 1985; М.Д.Машковский, 1994) та інактивує ВІЛ (M.A. Harbison, S.M. Hammer, 1989). Проте хлоргексидин втрачає анти-ВІЛ активність у присутності 10% ЕСК (M.Suzuki et al., 1990). Враховуючи це було вирішено як нейтралізатор мірамістину використовувати ЕСК.

Умовні позначення: кількість клітин, що загинули у досліді (чорні кружки - заражені клітини обробляли ПАР) і контролях (білі кружки -інфіковані клітини не вносили); трикутники - ВІЛ-позитивні клітини, які виявлялись ІФ; квадрати - концентрація антигенів ВІЛ у КР (ІФА).

На клітинах Jurkat-tat була охарактеризована залежність пригнічення анти-ВІЛ активності мірамістину від вмісту ЕСК у середовищі. Заражені клітини обробляли 100 мкг/мл ПАР у присутності ЕСК. У присутності 5% ЕСК ПАР повністю блокував розвиток ВІЛ-інфекції. У присутності 12,5% ЕСК цитопатогенну дію вірусу було ослаблено, але в ІФ виявлялись ВІЛ+ клітини. При роботі із ЕСК у концентрації 25% віруліцидна дія детергенту не проявлялась. Таким чином, мірамістин у концентрації 100 мкг/мл, яка використовується у сумішах для індивідуальної профілактики венеричних захворювань типу “Септиком” (А.И. Милявский та ін., 1996), інактивує внутрішньоклітинний вірус у присутності 5% ЕСК.

Умовні позначення: 1-кількість мертвих клітин у досліді (чорні кружки); 2-кількість мертвих клітин у контролі (із ПАР інкубували інтактні клітини-білі кружки); 3-загальна кількість клітин у досліді (чорні трикутники); 4-загальна кількість клітин у контролі (білі трикутники).

Такі розчини можуть бути рекомендовані для індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції. При збільшенні вмісту білка у заразному матеріалі ефективність ПАР знижується. Є доцільним при застосуванні мірамістину дотримуватись правил:

1) Особам без запальних захворювань органів сечостатевої сфери рекомендується промивати статеві органи мінімум 20 мл розчином мірамістину. Такий об'єм у 10-40 разів перевищує кількість рідини, яка знаходиться у просвіті піхви здорової жінки і достатній для повного заміщення піхвового секрету (В.И. Покровский, 1994).

2) Особам із запальними захворюваннями без нагноєння рекомендується розпочинати за декілька днів до статевого акту систематичні промивання статевих органів розчинами ПАР і використовувати їх перед і після статевого акту тільки, якщо така попередня обробка призводить до зникнення запальних проявлень.

3) Особам з ознаками нагноєння рекомендується здійснювати промивання до зникнення гною чи крові. Статевий контакт варто проводити тільки після припинення запального процесу з додатковим захистом, презервативом. Використання презервативів у сполученні з мірамістином доцільно, тому що кондоми ефективно захищають від бактерій, але лише частково знижують ризик зараження ВІЛ (B.Voeller et al., 1994).

ECK використовували як нейтралізатор при аналізі впливу антисептика на ВІЛ, сорбований на тканину (БТО). Аналіз розвитку інфекції у клітинах ТНР-1 і МТ-4 після їх зараження вірусом, десорбованим з батисту (БТО обробляли ПАР), показав, що ВІЛ-1 інтенсивно розвивався у культурах при застосуванні 10 мкг/мл ПАР, і повільнішепри роботі з 30 і 100 мкг/мл детергенту. Сорбція на тканину захищає ВІЛ-1 від впливу мірамістину. Застосування для обеззараження інфікованих тканин розчинів типу “Септиком” із вмістом ПАР 100 мкг/мл недостатньо ефективно.

Таблиця 3 Продукція ВІЛ-1 р24 у клітинах Jurkat-tat після зараження вірусовмісним матеріалом (ВВМ), обробленим мірамістином (М)

Варіант експерименту	Розведення ВВМ*	Накопичення ВІЛ р24 Спостереження 3 день 7 день	(нг/мл) у КР за днями (Mm): 11 день 14 день
ВВМ обробляли 50 мкг/мл М	1 2 3 4	немає немає немає немає	136,518,0 8,95,2 немає немає	135,311,0 98,062,0 немає немає	148,57,0 140,08,5 немає немає
ВВМ не інкубували з М (контроль)	1 2 3 4 5 6	30,61,6 3,02,1 1,81,0 немає немає немає	137,54,5 82,05,0 26,91,1 немає немає немає	156,50,5 158,54,5 130,511,5 23,98,9 немає немає	143,510,5 165,01,0 160,03,0 82,535,5 1,30,8 немає

Застосування ЕСК дозволило вивчати інактивацію позаклітинного ВІЛ мірамістином у концентраціях до 400 мкг/мл. Використання 100 мкг/мл ПАР призводило до повної інактивації позаклітинного ВІЛ-1. Застосування 50 мкг/мл знижувало інфекційність вірусу в 1000 раз, проте не усувало її повністю (табл.3). Таким чином, мірамістин належить до найбільш ефективних противірусних антисептиків і може бути рекомендований для проведення індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції. Присутність у вірусовмісному матеріалі сироватки крові та сорбція ВІЛ на тканину знижує їхню ефективність.

Імуноад'ювантні властивості та дія на ВІЛ-1 таурозидів.

У роботі вивчали властивості виділених із кримського плюща Hedera taurica Carr. сапонінів, які належать до таурозидів.

Таурозиди відрізнялися тільки за характером хімічних груп у 3 і 4 вуглецевих атомів аглікону (В.И. Гришковець та ін., 1992).

Аналіз здатності таурозидів стимулювати продукцію антитіл в імунізованих rgp 160 мишей виявив, що найменш активний є таурозид Н2. Таурозиди І і St-K стимулювали продукцію анти-gр 160 антитіл на рівні фосфату алюмінію (алюм). Стосовно синтезу антитіл проти gр 120, - таурозид I індукував імунну відповідь cлабше, ніж алюм, а таурозид St-K-не поступався алюм. Здатність посилювати продукцію антитіл до антигенів ВІЛ зростала у ряді: таурозид Н2-таурозид I-таурозид St-K.

Таблиця 4 Рівні антитіл проти глікопротеїдів ВІЛ-1 після третьої реімунізації rgp 160 у суміші з таурозидами, виражені як середні значення log10 титрів (Mm) для кожної групи мишей

Сапонін	Титри анти-gp160	Титри анти-gp120
(1)Таурозид Н2 (2)Таурозид I (3) Таурозид St-K Фосфат алюмінію	4,680,16 5,130,20 4,880,05 5,070,13	4,300,16 4,470,11 4,810,08 4,800,13

Отримані результати не повністю збігаються із твердженням, що ад'ювантність сапонінів визначається наявністю розгалужених ланцюгів цукрів у позиціях 3 і 28 (R.Bomford et al., 1992). Таурозиди в позиції 28 мають однаковий лінійний олігосахаридний ланцюг, а в позиції 3 тільки таурозид Н2 має дисахаридний залишок. Ад,ювантно-активні таурозиди I і St-K мають у позиції 3 відповідно залишки сірчаної і глюкуронової кислот. Раніше було встановлено, що ад,ювантно-активним сапонінам із Quillaja saрonaria Molina притаманні дві спільні риси: наявність 2,3 глюкуронової кислоти (C.R.Kensil et al., 1991), і тритерпенової конструкції аглікону, що містить альдегідну групу біля 4 атома вуглецю (С4) (S.Soltysik et al., 1995). Цій альдегідній групі приписують ключове значення для ад,ювантності (R.Higuchi et al., 1987). Вивчені в рамках цієї роботи таурозиди не мали альдегідної групи в С4. З цього випливає, що ад,ювантна активність тритерпенових глікозидів, принаймні здатність стимулювати продукцію антитіл, не лімітується наявністю в цій позиції альдегіду. Наявність у 4 вуглецевого атома аглікону метильної (таурозид І) чи оксиметильної (таурозид St-K) груп не призводить до втрати ад,ювантності. Очевидно, ослаблення цієї якості у таурозиду Н2 пов,язане з відсутністю в 3 вуглецевого атома аглікону залишків кислот. У цьому наші відомості збігаються з уявленнями про те, що ад'ювантність тритерпенових глікозидів забезпечується наявністю в положенні 3 аніонної функціональної групи кислот (R.Bomford et al., 1992; S.Soltysik et al., 1995).

Таурозиди продемонстрували низькі рівні специфічної стимуляції Т-клітин селезінки мишей. Індекси стимуляції були в межах 0,94-2,09. При використанні алюм вони перевищували 7,0.

У сапонінів з різних рослинах був виявлений противірусний ефект (M.Amoros et al.,1987; G.S.Rao et al.,1974). Гліциризин із Glycyrrhiza glabra інгібує ВІЛ-1 (В.И.Покровский та ін., 1998). У нашій роботі було досліджено вплив таурозидів на розвиток ВІЛ при зараженні клітин Jurkat-tat вірусом ВІЛ-1 LAІ.

Про дію таурозидів судили за їхнім впливом на відносну продукцію ВІЛ р24 (кількість вірусного антигену, яка припадає на одну життєздатну клітину), відображену у формі коефіцієнту репродукції (КР). Такий критерій обрали тому, що про репродукцію ВІЛ-1 свідчить як накопичення вірусного білка, так і цитопатична дія вірусу, яка проявляється в зменшенні концентрації життєздатних клітин. Динаміка змін зазначених показників при вживанні таурозиду І в різних концентраціях. Аналогічний підхід раніше було використано для вивчення впливу МДП на репродукцію ВІЛ-1 в промоноцитах лінії U937 (K.N.Masihi et al.,1990). Порівняльна характеристика ефектів таурозидів продемонстрована в таблиці 5.

Таурозиди Н2 і -St-K стимулювали відносне вивільнення клітинами ВІЛ р24, хоча перший у концентрації 500 мкг/мл на 7 день після зараження культур демонстрував пригнічення продукції вірусу на 30-40%. Навпаки, таурозид I у всьому діапазоні концентрацій інгібував реплікацію ВІЛ-1. Зростання значень КР на 11-14 дні носило компенсаторний характер і було зумовлене збільшенням концентрації клітин-додаткових продуцентів вірусу, захищених сапоніном від цитопатогенної дії ВІЛ-1 на ранніх етапах експерименту.

Однією з основних характеристик анти-ВІЛ дії препаратів є індекс селективності (IS). Нами було встановлено, що для таурозиду І IS=3,0. Для -гліциризинової кислоти він має близьке значення (IS=4,45), що додатково свідчить про подібність тритерпенових сапонінів із кримського плюща і солодки голої (О.А.Плясунова та ін., 1992).

Умовні позначення: стовпці відображають значення параметрів по строках спостереження: чорніна 3-й, сірі7-й, смугасті11-й, білі14-й дні. По осі ординат указані: (а) концентрація ВІЛ р24 (нг/мл) і (б) концентрація життєздатних клітин (млн/мл).

Зіставлення хімічних структур продемонструвало, що ВІЛ-активуючі таурозиди містять у положенні 4 оксиметильну группу, а ВІЛ-інгібуючий таурозид I метильний радикал. Гліциризин також має метильний залишок у С4 (R.Bomford et al., 1992). Характер відмінностей хімічних груп у положенні 3 менш очевидний.

Спостерігається деяка схожість молекул ВІЛ-стимулюючих таурозидів і гліциризину, а структури функціональних груп обидвох ВІЛ-інгібуючих сапонінів не збігаються: гліциризин містить лінійний дисахарид, а таурозид Iсульфогрупу. Однак, як у гліциризину, так і в таурозиду I в положенні С3 локалізуються аніонні залишки кислот.

Вважаємо, що на основі наведених даних можна сформулювати гіпотезу: анти-ВІЛ активність таурозидів пов,язана з наявністю в 3 вуглецевого атома аглікону функціональних груп, що включають залишки кислот, а в 4 вуглецевого атома аглікону, метильної групи. Включення до складу вуглецевих залишків у положенні 4 атомів кисню призводить до набуття глікозидами здатності стимулювати репродукцію вірусу імунодефіциту людини.

Таурозид I може бути зарахований до сапонінів, які наділені як ВІЛ-інгібуючими, так і імуноад,ювантними властивостями.

Імуноад'ювантні властивості та дія на ВІЛ-1 мурамілпептидів.

Вивчені в роботі мурамілпептиди належали до аномерних похідних МДП і мали фіксовану конфігурацію аномерного центру (АЦ). -бутил-МДП і МДП-холіл мали -конфігурацію АЦ. Серед глікозидів з -конфігурацією АЦ -холестерил-МДП, -додецил-МДП і -G27-МДП мали різко ліпофільні замінники при С1.

Усі досліджені мурамілпептиди, за винятком МДП-холілу, індукували більш інтенсивне вироблення анти-rgp160 антитіл, ніж МДП. Частково це пов'язанозі збільшеною у порівнянні з МДП ліпофільністю сполук. Відомо, що комбінація глікопептиду з ліпофільним компонентом забезпечує високу біологічну активність речовини. Прикладом цього є ромуртид ліпофільний мурамілпептид, дозволений до застосування як засіб лікування лейкопенії (М.Tamura et al., 1995). Підвищена ад'ювантність деяких мурамілпептидів визначалася фіксованим положенням замінників при С1 вуглецевому атомі. Це чітко виявилось в різних імуноад'ювантних властивостях - і -бутилу-МДП

Найбільш високі титри антитіл проти глікопротеїнів ВІЛ реєструвалися при використанні -холестерилу-МДП і -бутилу-МДП. Проте -холестерил-МДП, як МДП, -бутил-МДП, -гептил-МДП і -додецил-МДП, індукував переважно В-клітинну відповідь і не викликав суттєвого підвищення проліферації Т-клітин. Індекс антигензалежної стимуляції клітин селезінки тварин, імунізованих rgp 160 разом з указаними похідними МДП, дорівнював 1,03-2,13. У цей же час, препарати -G27-МДП, МДП-холіл і -бутил-МДП, активно індукували Т-клітинну відповідь (ІС=5,74; 8,46 і 13,78 відповідно). -бутил-МДП перевищував фосфат алюмінію (ІС=7,4), який традиційно використовується у вакцинах (F.R.Vogel, 1995).

Таким чином, тільки -бутил-МДП стимулював сильні В- і Т-клітинні імунні відповіді проти глікопротеїдів ВІЛ-1.

Характерно, що -ізомерна форма речовини (-бутил-МДП) значно поступалася -бутилу-МДП у стимуляції антитільної та Т-клітинної імунних відповідей. Ці результати збігаються з даними про те, що -похідні МДП як імуностимулятори поступаються -похідним МДП (Н.П. Елинов, 1984). Серед вивчених у роботі мурамілпептидів був ще один препарат з -конфігурацією АЦ, МДП-холіл. МДП-холіл, як і -бутил-МДП, слабо стимулював антитільну відповідь до rgp 160/120. Разом з тим, сильна стимуляція Т-клітинної проліферації МДП-холілом свідчить про те, що гідрофобізація -похідних МДП може призводити до створення високоактивних ад'ювантів, які вибірково стимулюють клітинні імунні реакції. В останні роки інтерес до імуностимуляторів з такими властивостями значно зріс, оскільки було встановлено, що протективною у відношенні ВІЛ-інфекції є клітинна імунна відповідь (M. Clerici, G.M. Shearer, 1994).

Специфіка хімічної структури визначає як ад'ювантні властивості, так і дію мурамілпептидів на ВІЛ-1. У наших експериментах (табл.7) було отримано підтвердження того, що МДП і більша частина його похідних здатні посилювати репродукцію ВІЛ-1 (К.N. Masihi et al., 1990; R.Schreck et al., 1992). У дозі 40 мкг/мл МДП на 7 день помірно пригнічував (КР=79,15,6%), а в концентраціях 2 і 10 мкг/мл стимулював відносну продукцію ВІЛ-1 р24 (КР= 149,96,5% і 131,06,5%; Р0,05). 6 із 7 вивчених аномерних похідних МДП у різній мірі стимулювали репродукцію ВІЛ-1. -бутил-МДП виявився єдиним препаратом, який не активізує продукцію ВІЛ р24. Як імуноститулятор -бутил МДП переважає над фосфатом алюмінію і може бути віднесений до кандидатів на роль безпечного ад,юванту для вакцин проти СНІДу. Вагомість одержаних результатів визначається тим, що переважну більшість публікацій присвячено мурамілпептидам з нефіксованою конфігурацією аномерного центру. Серед публікацій, які торкаються аналізу біологічних властивостий аномерних мурамілпептидів, ми не знайшли матеріалів, присвячених ВІЛ (Н.П.Елинов, 1984; А.Е. Земляков, 1998). У результаті вивчення імуноад,ювантних властивостей і дії на ВІЛ аномерних похідних МДП, була отримана можливість сформулювати деякі принципові положення:

1) Заміна напівацетального гідроксилу мурамової кислоти МДП на бутоксигрупу і -конфігурація аномерного центру мало впливають на імуноад'ювантні, але посилюють ВІЛ-активізуючі властивості речовини (-бутил-МДП). 2) Заміна напівацетального гідроксилу на бутоксигрупу і -конфігурація аномерного центру посилює здатність речовини індукувати імунну відповідь, а також позабавляють сполуку здатності активізувати репродукцію ВІЛ-1 (-бутил-МДП). 3) Заміна напівацетального гідроксилу на різко гідрофобні радикали у -положенні (-холестерил-МДП, -G27-МДП) посилює ВІЛ-активізуючу дію речовин. Їх ад'ювантні властивості залежно від типу радикалу варіюють.

Одержані нами відомості створюють теоретичну основу для нового підходу в конструюванні імуностимуляторів, які не активують репродукцію ВІЛ-1.

Таким чином, у результаті вивчення віруліцидних властивостей детергентів мірамістину і дезінтегрону-О, солюбілізації білків вірусів грипу дезінтегроном-О, дії на ВІЛ-1 і імуноад,ювантних характеристик таурозидів і аномерних похідних МДП, визначені анти-ВІЛ характеристики вказаних детергентів і фактори, які впливають на їх реалізацію; встановлена можливість застосування мірамістину для індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції; одержані імунореагенти і на їх основі розроблені імунофлуоресцентна та імунопероксидазна тест-системи для виявлення вірусів грипу; виявлені структурно-функціональні залежності, які визначають дію на ВІЛ та імуноад'ювантні ефекти таурозидів і аномерних похідних МДП. Ідентифіковані нові імуноад,юванти, які пригнічують репродукцію ВІЛ-1.

Виражаю глибоку вдячність моєму вчителеві професорові Ю.С. Кривошеїну, а також І.Б. Андроновській, які надали мені неоціненну допомогу в організації і проведенні досліджень. Виражаю глибоку вдячність співробітникам Національного медичного університету ім О.О.Богомольця за допомогу в оформленні роботи.

Висновки

1. Поверхнево-активні речовини, які належать до різних типів синтетичних (детергенти і гідрофобізовані аномерні мурамілпептиди) та природних (тритерпенові сапоніни) хімічних сполук, залежно від типу і особливостей індивідуальної хімічної структури у різній мірі наділені віруліцидними, солюбілізуючими та імуноад'ювантними властивостями, а також здатністю впливати на репродукцію вірусу імунодефіциту людини 1 типу.

2. Амфотерний детергент дезінтегрон-О солюбілізує більшу частину гемаглютиніну і нейрамінідази вірусів грипу типів А і В та забезпечує ефективне звільнення від них нерозчинних субвірусних часток. Одержані за допомогою цієї ПАР субвірусні продукти зберігають свої біологічні властивості і придатні для одержання моноклональних антитіл. Розроблені на основі таких антитіл до М1-білка імунофлуоресцентна та імунопероксидазна тест-системи дозволяють виявляти віруси грипу різних підтипів і можуть використовуватись для діагностики грипу.

3. Катіонний сурфактант мірамістин у безбілковому середовищі повністю пригнічує інфекційність внутрішньоклітинного і позаклітинного ВІЛ-1 в концентрації 0,1 мг/мл. Він належить до найбільш ефективних віруліцидних препаратів із ряду рекомендованих до застосування у людей, і може використовуватись для індивідуальної профілактики статевого зараження ВІЛ-1.

4. Дезінтегрон-О значно поступається перед мірамістином, руйнуючи ВІЛ-інфіковані клітини у мінімальній концентрації 12,5 мг/мл, і не може бути рекомендований для індивідуальної профілактики ВІЛ/СНІДу.

5. Наявність у вірусовмісному матеріалі сироватки крові та сорбція ВІЛ-1 на тканину (батист) знижує віруліцидну активність мірамістину. Антисептичні засоби, які включають 0,01% водяний розчин мірамістину, можуть бути рекомендовані для індивідуальної профілактики ВІЛ-інфекції, але не можуть розглядатися як засоби обеззараження інфікованої ВІЛ-1 тканини.

6. Тритерпенові сапоніни із кримського плюща Hedera taurica Carr. (таурозиди) мають імуноад'ювантні властивості. Таурозид І стимулює продукцію антитіл проти gp 120 слабше, а проти gp 160 на рівні фосфату алюмінію. Таурозид St-К стимулює вироблення антитіл проти глікопротеїдів ВІЛ-1 на рівні фосфату алюмінію. Ад'ювантна активність таурозидів пов,язана з наявністю у 3 вуглецевого атома аглікону аніонних функціональних груп кислот і не лімітується наявністю альдегідної групи у 4 вуглецевого атома.

7. Таурозид I дозозалежно пригнічує репродукцію ВІЛ-1, а таурозиди Н2 і St-К стимулюють експресію вірусного р24. Анти-ВІЛ активність таурозидів пов'язана з наявністю у 3 вуглецевого атома аглікону функціональних груп, які включають залишки кислот, а у 4 вуглецевого атома аглікону метильної групи. Наявність у положенні 4 оксиметильної групи надає таурозидам здатність стимулювати репродукцію вірусу.

8. Ад'ювантні властивості гідрофобізованих похідних МДП та їхня здатність впливати на репродукцію ВІЛ-1 залежать від конфігурації аномерного центру мурамілпептидів. Вказані біологічні ефекти більш виражені у сполуках з -конфігурацією аномерного центру.

9. -бутил МДП стимулює антитільну і клітинну імунні відповіді проти глікопротеїдів ВІЛ, значно переважаючи -бутил МДП і не поступаючись перед фосфатом алюмінію. На відміну від свого аналога з -конфігурацією аномерного центру -бутил МДП не посилює репродукцію ВІЛ-1 і може бути рекомендований для включення в вакцини проти ВІЛ-інфекції як безпечний ад,ювант.

10. Гідрофобізація -похідних МДП здатна вибірково посилювати їхні ад'ювантні властивості. Приєднання до -бутилу-МДП до С-кінця D-ізоглутаміну додаткового гідрофобного радикала надає одержаному таким чином МДП-холілу виражену здатність індукувати Т-клітинну імунну відповідь.

11. Гідрофобізація мурамілпептидів шляхом заміни напівацетального гідроксилу на різко гідрофобні залишки у -положенні (холестерилоксигрупу, ди(додецилокси) пропілоксигрупу) надає похідним МДП виражену здатність активувати репродукцію ВІЛ-1 і селективні ад'ювантні властивості. Одержані таким чином ПАР вибірково індукують або антитільну (-холестерил-МДП), або клітинну (-G27-МДП) імунні відповіді.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації.

1. Бакова А.А., Брондз Б.Д., Федоркина О.А., Гусев В.А., Гордиенко А.И., Кривошеин Ю.С., Криворутченко Ю.Л., Прокопенко Т.Г., Попов И.А. Использование моноклональных антител для выявления вируса гриппа // Вопр. вирусол.-1994.-№ 4.-С.187-189.

2. Бакова А.А., Гусев В.А., Попов И.А., Гордиенко А.И., Криворутченко Ю.Л., Кривошеин Ю.С. Использование иммунопероксидазного теста с моноклональными антителами для выявления вирусов гриппа А // Мiкробiол. журн.-1995.-Т.57, №4.-С.54-59.

3. Криворутченко Ю.Л. Сучасна профілактика статевого шляху розповсюдження вірусу імунодефіциту людини // Інфекційні хвороби.-1999.-№1.-С.47-50.

4. Криворутченко Ю.Л. Иммуноадъювантные и противовирусные свойства сапонинов // Вопр. вирусол.-1998.-№ 1.-С.7-10.

5. Криворутченко Ю.Л. Инактивация мирамистином вируса иммунодефицита человека // Журнал дерматологии и венерологии (Харьков).-1998.-№1(5).-С.22-24.

6. Криворутченко Ю.Л. Дозозависимая инактивация мирамистином внеклеточного вируса иммунодефицита человека // Вопр. вирусол.-1998.-№ 3.-С.122-124.

...