Отримання біологічних компонентів та конструювання високоінформативної тест-системи для діагностики віл-інфекції

Таблиця 7 Порівняльний аналіз пероксидазних кон'югатів в ТІФА для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл на стандартних панелях сироваток.

Примітка. * через дріб вказана кількість сироваток, позитивних в даній системі по віднношенню до загальної кількості сироваток в панелі. 1 - стандартна панель сироваток, що містять антитіла до ВІЛ-1 в низьких концентраціях (ГИСК), 2 - референтна панель сироваток: дві ВІЛ-позитивні, дві інші - ВІЛ-негативні. (''Labquality), 3 - оригінальний набір сироваток, що містять антитіла до ВІЛ-1 в низьких концентраціях, 4 - панель сироваток, що містять антитіла до ВІЛ-1 в низьких концентраціях (14 - ВІЛ-позитивних, один зразок - ВІЛ-негативний) - PRB-106 (BBI), 5 - стандартна панель сироваток, що не містять антитіл до ВІЛ (ГИСК)

В результаті проведених досліджень було показано високу чутливість та специфічність імуноферментної тест-системи з використанням конўюгатів рекомбінантних білків ВІЛ з ПХ. На основі цього варіанту ТІФА було створено та введено в виробництво імуноферментну тест-систему третього покоління "ІФА-ВІЛ 1/2-ІІІ", що в лютому 1999 року пройшла реєстрацію в Комітеті з питань імунобіологічних препаратів та отримала "сертифікат якості".

2.5 Аналіз показників інформативності (чутливості і специфічності) та стабільності імуноферментної тест-системи "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ"

Протягом шести місяців досліджували чутливість виробничих серій тест-систем "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ" на дванадцяти панелях анти-ВІЛ-1 низькотитражних сироваток, отриманих від ВІЛ-інфікованих громадян України на стадії раньої сероконверсії, а також на панелі сироваток, сформованій згідно рекомендацій ВООЗ з діагнозом ВІЛ-інфекція на різних стадіях інфекційного процесу та здорових донорів (вище в тексті ми детально охарактеризували дану панель). Панелі сироваток були сконструйовані в лабораторії вірусних гепатитів та ВІЛ-інфекцї АМН України. Згідно отриманих нами даних, всі 246 зразків від ВІЛ-інфікованих пацієнтів визначені як позитивні, та чутливість по панелям склала 100 %, сироватки здорових донорів визначені як негативні.

Для визначення специфічності аналізів тест-системи "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ" була сконструйована оригінальна панель потенційно хибнопозитивних сироваток (95 зразків) від різних контингентів людей - вагітних жінок, хворих туберкульозом, гепатитами В та С, ревматоїдним артритом, онкохворих, - що не містять антитіл до ВІЛ. При дослідженні цієї панелі було визначено лише одну хибнопозитивну сироватку від хворого гепатитом С. Специфічність тест-системи на даній панелі склала 99%.

Паралельно оцінку специфічності розробленого нами набору проводили за даними, отриманими зі станцій переливання крові, СЕС та центрів СНІД України, де за період з січня по травень 2000 року було проведено 589665 досліджень на тест-системах "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ". Специфічність тест-набору склала 99,5 %.

Окрім таких важливих показників, як чутливість та специфічність діагностичних тест-наборів, для практичного використання важливою характеристикою є стабільність результатів протягом певного строку використання тест-системи. При дослідженні стабільності показників інформативності протягом 10 місяців спостереження за промисловими серіями тест-наборів "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ" не було відмічено зниження чутливості або специфічності аналізів.

2.6 Конструювання ТІФА для виявлення корового антигену р24 вірусу імунодефіциту людини в біологічних рідинах

З метою конструювання тест-систем четвертого покоління були отримані аффінноочищені поліклональні антитіла до рекомбінантного білку Gag вірусу імунодефіциту людини, три вида моноклональних антитіл до цього білку та пероксидазні кон'югати з ними, сконструйовали експериментальну модель ТІФА для виявлення рекомбінантного антигену р24 з чутливістю - 14 нг/мл.

Висновки

1. Вперше в Україні розроблені науково-методичні основи отримання основних біологічних компонентів та конструювання високоінформативних тест-систем третього покоління.

2. На основі імуноферментних кон'югатів (проти імуноглобулінів людини) поліклональних антитіл з пероксидазою хрону та біотином, аффінноочищених антивидових імуноглобулінів з ПХ, рекомбінантного білку А S. aureus та стрептавідину з ПХ, моноклональних антитіл проти IgG людини з ПХ було сконструйовано імуноферментні системи другого покоління.

3. Вперше отримані стабільні препарати очищених пероксидазних кон'югатів з оригінальними рекомбінантними антигенами ВІЛ-1 та ВІЛ-2 та сконструйовано на їх основі високоінформативну імуноферментну тест-систему третього покоління для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл.

4. Проведено порівняльну оцінку сконструйованих ТІФА систем другого та третього поколінь на зразках крові ВІЛ-інфікованих громадян Украіни, стандартних панелях анти-ВІЛ1/2 позитивних та негативних сироваток та на масиві ВІЛ-1/2 негативних зразків. Встановлено, що найбільш високою чутливістю та специфічністю серед розроблених ТІФА систем характеризувалась імуноферментна система третього покоління з використанням пероксидазних кон'югатів рекомбінантних антигенів ВІЛ.

5. На основі ТІФА третього покоління розроблено тест-набір - ІФА-ВІЛ1/2-III, детально проаналізовано його показники інформативності (чутливість, специфічність) та стабільність. Чутливість тест-системи ІФА-ВІЛ1/2-III на застосованих стандартних панелях сироваток склала 100 %, специфічність була 99,5 % при тестуванні 589665 анти-ВІЛ1/2 негативних зразків сироваток. Наведені показники інформативності були стабільними протягом 10 місяців спостереження за промисловими серіями тест-систем. Тест-набір ІФА-ВІЛ1/2-III впроваджено в виробництво на підприємстві "Діапроф Мед".

Основний зміст роботи викладено у публікаціях

1. Раєвська Г. Є., Співак М. Я. Сучасні методи лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції // Мікробіологічний журнал. - 2000. - Т. 62, №4. - С. 56-65.

2. Раевская Г. Е., Иванская Н. В., Терещенко М. И., Пилипенко В. Г., Чумак Р. М., Спивак Н. Я.. Сравнительный анализ чувствительности и специфичности оригинальной тест-системы третьего поколения для выяления антител к вирусу иммунодефицита человека // Імунологія та Алергологія. - 2000. - №1. - С. 76-80.

3. Раєвська Г. Є., Співак М. Я., Пилипенко В. Г., Ростопіра Н. М., Ткачікова Л. Отримання пероксидазних кон'югатів для виявленння ВІЛ-специфічних антитіл методом імуноферментного аналізу // Імунологія та Алергологія. - 2000. - №2-3. - С. 39-42.

4. Раєвська Г. Є., Співак М. Я., Ростопіра Н. М. Порівняльна оцінка пероксидазних кон'югатів для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл методом імуноферментного аналізу // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. - 2000. - №7. - С. 48-49.

5. Раевская Г. Е., Иванская Н. В., Терещенко М. И., Мартыненко Д. Л., Спивак Н. Я. Использование рекомбинантных антигенов вируса иммунодефицита человека для выявления специфических антител методом иммуноферментного анализа. // Вопр. Вирусологии. - 2000. - № 5. - С. 49.

6. Rayevskaya G., Ivanskaya N. V., Pilipenko V. G., Tkachikova L., Spivak N. Ya., Chumak R. M. Elaboration of the third generation enzyme immunoassay "IEA-HIV1/2-III" for the detection of anti-HIV specific antibodies in human sera // Науковий вісник Ужгородського державного університету. Серія: Біологія - 2000. - №8. - С. 201-202.

7. Пат. 99115959 UA, МПК А61К39/21, С12N1/00. Тест-система для виявлення антитіл проти вірусу імунодефіциту людини "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ"./ Мартиненко Д.Л., Чєрєпанов П. А.(RU), Міхайлова Т. Г. (RU), Іванська Н. В., Раєвська Г. Є., Терещенко М. І., Чумак Р. М., Шевчук О. А., Спіженко Ю. П., Гураль А. Л., Троянський В. В., Пилипенко В. Г.; АОЗТ НВК "Діапроф Мед". - № 99115959; Заявлено 01.11.1999.

8. Терещенко М. И., Раевская Г. Е., Иванская Н. В., Спиженко Ю. П., Мартыненко Д. Л., Чумак Р. М. Иммуноферментная тест-система третьего поколения для скрининга ВИЧ-инфекции // Русский Журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. - 1999. - Т.3, №1. - С. 113

9. Раевская Г. Е., Мартыненко Д. Л., Чумак Р. М. Анализ чувствительности и специфичности иммуноферментной тест-системы третьего поколения - "ІФА-ВІЛ1/2-ІІІ" - для выявления антител к ВИЧ // Русский Журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы - 2000. - Т.4, №1. - С. 58

10. Раєвська Г. Є., Вергун Л. Ю. Порівняльна оцінка типу імуноферментного аналізу для виявлення ВІЛ-специфічних антитіл // Тези ІІ Міжнародної конференції "Біоресурси та віруси". - Київ (Україна). - 1998. - С. 61

Размещено на Allbest.ru