Отримання біологічних компонентів та конструювання високоінформативної тест-системи для діагностики віл-інфекції

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Отримання біологічних компонентів та конструювання високоінформативної тест-системи для діагностики віл-інфекції

03.00.06 - Вірусологія

Раєвська Галина Євгенівна

УДК 57.083.3: 578.828.6: 616.98

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в науково-виробничому підприємстві "Діапроф Мед" та в Інституті мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, Співак Микола Якович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Швед Анатолій Давидович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної вірусології;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник, Рибалко Світлана Леонтіївна, Інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім. Л. В. Громашевського АМН України, головний науковий співробітник відділу загальної вірусології.

Провідна установа: Національний Медичний Університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться “18” квітня 2001 року о 1200 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154, Інститут мікробіології і вірусології НАН України, зал засідань).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України.

Автореферат розісланий “ 17 ” березня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, канд. біол. Наук Л.М.Пуріш

Анотація

біологічний снід антиген імуноферментний

Раєвська Галина Євгенівна. Отримання біологічних компонентів та конструювання високоінформативної тест-системи для діагностики ВІЛ-інфекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Інститут мікробіолгії і вірусології НАН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена розробці науково-методичних основ отримання біологічних компонентів та конструювання на їх основі високоінформативної імуноферментної тест-системи для діагностики ВІЛ-інфекції.

Антигенами в дослідженнях були рекомбінантні білки ВІЛ-1: Env-1, Gag-1, Gag120 та ВІЛ-2: Env-2. На основі імуноферментних кон'югатів (проти імуноглобулінів людини) поліклональних антитіл з пероксидазою хрону (ПХ) та з біотином, аффінноочищених антивидових імуноглобулінів з ПХ, рекомбінантного білку А S. aureus та стрептавідину з ПХ, моноклональних антитіл проти IgG людини з ПХ було сконструйовано імуноферментні системи другого покоління.

Вперше були отримані стабільні препарати пероксидазних кон'югатів з рекомбінантними антигенами ВІЛ-1 та ВІЛ-2 та сконструйовано на їх основі імуноферментну тест-систему третього покоління для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл.

Порівняльний аналіз розроблених ТІФА систем другого та третього поколінь на зразках крові ВІЛ-інфікованих громадян Украіни, стандартних панелях анти-ВІЛ1/2 позитивних та негативних сироваток та на масиві ВІЛ-1/2 негативних зразків показав, що найбільш високою чутливістю та специфічністю характеризувалась імуноферментна система третього покоління з використанням пероксидазних кон'югатів рекомбінантних антигенів ВІЛ. На основі цього варіанту розроблено тест-набір - ІФА-ВІЛ1/2-III, детально проаналізовано його показники інформативності (чутливість, специфічність) та стабільність.

Тест-набір ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ впроваджено в виробництво на підприємстві "Діапроф Мед" та введено в практику охорони здоровўя не лише в Україні, а і у Росії, Ізраілі та Республіці Білорусь.

Ключові слова: ВІЛ, СНІД, діагностика, твердофазний імуноферментний аналіз, антитіло.

Раевская Галина Евгеньевна. Получение биологических компонентнов и коструирование высокоинформативной тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена разработке научно-методических основ получения биологических компонентов и конструированию на их основе высокоинформативной иммуноферментной тест-системы для диагностики ВИЧ-инфекции.

Антигенами в наших исследованиях были рекомбинантные белки оболочечного антигена ВИЧ-1 и ВИЧ-2 - Еnv1 и Еnv2, соответственно, а также корового антигена - Gag и слитного антигена Gag120 ВИЧ-1. Все рекомбинантные белки-антигены были получены из трансформированных соответствующими плазмидами штаммов E.coli по оригинальной методике. На основе этих рекомбинантных антигенов, антивидовых конъюгатов против иммуноглобулинов человека классов G и M (поликлональные кроличьи имуноглобулины против IgG и IgM человека меченные пероксидазой хрена (ПХ) и конъюгированные с биотином), пероксидазных конъюгатов рекомбинантных белков ВИЧ и стрептавидина с ПХ мы сконструировали следующие экспериментальные ТИФА системы:

1. Иммуноферментная система второго поколения с использованием антивидовых поликлональных антител, меченных пероксидазой хрена.

2. Иммуноферментная система второго поколения с использованием антивидовых поликлональных антител, меченных биотином, и конъюгата стрептавидина с пероксидазой.

3. Иммуноферментная система третьего поколения, где в качестве меченого соединения использовали конъюгат рекомбинантных белков с пероксидазой хрена.

По результатам сравнительного анализа специфичности и чувствительности разработанных иммуноферментных систем на сыворотках крови ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров наименьшей чувствительностью и специфичностью обладала иммуноферментная система с антивидовым пероксидазным конъюгатом: чувствительность и специфичность ее составляла 74,5 % и 92 %, соответственно. Введение биотин-стрептавидинового комплекса обеспечивало повышение чувствительности метода до 92,3 процентов, специфичность же была не выше, чем при работе с антивидовым пероксидазным конъюгатом. В ТИФА третьего поколения количество ложноположительных результатов снизилось до 3 %. В то же время чувствительность системы в наших предварительных опытах была ниже тест-системы второго поколения с стрептавидин-биотиновым усилением и не превышала 90 %.

Усовершенствование тест-системы третьего поколения мы проводили в направлении оптимизации синтеза конъюгатов на основе рекомбинантных белков, подбора оптимальных соотношений составляющих компонентов и условий проведения иммуноферментного анализа. Сравнительный анализ сорбционных способностей планшетов разных фирм-производителей позволил нам выбрать твердую фазу наиболее приемлемую для проведения ТИФА и подобрать оптимальтное соотношение и комбинацию рекомбинантных антигенов env1, env2, gag1 и gag120. Для достижения максимальных показателей чувствительности и специфичности мы проводили исследования по проведению ТИФА в несколько этапов или одномоментно, определяли оптимальное время инкубации образцов и конъюгата, которое составило 90 минут. Для снятия неспецифических реакций был подобран оптимальный состав раствора для разведения конъюгата - количество сухого молока, белков лизата E. coli и наличие детергентов. С использованием иммуноферментных конъюгатов рекомбинантного белка А S. aureus, моноклональных антител против IgG человека с ПХ были сконструированы системы второго поколения.

Сравнительный анализ совершенствованных ТИФА систем второго и третьего поколений на образцах крови ВИЧ-инфицированных граждан Украины, стандартных панелях анти-ВИЧ1/2 положительных и отрицательных сывороток и на массиве ВИЧ-1/2 отрицательных образцов показал, что наиболее высокой чувствительностью и специфичностью характеризовалась иммуноферментная система третьего поколения с использованием пероксидазных конъюгатов рекомбинантных антигенов ВИЧ. На основе этого варианта разработан тест-набор - ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ, детально проанализированы его показатели информативности (чувствительность, специфичность) и стабильность. Чувствительность тест-системы ІФА-ВІЛ1/2-III на использованных стандартных панелях анти-ВИЧ1/2 положительных сывороток составила 100 %, специфичность была 99,5 % при тестированнии 589665 анти-ВИЧ1/2 отрицательных образцов. Приведенные показатели информативности были стабильными на протяжении 10 месяцев наблюдения за производственными сериями тест-систем. Тест-набор ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ внедрен в производство на предприятии "Диапроф Мед" и введен в практику здравоохранения не только в Украине, но и в России, Израиле и Республике Беларусь.

Ключевые слова: ВИЧ, СПИД, диагностика, твердофазный иммуноферментный анализ, антитело.

Rayevska Galina Yevgenivna. Obtaining biocomponents and elaboration of the high sensitive and specific ELISA test-system for the diagnostics of HIV-infection. - Manuskript.

Thesis for the candidate's degree by speciality 03.00.06 - virology. - Institute of Microbilogy & Virology , National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The work is devoted to elaborating of methodological approaches of obtaining biocomponents and developing of the high sensitive and specific ELISA test-system for the detection of HIV-specific antibodies.

The HIV-specific recombinant proteins Env-1, Gag-1, Gag120 (of HIV-1) and Env-2 (of HIV-2) were used as antigens. The second generation ELISA test-systems were designed using next anti-human immunoenzyme conjugates: polyclonal antibodies with horse-radish peroxidaze (HRP), policlonal antibodies-biotin, affinity purifid antibodies-HRP, recombinant A protein of S. aureus-HRP, streptavidin-HRP, and monoclonal antibodies-HRP.

The stable HRP conjugates HIV-specific recombinant proteins were obtained first and the third generation of ELISA test-system for the detection of HIV-specific antibodies was designed.

The comparetive evaluation of designed second and third generation immunoenzyme test-system using HIV-positive specimens, anti-HIV1/2 standard panels, standard panels of negative sera and range of negative sera have been shown the highest sensitivity and specificity of the third generation test-system with HIV-specific recombinant protein-HRP conjugates. The ELISA test-kit “ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ” was elaborated based on this third generation ELISA and the sensitivity, specificity and stability of this kit were evaluated.

The ELISA test-kit “ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ” was applied in industry at the Scientific-Productive Enterprise “Diaproph-Med” and licensed for clinical laboratory practice in Ukraine, Israel and Republic of Belorussia.

Key words: HIV, AIDS, diagnostics, ELISA, antibody.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. ВІЛ/СНІД - інфекційне захворювання, що за короткий час поширилось практично по всьому світу. Досить швидко дослідникам вдалось виявити етіологічний агент захворювання - вірус імунодефіциту людини (ВІЛ) та встановити основні шляхи його поширення. Вірус було відкрито в 1983 році і ідентифіковано як Т-лімфотропний ретровірус, пізніше подібний вірус було виділено і від хворих на СНІД та переіменовано в ВІЛ [Gallo et al., 1983]. Вірус являє собою РНК-геномний агент з нуклеокапсидом, що оточений ліпопротеїновою оболонкою, в якій присутні два глікопротеїни - gp120 та gp41. Вірус містить дві молекули РНК та зворотню транскриптазу [Еремин, 1996]. Геном вірусу складається з двох ідентичних одноланцюгових РНК яка містить 3 групи структурних генів: gag, що кодує груповий антиген, pol, який кодує фермент РНКполімеразу, env, що відповідає за синтез оболонкового глікопротеїду, та три групи регуляторних генів [Покровский, 1996 ].

Складна епідемічна ситуація в світі щодо інфекції, спричиненої вірусом імунодефіциту людини, перетворилася на пандемію, яка охоплює все нові країни. На початок 2000 року, згідно даних ВООЗ, чисельність ВІЛ-інфікованих в світі становила 36 млн. Проблема поширення СНІДу не обійшла і Україну, що на сьогоднішній день є найбільш ураженою територією серед країн Східної Европи. За станом на 01.07.2000 в Україні було зареєстровано 33627 ВІЛ-інфікованих осіб та 58586 виявлено по сероепідеміологічному моніторингу [Щербинская и др. 2000].

ВІЛ-інфекція поки що не контролюється засобами специфічної імунопрофілактики, тож спрямованість основних заходів, що сприяють обмеженню розповсюдження цієї інфекції має бути зорієнтована на запобігання зараження вірусом. Це може бути забезпечено завдяки добре налагодженій системі епідемічного нагляду, що неможливо без застосування сучасних методів лабораторної діагностики, які є невід'ємною частиною епіднагляду.

Метод твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА) для діагностики ВІЛ-інфекції вперше був застосований у 1984 році. Принцип методу полягає в тому, що специфічні антитіла з досліджуваної сироватки зв'язуються з антигеном, сорбованим на твердій фазі, і виявляються в подальшому вторинними антитілами, міченими ферментом. В перших поколіннях тест-систем ТІФА в якості антигену використовували лізати очищеного вірусу імунодефіциту людини. В імуноферментних системах другого покоління застосовували рекомбінантні білки та синтетичні пептиди; вторинними антитілами являлись антитіла (проти імуноглобулінів людини), мічені ферментом. Однак, в такому варіанті тест-системи, як правило, не здатні виявляти імуноглобуліни класів М та А - в більшості тест-систем використовується кон'югат проти IgG людини. При цьому не враховується можлива наявність специфічних IgM, що з'являються першими на початку вірусемії та зберігаються протягом кількох місяців. Таким чином, збільшується період "сероконверсійного вікна" (початкова стадія інфікування перед появою антитіл в крові). В системах третього покоління застосовують кон'югат рекомбінантних білків або синтетичних пептидів з ферментом, що дає можливість виявляти специфічні імуноглобуліни незалежно від їх приналежності до певних класів G, M чи A і, таким чином, зменшити період "сероконверсійного вікна" до 20-28 днів [Constantine, 1994]. ТІФА четвертого покоління базується на принципі одночасного виявлення специфічних антитіл та антигену в сироватці крові. Такий аналіз дозволяє виявляти ВІЛ-інфекцію на 4-5 днів раніше ТІФА третього покоління [Weber et al., 1998], однак цей новий тест поки що знаходиться в стадії експериментальних досліджень.

Саме метод імуноферментного аналізу є найбільш поширеним тестом, що застосовується для скринінгу крові на наявність ВІЛ-інфекції. Однак застосування ТІФА систем в нашій країні повўязано з деякими труднощами, бо в більшості це системи закордонного виробництва, а наявність їх на світовому ринку не вирішує повністю проблеми для нашої країни через економічні чинники. Тому питання про розробку та виробництво вітчизняних високочутливих та високоспецифічних тест-систем для діагностики ВІЛ-інфекції беззаперечно стоїть на порядку денному і має бути нагально вирішене в Україні. Саме створенню таких ТІФА тест-систем присвячено дану роботу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно із тематикою програми "Імунопрофілактика населення України 1993-2000 р.р." (Постанова Кабінету міністрів України № 088 від 1.IV.93).

Обраний напрямок дослідженння здійснювався відповідно до плану науково-дослідних розробок підприємства “Діапроф Мед” щодо створення імуноферментних тест-систем третього покоління для діагностики інфекційних захворювань.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було отримання біологічних компонентів та конструювання на їх основі високочутливої та високоспецифічної тест-системи для діагностики ВІЛ-інфекції методом імуноферментного аналізу.

Для реалізації вказаної мети вирішувались такі завдання:

1. Одержати біологічні компоненти, дослідити їх імунохімічні властивості та сконструювати на їх основі ТІФА системи другого та третього поколінь.

2. Провести порівняльний аналіз показників інформативності сконструйованих імуноферментних тест-систем для діагностики ВІЛ-інфекції.

3. Вдосконалити імуноферментну систему третього покоління для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл та порівняти показники інформативності з ТІФА другого покоління на основі високоспецифічних антивидових конўюгатів.

4. Проаналізувати показники інформативності (чутливості, специфічності) та стабільності імуноферментної тест-системи ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ.

5. Для конструювання ТІФА систем четвертого покоління отримати високоаффінні антитіла проти корового антигену ВІЛ-1 - р24, вивчити їх імунохімічні властивості, з подальшим конструюванням на їх основі імуноферментної системи для виявленння антигену р24.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено умови отримання стабільних пероксидазних конўюгатів з оригінальними рекомбінантними антигенами ВІЛ-1 та ВІЛ-2 та сконструйовано на їх основі високоінформативну імуноферментну систему третього поколінння для виявленння ВІЛ-специфічних антитіл, проаналізовано чутливість та специфічність даного діагностичного набору, що за цими показниками не поступається світовим аналогам ТІФА систем третього поколінння.

Результати даної роботи заклали науково-методичні основи для розробки високоінформативних тест-систем третього покоління з використаннням пероксидазних конўюгатів рекомбінантних антигенів для діагностики ряду інфекційних захворювань.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методи отримання стабільних пероксидазних конўюгатів з рекомбінантними антигеннами ВІЛ. Визначено схему проведенння ТІФА третього поколінння, склад компонентів діагностичної системи та особливості проведенння аналізу, що дозволяє на високому методичному рівні розвўязувати діагностичні задачі, що повўязані з виявленнням антитіл проти антигенів ВІЛ-1 та ВІЛ-2.

На підставі проведених досліджень запроваджено у виробництво імуноферментну тест-систему третього покоління для діагностики ВІЛ-інфекції "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ". В 1999 році в Комітеті з питань імунобіологічних препаратів МОЗ України дана тест-система пройшла реєстрацію та отримала "сертифікат якості". В нормативно-технічній документації на тест-систему регламентовані показники чутливості та специфічності не нижче 99 %.

На сьогоднішній день тест-набір ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ для діагностики ВІЛ-інфекції зареєстровано та впроваджено в практику охорони здоровўя не лише в Україні, а і у Росії, Республіці Білорусь та Ізраілі.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, виконана автором особисто.

Очищені препарати рекомбінантних антигенів та імуноглобулінів класів G та M людини автор отримував спільно з співробітниками НВК Діапроф Мед - к.б.н.Пилипенко В.Г. та Машковським М.М..

Дослідження щодо отримання та стабілізації антивидових кон'югатів та кон'югатів рекомбінантних антигенів з пероксидазою хрону, визначення складу компонентів та умов проведення імуноферментного аналізу другого та третього поколінь, порівняльний аналіз ТІФА, конструювання імуноферментної системи ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ та дослідження показників інформативності цього тест-набору автор проводив самостійно.

Автором були отримані аффінноочищені поліклональні антитіла до рекомбінантного антигену Gag1, досліджені імунохімічні властивості полі- та моноклональних антитіл, отримані пероксидазні конўюгати з ними, сконструйовано експериментальну модель імуноферентної системи для виявленння антигену р24.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на 2-й Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, 1998 р.; на 7-й Міжнародній конференції “СПИД, рак и родственные проблемы”, Санкт-Петербург, 1999 р.; на 8-й Міжнародній конференції “СПИД, рак и родственные проблемы”, Санкт-Петербург, 2000 р.; на Установчому мікробіологічному з'їзді, Чернігів, 2000р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких - 6 статей у наукових фахових виданнях, патент на винахід та 3 тез.

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 138 сторінок машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, яка включає виклад результатів та обговорення з використанням 15 ілюстрацій та 27 таблиць, висновків, а також списку літератури, який складається з 143 публікацій.

2. Зміст роботи

2.1 Вірус імунодефіциту людини - інфекційний агент та методи діагностики ВІЛ-інфекції

Розділ складається з двох підрозділів, в яких розлянуто структурну організацію вірусу імунодефіциту людини та його вплив на імунну систему людини. Докладно проаналізовано сучасні методи лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції.

2.2 Імуноферментний аналіз, принцип та методи отримання основних компонентів

На основі аналізу та узагальнень даних літератури в розділі, що складається з чотирьох підрозділів, наведена характеристика різних модифікацій ТІФА, ферментних міток, що застовуються в ТІФА, методів отримання кон'югатів білків з ферментами та препаратів рекомбінантних антигенів.

Матеріали та методи досліджень

Антигенами в дослідженнях слугували наступні рекомбінантні білки, злиті з 5ў-фрагментом b-галактозидази:

білок оболонкового антигену ВІЛ-1 - Еnv1 (gp120 та gp41), білок оболонкового антигену ВІЛ-2 - Еnv2 (gp110 та gp38), білок корового антигену вірусу імунодефіциту людини першого типу - Gag1 (р25 та р17), рекомбінантний білок Gag-120 (р17, р25, gр120), рекомбінантний білок A S. aureus, що містить повну амінокислотну послідовність білку A S. aureus.

Чистоту та специфічність очищених препаратів рекомбінантних антигенів контролювали методами електрофорезу [Laemmli, 1970 ] та імуноблотингу [Towbin, Gordon, 1984].

Для отримання білків лізату клітин E. coli використовували штам-рецепієнт рор 2136 трансформований рекомбінантною плазмідою, що містить клонований ген 5ў-фрагменту-b-галактозидази; поліпептид, що синтезується цим штамом не виявляв реактивності з ВІЛ-специфічними антитілами.

Використовували моноклональні антитіла проти важких ланцюгів імуноглобулінів класу G та М людини виробництва Інституту імунології РАН (м. Москва). Моноклональні антитіла проти білку Gag1 на наше замовлення були отримані в Інституті біоорганічної хімії ім. М. М.Щемякіна та Ю. А. Овчиннікова РАН (м. Москва).

Дослідження проводили на сироватках крові ВІЛ-інфікованих осіб (220 зразків), отриманих з Південного філіалу Українського центру по боротьбі зі СНІДом та на сироватках клінічно здорових людей (380 зразків), отриманих зі станцій переливання крові.

В процесі проведення досліджень використовували такі стандартні панелі сироваток: стандартна панель сироваток, що містять антитіла до вірусу імунодефіциту людини в низьких концентраціях (ГИСК им. Л.О.Тарасевича, Росія); стандартна панель сироваток, негативних на антитіла до ВІЛ (ГИСК им. Л.О.Тарасевича, Росія); панелі анти-ВІЛ-1 низькотитражних сироваток № 5 - 17, виробництва лабораторії вірусних гепатитів та ВІЛ-інфекції Інституту епідеміології та інфекційних захворювань ім Л.В. Громашевського АМН України; панель сироваток від пацієнтів з діагнозом ВІЛ-інфекція на різних стадіях інфекційного процесу та здорових донорів, яка була сформована згідно з рекомендаціями ВООЗ і включала 54 нативні сироватки ВІЛ-інфікованих осіб, з них 16 - отримані від пацієнтів на стадії сероконверсії, 15 - від пацієнтів на стадії ВІЛ-носійства, 8 - від пацієнтів на стадії СНІД-АК, 7 - від пацієнтів на стадії СНІДу, 8 - від дітей, народжених ВІЛ-інфікованими матерями та 46 сироватки здорових донорів крові (Інститут епідеміології та інфекційних захворювань ім Л.В. Громашевського АМН України); референтна панель сироваток (''Labquality'', Фінляндія); анти-ВІЛ-1 сероконверсійна панель PRB931 (BBI, США); панель PRB106 анти-ВІЛ-1 низькотитражних сироваток (BBI, США).

Очищені препарати імуноглобулінів класів G та M отримували з сироватки клінічно здорового донора за описаним методом [Johnstone, Thorpe, 1982]. Розділення імуноглобулінів класів G та M проводили гель-фільтрацією на сефакрилі S300 (Pharmacia, Швеція). Чистоту та специфічність визначали методами імуноелектрофорезу [Кетти и др., 1991], електрофорезу в поліакриламідному гелі [Laemmli, 1970] та імуноферментного аналізу.

Для імунізації кролів використовували очищені препарати імуноглобулінів людини класів G та M та очищений білок Gag1. Імунну активність сироваток визначали методом подвійної імунодифузії за Оухтерлоні [Ouchterlony, 1978].

Очищення глобулінів з імунних (проти IgG та IgM людини) кролячих сироваток проводили методом афінної хроматографії на протеїнА сефарозі CL-4B (Pharmacia, Швеція) згідно інструкцій фірми-виробника.

Афінноочищені анти-IgG та анти-Gag1 поліклональні кролячі антитіла отримували з імунних сироваток кролів шляхом афінної очистки на IgG-сефарозі або Gag1-сефарозі та сефарозі з білками лізату E. coli. Попередньо CNBr-активовану сефарозу конўюгували з відповідними білками згідно інструкції фірми-виробника ("Pharmacia", Швеція).

Конўюгування антитіл та рекомбінантних антигенів з пероксидазою хрону (Sigma, США) проводили методом перйодатного окислення [Tijssen, 1985]. Для біотинілювання антивидових глобулінів використовували N-оксисукцинімідний ефір біотинкапроїлової кислоти (Sigma, США).

Концентрацію білків визначали біуретовим методом за стандартною методикою [Северин и др., 1989].

Для підрахунку граничного рівня оптичної густини в імуноферментних системах визначали середнє квадратичне відхилення s [Урбах, 1963].

Чутливість імуноферментної системи визначали за формулою: Ч=Nп /(Nп+Nнн), де Ч - чутливість системи, Nп - кількість позитивних аналізів в даній системі, Nнн - кількість хибнонегативних аналізів в даній системі [Schochetman, George 1992].

Специфічність імуноферментної системи визначали за формулою:

С=Nн/(Nн+Nнп),

де С - специфічність системи, Nн - кількість негативних аналізів в даній системі, Nнп - кількість хибнопозитивних аналізів в даній системі [Schochetman, George 1992].

Імуноферментний аналіз проводили на твердофазних носіях - полістиролових планшетах виробництва фірм Nunc (Данія), Costar (США) та Grеiner (Німеччина). Для сенсибілізації лунок планшету рекомбінантними антигенами проводили сорбцію білків у 0,05 М карбонат-бікарбонатному буфері протягом 18-20 годин при 4°С. При проведенні непрямого імуноферментного аналізу тест-систем другого покоління час інкубації з досліджуваними сироватками (розведення 1/5) становив 60 хв. при 37°С, з пероксидазним конўюгатом - 30 хв. (37°С), при конструюванні тест-систем третього покоління спочатку застосовували описану схему постановки ТІФА, а потім змінювали умови проведення імуноферментного аналізу, що описано в результатах досліджень. В конкурентному ТІФА лунки планшетів сенсибілізували очищеними імуноглобулінами класу G або М людини в концентрації 5 мкг/мл, інкубували з досліджуваними імунними сироватками, що титрувались в двократних розведеннях, починаючи з розведення 1/5, протягом 60 хв. при 37°С і з конўюгатом моноклональних анти-IgG людини з пероксидазою хрону протягом 30 хв. при 37°С. Хромогеном в наших дослідженнях був о-фенілендіамін (НВК Діапроф Мед). Значення оптичної густини (ОГ) вимірювали на багатоканальному спектрофотометрі "Multiskan MS" ("Labsystems", Фінляндія) при основній довжині хвилі 492 нм відносно 620 нм.

2.3 Одержання біологічних компонентів, дослідження їх імунохімічних властивостей та конструювання на їх основі ТІФА систем другого та третого поколінь.

На першому етапі наших досліджень ми прагнули сконструювати максимально чутливі тест-системи другого покоління для визначення ВІЛ-специфічних антитіл методом ТІФА. З цією метою отримали кілька антивидових конўюгатів проти імуноглобулінів людини класів G та M (поліклональні кролячі імуноглобуліни проти IgG та IgM людини мічені пероксидазою та конўюговані з біотином) та застосували метод біотин-стрептавідинового підсилення в ТІФА другого покоління. В процесі експериментальних досліджень на основі отриманих препаратів очищених рекомбінантних антигенів - Env1, Env2, Gag1 та Gag120, пероксидазних кон'югатів з ними та антивидовими поліклональними антитілами були сконструйовані наступні експериментальні моделі ТІФА систем:

1. імуноферментна система другого покоління з використанням антивидових (проти IgG та проти IgМ людини) кролячих поліклональних антитіл, мічених пероксидазою хрону (ПХ).

2. імуноферментна система другого покоління з використанням антивидових (проти IgG та проти IgМ людини) поліклональних антитіл, мічених біотином, та конўюгату стрептавідину з ПХ.

3. імуноферментна система третього покоління, де в якості міченої сполуки використовували конўюгати рекомбінантних білків (Env1, Env2 та Gag120) з ПХ.

Дослідження показників чутливості та специфічності сконструйованих тест-систем проводили на сироватках крові ВІЛ-інфікованих осіб - 196 зразків, та на сироватках клінічно здорових людей - 75 зразків (Таблиця1).

Результати порівняльного аналізу специфічності та чутливості експериментальних ТІФА показали (Таблиця 1), що найменшою чутливістю та специфічністю характеризувалась імуноферментна система з антивидовим пероксидазним конўюгатом: чутливість та специфічність її складала 74,5% та 92%, відповідно.

В літературі зустрічається інформація щодо підвищення чутливості імуноферментних систем при введенні біотин-стрептавідинового підсилення в 3-15 разів [Овчинников и др., 1987, Мананков и др., 1992]. Теоретично введення такого роду молекулярного підсилення повинно збільшувати номінальну кількість молекул ПХ, що припадають на одну молекулу імуноглобуліну. Введення біотин-стрептавідинового комплексу в наших дослідах забезпечувало підвищення чутливості аналізу на 18%, специфічність була не вище, ніж при роботі з антивидовим пероксидазним конўюгатом. Цей факт можна пояснити використанням в аналізі поліклональних антитіл, неспецифічне звўязування котрих може бути високим [Кетти и др., 1991, Лефковитс и др., 1981].

Таблиця 1 Порівняльна оцінка чутливості та специфічності імуноферментних систем з антивидовими кон'югатами та кон'югатами рекомбінантних білків з ПХ.

Тип ТІФА	1	2	3
Кількість тестованих ВІЛ-позитивних зразків, з них:	196	196	196
Позитивних в даній системі	146	181	175
Негативних в даній системі	50	15	21
Чутливість, %	74,5	92	89
Кількість тестованих ВІЛ-негативних зразків, з них:	75	75	75
Негативних в даній системі	69	69	73
Позитивних в даній системі	6	6	2
Специфічність, %	92	92	97,3

Примітка. Під номерами 1-3 представлено: 1 - ТІФА з антивидовим конўюгатом, 2 - ТІФА з антивидовим конўюгатом та стрептавідин-біотиновою взаємодією, 3 - ТІФА з конўюгатами рекомбінантних білків з ПХ.

Окрім того, перебіотинілювання антитіл також може призвести до високих фонових значень та підвищення кількості хибнопозитивних результатів. Одним з напрямків вдосконалення ТІФА для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл було також і конструювання ТІФА системи третього покоління з застосуванням рекомбінантних білків конўюгованих з ПХ. Проведені дослідження показали, що специфічність такої тест-системи характеризувалась низьким числом хибнопозитивних результатів (не більше 3%). В той же час чутливість системи в попередніх дослідженнях була нижче чутливості системи другого покоління з стрептавідин-біотиновим підсиленням.

Згідно представлених результатів, в подальшому зосередили увагу на вдосконаленні імуноферментної системи третього покоління, а також на отриманні конўюгатів з афінноочищеними антивидовими імуноглобулінами, моноклональними антивидовими антитілами та білком А S. aureus.

2.4 Вдосконалення імуноферментної системи третього покоління для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл та порівняння показників інформативності з ТІФА другого покоління на основі високоспецифічних антивидових кон'югатів

З метою вдосконалення імуноферментної системи другого покоління були розроблені підходи, пов'язані з введенням кон'югатів з аффінноочищеними антивидовими імуноглобулінами, моноклональними антитілами та білком А S. aureus. Отримані нами препарати аффінноочищених антитіл та білку А характеризувались специфічною активністю: в конкурентному ТІФА з імуноглобулінами класу G людини білок А інгібував зв'язування моноклональних антитіл в мінімальній концентрації 0,4 мкг/мл, а антитіла - 1,6 мкг/мл.

Вдосконалення імуноферментної системи третього покоління проводили в напрямку оптимізації синтезу кон'югатів на основі рекомбінантних білків, добору оптимальних співвідношень складових компонентів та умов проведення імуноферментного аналізу. Порівняльний аналіз сорбційних властивостей планшетів різних фірм-виробників дозволив обрати тверду фазу найбільш прийнятну для проведення ТІФА та визначити оптимальне співвідношення рекомбінантних антигенів env1, env2, gag1 та gag120. Згідно результатів, представлених у вигляді співвідношення оптичної густини до граничного значення аналізу, цей показник є найбільш високим при співвідношенні білків 5.2.5. (Таблиця 2). Найкраща комбінація антигенів env1, env2, gag1 або env1, env2, gag120 була визначена на панелі низькотитражних анти-ВІЛ1 позитивних сироваток: заміна білка gag1 на gag120 призвела до "випадіння" трьох сироваток в складі панелі.

Таблиця 2 Порівняльний аналіз сорбційних доз рекомбінантних білків в ТІФА третього покоління для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл.

анти ВІЛ-1 позитивні сироватки	Сорбційні дози рекомбінантних білків, мкг/мл
	Env1:Env2:Gag1	Env1:Env2:Gag120
	5:2:5	2,5:1:2,5	1,25:0,5:1,25	5:2:5	2,5:1:2,5	1,25:0,5:1,25
191	10,4	10,6	9,1	10,4	9,4	7,4
11326	12,9	9,1	6,4	14,8	11,4	9,2
К1	13,4	11,9	9,9	10,8	9,3	8,0
177	16,6	18,9	19,8	17,6	18,3	20,8

Примітка. Результати тестування представлені у вигляді співвідношення оптичної густини анти-ВІЛ-1 позитивних зразків до граничного значення в системі.

Були проведені дослідження двох варіантів постановки ТІФА - звичайно використовуваного двохстадійного при почерговій інкубації сироваток та конўюгату та одностадійного при одночасній інкубації сироваток з конўюгатом. Встановлено, що при проведенні одностадійного ТІФА третього покоління значення оптичної густини позитивних сироваток, так само як і співвідношення ОГ позитивних сироваток до граничного значення, є набагато вищим, ніж при постановці ТІФА в два етапи (Таблиця 3).

Таблиця 3 Порівняльний аналіз проведення ТІФА третього покоління в кілька етапів.

анти ВІЛ-1 позитивні сироватки	Одностадійний ТІФА	Двостадійний ТІФА
207740	40,4	6,9
11326	16,7	0,9
К1	11,9	0,7
210745	10,0	0,3
206273	39,1	6,8

Примітка. Результати тестування представлені у вигляді співвідношення оптичної густини анти-ВІЛ-1 позитивних зразків до граничного значення в системі.

Дані літератури свідчать, що при взаємодії біологічних компонентнів (антигену з антитілами) час, за який досягається рівноважний стан взаємодії, в значній мірі залежить від афінності антитіл по відношенню до антигену [Кетти и др., 1991]. Зважаючи на те, що в сироватках ВІЛ-інфікованих знаходяться антитіла з різною аффінністю, а при ранній сероконверсії утворюються переважно антитіла з низькою афінністю (класу М), була досліджена можливість підвищення чутливості системи при збільшенні часу інкубації сироваток з конўюгатом від 30 до 120 хвилин, з кроком в 30 хв. Оптимальний час інкубації зразків та кон'югату при проведенні ТІФА третього покоління складав 90 хв.

Для зниження неспецифічних реакцій визначали оптимальний склад розчину для розведення кон'югату щодо кількості сухого знежиреного молока (СЗМ), білків лізату E. coli та наявності детергентів. В тих випадках, коли не проводиться блокування вільних місць звўязування, в систему звичайно вводять неіонний детергент (Твін 20, Тритон Х100 та ін.), що заважає неспецифічній взаємодії між компонентами реакції [Pejsak, Lipowski, 1992]. Порівняльний аналіз неіонних детергентів в складі розчину для розведення сироваток та кон'югату показав, що додавання неіонних детергентів негативно впливає на проходження реакції, так як знижується сигнал оптичної густини позитивних сироваток та співвідношення ОГсер(+)/ОГсер(-). Тому в подальших дослідженнях використовували розчин для розведення сироваток та конўюгату без додавання детергентів.

За даними літератури, при роботі з рекомбінантними білками, які експресуються в клітинах кишкової палички, можливі такі небажані вставки в цих білках, що призводять до взаємодії білків з антитілами проти E. coli, в нормі присутніми в крові людей [Каральник и др., 1991]. Кількість таких антитіл особливо підвищується при захворюваннях, що сприяють поліклональній активації лімфоцитів. Зниження специфічності ТІФА також може бути обумовлене взаємодією антигенів E. coli, що присутні в препаратах рекомбінантних білків, з антитілами проти цих антигенів, що містяться в досліджуваних сироватках. За цієї причини в розчин для розведення сироваток додають лізат клітин E. coli. Загальновідомо, що в молоці знаходиться велике розмаїття олігосахаридів, які можуть здійснювати стабілізуючий ефект на структурну організацію білків та на міжбілкові взаємодії [Arakawa, Timasheff, 1982]. Беручи за базис ці дані, ми досліджували вплив концентрації білків лізату E. coli та вмісту сухого знежиреного молока (СЗМ) в різних концентраціях на проведення імуноферментного аналізу (Таблиця 4).

Таблиця 4 Вплив вмісту білків лізату клітин E. coli та сухого знежиреного молока у розчині для розведення сироваток та конўюгату на величину сигналу ОГ після проведення ТІФА.

Досліджувані зразки	Додавання СЗМ та лізату E. coli (КБР) до розчину для розведення сироваток та конўюгату, мг/мл
	0,5 КБР	1,0 КБР	1,5 КБР	0,5 КБР	1,0 КБР	1,5 КБР	0,5 КБР	1,0 КБР	1,5 КБР
ОГ сер.(+)	2.156	1.889	1.658	2.453	2.136	1.994	2.451	2.203	1.857
ОГ сер. (-)	0.146	0.095	0.072	0.117	0.089	0.075	0.097	0.068	0.052
ОГсер(+)/ОГсер(-)	14.76	19.88	23.03	20.97	24.00	26.6	25.27	32.40	29.95

Примітка. ОГ сер. (+) - середнє значення оптичної густини позитивних сироваток; ОГ сер. (-) - середнє значення оптичної густини негативних сироваток; ОГсер.(+)/ОГсер.(-) - співвідношення середнього значення оптичної густини позитивних сироваток до середнього значення оптичної густини негативних сироваток.

З матеріалів, що наведені в Таблиці 4, видно, що збільшення концентрації білків лізату E. coli до 1,0 мг/мл в розчині для розведення сироваток та конўюгату призводить до незначного зниження сигналу оптичної густини позитивних сироваток та зниження сигналу оптичної гутини негативних сироваток і, як наслідок, підвищенння співвідношення ОГсер.(+)/ОГсер.(-). Стосовно підвищення концентрації сухого молока в розчині, маємо сказати про те, що в Таблиці 4 наведені концентрації сухого молока, які були внесені, як наважки. Однак, у звўяку з обмеженою розчинністю знежиреного сухого молока було проведено освітлення розчинів центрифугуванням і визначення концентрації білку біуретовим методом. При цьому отримали наступні дані: при внесенні 30 мг/мл СЗМ концентрація білку в розчині складала 15,2 мг/мл, 60 мг/мл СЗМ - 28,1 мг/мл, 120 мг/мл - 31 мг/мл. Тобто збільшення СЗМ, що додавали в розчин, від 60 мг/мл до 120 мг/мл не призводило до двократного збільшення концентрації білку в розчині, однак, суттєво впливало на результати ТІФА - збільшувалось співвідношення ОГсер.(+)/ОГсер.(-). Такі результати можуть бути пояснені стабілізуючою дією олігосахаридів, що добре розчиняються у водних розчинах, на міжбілкові взаємодії. В подальших дослідженнях в складі розчину для розведення сироваток та конўюгату використовували СЗМ у концентрації 120 мг/мл та лізат клітин E. coli у концентрації 1,0 мг/мл.

Вище ми навели дані щодо вдосконалення імуноферментної тест-системи третього покоління для визначення ВІЛ-специфічних антитіл у сироватках крові людей. Були отримані також конўюгати моноклональних та аффінноочищених поліклональних анти-IgG людини імуноглобулінів та білку А S. aureus з ПХ. На основі цих конўюгатів ми сконструювали ТІФА системи другого покоління і проаналізували їх чутливість та специфічність у порівнянні з вдосконаленими ТІФА третього покоління на сироватках крові ВІЛ-інфікованих громадян України, клінічно здорових донорів та на стандартних панелях сироваток.

Результати порівняльного аналізу специфічності та чутливості сконструйованих імуноферментних систем на 196 ВІЛ-позитивних та 175 негативних сироватках показали, що найменшими показниками чутливості та специфічності характеризувались імуноферментні системи з антивидовим (поліклональні афінноочищені анти-IgG людини) пероксидазним конўюгатом та з конўюгатом рекомбінантного білку А з ПХ, їх чутливість складала 98,0 % та 99,0 %, а специфічність - 98,9 % та 97,7 %, відповідно (Таблиця 5). Більш високі показники чутливості та специфічності зафіксовані при використанні ТІФА з конўюгатом моноклональних антитіл проти IgG людини з ПХ - 99,0 % та 99,4 %, відповідно. Дані літератури свідчать про підвищення чутливості та специфічності ТІФА третього покоління в порівнянні з ТІФА другого покоління до 99 % [Kopprell, 1992, Vasudevachari, 1997]. Проведені дослідження показали, що якість розробленої нами тест-системи також характеризувалась низькою кількістю хибнопозитивних результатів (не більше 0,6 %), в той же час чутливість системи в експериментах була найвищою і складала 100,0 % (Таблиця 5).

Таблиця 5 Порівняльний анализ чутливості та специфічності ТІФА другого та третього поколінь для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл:

	Пероксидазний кон'югат*
	1	2	3	4
Кількість тестованих ВІЛ-позитивних зразків, з них:	196	196	196	196
Позитивних в даній системі	192	194	194	196
Негативних в даній системі	4	2	2	0
Чтливість, %	98	99	99	100
Кількість тестованих ВІЛ-негативних зразків, з них:	175	175	175	175
Негативних в даній системі	173	171	174	174
Позитивних в даній системі	2	4	1	1
Специфічність, %	98,9	97,7	99,4	99,4

Примітка. Під номерами 1-4 представлено: 1 - ТІФА другого покоління з кон'югатом аффінноочищених поліклональних антитіл проти імуноглобулінів G людини з ПХ; 2 - ТІФА другого покоління з кон'югатом рекомбінантного білку А S. aureus с ПХ; 3 - ТІФА другого покоління з кон'югатом моноклональних антитіл проти імуноглобулінів класу G людини з ПХ; 4 - ТІФА третього покоління з кон'югатом рекомбінантних білків ВІЛ з ПХ.

У відповідності до поставлених завдань, проводили дослідження вдосконалених ТІФА другої і третьої генерації та тест-наборів ведучих світових виробників на сероконверсійній панелі сироваток PRB931 (BBI, США). Сероконверсійна панель PRB931 являє собою набір сироваток від одного донора, отриманих в різні строки з певним інтервалом у часі від дня можливого інфікування. Такі панелі дозволяють приблизно встановити період "сероконверсійного вікна" для даного тест-набору, іншими словами - приблизний строк виявлення ВІЛ-інфекції з моменту інфікування. Для всіх варіантів порівнюваних ТІФА систем з різними конўюгатами цей період складав 28 днів. Слід відмітити що, згідно даних, наведених в паспорті на панель, наявність антигену виявляється дещо раніше - на 15-й день при визначенні вірусної РНК методом полімеразної ланцюгової реакції та на 15-28-й при визначенні антигену р24 методом ТІФА тест-наборами різних фірм-виробників. Що стосується імуноблоту, то лише на 33-й день можна підтвердити наявність ВІЛ-інфекції у даного донора цим методом.

Таблиця 6 Результати тестування зразків сироваток панелі BBI PRB-931 в ТІФА з антивидовими кон'югатами та кон'югатом рекомбінантних антигенів ВІЛ-1 та ВІЛ-2

№ зразка	термін донації	ABBOTT 3rd Gen Plus	Diagn Pasteur Genscreen	Org. Tek. Uniform II	1	2	3	4
931-01	0	0.1	0.2	0.4	0,3	0,4	0,1	0.3
931-02	2	0.2	0.7	0.3	0,4	0,5	0,2	0.4
931-03	7	0.1	0.2	0.5	0,4	0,6	0,1	0.3
931-04	9	0.1	0.1	0.4	0,3	0,5	0,1	0.3
931-05	15	0.1	0.1	0.6	0,4	0,5	0,1	0.3
931-06	28	14.3	>20.1	4.0	3,1	4,6	1,6	5.1
931-07	33	>17.0	>20.1	10.4	9,3	11,5	14,1	27.0
931-08	35	>17.0	>20.1	11.9	14,8	13,4	20,9	28.9
931-09	42	>17.0	>20.1	12.5	25,0	16,8	28,4	30.4

Примітка. Результати тестування представлені як співвідношення оптичної густини зразка до граничного значення; під номерами 1-4 вказані сконструйовані ТІФА з наступними пероксидазними кон'югатами: 1-поліклональні анти-IgG людини с ПХ, 2-рекомбінантний білок А S. aureus, 3-моноклональні анти-IgG людини з ПХ, 4-рекомбінантні білки ВІЛ з ПХ

В процесі проведення порівняльних досліджень використовували також стандартні панелі сироваток, що містять ВІЛ-позитивні та ВІЛ-негативні зразки (Таблиця 7). Панель PRB106 анти-ВІЛ-1 низькотитражних сироваток (BBI, США) представляє собою набір 14 зразків сироваток, що містять антитіла до ВІЛ-1 в низьких концентраціях та один негативний контрольний зразок. До складу цієї панелі входять дві сироватки від одного донора, отримані з інтервалом в два дні. Перший зразок від цього донору є найбільш низькореактивним в цій панелі та ідентификується не всіма перерахованими в таблиці тест-наборами. Згідно отриманих нами даних, чутливість імуноферментного аналізу з кон'югатами третього покоління з ПХ дозволяє діагностувати всі зразки низькотитражних сироваток як позитивні, при цьому відсутні були хибнопозитивні результати. Система ТІФА другого покоління з кон'югатом білку А з ПХ характеризувалась також високою чутливістю аналізу, однак більш низькою специфічністю - один хибнопозитивний результат на панелі. В той же час експериментальна модель ТІФА другого покоління з кон'югатом моноклональних антитіл мала високу специфічність - на рівні ТІФА третього покоління, однак більш низьку чутливість - дві сироватки в складі панелей не визначались цим методом. найбільш низькі показники інформативності були в ТІФА з кон'югатом аффінноочищених анти-IgG антитіл.

...