Математичне моделювання процесів виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.Н. КАРАЗІНА

УДК: 577.51-7.616-006

Математичне моделювання процесів виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора фізико-математичних наук

Соляник Галина Іванівна

Харків 2000

Дисертацією є рукопис:

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, Волков Сергій Наумович, Інститут теоретичної фізики ім.М.М.Боголюбова НАН України, провідний науковий співробітник, (м.Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор, Товстяк Володимир Васильович, Харківський національний університет ім.В.Н.Каразіна Міністерства освіти України, старший науковий співробітник, (м.Харків);

доктор біологічних наук, професор, Кнігавко Володимир Гілярійович., Харківський державний медичний університет МОЗ України) завідуючий кафедрою, (м.Харків).

Провідна установа - Інститут фізики НАН України, м.Київ

Захист відбудеться “13_” _квітня 2000р. о 15_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 в Харківському національному університеті ім. В.Н.Каразіна за адресою 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4 ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім.В.Н.Каразіна за адресою 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий “13”березня_2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

гетерогенність пухлинний проліферативний

Актуальність теми. Без сумніву, проблема рака є однією з самих гострих та актуальних проблем людства. Незважаючи на значні зусилля, прогрес в цій галузі виглядає незначним, що обумовлено складністю самої проблеми. Канцер виявляє в драматичній формі та за короткий час ті ж закономірності, що і саме життя у цілому: варіабельність, обумовлену як гетерогенністю клітинного складу неоплазми, так і динамічною природою самої пухлини, і селективність, що забезпечує максимальну здатність до виживання пухлинних клітин. Злоякісні пухлини не без підстави розглядаються як клітинні суспільства, в яких окремі індивідууми чи групи індивідуумів еволюціонують та взаємодіють один з одним. Тому для розуміння процесів виникнення пухлин та механізмів їх прогресії більш плідним може виявитись підхід, який розглядає пухлину як інтегруючу тканину, в якій властивості цілісності не є проста сума властивостей окремих її частин (сінергізм пухлини). При такому підході суттєвим є розуміння механізмів, що лежать в основі такого сінергізму. Вивчення таких механізмів потребує не докладного обговорення окремих прикладів (кожен з котрих природно має свої особливості та специфічні механізми інтеграції), а дослідження загальних чи, скоріше, узагальнюючих закономірностей. Саме пошук останніх і є основною метою дисертаційної роботи.

Незважаючи на те, що не існує двох однакових пухлин, та перебіг онкологічного захворювання не можна передбачити з якоюсь певною ймовірністю, точка зору, що єдина концепція зможе задовільно пояснити виникнення та прогресію злоякісних пухлин є найбільш принадною та перспективною в сучасній онкології. Така концепція повинна визначити різноманіття характеристик, що обумовлюють злоякісний фенотип ракових клітин. Розробка такої концепції пов'язана з труднощами, обумовленими складною динамічною природою пухлин та їх варіабельною взаємодією з організмом. Проте великий обсяг інформації про особливості ракових клітин, отриманий методами молекулярної та клітинної біології, біології розвитку, біофізики, а також велика кількість змінних, що характеризують процеси виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин, неможливо усвідомити та узагальнити без розробки нових теоретичних підходів їх аналізу, серед яких математичне моделювання є найбільш перспективним. Мета математичного моделювання в онкології - узагальнення результатів наукових досліджень, перевірка ключових ідей та концепцій, а також формування напрямків подальших експериментальних досліджень для пізнання основних властивостей канцеру: гетерогенності клітинного складу, росту та прогресії. Незважаючи на існування характерних відмінностей, узагальнюючою рисою цих властивостей є їх динамічна природа. Проте, аналіз наукової літератури показав, що більшість математичних моделей кінетики росту пухлин та популяцій пухлинних клітин чи спрямовані на макроскопічний опис самої картини росту, не враховуючи біологічні процеси, що обумовлюють цю картину (“емпіричні” моделі), чи розглядають “статичну проекцію” динамічної картини (структурні математичні моделі). При очевидній перспективності динамічного підходу в дослідженнях механізмів виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин, саме динамічних математичних моделей, що базуються на реальних біологічних процесах (функціональні динамічні моделі), дуже мало. Розробка таких моделей є актуальною та важливою для дослідження динамічного зв'язку між “елементами” організації живих систем та “елементарними” процесами в них. Без цього неможливо зрозуміти, чим патологічна еволюція пухлинних тканин (канцер) відрізняється від нормальної.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота за темою дисертації проводилась у рамках планово-бюджетних НДР Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, зокрема:- тема N 2.2.5.138 “ Розробка сорбційної терапії з використанням специфічних сорбентів на основі полімерних матеріалів в цілях зниження токсичних ефектів протипухлинних препаратів” (VA01004451P); тема N 2.2.5.171 “ Підвищення протипухлинної резистентності організму в умовах хіміотерапії злоякісних новоутворень з врахуванням механізму дії цитостатиків"(VA01003349P); тема N 2.2.5.158 “Моделювання та дослідження процесу виникнення резистентності пухлин з метою пошуку позапухлинних маркерів їх резистентності”(VA01003366P); тема N 2.2.5.210 “ Вивчити механізм передачі нормальним та пухлинним клітинам фенотипічних властивостей лікарської резистентності“ (0198V001090). Держ. замовлення (N 0198V005250) “ Розроблення та впровадження способів лікування злоякісних пухлин шляхом застосування моноклональних антитіл, кон'югованих з перспективними протипухлинними препаратами з використанням вітчизняного інкубаційного устаткування”. Проект N142-90 “Програми розвитку в Українській РСР фундаментальних і прикладних досліджень в галузі математичних наук”: “Розробка математичних фармакокінетичних моделей для оптимізації та індивідуалізації протипухлинної терапії”. Проект Державного фонду фундаментальних досліджень: N 5.4/416 “Вивчити механізм дії низькоінтенсивного випромінювання міліметрового діапазону на фізико-хімічні та біологічні властивості клітинних мембран”.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи були розробка математичних моделей та використання методів математичного моделювання для пошуку та аналізу узагальнюючих закономірностей в механізмах виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин. Для досягнення цієї мети були поставлені та вирішувались такі задачі:

1. Розробити математичну модель кінетики росту популяції пухлинних клітин з урахуванням проліферативної гетерогенності їх клітинного складу; проаналізувати особливості кінетики росту клітинних популяції при дії несприятливих факторів середовища інкубації.

2. Розробити математичну модель кінетики росту багатоклітинних пухлинних сфероїдів (БПС) та вивчити вплив просторової (3-D) конфігурації агрегатів пухлинних клітин на кінетику їх росту та проліферативну гетерогенність їх клітинного складу.

3. Розробити математичну модель кінетики росту гетерогенної пухлини, що складається з двох різних клітинних субпопуляцій, та дослідити вплив клітинних взаємодій на динаміку зміни їх клітинного складу; дослідити вплив клітинного складу на початку росту пухлини на динаміку зміни клітинної композиції пухлини в процесі її росту; проаналізувати роль гетерогенності клітинної композиції в проблемі зворотності (незворотності) прогресії злоякісних пухлин.

4. Побудувати математичну просторово-розподілену модель кінетики росту гетерогенної пухлини та проаналізувати роль клітинної рухливості та неоднорідності розподілу поживних субстратів в явищі домінування популяцій клітин, що повільно діляться.

5. В дослідах in vivo вивчити особливості кінетики росту та динаміку зміни клітинного складу пухлини в процесі розвитку в ній резистентності до дії протипухлинних пошкоджуючих агентів; за допомогою методів математичного моделювання проаналізувати роль селективних та індукційних механізмів в прогресії злоякісних пухлин.

6. Розробити математичні моделі кінетики розподілу протипухлинних препаратів в організмі людини, що враховують особливості введення цих препаратів; дослідити зв'язок між фармакокінетикою протипухлинних препаратів та ефективністю їх протипухлинної дії.

7. Побудувати математичну модель ведучого механізму ділення клітин та проаналізувати особливості цього процесу в нормальних та пухлинних клітинах; вивчити роль мембранних механізмів в явищі функціональної глухоти пухлинних клітин.

8. Розробити математичну модель кінетики росту гомогенної популяції нормальних клітин, що диференціюються; проаналізувати роль чутливості нормальних клітин до дії факторів диференціювання в процесі росту клітинної популяції; дослідити вплив стохастичної природи вибору клітиною одного з альтернативних сценаріїв її розвитку на еволюцію ансамблю нормальних клітин.

9. Дослідити вплив гетерогенності популяції нормальних клітин, що диференціюються, на динаміку її розвитку та визначити, які параметри клітинної популяції обумовлюють виникнення злоякісних пухлин. Проаналізувати роль селекції в механізмі патологічної еволюції нормальних клітин.

Наукова новизна одержаних результатів: Запропоновані нові адекватні математичні моделі кінетики росту популяцій нормальних та пухлинних клітин, що враховують гетерогенність клітинного складу популяції та динамічну природу взаємодії клітин популяції з мікрооточенням. Ці моделі є необхідним та важливим інструментом аналізу результатів експериментальних досліджень.

Вперше визначено характер впливу власно клітинних та ансамблевих характеристик на кінетику росту популяції пухлинних клітин. Показано, що кожна популяція пухлинних клітин характеризується множиною кінетичних кривих росту. Ця множина однозначно визначається власно клітинними характеристиками росту популяції. Яка саме кінетична крива росту реалізується із усього різноманіття не залежить від клітинних параметрів, а повністю визначається ансамблевими (популяційними) характеристиками: загальною кількістю клітин та співвідношенням клітин, що діляться, та клітин, що не діляться, на початку росту популяції.

Аналіз впливу рівня глюкози в позапухлинному середовищі на проліферативну гетерогенність тривимірних агрегатів пухлинних клітин показав, що збільшення цього рівня призводить до збільшення кількості клітин, які не діляться (і є малочутливими до дії пошкоджуючих агентів). Це є першим теоретичним обгрунтуванням недоцільності введення глюкози перед проведенням протипухлинної хіміо- та променевої терапії.

Вперше показано, що клітинний склад гетерогенної пухлини є тригерною системою, в якій реалізується дискретний набір стійких клітинних композицій. Тригерний характер клітинного складу обумовлений існуванням композиційних нестійкостей пухлин, для яких визначені необхідні умови їх виникнення. Композиційні нестійкості клітинних популяцій (разом з відомими генетичними та фенотипічними нестійкостями окремих пухлинних клітин) замикають каскад нестійкостей, що визначають напрямок та незворотний характер прогресії злоякісних пухлин.

Продемонстровано, що дифузія пухлинних клітин, які повільно діляться, достатня для забезпечення домінування цих клітин в гетерогенній пухлині. Встановлено, що процес домінування є пороговим відносно коефіцієнту дифузії, але не залежить від кількості рухливих клітин на початку росту гетерогенної пухлини. Такий механізм домінування є першим найбільш повним обгрунтуванням відомого в онкології явища домінування метастатично активних клітин.

Аналіз відмінних особливостей мітотичної активності нормальних та пухлинних клітин, проведений за допомогою математичної моделі, сприяв подальшому розумінню важливої ролі структурних перебудов клітинної мембрани в регуляції процесів ділення клітин та дозволив проаналізувати вплив різних фізичних та фізико-хімічних факторів на ці процеси.

Вперше передбачено та проаналізовано явище автоселекції, яке обумовлює появу та домінування в популяції клітин з пухлинним фенотипом. Патологічна еволюція клону виникає, коли ступінь гетерогенності клітинної популяції перевищує порогове значення. На відміну від існуючої в онкології точки зору, що гетерогенність є наслідком канцерогенезу, вперше показано, що гетерогенність популяції нормальних клітин може бути причиною як виникнення злоякісних пухлин, так і гетерогенності їх клітинного складу. Гетерогенність клітинних популяцій у цьому випадку є узагальнюючою закономірністю механізмів виникнення та прогресії злоякісних пухлин. Це дозволяє запропонувати міжклональну та внутрішньоклональну варіабельність характеристик мітотичної активності нормальних клітин як маркер ризику виникнення канцеру, а відповідну варіабельність пухлинних клітин - як маркер прогресії злоякісних пухлин.

Вперше розроблені та апробовані в клініці математичні моделі фармакокінетики протипухлинних препаратів при різних схемах введення цих препаратів. Ці моделі є необхідним інструментом для індивідуалізації та оптимізації протипухлинної хіміотерапії.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені нові математичні моделі кінетики росту популяцій нормальних та пухлинних клітин, що враховують гетерогенність клітинного складу популяції та динамічну природу взаємодії клітин популяції з мікрооточенням, є необхідним та важливим інструментом аналізу даних експериментальних досліджень.

Розроблені автором та клінічно апробовані фармакокінетичні моделі дозволяють вирішувати питання індивідуального дозування протипухлинних препаратів. Ці розробки увійшли до комп'ютерної інформаційно-довідникової системи по медикаментозному лікуванню онкологічних хворих та в монографію “Медикаментозне лікування онкологічних хворих”. За розпорядженням МОЗ України (наказ № 61-Адм від 21.08.98) на робочій нараді 17.09.98 комп'ютерна система була передана для користування всім спеціалізованим онкологічним закладам України.

Закономірності, виявлені в процесі роботи, дозволили сформулювати концепцію існування позапухлинних маркерів резистентності пухлин до дії протипухлинних препаратів та запропонувати сироватку крові як тест-систему для пошуку та дослідження цих маркерів. Зараз проводяться експериментальні дослідження та клінічна апробація цієї концепції.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота являє собою реалізацію особистих творчих ідей автора. Автором самостійно сформульовані основні робочі гіпотези досліджень та проведено узагальнюючий аналіз отриманих автором результатів роботи. Автор дисертації особисто розробив та дослідив (аналітично та чисельно) математичні моделі, провів перевірку адекватності розроблених моделей, використав розроблені моделі та методи математичного моделювання для планування експериментальних досліджень та аналізу отриманих результатів. Автору належить основна роль в розробці програми клінічних досліджень, структура яких в значній мірі визначається особливостями побудованих автором фармакокінетичних моделей та їх спроможністю аналізувати отримані в клінічних дослідженнях результати.

В опублікованих зі співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:

[3-5,8,14,17-20,23] - у формулюванні мети та задач дослідження, в розробці і дослідженні (як аналітичному, так і чисельному) математичних моделей та перевірці їх адекватності.

[2,10,11] - у формулюванні мети роботи, в розробці, дослідженню та перевірці адекватності математичних моделей, у плануванні експериментальних та клінічних досліджень та аналізу отриманих результатів за допомогою розроблених моделей.

[6,7,9,12,13,15,16,26] - у формулюванні мети роботи, у плануванні експериментальних і клінічних досліджень та аналізі отриманих результатів за допомогою методу математичного моделювання.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на: I Міжнародній конференції по сінергетиці, Пущино, 1978 г.; I Всесоюзному біофізичному З'їзді, Москва, 1982 г.; Всесоюзній конференції “Роль вспомогательных веществ в фармакологии”, Харків, 1982; VIII З”їзді онкологів УРСР, Донецьк, 1990; VI З'їзді фармакологів України, Харків, 1990; Міжнародному симпозіумі “Математическая теория биологических процессов”, Калінінград, 1993; Конференції онкологів України “Шляхи впровадження найбільш ефективних методів обліку та лікування”, Донецьк, 1993; IX З'їзді онкологів України, Вінниця 1995; Workshop on “Cell and Tissue Motion - Models, Analysis and Simulations, Bonn-Rottgen, Germany, 1995; IV Всеросійському З'їзді онкологів “Проблемы современной онкологии”, Москва, 1995; Українському Конгресі радіологів, Київ, 1995; I З'їзді онкологів СНД, Москва, 1996; 3rd European Conference on mathematics applied to biology and medicine, Heidelberg, Germany, 1996; Семінарі Київського відділення українського біофізичного товариства, 1997; International Conference on deterministic and stochastic modeling of biointeraction, Sofia, Bulgaria, 1997; 5th International Conference “Mathematical population dynamics”, Zakopane, Poland, 1998, II з'їзді українського біофізичного товариства, Харків, 1998; Міжнародній конференції “Physics of biological systems”, Київ, 1998; International Conference on “Theory and Mathematics in Biology and Medicine”, Amsterdam, Netherlands, 1999; II з'їзді біофізиків Росії, Москва , 1999.

Публікації. Результати роботи опубліковані в 40 наукових працях, у тому числі в 26 статтях, з них 5 без співавторів, та 14 тезах доповідей національних і міжнародних конференцій, симпозіумів, з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, шести розділів та висновків. Повний обсяг дисертації становить 301 сторінку, 70 ілюстрацій, з них 2 ілюстрації займають повну сторінку, 19 таблиць, з них 8 таблиць займають 4 повних сторінки. Список використаних бібліографічних джерел (367 найменувань) займає 29 сторінок.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі визначені основні проблеми сучасної онкології, що до цього часу залишаються невирішеними. Обгрунтована актуальність обраної теми, сформульована мета дослідження та задачі, які необхідно вирішити для її досягнення, наведено загальну характеристику дисертаційної роботи.

У розділі 1 на основі наявних літературних даних проведено детальний аналіз сучасного стану проблеми і сформульовані основні ідеї та гіпотези дослідження. Відзначено, що сучасні уявлення про процеси виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин базуються на трьох основних концепціях онкології. В межах цих концепцій вважається, що пухлина виникає з однієї нормальної клітини (стволова клітина) в результаті генетичної мутації в ній (моноклональна концепція виникнення пухлин). Зміни в генетичному апараті, які викликані цією мутацією, обумовлюють генетичну та фенотипічну нестійкість клітини, що мутувала. Ці нестійкості призводять до підвищення гетерогенності клітинної популяції, що виникає внаслідок ділення стволової клітини (концепція гетерогенності). Впливаючи на таку гетерогенну клітинну популяцію, селективні фактори (регуляційні системи організму, різні пошкоджуючи агенти), забезпечують здатність до виживання тих клітин, які не чутливі до дії цих факторів (клонально-селективна концепція). Не дивлячись на удавану повноту уявлень про основні процеси виникнення та прогресії злоякісних пухлин, аналіз результатів багаточисленних експериментальних та клінічних досліджень показує, що поза концептуальною тріадою залишилась найважливіша властивість неоплазми - динамічна природа пухлини, як багатоклітинного утворення. Генетична концепція гетерогенності клітинних популяцій базується на динамічній нестійкості внутрішньоклітинних процесів і не може пояснити, яким чином властивості окремих клітин формують властивості цілісної пухлини. Неспроможною з цієї точки зору є також і клонально-селективна концепція. Поряд з цим експериментальними дослідженнями було показано, що властивість цілісної пухлини не є проста сума властивостей окремих її клітин. Цей сінергізм пухлини обумовлений існуванням міжклітинних взаємодій. Урахування динамічної природи таких взаємодій дозволяє сформулювати ряд відкритих проблем, у вирішенні яких важливе місце займає метод математичного моделювання, в першу чергу, з використанням динамічних математичних систем.

Оскільки з усього різноманіття характерних властивостей пухлинних клітин неконтрольований ріст є універсальним маркером канцеру (який властивий всім без винятку пухлинним клітинам), аналіз кінетичних характеристик росту пухлин чи популяцій пухлинних клітин є невід'ємною частиною досліджень механізмів виникнення, росту та прогресії злоякісних пухлин. В дисертаційній роботі роль гетерогенності клітинних популяцій та вплив міжклітинних взаємодій в пухлинному процесі досліджуються з позицій кінетичних особливостей росту популяцій пухлинних клітин. При цьому використовуються динамічні математичні моделі, які враховують реальні біологічні процеси, які лежать в основі механізмів, що досліджуються.

У розділі 2 представлені результати дослідження впливу проліферативної гетерогенності на кінетику росту популяцій пухлинних клітин.

Численними експериментальними дослідженнями було показано, що ріст однієї й тієї ж пухлини чи популяції пухлинних клітин характеризується множиною кінетичних кривих росту. Метою дослідження було показати, що різноманіття кривих росту клітинної популяції обумовлено її проліферативною гетерогенністю, тобто існуванням в ній клітин, які діляться та клітин, що знаходяться в стані спокою.

Для реалізації цієї мети була побудована феноменологічна динамічна модель кінетики росту гетерогенної клітинної популяції:

(1)

(2)

(3)

де х - кількість клітин, які діляться та; у - кількість клітин, що знаходяться в стані спокою в момент часу t; b - швидкість ділення клітин; d - швидкість їх загибелі. Функції Р та Q визначають інтенсивність переходу клітин із стану спокою в стан активного ділення і навпаки.

Математична модель була побудована при наступних біологічних припущеннях:

* Популяція пухлинних клітин складається з клітин, які діляться ( проліферують), та клітин, які знаходяться в стані спокою.

* При певних умовах клітини втрачають здатність до ділення. В цьому випадку клітина переходить з стану ділення в стан спокою.

* В свою чергу клітини, що знаходяться в стані спокою, можуть вступити в проліферацію, або загинути.

Проведений аналіз математичної моделі щодо кількості стаціонарних станів та характеру їх стійкості дозволив зробити такі висновки.

абсолютні кількості клітин, які діляться, та клітин, що знаходяться в стані спокою в стаціонарній фазі росту популяції, визначаються усіма параметрами системи; параметри b,c,d,a,, ми назвали власне клітинними характеристиками росту;

одна й та ж клітинна популяція має дуже широкий спектр кривих росту; вся численність можливих для даної клітинної популяції кривих росту однозначно визначається власне клітинними характеристиками росту; яка саме крива росту реалізується з усієї різноманітності кінетичних кривих, не залежить від власне клітинних характеристик росту і однозначно визначається загальною кількістю клітин та композиційним клітинним складом популяції на початку її росту (цим початковим характеристикам ми дали назву популяційних або ансамблевих характеристик росту).

Для перевірки адекватності математичної моделі та ілюстрації основних результатів аналізу ми використали опубліковані дані експериментальних досліджень кінетики росту трьох різних клітинних ліній пухлини молочної залози мишей після культивування їх в середовищі з обмеженим рівнем поживного субстрату. Структура експериментальних досліджень була наступна. Для кожної клітинної лінії з основної (базової) культури на різних етапах її росту відбирали клітини, які далі культивували (дочірні популяції) при тих самих умовах, що й базову культуру, і кінетику росту яких вивчали.

На рис.1 представлено прогноз математичної моделі кінетики росту дочірніх популяцій клітинної лінії 68Н. Відмітимо, що параметри моделі оцінювались методом нелінійної регресії з використанням експериментальної кривої росту базової культури. Звертає на себе увагу добре співпадіння теоретичного прогнозу з експериментальними даними, що вказує на здатність побудованої математичної моделі адекватно описувати кінетику росту гетерогенної клітинної популяції.

Проведене дослідження показало, що кожна клітинна лінія має велику кількість кривих росту. При цьому криві росту дочірніх популяцій, субкультивованих з експоненціальної фази росту, практично ідентичні між собою. Криві росту дочірніх популяцій, субкультивованих з стаціонарної фази росту (плато), характеризувались затримкою росту популяції. Тривалість цієї затримки для кожної клітинної лінії залежить від того, в який день клітини були пересіяні, та однозначно визначається популяційними характеристиками росту: чим менша доля клітин, які діляться на початку росту, тим довша затримка росту популяції спостерігається .

В розглянутому випадку клітинні культури росли у вигляді однорідного шару, в якому поживний субстрат був доступний всім клітинам однаковою мірою. Така умова не реалізується, коли клітинна культура росте, як тривимірний агрегат клітин. Можливо очікувати, що численність картин росту клітинних популяцій в цьому випадку може виникати внаслідок впливу мікрооточення на клітинні та ансамблеві характеристики клітинної популяції. Щоб дослідити вплив 3-D конфігурації на особливості кінетики росту популяції пухлинних клітин, була побудована математична модель кінетики росту багатоклітинних пухлинних сфероїдів. В рамках моделі припускалось, що:

багатоклітинний пухлинний росте, як сферично симетрична колонія клітин;

динаміка зміни кількості клітин, які діляться, та клітин, що знаходяться в стані спокою, описується системою диференційних рівнянь (1), в якій функції Q, P залежать від внутрішньоклітинної концентрації кисню та глюкози; швидкість загибелі клітин d (яка була константою в розглянутому вище випадку) є функцією концентрації глюкози;

так як характерний час дифузії кисню та глюкози всередині сфероїда малий в порівнянні з характерним часом росту сфероїда (ця оцінка правильна принаймні для сфероїдів з діаметром меншим за 1500 мікрон), припускалося, що в кожний момент часу в середині сфероїда досягається стаціонарний розподіл основних субстратів.

В рамках цих припущень кінетика росту популяції, що складається з клітин, які діляться (х - їх кількість в одиниці об'єму сфероїда), та клітин, що знаходяться в стані спокою (y), може бути представлена наступною системою диференційних рівнянь:

 (4)

; (5)

; (6)

з стаціонарними дифузійними рівняннями для концентрації кисню (Сo ) та глюкози (Cg):

(7)

(8)

при r = 0; ; при r =rmax=R; Cg = Gext та Co = Oext .

Di ефективний (макроскопічний) коефіцієнт дифузії кисню (і=о) та глюкози (і=g), які в рамках зроблених припущень не залежать від рівня цих субстратів в сфероїді. Pi характеризують швидкість поглинання кисню та глюкози (відповідно) пухлинними клітинами, що знаходяться в одиничному об'ємі сфероїда При інтегруванні математичної моделі припускалося щільне упакування клітин в сфероїді та їх нестисливість (гранична щільність) при існуванні кінцевого об'єму клітини.

Побудована модель була використана для аналізу проліферативної гетерогенності клітинного складу EМТ6/Rо сфероїдів при їх рості в середовищі з різним вмістом глюкози: 16.5mМ, 5.5mМ, 1.7mМ та 0.8mМ.

Оцінка параметрів моделі була проведена за допомогою нелінійної регресії з використанням експериментальних даних кінетики росту сфероїда в середовищі з нормальним рівнем глюкози (5.5 mМ). Це дозволило прогнозувати кінетику росту сфероїдів при інших концентраціях глюкози, а також побудувати градієнти розподілу клітин та субстратів. Модель дозволяє передбачати також характер залежності радіуса некротичної області як функції діаметра сфероїда при його рості в середовищі з різними рівнями глюкози. На рис.2 представлена залежність товщини шару живих клітин (різниця між радіусом сфероїда та радіусом некротичної області) від діаметра сфероїда. Видно, що прогноз моделі співпадає з даними експериментальних вимірів.

Важливим результатом проведеного дослідження є прогнозоване моделлю збільшення кількості клітин, що знаходяться у стані спокою, при інкубації сфероїдів в середовищі з високим рівнем глюкози. На сьогоднішній день з'явились експериментальні дослідження, які підтверджують результати моделювання.

Таким чином, в рамках розглянутих у розділі 2 математичних моделей, стаціонарний об'єм клітинної популяції однозначно визначається власне клітинними характеристиками росту. Регулювання росту клітинних популяцій (разом з стабілізацією росту) здійснюється не за рахунок дії будь-яких специфічних регуляторних факторів, а обумовлено, в першу чергу, внутрішньою потенцією клітин припиняти ділення, коли внутрішньоклітинні рівні критичних субстратів знижуються нижче критичних значень. Такий механізм, що базується на проліферативній гетерогенності клітинної популяції, дозволяє їй найкращим чином адаптуватися до змін зовнішньоклітинного мікрооточення і не вимагає при цьому спеціальної генетичної інформації.

У розділі 3 наведені результати дослідження та математичного моделювання процесів пухлинної прогресії. Під прогресією пухлини розуміють серію "перманентних і незворотних якісних змін однієї чи декількох характеристик неоплазми". Виділяють три основні напрямки прогресії злоякісних пухлин: виникнення резистентності, інвазія та метастазування пухлинних клітин. В рамках концепції гетерогенності співіснує принаймні дві точки зору відносно механізмів, що обумовлюють прогресію злоякісних пухлин. В рамках однієї, прогресія пухлин, як багатоклітинних утворень, є результатом відповідних змін клітинного складу пухлини під впливом таких факторів, як виснаження середовища по відношенню до основних специфічних та неспецифічних субстратів чи продуктів харчування, хіміо- чи променева терапія, функція імунної системи, тощо (селективний механізм). Дія цих факторів призводить до домінування тих клітинних субпопуляцій, які мають переваги в рості. В рамках другої точки зору робиться припущення, що зовнішні по відношенню до пухлини в цілому та до кожної пухлинної клітини окремо “фактори селекції” змінюють фенотипічні властивості окремих клітин в напрямку більшого прояву ознак злоякісної трансформації (індукційний механізм).

Щоб перевірити відносну роль селективного та індукційного механізмів у прогресії злоякісних пухлин, були проведені експериментальні дослідження особливостей змін кінетичних характеристик росту пухлини, що виникають при формуванні в ній резистентності (нечутливості) до дії різноманітних протипухлинних агентів. Дослідження було проведено на щурах з трансплантованою пухлиною карциноми Герена. В декілька етапів проводилась виробка резистентності пухлини до дії іонізуючого опромінення і протипухлинних препаратів, які широко використовуються в сучасній протипухлинній терапії: доксорубіцин, цисплатин, тіофосфамід.

На кожному етапі і для кожної тварини проводилось вимірювання об'єму пухлини. Аналіз кінетики пухлинного росту на всіх етапах дослідження проводили для кожної тварини контрольної групи за допомогою логістичних математичних моделей Гомперца, Верхалста та Вейбулла. Параметри моделей для кожної тварини визначали по експериментально виміряним кінетичним кривим росту методом нелінійної регресії. Як характеристика чутливості пухлини до дії протипухлинних агентів використовувався коефіцієнт гальмування росту пухлини, який визначався стандартним шляхом.

Порівняльний аналіз математичних моделей, які використовувалися, показав, що на всіх етапах досліджень модель Вейбулла в рамках інформаційного критерію краще описує кінетику росту карциноми Герена, ніж моделі Гомпертца і Верхалста. При цьому отримані результати вказують на існування в карциномі Герена принаймні двох клітинних субпопуляцій, які відрізняються як кінетичними характеристиками росту, так і чутливістю до дії різних протипухлинних агентів. З'ясувалося, що в процесі виникнення резистентності до дії доксорубіцину, цисплатину та іонізуючого опромінення змінюється співвідношення між двома клітинними субпопуляціями в напрямку зменшення чутливої до цих препаратів субпопуляції і збільшення резистентної. Ці зміни носять монотонний характер, що узгоджується з селективним механізмом виникнення резистентності, як форми пухлинної прогресії. Аналіз змін кінетичних параметрів двох клітинних субпопуляцій в процесі формування резистентності вказує на домінування селективного механізму над індукційним.

Аналіз літературних джерел та результатів власних досліджень дав змогу сформулювати невирішені проблеми клонально-селективної концепції. Що буде з пухлиною після закінчення дії на неї протипухлинних агентів? Як буде при цьому змінюватись її клітинний склад? Щоб відповісти на сформульовані вище питання, була побудована математична модель кінетики росту гетерогенної пухлини, яка враховує міжклітинні взаємодії. При побудові цієї моделі ми виходили з наступних припущень:

пухлина складається з двох клітинних субпопуляцій, які можуть відрізнятися як кінетичними характеристиками клітинного росту, так і чутливістю до дії різноманітних фізичних та хімічних агентів;

кінетика росту кожної з клітинних субпопуляцій описується системою рівнянь (1) з функцією Qi, представленою в (3), і функцією Pi, яка залежить від загальної кількості клітин, що діляться в пухлині, наступним чином:

(9)

де x1, x2 - кількість клітин, що діляться, а y1, y2 - кількість клітин, що знаходяться у стані спокою, І та ІІ субпопуляцій, відповідно, ci - інтенсивність поглинання факторів, що впливають на клітинний поділ, i - рівень субоптимальних умов харчування, нижче якого клітини перестають ділитися.

Аналіз математичної моделі показав, що побудована чотиривимірна модель кінетики росту гетерогенної клітинної популяції є тригерною системою з трьома (двома стійкими і центральним нестійким) станами чи з п'ятьма стаціонарними станами (три з яких є стійкими). Необхідною (але недостатньою) умовою тригерності є наявність клітинних взаємодій між субпопуляціями, а також проліферативна гетерогенність кожної клітинної субпопуляції.

В рамках побудованої математичної моделі гетерогенна пухлина має дискретний набір стійких клітинних композицій, які розділені між собою нестійкими. Прогресія пухлин розглядається як перехід з одного стійкого стаціонарного стану в інший. Механізм такого перемикання може бути силовим (аналог селективного механізму в онкології), чи параметричним (аналог індукційного механізму). Таким чином, прогресія пухлини (та її незворотній характер) пов'язані з наявністю незворотних процесів в ній. Нестійкі стани однозначно визначаються власне клітинними характеристиками субпопуляцій. Чим повільніше ділиться субпопуляція, тим вищою має бути кількість клітин цієї субпопуляції в початковій композиції гетерогенної пухлини для того, щоб вона стала домінуючою в пухлині.

Відзначимо, що експериментальні докази такого механізму домінування клітинних субпопуляцій (що базуються на проліферативних характеристиках клітин і реалізується через нестійкі стани) були отримані при вивченні змін композиційної структури гетерогенної пухлини, що складається з неметастатичних клітинних субпопуляцій (рис.3 а). Значна варіабільність клітинного складу, що спостерігається в процесі росту пухлини після перещеплення клональної суміші в співвідношенні 88%A:12%D (і не спостерігається для інших початкових клітинних композицій) обумовлена наближенням цієї композиції до нестійкого стану. Цей висновок підтверджується проведеним нами за допомогою математичної моделі чисельним експериментом (рис.3 б)

Аналіз даних експериментальних досліджень показав здатність метастатичних клітинних субпопуляцій переростати всі інші субпопуляції в пухлині незалежно від значень їх проліферативних характеристик (явище домінування метастатично активних клітин). Для дослідження цього явища була побудована математична модель кінетики росту гетерогенної популяції з урахуванням міжклітинних взаємодій і клітинної рухливості. Припускалося, що:

пухлина росте як сферично симетрична колонія клітин і складається з двох клітинних субпопуляцій, кожна з яких має пул клітин, що діляться (x1, x2) , та тих, що знаходяться у стані спокою (y1, y2);

модель враховує найбільш просту форму клітинної рухливості - дифузію, яка притаманна в межах моделі тільки клітинам, що діляться;

клітинні взаємодії проявляються в конкуренції за критичний субстрат (кисень).

При цих припущеннях модель може бути записана у вигляді:

 (10)

(11)

(12)

де bi - швидкість ділення, а Di - коефіцієнт диффузії клітин відповідної субпопуляції; Si характеризує залежність швидкості переходу клітин популяції від стану ділення до стану спокою від рівня субстрату.

Рівняння (10)-(12) вирішувались в одиниці об'єму сфери з радіусом R при наступних граничних умовах:

(13)

В основі нашого дослідження явища домінування метастатично активних клітин в пухлині лежала перевірка висунутої нами гіпотези, в межах якої рухливість клітин, що діляться повільно, може забезпечити їх домінування над нерухомими клітинами, що діляться швидко, при умові конкуренції клітин за загальний субстрат. Для перевірки гіпотези ми досліджували динаміку зміни клітинного складу гетерогенної пухлини, що складається з двох субпопуляцій: субпопуляція нерухомих клітин, які швидко діляться, та субпопуляція клітин, що мають здатність рухатися, але діляться повільно.

Проведене дослідження показало, що динаміка зміни композиційного складу пухлини залежить від значення коефіцієнта дифузії рухливої субпопуляції, демонструючи здатність цієї субпопуляції домінувати в пухлині, якщо коефіцієнт дифузії її клітин перевищує деяке порогове значення. Важливо зазначити, що при рухливості клітин першої субпопуляції вище порогового значення, вона домінує в пухлині незалежно від кількості клітин цієї субпопуляції в початковий момент росту пухлини.

Таким чином, використана нами математична модель для аналізу явища домінування метастатично активних клітин, описує експансію пухлини за рахунок і клітинного ділення, і властивості пухлинних клітин активно рухатися. Отримані результати шляхом чисельного інтегрування моделі підтвердили нашу гіпотезу та продемонстрували, що клітинна рухливість може забезпечити домінування метастатично активної клітинної субпопуляції в гетерогенній пухлині.

У розділі 4 представлені результати дослідження однієї з центральних проблем онкології - механізмів виникнення злоякісних пухлин (проблема канцерогенезу). Через те, що неможливо ідентифікувати окрему пухлинну клітину, вирішення проблеми канцерогенезу у більшості випадків пов'язують з дослідженням особливостей механізмів росту і прогресії злоякісних пухлин. З іншого боку, перспективним є вивчення та аналіз особливостей розвитку і функціонування нормальних клітин і тканин. Обговоренню останнього підходу і присвячено цей розділ дисертаційної роботи.

Оскільки виникнення злоякісних пухлин прямо пов'язують з порушеннями механізмів регуляції клітинного ділення, метою дослідження була побудова математичної моделі періодичних процесів в клітинній мембрані, що здатні забезпечити реалізацію циклу ділення клітини. При побудові динамічної моделі клітинного циклу ми виходили з наступних положень.

Існує достатньо простий і автономний механізм, який є провідним по відношенню до інших процесів, що протікають при діленні клітини.

Провідний механізм зосереджений в клітинній мембрані: зміни її фізичних властивостей є сигналом до переходу від однієї фази клітинного циклу до іншої.

Провідний механізм є релаксаційним.

Перерахованим вище положенням відповідають добре вивченні процеси вільнорадикального окислення ліпідів в мембрані клітини. Реакціям окислення ліпідів киснем при участі вільних радикалів відповідає наступна система диференціальних рівнянь (представлена в безрозмірному вигляді), в якій S характеризує фракцію ліпідів в мембрані, що найбільш легко окислюються, R - концентрація активних вільних радикалів, R1--концентрація антиоксидантів (слабких радикалів, що інгібують окислення):

(14)

Найбільш “швидкою” змінною є R: постійна часу другого рівняння порядку однієї секунди. Самою “повільною” є змінна S: s105 с. Характерний час зміни R1 (R1) становить близько 102 с. Параметри системи порядку одиниці.

Параметр описує стан клітинної мембрани (наприклад, її в'язкість). Передбачається, що, залежно від величини S, мембрана може бути в двох станах: 1 і 2 (1 <2). При цьому перехід з одного стану в другий може бути різким та гістерезисним (що відповідає структурі мембрани нормальної клітини), а може бути плавним не гістерезисним (що відповідає пухлинній клітині).

Система (14) досліджувалась як аналітично, так і чисельно. Аналіз моделі показав, що є декілька режимів моделі, які суттєво відрізняються за характером фазового портрету та регуляції клітинних переходів між станом спокою та станом ділення. При наявності структурних гістерезисних переходів в мембрані, в залежності від значень параметрів, в системі реалізується або один стійкий стан (граничний цикл), або два стійких стани ( граничний цикл і точкове стаціонарне рішення). Граничний цикл відповідає циклу клітинного ділення, а точковий стаціонарний стан є станом спокою клітини (Рис.4а).

Перехід з ділення в стан спокою та навпаки в рамках моделі може бути як силовим, так і параметричним. Важливою властивістю моделі є існування граничного циклу у випадку негістерезисних структурних переходів в мембрані (Рис.4б). В цьому випадку, який є характерним для пухлинних клітин, система мало чутлива до зміни параметрів, що характеризують фізичні властивості клітинної мембрани.

Таким чином, відмінності в регуляції процесів клітинного ділення між нормальними та пухлинними клітинами обумовлені змінами фізичних властивостей плазматичної мембрани, що проявляються в зміні характеру фазових переходів в них. Відзначимо, що відсутність фазових переходів в мембрані пухлинних клітин пов'язано з порушенням цільності олігоцукрозного каркасу клітини (в випадку гістерезисного переходу цей каркас відіграє роль “нетермодинамічної підсистеми”, що забезпечує виникнення фазових переходів). Подібні порушення повинні суттєво впливати на всі біохімічні та фізико-хімічні властивості мембрани клітини і спричиняти зміни чутливості пухлинних клітин до дії різних факторів.

Так як одними із перших проявів дії екзогенних факторів на клітину є зміни мембранного потенціалу та сумарного поверхневого заряду, нами було проведено експериментальне дослідження впливу різних екзогенних факторів (протипухлинних препаратів доксорубіцин і цисплатин, та електромагнітного випромінювання міліметрового діапазону) на електрофоретичну рухомість (ЕФР) нормальних (нормальні лімфоцити щурів) та пухлинних (лімфобластні клітини лімфосаркоми щурів) клітин.

Дія різних факторів обумовлювала збільшення ЕФР нормальних та пухлинних клітин, при цьому більш значні та різкі зміни ЕФР спостерігались у нормальних лімфоцитів. Серед трьох екзогенних факторів найбільш значний вплив на ЕФР виявив протипухлинний препарат доксорубіцин, який (на відміну від інших) характеризується мембранотропною дією. При взаємодії з клітиною велика органічна молекула доксорубіцину зв'язується з адгезивними рецепторами мембрани, активність яких в значній мірі залежить від цілісності олігоцукрозного каркасу. Цей результат дослідження добре узгоджується з основною гіпотезою моделі про ключову роль фізичної організації мембрани в функціонуванні клітини та онкопатологічному процесі.

В рамках запропонованої моделі клітинного ділення зміни біохімічних та фізико-хімічних властивостей мембрани пухлинної клітини повинні обумовлювати порушення взаємодії клітин в популяції, в першу чергу таких, які відповідають за регуляцію процесів клітинного ділення та диференціації. Вважається, що порушення такої регуляції лежать в основі багатьох патологічних процесів в організмі, включаючи і виникнення злоякісних пухлин. Вивчення механізмів регуляції процесів клітинного ділення і диференціації в популяції нормальних клітин було метою наступного дослідження. При цьому аналіз цих механізмів проводився за допомогою стохастичної моделі динаміки розвитку клону нормальних уніпотентних клітин у припущенні існування двох альтернативних сценаріїв розвитку кожної новонародженої клітини. Кожен із сценаріїв розвитку відповідає або проліферативному, або диференційованому статусу клітини. Вибір сценарію розвитку розглядається як випадкова подія, що залежить як від власної мітотичної активності клітини, так і від факторів диференціювання, що синтезуються диференційованими клітинами. При взаємодії з новонародженою клітиною, фактори диференційовки інгібують клітинне ділення та індукують процес її диференціації.

У межах зроблених припущень динаміка розвитку гомогенного клону нормальних клітин в термінах середніх значень X(n), Y(n) всіх клітин, що діляться (Xn) та клітин, що диференціюють, (Yn) n-ой генерації визначається наступними рекурентними співвідношеннями:

(15)

(16)

(17)

де wn і (1-wn) вірогідність клітині ділитися чи диференціюватися, відповідно, pn.- кількість факторів диференціації, які зв'язались з клітиною, k - індекс власної мітотичної активності. Треба відмітити, що основні припущення дослідження грунтувались на запропонованій в моделі (14) гіпотезі про ключову роль фізичної організації мембрани в функціонуванні клітини. Тому при побудові функції wn ми виходили не з законів хімічної кінетики, а використали Арреніусові експоненти. З (16) видно, що клітини, які характеризуються високими значеннями параметра k і, внаслідок цього, мають властивість активно ділитись, одночасно є менш чутливими до дії факторів диференціації. Це видається важливим, так як резистентність клітин до дії факторів диференціації є однією з основних особливостей, які відрізняють пухлинні клітини від нормальних.

Проведений аналіз показав, що при збільшенні параметру k в системі (15)-(17) послідовно змінюється асимптотичний характер залежності кількості клітин в клоні, що діляться, від номеру генерації: прямування до нуля; прямування до деякої граничної кількості клітин; квазігармонічні коливання кількості клітин; необмежений експоненціальний їх ріст. Останнє спостерігається, коли значення k перевищує деякий критичний рівень.

Такий характер поведінки моделі спостерігається в припущенні, що всі клітини клону мають однаковий індекс власної мітотичної активності (гомогенність клону нормальних клітин). Проте аналіз експериментальних досліджень показав, що гетерогенність притаманна як клонам нормальних, так і пухлинних клітин. Модифікація моделі з урахуванням гетерогенності клітинного складу популяції базувалась на наступних припущеннях:

первинна клітина клону (стволова клітина) належить популяції генетично ідентичних клітин, фенотипічний розподіл яких по параметру k може бути представлений у вигляді розподілу Гаусса, де Kp - середнє популяційне значення власної мітотичної активності клітини, а Cp - зворотна напівширина статистичного розподілення популяції;

для кожного значення Km стволової клітини клону (з популяційного розподілу) функція щільності вірогідності відповідних характеристик дочірніх клітин також може бути представлена розподілом Гауса, де Cc - зворотна напівширина розподілу клону.

Розрахунок моделі з урахуванням внутрішньопопуляційної та внутрішньоклональної гетерогенності показав два різних типи розвитку клону (рис.5). Перший з них - регресія середнього значення індексу власної мітотичної активності клону до середньопопуляційного значення Kp (рис.5а). Видно, що швидкість регресії тим вища, чим вища внутрішньоклональна варіабельність.

Збільшення гетерогенності клітинної популяції обумовлює інший сценарій розвитку клітинного клону. Регресія клону в напрямку Kp (яка також має місце) замінюється (із зменшенням клональної варіабельності) прогресією клону в напрямку більших значень k (рис.5б). Динаміка клону в останньому випадку демонструє поступову зміну характеру асимптотичної поведінки пулу проліферуючих клітин: від обмеженого росту до експоненційного збільшення кількості клітин, що діляться.

Таким чином висока гетерогенність клітинної популяції та низька клональна гетерогенність зміщують розподіл клону в напрямку появи та селекції активно проліферуючих та резистентних до дії факторів диференціації клітин, тобто в напрямку клітин з пухлинним фенотипом. Такому типу розвитку клону ми дали назву явище автоселекції (рис.6).

В межах нашого дослідження клітини з пухлинним фенотипом виникають в результаті перманентних немутаційних змін проліферуючих клітин та механізму автоселекції, що залишає для ділення тільки ті клітини, які менш чутливі до дії факторів диференціації. Немутаційні зміни в першу чергу стосуються мітотичної активності окремих клітин і пов'язаної з нею чутливості до дії факторів диференціації, і корелюють зі змінами фізичних властивостей клітинної мембрани.

У розділі 5 приведені результати дослідження клінічних аспектів лікарської резистентності як форми пухлинної прогресії.

Без сумніву кінцевою метою будь-якого дослідження в онкології (фундаментальних досліджень включно) є розробка підходів (або створення методів) для підвищення ефективності протипухлинної хіміотерапії (ПХТ). Відомо, що ефективність ПХТ визначається за допомогою двох факторів: ступенем чутливості пухлини до дії протипухлинних препаратів (міра прогресії злоякісних пухлин) та особливостями фармакокінетики цих препаратів. При цьому резистентність пухлин до дії протипухлинних препаратів вважається основним фактором, що визначає низьку ефективність ПХТ. Ступінь чутливості пухлини в клінічній практиці, як правило, оцінюють за допомогою ефективності проведенної ПХТ: низьку ефективність останньої прамо пов'язують з резистентностью пухлини. Висновок неправильний в силу того, що ефективність ПХТ в значній мірі залежить від особливостей розподілу протипухлинних препаратів в організмі хворих.

...