Дослідження токолітичної активності похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот, фенілалкіламінів і створення на цій основі лікарського засобу

Размещено на http://www.allbest.ru/

інститут фармакології та токсикології АМН України

УДК: 615.45.001.65:611.66

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Дослідження токолітичної активності похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот, фенілалкіламінів і створення на цій основі лікарського засобу

14.03.05 -- Фармакологія

Риженко Ірина Михайлівна

Київ 2000

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Особливою проблемою сучасного практичного акушерства залишається антенатальна охорона плоду при таких ускладненнях, як загроза недоношування вагітності (В.Е.Дашкевич, С.Н.Янюта, 1999; О.М.Капаліна і співавт., 1999). Однією з головних причин, які призводять до народження недоношених дітей і негативно впливають на показники народжуваності, є передчасні пологи (В.И.Кулаков, 1991; Е.В.Коханевич с соавт, 1997; D.C.Wheeler, 1994). Частота передчасних пологів коливається від 4 до 12% загальної кількості всіх пологів і на протязі останніх років залишається стабільною з відсутністю тенденції до пониження (P.Jonson, 1993). Недоношування значно підвищує рівень перинатальних захворювань та смертності, негативно відбивається на розвитку недоношених дітей і репродуктивної функції жінки (Л.Е.Мурашко, 1992; С.П.Писарева, 1996; Л.В.Архіпкіна і співавт., 1997; Л.Б.Маркін і співавт., 1999). На перинатальний період приходиться до 50% випадків мертвонароджень, при цьому діти з малою вагою гинуть в 64,7%, а виходжування немовлят неспроможним тягарем лягає на державний бюджет (Б.М.Венцковський, І.Б.Венцковська, 1997).

Таким чином, проблема недоношування вагітності в сучасних умовах набуває не тільки важливого медичного, але й соціального та демографічного значення.

Не дивлячись на застосування в акушерській практиці різних лікарських засобів, проблема фармакологічної регуляції підвищеної скорочувальної активності матки при передчасних пологах на даний момент залишається не до кінця вирішеною. Пов'язане це не тільки з багатофакторністю даної патології, складністю патогенетичних механізмів, сприяючих достроковому перериванню вагітності, але і з недостатнім їх вивченням, а також не завжди ефективною та безпечною фармакотерапією, що використовується при недоношеності.

Недосконалість сучасних токолітиків можна пояснити наступними обставинами:

1. Використовувані фармакологічні препарати не завжди є засобами обгрунтованої етіопатогенетичної терапії невиношування та недоношування вагітності, тому вони нерідко бувають неефективними. (В.Х.Ю.Виктор, Э.К.Вуд, 1991).

2. Сучасні утеролітики небезпечні. Їх недоліком є побічні ефекти, негативна дія на організм матері і плоду (H.G.Murray et al., 1993; L.D.Merril et al., 1994).

3. Вибір ефективних і безпечних токолітиків обмежений внаслідок необхідності проводити постійні купівлі препаратів за кордоном. З препаратів групи b₂_адреноміметиків, що є на світовому фармацевтичному ринку, тільки партусистен і гініпрал зареєстровані на Україні. На теперішній час доставки цих високоактивних, але дорогих за ціною ліків, не задовольняють щорічно зростаючу в них потребу акушерів.

В зв'язку з цим, арсенал засобів фармакологічної корекції підвищеної скорочувальної активності матки при передчасних пологах потребує кардинального поповнення, в першу чергу, за рахунок впровадження нових препаратів, поєднуючих високу ефективність та безпечність застосування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у межах пріоритетного конкурсного фінансування МОЗ України "Створення вітчизняного токолітичного препарату типу партусистену" (№ держреєстрації 01.9.153680) (1991 - 1993 рр.).

Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи є експериментальне обгрунтування пошуку речовин з утеролітичною активністю в рядах похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот, фенілалкіламінів, створення на цій основі високоефективного, малотоксичного токолітика та його фармакологічне дослідження.

Для досягнення зазначеної мети вирішували такі задачі:

1. Провести пошук нових хімічних речовин з токолітичною активністю серед похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот і фенілалкіламінів, з'ясувати наявність зв'язку "структура-активність" в ряду цих хімічних сполук, а також виявити найбільш перспективну потенційну утероактивну речовину.

2. Провести поглиблені дослідження основних фармакологічних ефектів сальбутамолу гемісукцинату (савентолу) та створеного на його основі нового токолітика - венттоколу.

3. Вивчити механізми токолітичної дії венттоколу.

4. Вивчити фармакокінетику ³Н_савентолу, встановити взаємозв'язок параметрів фармакодинаміки та фармакокінетики для характеристики специфічної дії та можливості прогнозування небажаних ефектів на материнський організм і плід.

5. Удосконалити методичні підходи та схему доклінічних досліджень утеролітичних властивостей фармакологічних засобів.

Наукова новизна одержаних результатів. Серед оригінальних похідних фенілалкіламінів виявлені сполуки з високим ступенем токолітичної активності та низькою токсичністю. Встановлена кореляційна залежність "структура-дія" нових речовин, та виявлені структурні фрагменти, що відповідають за їх утеролітичні властивості.

Вперше вивчена нова речовина - сальбутамолу гемісукцинат (савентол), на основі якого створений та рекомендований до медичного застосування високоефективний токолітик - венттокол. Вперше доведено, що комбінація савентолу з ендогенним метаболітом - янтарною кислотою в складі ін'єкційної лікарської форми - венттоколу, сприяє посиленню його токолітичного ефекту та зниженню токсичних властивостей. Проведено поглиблені дослідження специфічної активності, де вперше встановлена висока ефективність використання венттоколу в умовах формування патологічних станів (передчасних пологах), які викликані введенням потужних стимуляторів скорочень матки - окситоцином і естрадіолом. Встановлено взаємозв'язок між фармакологічними властивостями та фармакокінетичними параметрами нового препарату.

Вперше вивчено основні аспекти механізму токолітичної дії венттоколу, доведено вплив його на процеси активного та пасивного транспорту кальцію крізь плазмолему клітин міометрію.

Вперше узагальнено дані про фармакологічну корекцію підвищеної скорочувальної діяльності матки при недоношуванні вагітності, що покладено в основу сучасної класифікації утеролітичних засобів.

Удосконалено методичні підходи та схема доклінічного дослідження лікарських препаратів, які впливають на скорочувальну активність міометрію.

При проведенні фармакологічного скринінгу речовин, що мають токолітичні властивості, використан в паралельних дослідженнях in vitro поряд з традиційним об'єктом - міометрієм щурів, новий біологічний матеріал - матка вагітних мишей.

Практичне значення одержаних результатів. Препарат "Венттокол" зареєстровано в Російській Федерації і дозволено до медичного застосування та промислового випуску (Реєстраційне посвідчення №99/47/7 згідно наказу МОЗ РФ від 10.02.1999 р.)

Удосконалена схема доклінічного вивчення речовин на токолітичну активність, яка відображена в "Методичних рекомендаціях по експериментальному (доклінічному) вивченню лікарських препаратів, які впливають на мускулатуру матки" (ФК МОЗ України, 1995), рекомендованих до використання в науково-дослідницькій практиці. На підставі отриманих результатів експериментальних досліджень розроблені та видані інформаційні листи "Рациональное применение фенотерола, гинипрала и мелатонина при угрозе преждевременных родов" (1991), "Поиск новых лекарств для сохранения беременности" (1992), "Венттокол - первый отечественный токолитик" (1993), матеріали яких впроваджені в практику роботи закладів охорони здоров'я України.

За матеріалами дисертації отримано патент Російської Федерації №2090187 "Средство, обладающее токолитическим действием с малой токсичностью и его состав" (1997).

Запропоновано новий біологічний об'єкт для проведення скринінгових досліджень на токолітичну активність - міометрій вагітних мишей, що дозволяє розширити методичні підходи до роботи з ізольованими органами.

Матеріали досліджень впроваджені у навчальний процес на кафедрах фармакології Харківського, Луганського державних медичних університетів, Національної фармацевтичної академії України, факультеті фундаментальної медицини Харківського державного університету, кафедри клінічної фармації Національної фармацевтичної академії України, використовуються в післядипломній підготовці фармацевтів і провізорів в Інституті підвищення кваліфікації спеціалістів фармації (м. Харків).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто було здійснено патентно-інформаційний пошук, проведено аналіз даних літератури, визначено мету, завдання, методичні підходи та програма дослідження. Самостійно виконані усі експериментальні дослідження, статистична обробка отриманих даних, оформлення їх у вигляді таблиць і рисунків. Проведено аналіз результатів роботи, а також сформульовані основні положення та висновки, що захищаються в дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на І Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1992); науково-практичній конференції "Перспективы создания и производства лекарственных средств в Украине" (Одесса, 1993); науково-практичній конференції "Современные проблемы фармации" (Харьков, 1993); секції фармакологів Харківського відділення медичного товариства (Харків, 1994); республіканській науково-практичній конференції "Сучасні проблеми фармації" (Харків, 1994); конференції "Школа академіка О.І.Черкеса: ідеї, розвиток, перспективи" (Київ, 1994); І Конгресі Світової федерації Українських фармацевтичних товариств (Львів, 1994); науково-практичній конференції "Научные достижения и проблемы производства лекарств" (Харьков, 1995); науково-практичній конференції, присвяченій 75-річчю УкрФА "Досягнення сучасної фармації в медичну практику" (Харків, 1996); IV Російському національному конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1997); V Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 50 наукових робіт: 25 статей, з них 20 статей у центральних наукових журналах, у тому числі 10 моноосібних, 1 патент Російської Федерації, 1 методичні рекомендації, 3 інформаційні листи, а також 20 тез доповідей на наукових форумах.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на сторінках машинопису та складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалу та методів дослідження, 6 розділів експериментальних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків та списку використаної літератури. Робота ілюстрована 51 таблицею, 25 рисунками. Бібліографія складається з 497 джерел, зокрема 245 надруковані в іноземних видавництвах.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Об`єктами дослідження були субстанції 79 хімічних сполук: 13 похідних триптаміну, 44 похідних гетерилпропіонових кислот та їх напівпродуктів, 22 речовини - похідні фенілалкіламінів і гетероциклічних аміноспиртів, а також субстанція сальбутамолу гемісукцинату (савентол), його лікарська форма - венттокол і розчин савентолу, мічений ³Н-тимідином.

Хімічні сполуки для скринінгу на токолітичну активність представлені з ВНДХФІ ім. С.Орджонікідзе (Москва), НДІ ендокринології та хімії гормонів (Харків) д.ф.н. Чувуріним О.В., ВНЦ БАР (С. Купавна) д.х.н., проф. Скачіловою С.Я.

Для вирішення поставлених у роботі завдань використано комплекс сучасних фармакологічних, токсикологічних, біохімічних, фармакокінетичних, статистичних методів дослідження.

Експерименти проведені на білих безпородних щурах: невагітних, але тих, що народжували в минулому, вагою 180-200 г і вагітних 250-300 г на 18-20 добу гестації; білих мишах - невагітних, вагою 17-18 г та вагітних (25-28 г) на 21-22 добу гестації; морських свинках (600-650 г) на 50 добу гестації та кролицях породи Шиншилла (2,5-3 кг) на 20 добу вагітності.

Гостру токсичність похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот вивчали на мишах при внутрішньошлунковому, а похідних фенілалкіламінів і гетероциклічних аміноспиртів - внутрішньочеревинному введенні. Токсичні властивості савентолу, венттоколу та сальбутамолу сульфату досліджували на щурах в умовах внутрішньочеревинного введення методом пробіт-аналізу за В.В.Прозоровським (1992), ступінь токсичності визначали за класифікацією К.К.Сидорова (1973).

Токолітичну активність хімічних речовин вивчали в паралельних дослідах на ізольованих відрізках рогу матки вагітних щурів і мишей (in vitro), а сполук з обмеженою розчинністю в умовах цілісного організму (in vivo) на щурах.

Дослідження in vitro проводили в ізометричному режимі в умовах перфузійної камери за допомогою механоелектричної системи. В повному об`ємі дані методи досліджень представлені в матеріалах "Методичних рекомендацій по експериментальному (доклінічному) вивченню лікарських препаратів, що впливають на мускулатуру матки" (ФК МОЗ України, Київ, 1995). При обробці гістерограм скорочувальну діяльність матки оцінювали за хронотропним ефектом (за зміною частоти скорочень), інотропним ефектом (за зміною середньої величини амплітуди в мм), тривалістю скорочень (в сек), що виражалось в % до вихідного рівня. Тонотропний ефект визначали за ступенем зниження тонусу матки (в мм).

Токолітичну дію похідних триптаміну вивчали в діапазоні концентрацій 5ґ10^-6-1ґ10^-4 М, гетерилпропіонових кислот 1ґ10^-5-1ґ10^_4 М, фенілалкіламінів і гетероциклічних аміноспиртів 5ґ10^-9М-5ґ10^-6М.

В якості препаратів порівняння використовували імпортні токолітики: партусистен 5ґ10^-10-5ґ10^-8 М, орципреналіну сульфат фірми "Вoehringher Ingelheim" (Німеччина), бриканіл фірми "Астра" (Швеція), ритодрін фірми "Солвей Дюфар" (Нідерланди) 5ґ10^-8-5ґ10^-6 М і сальбутамол (сальбупарт) фірми "Polfa" (Польща), до складу якого входить сальбутамолу сульфат.

В умовах цілісного організму досліджували вплив савентолу, венттоколу, сальбутамолу сульфату (25, 50, 100 мкг/кг), партусистену (2,5; 5; 10 мкг/кг) на спонтанні скорочення матки вагітних щурів, а також венттоколу при дії його на індукований окситоцином міометрій вагітних щурів, морських свинок і кролиць. Для співставлення результатів дослідження розраховували середньоефективну концентрацію (ЕС₅₀), середньоефективну дозу (ED₅₀) та їх довірчі межі графічним методом за Я.І.Хаджаєм (1965).

Поглиблене вивчення утеролітичних властивостей венттоколу включало здатність його пролонгувати фізіологічно протікаючу вагітність у щурів, а також в умовах розвиненої патології скорочувальної діяльності матки - передчасних пологах. Для цього використані 2 експериментальні моделі недоношування вагітності з введенням сильних агоністів скорочень матки, таких як окситоцин та естрадіол (Б.В.Бойкова і співавт., 1989, І.В.Харченко, 1990). Ефективність дії венттоколу оцінювали по терміну настання пологів і стану плодів (середня маса тіла, наявність мертвонароджуваності).

Вплив венттоколу на функціональний стан організму матері та плоду вивчали на поліграфі RM-150 (Японія) з одночасною реєстрацією ряду показників серцево-судинної системи, системи дихання вагітних щурів, їх плодів (АТ, ЧСС, ЧД) та параметрів скорочувальної діяльності матки (В.Г.Філімонов, 1975).

Фармакологічний аналіз рецепторного механізму дії венттоколу проводили на ізольованому міометрії з використанням ряду фармакологічних індикаторів: специфічних агоністів М_холінорецепторів - ацетилхоліну, a-адренорецепторів - адреналіну, гістамінорецепторів - гістаміну, агоністів окситоцинових рецепторів і рецепторів простагландину F₂ - окситоцину та ПГF_2a, а також гіперкальцієвого та гіперкалієвого розчинів. Вивчення взаємодії венттоколу з наведеними вище агоністами засновувалось на оцінці гістерограм за змінами конфігурації кривої процесу скорочення-розслаблення міометрію.

Характер взаємодії венттоколу з b-адреноблокатором анаприліном вивчали в умовах in vitro та in vivo. Анаприлін досліджували в концентраціях (5ґ10^-11-1ґ10^-9 М), венттокол, партусистен в ЕС₅₀ (1,3ґ10^_8 М та 6,510^-9 М відповідно). У випадку конкурентного антагонізму анаприліну з венттоколом і партусистеном розраховували константу дисоціації (К_Д) за методом І.В. Комісарова (1986).

Вплив венттоколу на процеси активного та пасивного транспорту кальцію характеризували в модельних дослідах in vitro на везикульованих препаратах сарколеми міоцитів. Фракцію замкнутих везикул плазматичної мембрани міоцитів виділяли за методом Джонса (L.R. Jones et al. 1979), концентрацію білка визначали за методом Лоурі (1951). Дослідження процесів активного транспорту кальцію проводили на препаратах інвертованих везикул, інкубованих в середовищі такого складу: 25 мМ трис-НСl (рН=7,4), 135 мМ КСl, 5ґ10^-8-10^-6 М ⁴⁵Са²⁺, 100 мкг білка. Час інкубації у всіх експериментах був стандартним при температурі 37 ⁰С і відповідав виходу на плато швидкості накопичення кальцію везикулами. Реакцію зупиняли методом фільтрування через мембранні фільтри "Millipore" з діаметром пор 0,45 мкм. Фільтри промивали 10 мл 20 мМ Nа-фосфатного буферу (рН=7,4), що містить 70 мМ кальцію хлориду у випадку вивчення процесу пасивного транспорту і 5 мл буферу того ж складу при вивченні процесів активного транспорту кальцію. Фільтри висушували і визначали радіоактивність на гамма-спектрометрі "Inter-Techniqve SL-30".

Статистичну обробку результатів проводили за програмою "ENZFITTER" бібліотеки "Sigmaplot" на комп`ютері ІВМ РС ХТ.

Фармакокінетичні властивості савентолу вивчали за допомогою радіоізотопного методу, для цього його мітили ³Н-тимідином, питома радіоактивність якого складала 6,7 мкКu/мг препарату. Водний розчин ³Н_савентолу вводили вагітним тваринам в хвостову вену одноразово в дозах 0,28 мг/100 г і 2 мг/100 г ваги тіла щурів, що відповідало 100 та 700 ED₅₀. Щурів декапітували через 6, 15, 30, 45 хвилин, 1, 3, 6, 7, 9 годин від моменту введення ³Н-савентолу. Радіоактивність визначали в сироватці крові, в аліквоті 100-200 мг досліджуваних біорідин і тканин (печінці, нирках, матці, плаценті, амніотичній рідині та тканинах плоду), підготовлених до рідинного сцинтиляційного ліку за методом З.Д.Озриної і співавт. (1979). Радіометричні вимірювання проводили на сцинтиляційному лічильнику "Bekman" LS 100C (США). Імпульси за хвилину переводили в мікрограми препарату на 1 г тканини або 1 мг рідини по калібровочній кривій, яка була попередньо побудована.

Фармакокінетику ³Н-савентолу вивчали в рамках двочастинної моделі і характеризували за наступними основними модельно-незалежними параметрами: загальним кліренсом (Сl), стаціонарним об`ємом розподілу (Vss), площі під кривою "концентрація-час" (АUС), середнього часу перебування в організмі молекули препарату (MRT), періоду напіввиведення з сироватки крові та органів (Т<sub>1/2</sub>), коефіцієнту елімінації (К<sub>еl</sub>), коефіцієнту розподілу між кров`ю і тканиною (К_р). Основні фармакокінетичні параметри розраховували за методом статистичних моментів (В.К. Піотровський і співавт., 1986).

Ступінь трансплацентарного переходу визначали за індексом проникливості плаценти (ІПП), а перехід крізь навколоплідні оболонки - по індексу дифузії (ІД) в навколоплідні води (А.П.Кирющенков, 1988).

В експериментах використано білих мишей 790, білих безпородних щурів 725, кролиць породи Шиншилла 16, морських свинок 20. Тварини одержані з питомників "Крюково", "Білий мох", а також розводки віварію НФАУ і утримувались в стандартних умовах.

Результати досліджень та їх обговорення

В наших дослідженнях з метою обгрунтування напрямків пошуку високоефективних токолітиків були відібрані 79 хімічних сполук і проведена оцінка утеролітичних властивостей найближчих структурних аналогів мелатоніну - похідних триптаміну (13), похідних гетерилпропіонових кислот та їх напівпродуктів (44), в тому числі: похідних b-(2-бензімідазоліл)-пропіонової кислоти; похідних b-(2-бензоксазоліл)-пропіонової кислоти; похідних триазапіримідину; похідних орто-заміщених сукцинанілових кислот, а також 18 похідних фенілалкіламінів і 4 гетероциклічних аміноспиртів.

Вивчення токолітичної активності хімічних сполук проведено за удосконаленою нами методичною схемою доклінічного дослідження БАР, основні етапи якої представлені в "Методичних рекомендаціях по експериментальному (доклінічному) вивченню лікарських препаратів, що впливають на мускулатуру матки" (1995). Вперше утеролітична дія речовин вивчена в паралельних дослідах на ізольованому міометрії вагітних щурів і нетрадиційному біологічному матеріалі - матці вагітних мишей.

Результати дослідів по вивченню здатності 54 похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот та їх напівпродуктів інгібувати скорочувальну активність матки щурів і мишей наведені в табл. 1.

Таблиця 1. Токолітична активність похідних триптаміну, гетерилпропіонових кислот та їх напівпродуктів у порівнянні з мелатоніном

Размещено на http://www.allbest.ru/

У всіх групах хімічних сполук, за виключенням похідних b-(2-бензоксазоліл)-пропіонової кислоти, виявлені речовини, утеролітичні властивості яких порівнювались з мелатоніном (ЕС₅₀ - 8,35ґ10^-5М). Встановлено, що 14 (25,9%) речовин проявляють токолітичну активність різного ступеня вираженості: 4 (28,6%) хімічних сполук найбільш високу, яка перевищує утеролітичну активність мелатоніну в 1,2-6,9 рази; 5 (35,7%), як і мелатонін помірну; 5 (35,7%) - віднесені до розряду речовин з низькою активністю (10^-4 М). Ця закономірність спостерігається також у випадку використання для скринінгових досліджень матки вагітних мишей.

Таким чином, проведеними дослідженнями встановлено наявність утеролітичних властивостей у випробуваних речовин, але діапазон концентрацій (10^-5-10^-4 М) не дозволяє визначити перспективу їх практичного застосування. Однак подальший пошук речовин з утеродепримуючою дією в даних рядах похідних не виключений.

Вивчення 18 похідних фенілалкіламінів і 4 гетероциклічних аміноспиртів показало, що у 11 (61,1%) сполук токолітична активність виявляється в концентраціях 10^-8-10^-5 М. За ступенем активності похідні фенілалкіламінів розподілились наступним чином: речовини з помірними токолітичними властивостями 3 (16,7%), з високою активністю 6 (33,3%) і 2 (11,1%), що володіють дуже високою токолітичною активністю. Серед 4 гетероциклічних аміноспиртів тільки 1 речовина (ЛХТ 27-91) виявила помірну утерорелаксуючу дію, тоді як інші не впливали на скорочувальну активність міометрію.

Отримані дані підтверджені в експериментах з використанням матки вагітних мишей, хоча у 86,9% випадках ЕС₅₀ для мишей статистично достовірно в 1,4-2,2 рази перевищувала таку для щурів, що свідчить про декілька меншу чутливість міометрію мишей до дії речовин, що вивчалися.

Проведений нами порівняльний аналіз і вірогідність результатів дослідження свідчать про можливість використання міометрію вагітних мишей в якості нового об'єкту, який забезпечує отримання максимальної і достовірної інформації. Крім цього, це дозволяє розширити методичні підходи до роботи з ізольованими органами та позитивно вирішити питання про рентабельність проведення скринінгових дослідів на виявлення речовин з токолітичною активністю.

Аналіз залежності токолітичної активності від хімічної будови показав, що найперспективнішими в плані пошуку потенційних токолітиків виявились фенілалкіламіни з коротким алкільним ланцюгом, a_вторинноамінною групою і наявністю гідроксильної групи біля другого атому вуглецю, тобто феніламіноетаноли, похідним яких є сальбутамол. Порівняльна характеристика цієї групи сполук наведена в табл. 2.

Всі органічні солі сальбутамолу значно активніші за утеродепримуючою дією, ніж мінеральна сіль - сальбутамолу сульфат. Найактивнішою серед них виявилася речовина ЛХТ 1_89, яка являє собою подвоєну молекулу феніламіноалканолу, зв'язану органічним аніоном (янтарною кислотою) і дещо нагадує структуру високоефективного b₂_адреноміметика - гініпрала. Можливо, подібна структура даної сполуки забезпечує більш міцну взаємодію з b₂_адренорецепторами і, як наслідок цього, більш виражений токолітичний ефект (Штамм Х., 1987). Утеролітична активність сальбутамолу гемісукцинату перевищує в 2400 разів дію препарату порівняння (сальбутамолу сульфату).

Таблиця 2. Токолітична активність, гостра токсичність різних солей сальбутамолу 1-[(4-гідрокси -3-гідроксиметил)-феніл-] -2-(третбутиламіно-) - етанолу

похідні фенілалкіламінів токолітик

Оцінка токсичних властивостей похідних фенілалкіламінів свідчить про те, що дані сполуки відносяться до класу малотоксичних речовин (LD₅₀ 130-640 мг/кг). Виявлено, що на прояву токсичних властивостей впливають не стільки структурні зміни в молекулі фенілалкіламінів, скільки природа аніона. Найменш токсичними виявилися солі дикарбонових і пантотенової кислот, що узгоджується з даними літератури (В.В.Гацура, 1993), згідно яких введення аніонів дикарбонових кислот, особливо янтарної, до структури відомих сполук веде до зменшення їх токсичності.

Дані фармакологічного скринінгу підтверджені дослідами Г.В.Зайченко (1997), які дозволили на основі комп'ютерного аналізу залежності "структура-активність" ДСМ-методом виявити угрупування, що несуть відповідальність за токолітичну активність. Так, в структурі найбільш активних речовин (ЛХТ 1_89, ЛХТ 18_89) мають місце позитивні фармакофори - гідроксильна група і ароматичний замісник біля b_вуглецевого атому, а також метильна група біля атому азоту, що обумовлює їх високу токолітичну дію.

Отже, дані скринінгових досліджень вказують на доцільність подальшого поглибленого вивчення в дослідах in vitro і in vivo сполук з найбільш вираженою утеролітичною дією як потенційних токолітиків.

Для доклінічного вивчення відібрана органічна сіль сальбутамолу та янтарної кислоти, що дістала назву савентол, який став підставою для створення на його основі нового гравідопротектора - венттоколу.

В дослідах in vitro з використанням міометрію вагітних щурів показана висока здатність савентолу та венттоколу пригнічувати скорочувальну діяльність матки (ЕС₅₀ - 3,4ґ10^_8 М і ЕС₅₀ - 1,3ґ10^_8 М відповідно). За активністю савентол поступався венттоколу у 2,6 рази (р<0,05).

Для підтвердження отриманих даних у наступній серії експериментів вивчена токолітична дія савентолу та венттоколу в порівнянні з сальбутамолом сульфатом в умовах цілісного організму тварин (табл. 3).

Показано, що савентол (50 мкг/кг) поступово і стабільно знижує ритмічний компонент скорочувальної діяльності матки, досягаючи максимуму токолітичного ефекту до 60 хвилини. Зменшення величини амплітуди відносно фонових значень у цей момент складало 89,3% і залишалось на такому рівні до 80 хвилини.

Таблиця 3. Вплив сальбутамолу сульфату, савентолу та венттоколу на спонтанну скорочувальну активність матки вагітних щурів в дослідах in vivo

На відміну від савентолу токолітична дія сальбутамолу сульфату менш виражена. Максимальна депресія амплітуди складає лише 64,5% і за тривалістю дії він поступається савентолу. Під впливом сальбутамолу сульфату амплітуда скорочень матки вже на 100-110 хвилині спостереження відповідала даним ісходу у 87,5% тварин, тоді як при введенні савентолу величина маткових контракцій встановлювалась до рівня фонових у 75% щурів на 150-170 хвилині експерименту.

Венттокол в дослідах in vivo за токолітичною активністю переважає савентол. Підтвердженням цьому є не тільки більш ранній розвиток максимального ефекту (на 30 хвилині), але й більш сильне пригнічення амплітуди (93,8%), ніж при введенні савентолу і референс-препарату. Відновлення скорочень матки відмічається на 150-170 хвилині тільки у 60% щурів. Одержані дані вказують на наявність відмінностей в характері та тривалості релаксуючої дії вивчених утеролітиків і можуть відображати особливості їх фармакокінетики. За токолітичною активністю венттокол у 2,2 рази ефективніший за савентол (ED₅₀ 28,8 і 64 мкг/кг відповідно), а за показником терапевтичного індексу перевищує його в 3,2 рази. В той же час савентол як за ефективністю, так і за терапевтичним індексом не поступається препарату порівняння.

Вивчення у різних тварин наявності чутливості міометрію до венттоколу вказує, що вона однакова у щурів і морських свинок (ЕС₅₀ - 1,310^_8 М і ЕС₅₀ - 2,1ґ10^_8 М відповідно) (р>0,05) і менша у кролиць (ЕС₅₀ - 2,7ґ10^_8 М) в 2,1 рази. Отримані дані можна пояснити перевагою в гладеньких м'язах матки щурів і морських свинок гальмівних b₂_адренорецепторів (И.Д.Дуда, 1989; В.И.Циркин, С.А.Дворянский, 1997).

Порівняльне вивчення in vitro венттоколу з широко використовуючими в акушерській практиці b₂-адреноміметиками: партусистеном, орципреналіном сульфатом, бриканілом і ритодріном, дозволило встановити, що за утеролітичною активністю препарат всього лише в 2 рази поступається партусистену, але в 70 разів переважає бриканіл, у 22,3 рази орципреналіну сульфат і в 15,4 рази ритодрін, що свідчить про його високу специфічну дію.

Наступні дослідження in vivo дії найбільш активних токолітиків - венттоколу і партусистену на спонтанну скорочувальну діяльність матки вагітних щурів показали, що за токолітичною активністю венттокол (ED₅₀ - 28,8 мкг/кг) поступається партусистену (ED₅₀ - 3,9 мкг/кг), але переважає його за тривалістю ефекту та за показником терапевтичного індексу в 1,5 рази.

Враховуючи, що в регуляції скорочувальної активності матки як при термінових, так і передчасних пологах, серед чисельних гуморальних факторів основна роль належить ендогенному окситоцину (Дуда И., 1989), важливо було вивчити дію савентолу, венттоколу і партусистену на фоні окситоцинової гіперстимуляції міометрію вагітних тварин. Доведено, що токолітична дія препаратів при введенні в дозах, що відповідають ED₅₀, була більш виражена в умовах модельної патології порушень скорочувальної діяльності матки, ніж при дії на спонтанні маткові контракції. Цей ефект лежить в одній площині з даними, отриманими В.В.Абрамченко і співавт. (1991) в дослідах in vitro та in vivo з партусистеном, Е.В.Омельянюк і співавт. (1983) в дослідах in vitro з бриканілом.

Одержаним результатам важко дати єдине трактування внаслідок недостатніх знань про особливості молекулярного механізму дії білково-пептидного гормону - окситоцину та відсутності відомостей про будь-який вплив його на аденілатциклазну систему такої ефекторної клітини, як міоцит. На нашу думку, пояснення слід шукати в складному впливові _адренорецепторного інгібуючого механізму (b_АРІМ) на міометрій. Можна припустити, що при одноразовому введенні утеротоніка, здатного підсилювати скорочення матки, але далеко не достатнього для розв'язання передчасної пологової активності, компенсаторно підвищується вміст гуморальних компонентів цього механізму - ендогенного b_адреноміметика (ЕБМ) і сенсибілізатора b_адренорецепторів (ЕСБАР). Мабуть, це і є той фактор, що зумовлює в даних умовах підвищену чутливість b_адренорецепторів не тільки до ендогенних, але й до екзогенних b_агоністів, що в свою чергу призводить до підсилення релаксації гладеньких м'язів матки, реалізовану в більш вираженому токолітичному ефекті.

В зв'язку з вище наведеним було цікавим вивчити вплив венттоколу на тривалість перебігу не тільки фізіологічної вагітності у щурів, але і визначити ефективність використання його при порушенні скорочувальної діяльності матки, викликаної передчасними пологами.

Показано, що венттокол у дозах 2,5 ED₅₀ і 2,0 ED₅₀ (70 і 58 мкг/кг) збільшує строк вагітності у щурів в порівнянні з контрольною групою тварин відповідно на 0,91 і 0,81 доби (р<0,01), тривалість гестації при цьому залишалась в межах фізіологічної норми і термінові пологи закінчувались народженням життєздатних щуренят.

Відомо, що серед передбачуваних пускових механізмів, які викликають початок передчасної пологової діяльності, поряд зі зміщенням естроген-прогестогенного балансу в бік підвищення синтезу естрогенів, має місце збільшення числа рецепторів окситоцину та його вивільнення, підвищення продукування простагландинів і зменшення інгібіторів їх біосинтезу. Врешті решт це призводить до збільшення вмісту в міометрії простагландинів - найсильніших стимуляторів скорочувальної активності матки (Виктор В.Х.Ю., Вуд Э.К., 1991, В.В.Абрамченко, 1994).

В умовах відтворення передчасних пологів у щурів окситоцином і естрадіолом венттокол сприяє пролонгації вагітності без ознак її переношування. При використанні окситоцинової моделі недоношування препарат у дозах 2,5 ED₅₀ і 3,0 ED₅₀ (70 і 86 мкг/кг) подовжує у тварин строки вагітності на 1,22 і 2,1 доби (р<0,01) в порівнянні з контрольною групою, а при індукції передчасних пологів естрадіолом - на 1,85 і 2,33 доби (р<0,001). У всіх випадках вагітність закінчувалась народженням живих плодів на відміну від контролю, де мала місце загибель щуренят. Венттокол в силу своєї високої токолітичної активності значно знижує не тільки силу маткових скорочень, але і тонічне напруження матки, що сприяє поліпшенню матково-плацентарного кровообігу, покращує оксигенацію плодів, внаслідок чого спостерігається сприятливе завершення пологів.

Особлива увага в роботі приділялась вирішенню завдання, пов'язаного зі з'ясуванням питання про вплив венттоколу на функціональний стан серцево-судинної та дихальної системи вагітних самок щурів і їх плодів. Підставою для цього стали дані літератури, згідно яких висока токолітична дія b₂_адреноміметиків супряжена з появою небажаних кардіоваскулярних ефектів, що пов'язані зі стимуляцією екстрагенітальних b₁-адренорецепторів і можуть викликати тахікардію у матері та плоду (В.В.Абрамченко с соавт., 1991; M.Packer, 1990).

В окремій серії досліджень показано, що внутрішньовенне введення щурам венттоколу на 20-21 день гестації в дозах 28,8 мкг/кг і 100 мкг/кг не виявляє негативної дії на серцево-судинну та дихальну системи материнського організму (табл. 4). Нами не встановлено збільшення частоти серцевих скорочень й порушення серцевого ритму, реакція артеріального тиску була односпрямованою і виражалась нормотензією. Показники, які характеризують функцію дихання, не змінювались на протязі всього періоду спостереження.

При вивченні впливу венттоколу на показники серцево-судинної системи плодів спостерігається двофазна реакція зміни частоти серцевих скорочень. Препарат у дозі 28,8 мкг/кг викликає на протязі 10 хвилин брадикардію з наступною тенденцією до зростання ритму серця (див. табл. 4). Після введення венттоколу в дозі 100 мкг/кг спочатку відмічалось статистично значиме зниження частоти серцевих скорочень, потім реєструвалась нормалізація серцевого ритму та подальше його збільшення до кінця експерименту. Однак, показники діяльності серця не виходили за межі коливань фізіологічної норми і тахікардичну реакцію можна розцінювати як фізіологічну.

Таблиця 4. Зміна показників функціонального стану дихальної та серцево-судинної системи (%) у вагітних щурів і їх плодів при введенні венттоколу в дозі 0,028 мг/кг і 0,1 мг/кг

Одночасна гістерографія дозволила простежити зміни параметрів скорочувальної діяльності матки та їх кореляцію з динамікою частоти серцевих скорочень у плодів. Максимальна депресія тонічного та ритмічного компонентів скорочення міометрію відмічалась в перші 10 хвилин від моменту введення препарату і пов'язана, очевидно, з тим, що в цей період відбуваються різкі зміни матково-плацентарного кровообігу. Спостерігаємі коливання з боку частотних показників діяльності серця плодів, на нашу думку, слід вважати як зворотну реакцію організму плоду на зміну транспортно-трофічної функції, яка настає у зв'язку з трансформацією регіональної гемоциркуляції при зниженні тонусу матки.

Відсутність у венттоколу вираженого впливу на серцево-судинну систему вагітних самок і їх плодів, напевне, зумовлено високою селективністю сальбутамолу. На користь такого припущення вказують дані Ю.Б.Білоусова (1996) про те, що для b₂_адреноміметика сальбутамолу характерна низька спорідненість до b₁_адренорецепторів (сальбутамол < фенотерол < ізопреналін), а в терапевтичних дозах його вплив на частоту серцевих скорочень не відрізняється від дії плацебо.

Однією з ключових ланок патогенезу дострокового переривання вагітності є активація процесів ПОЛ (Е.Т.Михайленко і співавт., 1991; В.В.Абрамченко і співавт., 1995). В зв'язку з цим, до числа позитивних фармакологічних властивостей венттоколу слід віднести наявність у нього вираженої антиоксидантної дії (Г.В.Зайченко, 1997). За даними цього дослідника, поєднання утеролітичних властивостей препарату та його здатність зменшувати підвищення ПОЛ, визначає високу токолітичну активність венттоколу, а відсутність роз'єднуючої дії на процеси окислення та фосфорилювання мітохондрій - низьку токсичність.

Таким чином, встановлена одна з найважливіших сторін фармакодинаміки венттоколу, яка значно відрізняє його від відомих утеролітиків, таких як інгібітори синтезу простагландинів (В.В.Абрамченко, 1994).

Раціональне використання лікарських засобів в терапії недоношування вагітності неможливо без глибокого розуміння механізмів їх дії. Дослідження по вивченню окремих сторін механізму токолітичної дії венттоколу проводились на підставі порівнювальної оцінки взаємодії його з різними агоністами скорочувальної діяльності матки, а також включали встановлення виду антагонізму, який при цьому виникає.

В дослідах in vitro та in vivo вивчено взаємодію венттоколу з різними фармакологічними індикаторами, які вибірково збуджують М_холінорецептори, a_адренорецептори, гістамінові, окситоцинові, простагландинові рецептори матки, що сприяють розвитку кальцієвої та калієвої контрактур, а також блокатором b_адренорецепторів - анаприліном. Встановлено, що в концентраціях 5ґ10^_8-5ґ10^_7 М препарат пригнічує скорочувальну активність матки, викликану введенням ацетилхоліну, адреналіну, гістаміну, а в концентраціях 5ґ10^_6 М і 2,8ґ10^_8 М зменшує маткові контракції, викликані окситоцином і простагландином F_2a. В концентрації 2,810^-8 М ефект послаблення міометрію проявляється також на фоні попереднього введення гіперкальцієвих і гіперкалієвих розчинів. Всі агоністи маткових скорочень майже повністю звертають утеродепримуючу дію венттоколу (2,8ґ10^_8 М).

При вивченні характеру взаємодії між венттоколом і b_адреноблокатором анаприліном показано, що препарат в концентрації 2,8ґ10^_8 М незначно зменшує стимулюючий ефект анаприліну. Анаприлін, в свою чергу, не звертає утероінгібуючої дії венттоколу. Отримані результати підтвердились в дослідах in vivo. Відсутність явно вираженого антагонізму з анаприліном вказує на те, що при дії венттоколу відбувається стимуляція гальмівних b₂_адренорецепторів матки.

Останнє доведено в дослідах по вивченню характеру антагонізму між венттоколом, відомим b₂_адреноміметиком партусистеном і передбаченим конкурентним антагоністом - анаприліном. В присутності анаприліну ступінь зрушення кривих lg "концентрація-ефект" для обох агоністів була однаковою і суворо пропорціональною збільшенню концентрації анаприліну (рис. 1). Величини констант дисоціації для анаприліну як конкурентного антагоністу до венттоколу та партусистену збігаються (Кд - 1,550,11 і Кд - 1,49±0,09 відповідно).

Таким чином, після проведеного фармакологічного аналізу рецепторного механізму дії венттоколу встановлено, що токолітичний ефект його реалізується шляхом стимуляції гальмівних b₂_адренорецепторів матки. Відсутність антагонізму між утеродепримуючою дією венттоколу та утеростимулюючою дією анаприліну свідчить про те, що в основі такої взаємодії лежить конкурентний антагонізм. Взаємодія венттоколу з іншими агоністами скорочувальної діяльності матки носить неконкурентний характер і, напевне, не є основним в його механізмі дії.

Для встановлення інших механізмів токолітичної дії венттоколу вивчали вплив препарату на процеси транспорту Са²⁺ в клітинах міометрію. В серії дослідів по з'ясуванню впливу венттоколу на пасивний транспорт Са²⁺, проведених на препаратах везикул, сформованих з сарколеми міоцитів, показано, що венттокол і партусистен в концентрації 30 мкг/л викликають зміни кінетичних констант, які спрямовані на зниження його внутрішньоклітинної концентрації. K_m для субстрату переносу в порівнянні з контролем перевищує на 125% (венттокол) і 116% (партусистен), що вказує на зменшення спорідненості кальцієвих каналів із Са²⁺. Отримані теоретичні значення максимальної швидкості (V_max) пасивного транспорту Са²⁺ всередину везикул довели, що вивчаємі препарати сприяють незначному збільшенню V_max (на 28% - венттокол і 20% - партусистен) і свідчать про пониження швидкості пасивного надходження Са²⁺ в цитоплазму клітини міометрію під їх дією.

При вивченні впливу активного транспорту кальцію всередину везикул приймалось до уваги, що енергозалежний транспорт Са²⁺ відбувається за участю Са²⁺-Mg²⁺_АТФази і супроводжується гідролізом АТФ (М.Д.Курский с соавт., 1987). Така реакція є двохсубстратною, що викликало необхідність визначення кінетичних констант для Са²⁺ і АТФ.

В результаті проведеного аналізу відповідних К_m для Са²⁺ і АТФ встановлено, що партусистен при фізіологічних величинах значень внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺ незначно впливає на кінетичні характеристики активного транспорту Са²⁺ крізь плазмолему клітин міометрію. Його результуюча дія на процес активного транспорту може змінюватись лише внаслідок різноспрямованих змін цитоплазматичної концентрації Са²⁺ і АТФ. Венттокол теж незначно інгібує Са²⁺-Mg²⁺_АТФазу в порівнянні з контролем, а також з партусистеном.

Таким чином, аналізуючи кінетичні параметри активного транспорту Са²⁺, ми зіткнулись з феноменом "ножиць". Обидва досліджуваних препарати підвищують спорідненість кальцію до Са²⁺-Mg²⁺_АТФази, що повинно було б активізувати процес його викиду. Однак, розрахована при цьому швидкість активного транспорту Са²⁺ була менше контрольних величин (венттокол - 43 нмоль/пробу, партусистен - 47 нмоль/пробу, контроль - 52 нмоль/пробу). Такі різноспрямовані зміни кінетичних характеристик активного транспорту Са²⁺ не можуть відігравати ключову роль в процесі релаксації міометрію під впливом вивчаємих токолітиків.

Аналіз кінетичних сумарних констант для процесів активного та пасивного транспорту Са²⁺ крізь плазматичну мембрану клітин міометрію дозволяє стверджувати, що в порівнянні з контролем, дії венттоколу і партусистену односпрямовані. Це може призводити до пониження внутрішньоклітинної концентрації кальцію, що, напевно, пов'язане зі збудженням ₂_адренорецепторів і послідуючим розвитком токолітичного ефекту.

Вивчення фармакокінетики ³Н_савентолу сприяло поясненню деяких особливостей фармакодинаміки вивчаємого препарату й більш обгрунтованому прогнозу перспектив застосування його в клінічній практиці.

Фармакокінетику ³Н_савентолу розглядали в рамках двочастинної моделі. При внутрішньовенному введенні в дозах 0,028 мг/100 г і 2 мг/100 г маси вагітних щурів він швидко проникає крізь гістогематичний бар'єр і розподіляється в органах. Кінетичні криві (рис. 2) незалежно від дози мають двофазний характер: a_фаза характеризується швидким і значним перерозподілом ³Н_савентолу в тканини та органи з системного кровообігу. Так, через 0,1 години виявляється максимальна концентрація його в сироватці крові 44 мкг/мл (0,28 мг/100 г) і 68 мкг/мл (2 мг/100 г), чим пояснюється швидкий розвиток токолітичного ефекту на перших хвилинах після введення. Через 40 хвилин вміст ³Н_савентолу знижується в 2-2,3 рази. Повільна елімінація препарату з організму відповідає b_фазі.

Показано, що кінетика ³Н_савентолу в сироватці крові має дозозалежний характер. Це підтверджено аналізом напівлогарифмічних кривих нормованих до дози (рис. 3) та основних модельно-незалежних параметрів, а саме, залежності AUC від С₀ (табл. 5). Кінетичні криві, нормовані до доз lgC/D від Т, суттєво відрізняються одна від одної, а площа під кривою "концентрація-час" (AUC) із збільшенням дози в 7 раз (2 мг/100 г) збільшується лише у 1,86 рази.

При вивченні кінетичних кривих ³Н_савентолу встановлено переважний розподіл його в тканинах печінки та нирок. На відміну від аналогічних кривих для ³Н_савентолу в крові вони характеризуються наявністю точок екстремуму, що свідчить про швидкий перерозподіл його із системного кровообігу до печінки. Квазістаціонарний стан (К_tр) для дози 0,28 мг/100 г через 3 години складає 4,2. Значення коефіцієнту розподілу тканина/кров (К_р<1) в перші 0,25 години після введення ³Н_савентолу свідчить про те, що находження препарату в печінці зумовлено за рахунок вмісту його в крові. Наступне збільшення даного показника (К_р>1) дозволяє думати про проникнення ³Н_савентолу в структурні елементи гепатоцитів, що, можливо, пов'язано з наявністю в них великої кількості ₂_адренорецепторів.

Таблиця 5. Модельно-незалежні фармакокінетичні параметри ³Н_савентолу в сироватці крові, печінці, нирках при внутрішньовенному введенні вагітним щурам

Час утримання ³Н_савентолу в печінці (MRT) перевищує відповідні показники для крові, при цьому коефіцієнт елімінації (K_еl) дорівнює 3,38 1/год і 0,23 1/год при різних дозах введення проти (1,904 1/год і 0,346 1/год) в крові (див. табл. 5). Отримані дані дозволяють стверджувати, що в загальному процесі елімінації ³Н_савентолу з організму щурів важлива роль надається здатності його метаболізувати в печінці.

Оцінюючи характер кінетичних кривих для ³Н_савентолу в нирках, відмічено дуже швидке накопичення його в тест-тканині з вираженим максимумом концентрації 220 мкг/г за 0,25 години при введенні дози 2 мг/100 г і з більш розмитим максимумом концентрації в проміжку 0,5-2 години, характерним для дози 0,28 мг/кг. K_tp складає відповідно 3,72 і 3,12, що свідчить про знаходження препарату в тканині нирок у стані рівноваги (див. табл. 5). Розраховані модельно-незалежні параметри ³Н_савентолу в нирках дозволяють говорити про швидку ниркову екскрецію препарату. Вказане підтверджується даними коефіцієнту розподілення нирки/кров. Максимальне насичення тканини нирок ³Н_савентолом спостерігається до 0,5 год (К_р - 4,22), а наступне далі зниження до К_р - 1,84 пов'язане із виведенням його з організму. Резюмуючи вищесказане можна заключити, що поряд з процесом біотрансформації відмічено значний в...