Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

Кримський республіканський науково-дослідний інститут фізичних методів лікування і медичної кліматології ім. І.М.Сєченова

На правах рукопису

ГОРЛОВ ОЛЕКСАНДР ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК:616:612.017.71:577.1:615.831.4/.6-834

АВТОРЕФЕРАТ ДИСЕРТАЦІЇ НА ЗДОБУТТЯ ВЧЕНОГО СТУПЕНЯ ДОКТОРА МЕДИЧНИХ НАУК

ІМУНО-БІОХІМІЧНІ АСПЕКТИ ЕФЕКТИВНОГО ВИКОРИСТАННЯ УЛЬТРАФІОЛЕТУ В КЛІНІЧНІЙ ПРАКТИЦІ (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛІНІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.01.33-курортологія і фізіотерапія

Ялта - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Каладзе Микола Миколайович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедрою педіатрії і фізіотерапії факультету післядипломної освіти.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Куніцина Людмила Олександрівна, Кримський республіканський НДІ фізичних методів лікування і медичної кліматології ім. І.М. Сєченова, провідний науковий співробітник відділу неврології.

- доктор медичних наук, професор Тондій Леонід Дмитрович, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедрою фізіотерапії і курортології.

- доктор медичних наук, професор Шмакова Ірина Петрівна, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувачка кафедрою фізіотерапії, медичної реабілітації і курортології, головний позаштатний фізіотерапевт МОЗ України.

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти МОЗ України ім.П.Л.Шупика, кафедра медичної реабілітації, фізіотерапії та курортології. Захист відбудеться “10” січня 2003 р. о 12.00 годин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.610.01 при Кримському республіканському НДІ фізичних методів лікування і медичної кліматології ім. І.М.Сєченова (98603, Республіка Крим, м. Ялта, вул. Полікурівська,25).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Кримського республіканського НДІ фізичних методів лікування і медичної кліматології ім. І.М.Сєченова (98603, Республіка Крим, м. Ялта, вул. Полікурівська,25).

Автореферат розісланий “10” січня 2002р.

Вчений секретар спеціалізованої ради, к. мед. н.,доцент П'янков О.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Природні ресурси України забезпечують унікальні можливості санаторно-курортного лікування, яке має важливе соціально-економічне значення (Л.Д.Тондій, 2000, Н.П.Дрінєвський і співавт., 2001). Невід'ємним елементом такого лікування є геліотерапія, що застосовується для підвищення загальної і специфічної резистентності, забезпечення якої пов'язана з корекцією метаболізму та імунного дисбалансу (М.В.Іванова, 1996, І.В.Кармазіна, 1998).

Тим часом, в умовах екологічного неблагополуччя імунологічний і гормональний дизбаланси виступають у ролі синдромів, які визначають загальний стан організму, що особливо характерно для контингенту дітей із зон радіонуклідного забруднення (О.О.Бобильова, 1996). Корекція імуно-гормонального дизбалансу є однієї з актуальних клінічних проблем сучасної курортології (М.М.Каладзе, 1994, И.В.Богадельніков і співавт., 1996).

У зв'язку з неоднозначністю клінічних ефектів геліотерапії питання про терміни кліматолікування та інтегральні дози УФО продовжує активно дискутуватися (А.М.Гофельд і співавт., 1998). Обмеження ж інсоляції для контингенту дітей із зони аварії на ЧАЕС, продиктоване особливостями імуно-гормонального статусу (Т.В.Сорокман, 1999), використовується в дитячої курортології (В.П.П'яткін і співавт., 1997), однак середній курс, що рекомендується, призначається фактично без обліку патогенетичної картини імунного реагування на УФР. Це призводить до необхідності хоча й диференційованого, але емпіричного по своїй природі підбору доз і режимів геліотерапії, найчастіше заснованих на поточному аналізі функціонального стану організму (Л.Н.Швєдунова, Ю.М.Грінзайд, 1996, Г.С.Обітоцька, 1999), та без обліку особливостей (типів) імунного реагування на УФР, які можуть визначатися генетичними (конституціональними) чинниками.

Конституційні антропометричні типи тісно пов'язані з біохімічними особливостями організму (Є.Н.Хрісанфова, 1990), генетичною детермінацією груп крові (Г.І.Вереніч, 1988), особливостями імуно-гормонального статусу (Ю.С.Сергієв, 1987). Здатність УФР індукувати диференцировку Т- і В-лімфоцитів (J.Garrsen et al.,1999), супресувати NK-клітини (K.Toda et al.,1986), викликати толерогенний ефект та апоптоз (A.Schwarz at al.,1998), змушує з усе більшою обережністю відноситися до цього фізичного фактора. Перші повідомлення про використання УФР для специфічного гальмування відторгнення трансплантату (R.L.Truit et al.,1999), лікування системних колагенозів (M.Dumas,2000) і СНІД (R.Akaraphanth, H.W.Lim,1999) формують нову систему клінічних поглядів на УФР, що дозволяють більш адекватно розцінювати причини неоднозначних метаболічних і імунологічних ефектів УФР. Генетична детермінація імунотропних ефектів УФО (M.Yamawaki et al.,1997) змушує припускати наявність більш інтегральних закономірностей УФ-реагування, що реалізуються на конституціональному рівні. Окремі повідомлення про закономірності лікувальних ефектів геліотерапії в зв'язку з показниками конституції свідчать про необхідність проведення глибокого аналізу варіацій картини метаболічних зрушень і імунних реакцій після впливу УФР та пошуку патогенетично обґрунтованих УФ-фотогенних типів імунного реагування.

У дисертації дане нове рішення наукової проблеми, науковим припущенням якої є взаємозв'язок сукупності конституціональних критеріїв з УФ-фотогенними типами імунного реагування, що визначають перевагу клітинних чи гуморальних імунних реакцій організму на УФР з урахуванням глибини базових імуно-гормональних зрушень у дітей з екологічно несприятливих регіонів і транзиторного імуносупресивного стану, індукованого ультрафіолетом у ході геліотерапії.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Робота виконувалася в рамках ініціативних тем науково-дослідної роботи каф. педіатрії і фізіотерапії ФПО Кримського держ.медуніверситету ім.С.І.Георгієвського (КДМУ) “Патогенетичне обґрунтування санаторно-курортного лікування дітей із зони радіонуклідного забруднення” (1991-1997р.р.), каф. біофізики КДМУ “Інтегровані біологічні реакції компонентів системи гемостазу, шкірних і слизових покривів людини при УФ-опроміненні” (№1.0120195U020528, 1996-2000р.р. - відповідальний виконавець), каф. медичної інформатики КДМУ “Інформаційно-біотехнічні підходи і методи модифікації, корекції і керування біологічними явищами у біосистемах” (№0100U002030, 2000-2005р.р. - відповідальний виконавець).

Ціль роботи: дати імуно-біохімічне обґрунтування раціонального використання ультрафіолетового випромінювання в умовах санаторно-курортного лікування з урахуванням типів фотогеного імунного реагування на УФ-радіацію.

Задачі роботи:

Вивчити закономірності УФ-індукованих пероксідаційних процесів у взаємозв'язку з морфо-функціональними властивостями клітин крові при УФО.

Вивчити фотомодифікаційні ефекти та УФ-фотопротекторну дію низькодозового превентивного УФО.

Вивчити процеси старіння еритроцитів у зв'язку з УФ-фотогенною пероксідацією і ефектами антиоксидантів, популяційну динаміку і імунозалежну елімінацію еритроцитів людини, та вплив на ці процеси УФ-радіації.

Вивчити вплив ультрафіолету на рівень експресії маркерів клітинної диференцировки й антигенів головного комплексу гістосумісності імуно-компетентних клітин.

Вивчити стан шкірного імунітету (SALT-системи) при УФО та його взаємозв'язок з УФ-індукованими пероксідаційними процесами, закономірності розвитку локальних і системних імуносупресивних ефектів при УФ-опроміненні шкіри.

Вивчити можливості керування імуносупресивними реакціями, а також - цілеспрямованого фотогенезу імунологічної толерантності.

Вивчити взаємозв'язок варіантів імунотропних ефектів ультрафіолетової радіації і типів конституції дітей, що проходять санаторно-курортне лікування з застосуванням геліотерапії.

Вивчити патогенетичні взаємозв'язки та механізми формування імунологічної картини різних типів УФ-фотогенного імунного реагування.

Вивчити особливості прояву типів УФ-фотогенного імунного реагування у дітей із зони радіонуклідного забруднення (аварії на ЧАЕС).

Вивчити дозові закономірності імуно-біохімічного реагування при проведенні геліотерапії.

Об'єктом дослідження з'явилися імунотропні ефекти УФ-радіації в зв'язку з фотогенною пероксідацією, фототропною динамікою клітинних популяцій, фотоіндукованою зміною кілерного потенціалу клітин-ефекторів, апоптотичною готовністю клітин, а також - взаємозв'язок з генетичними (конституціональними) типами УФ-індукованих імунних реакцій і закономірностями розвитку УФ-фотогенної імуносупресії.

Предмет дослідження експериментальної частини роботи був визначений біоетичними розуміннями. Потребуючий великого обсягу крові аналіз морфо-функціонального стану її клітин, пероксідаційного статусу, експресії маркерів CD і HLA був проведений на крові і її компонентах 278 практично здорових волонтерів (студенти КДМУ обох статей у віці 18-32 років). Дослідження супресії потенційно небезпечних реакцій гіперчутливості, викликаної хімічним гаптеном, і контактних алергійних реакцій - на 94 білих лабораторних щурах лінії “Вістар”. Предметом клінічного дослідження стало 434 дитини (які проходили санаторно-курортне лікування на курорті Євпаторія), з них - 93 хворих ревматизмом у неактивній фазі (клас IX, Н109 і Н105 МКБ), 102 хворих хронічним тонзилітом (клас X, J35.0), з регіону ЧАЕС - 82, 93 - хворих диспластичним сколіозом I-II ступеня (клас XIII, М41.1) і 64 здорових дитини у віці від 11 до 15 років.

Методи дослідження. Фотомодифікаційну та антиоксидантну дію превентивного УФО вивчали по ефектах імунозалежної фрагментації еритроцитів та динаміці еритроцитометричних показників. Закономірності дії фотомодифікуючих біохімічних агентів при УФО було вивчено по впливу вітамінів С и Е на пероксидаційний статус, морфо-функціональні параметри клітинних мембран, процеси УФ-індукованого фотостаріння та руйнування клітин крові. Морфологічні зміни клітин крові оцінювали за допомогою світлової та електронної мікроскопії. Локальні імуносупресивні ефекти УФО та антигенспецифічну імуносупресію вивчали в експериментальних умовах по реакції контактної (КГЧ) і уповільненої (УГЧ) гіперчутливості у лабораторних щурів на гаптен динітрохлорбензол (ДНХБ) і чужорідні протеїни - бичачий і людський альбуміни. Вивчалися показники загальноклінічного аналізу крові, динаміка протеїнограм, рівня Na⁺ і K⁺ плазми і еритроцитів, імунологічні критерії (рівні IgА, М, G; В-лімфоцитів, Т-хелперів і супрессорів), показники неспецифічної резистентності (лізоцим, комплемент; титри АСГ, АСЛ-О). Експресія маркерів CD і антигенів HLA оцінювалася методом непрямої імунофлюоресценції. Гормональний стан визначали радіоімунним методом по динаміці екскреції трийодтіроніна - Т_3, тіроксину - Т₄ і кортизолу.

Усі дані піддані статистичній обробці для зв'язаних і не зв'язаних спостережень. Вірогідність розходження параметрів оцінювалося за критерієм t. Взаємозв'язок досліджуваних явищ - за коефіцієнтами лінійної і нелінійної кореляції. Для інтегрального аналізу критеріїв імунологічних реакцій застосовували багатофакторний аналіз (Н.А.Плохінський, 1970, Є.Ф.Лакін, 1990). Полімодальність варіаційних розподілів оцінювали за допомогою “нульової гіпотези” по відповідності емпіричного й ідеального розподілів, далі мірою розходжень служив параметр асиметрії і глибини трансгресії рядів. Варіаційну неоднорідність сукупностей оцінювали по показнику ексцесу.

Наукова новизна роботи. У роботі вперше описані закономірності прямого та опосередкованого генезу локальної та системної імуносупресії при впливі УФР в експериментальних умовах, а також - неспецифічні й антигензалежноі форми УФ-фотогенної транзиторної толерантності. Вперше показана наявність двох різних типів імунного реагування при впливі УФР в умовах санаторно-курортного лікування, популяційно добре співпадаючих із ТК, а патогенетично - сполучених з реакціями клітинного, або - гуморального ланок імунітету. Висловлено припущення про можливу роль інтраепітеліальних -лімфоцитів у забезпеченні типажу фотогенної імунологічної реакції. Деталізовано відомі з літератури факти захисної дії превентивного (попереднього) малодозового УФО у відношенні до наступних сеансів впливу УФ-радіації.

Практична значимість отриманих результатів. Методика визначення типів конституції в дітей (по В.П.Казначеєву) і типів імунного реагування в умовах Євпаторійского курорту впроваджена в клінічних санаторіях "Примор'є", "Дружба", "Здравниця". Запропоновано формулу визначення критерію ТК по базових антропометричних параметрах, простий лабораторний критерій динаміки чисельності еритроцитів, еозинофільно-моноцитарного індексу в ході геліотерапії для оцінки приналежності дітей до УФ-фотогенних типів імунного реагування. Патогенетично обґрунтована і показана необхідність обмеження доз УФР при геліотерапії з метою запобігання негативних імунологічних ефектів надлишкової УФ-радіації для контингентів дітей із зони аварії на ЧАЕС. Запропоновано на підставі обліку типу ТК (ТІР) планування геліотерапії виходячи зі спектру супутньої імунологічної патології. Отримані в роботі нові дані застосовуються в педагогічному процесі на кафедрі педіатрії і фізіотерапії ФПО Кримського медичного університету ім. С.І. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Самостійно проводив формування груп, спостереження і клінічне обстеження дітей, постановку, апробацію методик та всі серії експериментальних досліджень. Проводив ретроспективний статистичний аналіз і обробку даних геліо- та метеопараметрів, які впливають на умови геліотерапії, а також - безпосереднє вивчення динаміки прямої сонячної радіації в літній період на курорті Євпаторія. Здійснював моніторинг проведеного лікування, самостійно проводив аналіз, статистичну обробку й оформлення роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були апробовані на 16 міжнародних і регіональних науково-практичних конференціях, симпозіумах і з'їздах, у тому числі на: міжнародної конференції “Слабкі і понадслабкі поля і випромінювання в біології і медицині” (С.-Петербург, 2000); першому національному конгресі по біоетиці (м. Київ, 17-20 вересня 2001р.); І й ІІ з'їздах фізіотерапевтів і курортологів Криму (Євпаторія, 2001р., 2002р.); 3-му Міжнародному Конгресі “Актуальні питання біофізичної медицини”. (Київ, 13-17 травня 2002р.); 2-му Міжнародному симпозіумі “Мікроциркуляція і її вікові зміни” (Київ, 22-24 травня 2002р.); Всеукраїнської науково-практичної конференції, присвяченої 5-річчю Міжнародного дитячого медичного центра “Євпаторія” (Євпаторія, 26-27 вересня 2002р.)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 56 наукових праць, у тому числі 3 монографії, 21 робота - у спеціальних медичних наукових виданнях, що входять у перелік ВАК України, 32 роботи в наукових збірниках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. В експериментальній частині роботи джерелом УФ-проміней служив стандартний опромінювач ОКН-11-М зі світлофільтром УФС1. Експозиційні дози обрані в інтервалі 1,12-16,7кДж/м², що рекомендується в якості клінічних експозиційних доз (Ю.В.Попов, Д.Н.Лазарєв, 1986). У клінічному дослідженні режими і дози УФО визначалися сезоном року (число днів сонячного сяйва), тривалістю курсу сонячних ванн і типом їхнього прийняття (загальна і розсіяна радіація). Діти, хворі хронічними захворюваннями, спостерігалися протягом усіх сезонів року, здорові діти були обстежені в умовах перебування в сезонній санаторно-курортній установі протягом літа. За умовами впливу природної УФР формувалися дві групи: літня (травень-вересень) і зимова (жовтень-квітень). геліотерапія біохімчний фотогенний еритроцит

У літній групі хворі діти одержували геліотерапію, дозовану по двох типах. 1-ий тип - курс сонячно-повітряних ванн сумарної радіації (10 процедур - 1 біодоза), 2-ий тип - сонячно-повітряні ванни розсіяної радіації (10 процедур - 0,25 біодози) під суцільним навісом. Здорові діти, діти, хворі ревматизмом і сколіозом, інсолювалися тільки по першому типу, діти з регіонів радіонуклідного забруднення - тільки по другому типу геліотерапії. Діти, хворі хронічним тонзилітом з екологічно сприятливих регіонів були розділені на дві рівнозначні за обсягом групи, що інсолювалися як по 1-ому, так і по 2-ому типам геліотерапії (табл. 1).

Таблиця 1 Розподіл дітей по групах дослідження з обліком нозологічної приналежності і режиму УФО при санаторно-курортному лікуванні

У наших дослідженнях перекисного окислення з урахуванням ефектів фотоінактивації токоферолу (табл. 3) було виявлено, що зі зростанням дози поглиненої УФ-енергії спостерігається характерна двухфазна залежність для маркера інтенсивності ПОЛ МДА та показників каталазної активності і перекисної резистентності еритроцитів: доза 1,12кДж/м² викликають активацію антиоксидантних систем, понад - пропорційно дозі їхнє пригнічення, яке виявляється прогресивним накопиченням МДА. При дослідженні дозової динаміки показника, яка представляє відношення концентрації МДА в опромінених субстратах без токоферолу до такій при його додаванні (n=23), виявляється діапазон в околицях дози 5,6кДж/м², де спостерігається найбільш виражене гальмування пероксидаційних процесів вітаміном. З ростом поглиненої УФ-енергії антиоксидантна активність препарату різко падає і при дозах, близьких до 10,12кДж/м² практично не виявляється. Таким чином, при УФО антипероксидаційна активність вітаміну Е істотно залежить від дози УФР, що варто пояснювати фотоінактивацією токоферолу при прямому поглинанні УФ-квантів.

Таблиця 3 Показники перекисного окислювання в суспензії еритроцитів при УФО (n=23)

Примітка: МДА - концентрація малонового діальдегіда, АК - активність каталази, ПРЕ - перекісна резистентність еритроцитів, “+Т” - з додаванням токоферолу. ¹ - вірогідність відмінності параметра від контролю менш 0,05; ² - не має достовірні розходження від контролю; ³ - для рівних доз УФО не має вірогідної відмінності при додаванні токоферолу; ⁴ - для рівних доз УФО вірогідність відмінності при додаванні токоферолу менш 0,05.

При впливі УФО віковий склад опромінених червонокрівців різний, а облік специфіки фотореакцій різних вікових груп еритроцитів представляє безсумнівний клінічний інтерес (О.В.Шашкін, І.А.Тєрсков, 1986). У наших спостереженнях динаміки електро-механічних властивостей еритроцитів (табл. 4) (n=32) інкубація з токоферолом послабляла падіння їхньої жорсткості після УФО. Активність антиоксидантних систем еритроцита знижується, а фоновий рівень пероксидації наростає пропорційно віку клітин, про що свідчить хронологічно прогресивне підвищення рівня МДА з максимумом у 30-денних зразків.

При інкубуванні з токоферолом ефект антиоксиданту виявився більш вираженим у 30-денних еритроцитів, що зумовлено захопленням агента компонентами мембрани та його ефективним розподілом у мембрані.

Таблиця 4 Кондуктометричні параметри при УФО (n=32)

Примітка: - експоненційний показник кондукторгами; Ro - базова електропровідність зразків крові; Т - інкубація з токоферолом.

Для вивчення фотомодифікаційної дії на УФ-індукуємі зміни електромеханічних властивостей еритроцитів людини були обрані виявлені екстремальні експозиції: 1,12кДж/м² - доза, що відповідає максимуму активації ферментних систем (превентивна доза) та 10,12кДж/м² - рубіжна доза їхнього тотального інгибування. Було виявлене падіння, що пропорційно розвивається експозиційній дозі, параметра Ro досліджуваних зразків, що варто пояснювати трансмембранним пасажем іонів при розвитку фотогенного ПОЛ мембранної матриці з різким ростом її пасивної проникності та падінням активності транспортних систем. Останній ефект треба пояснювати не тільки формуванням перекісних зшивок (що підвищує ригідність макромолекул (А.В.Горобець, С.В.Пінчук, 1995), але й роз'єднанням процесів транспорту та енергетичного забезпечення (Е.Б.Бурлакова і співавт., 1982).

Ступінь пероксидації істотно впливає на механічні властивості мембран. В усіх серіях наших спостережень був виявлений сильний кореляційний взаємозв'язок (r>0,89) між параметром початкового опору зразків Ro і експоненційним показником другої фази кондуктограм , що інтегрально характеризує механічну жорсткість клітин.

Для еритроцита, що не має тубулярної системи цитоскелету, показник відбиває саме ізольовану механічну жорсткість ліпідної матриці мембрани, хоча не виключено, що внутрішній білковий кістяк мембрани також може істотно впливати на її жорсткість особливо в умовах зміни іонного складу середовища.

При превентивному УФО було виявлено різке гальмування росту іонної проникності. Величина параметру Ro наблизилася до його значення для меншої в 11 разів експозиційної дози. Виходячи з цього і факту відсутності вірогідної відмінності параметра швидкості гемолізу між групами з різними дозами УФО, необхідно вважати, що при призупинення росту іонного складу при УФО з експозиційною дозою 11,12кДж/м² за допомогою превентивного УФО малою дозою (1,12кДж/м²) найбільш ймовірною причиною феномена, що спостерігається, є не активація транспортних систем мембрани, а гальмування перекисного окислення в її ліпідній матриці.

Показники жорсткості мембран, їхньої іонної проникності та критерії оцінки пероксидаційного гомеостазу зв'язані зі зручними для інтегральної характеристики клітинної популяції еритроцитометричними параметрами, УФ-фотомодифікацію яких превентивним УФО вивчали далі. Був виявлений не тільки ріст середнього діаметру клітин, але й падіння ексцесу розподілу критерію. Одним з можливих механізмів, що забезпечують виявлений феномен, є виявлена нами фотоактивація антиокислювальних систем мембрани.

Закономірності УФ-фотоіндукованих пероксідаційних процесів є концептуальним фундаментом, на якому базуються сучасні уявлення про імунотропну дію УФР, яку найбільш легко виявити у формі модифікації класичних реакцій гіперчутливості. При вивченні реакції КГЧ на ДНХБ при впливі на організм лабораторних тварин (n=40) еритемних доз УФР у контрольній групі спостерігали виражену реакцію КГЧ, що виявлялася у формі типових ознак: гіперемії і набряку. Вірогідне (у порівнянні з інтактною групою; Р<0,05) падіння електричного опору тканини підтвердило якість використаного гаптену.

Локальне пригнічення КГЧ мало місце відразу ж після УФО. Генералізація супресії КГЧ спостерігалося тільки по витікання 48 годин Таким чином, для розвитку системної реакції необхідний інкубаційний період, тривалість якого не менш двох діб. Локальний супресивний ефект “поглинається” системним. Найбільш ймовірним кандидатом на роль біохімічного агента, що запускає описані події, є цис-уроканова кислота (F.P.Noonan et al., 1988), яка утворюється в результаті фотоізомеризації уроканової кислоти при УФО шкіри (L.J.Webber et al., 1997).

Проте, розвиток імуносупресії, хоч і зв'язаний з цим біохімічним агентом, спряжений також із запуском більш складних ланцюгів цитокінових реакцій (A.Boonstra, H.F.Sevelkoul, 1997), у зв'язку з чим далі була вивчена гуморально-опосередкована супресія КГЧ (n=30) після підшкірної ін'єкції 0,2мл надосадової рідини (супернатанта) УФ-опромінених аутокератиноцитів. Було виявлено вірогідне зниження КГЧ, аналогічне дії прямого УФО, що свідчить про вагому роль у супресії КГЧ на ДНХБ фотомодифікованих гуморальних факторів.

Глобальний УФ-фотогенний толерогенез може бути зв'язаний із запуском при УФО антигенспецифічних імунних механізмів, сполучених з фотогенними пероксидацією і апоптозом (R.Caricchio et al., 1998). У зв'язку з цим далі була вивчена реакція УГЧ, що розвивається на підшкірне (0,1мл 10% р-на) введення лабораторним щурам (n=24) чужорідного протеїну (бичачий (БА) і людський альбумін (ЧА)) через добу після УФО (5,6кДж/м²). Через 3 доби всім тваринам на протилежній стороні тіла на відстані 5 см робили одночасне введення обох типів альбуміну.

У контрольних групах спостерігали яскраву реакцію на протеїн, що вводиться (табл. 5), у дослідних групах реакція УГЧ була подавлена. Досліджуваний параметр вірогідно різний для контролю і досліду як для ЧА, так - і БА, що свідчить про антигенну інваріантність первинної супресії. Після вторинного введення протеїну в інтактній і контрольній групах мала місце яскраво виражена реакція УГЧ. Зміни досліджуваного параметра для двох типів білка в дослідних групах однотипні і вагомо кореляційно взаємозв'язані (r=0,85(0,07). При протіканні первинного контакту тварини з алергеном на тлі попереднього УФО вторинна реакція на нього виявляється різко подавленою. В умовах наших спостережень така антигенна специфічність була рестріктована парентеральним контактом з алергеном після протікання 24 годин з моменту опромінення.

Варто думати, що прямолінійних патогенетичних схем, заснованих на уявленнях про фотогенний апоптоз ІКК, якими цілком можна пояснити супресію при первинному введенні антигену (A.Schwartz et al., 1998), виявляється явно недостатньо, щоб дати трактування специфічності феномена, що спостерігається.

Таблиця 5 Імуносупресивні ефекти УФО (електричний імпеданс, Ом) (n=24)

Подальший розвиток уявлень про механізми імунотропної дії УФР був зв'язаний з рішенням двох груп тісно взаємопов'язаних задач, що дозволило б описати екзогенну апоптогенну активність клітин-ефекторів після УФО, з одного боку, і готовність УФ-опромінених клітин, до реалізації ПКЗ, з іншої. Перша група задач може бути зведена до виявлення закономірностей експресії маркерів ПКЗ, зокрема - Fas-рецептора (CD95) і сполученою динамікою експресії інших маркерів CD, які характеризують потенційний рівень екзогенної індукції апоптозу (активність макрофагів, NK і CD8-опосередкована активність). Друга задача була більш складною і пов'язана з необхідністю створення модельних умов in vitro, що дозволяють вивчити як динаміку готовності клітинних популяцій до ПКЗ, так і властивості клітин-ефекторів адекватно реагувати на описані вище зміни популяціних властивостей. В якості об'єкта, що задовольняє цим умовам, була обрана модель еритроцитарних популяцій, які старіють in vitro у фізіологічних умовах, та далі піддаються контактному впливу аутологічних клітин-ефекторів білої крові.

Для дослідження процесів популяційного розподілу й активації ІКК після УФО нами були обрані ключові кластери, що відповідають як групам клітин (CD4, CD8 та CD16 - Т-хелпери, Т-супресори і NK), так і конкретному функціональному стану кліток - CD25 (активовані моноцити, Т-, В-лімфоцити) і CD95 (рецептора запуску апоптозу).

Нас цікавила також експресія антигенів МНС, що диктувалося важливою кілінг-інгібуючою роллю МНС-І як рецепторів, що перешкоджають ініціації цитотоксичного акту та запуску екзогенного (перфорин-гранзим-індукованого) апоптозу, а також - ключовою роллю МНС-ІІ (у наших спостереженнях - локус HLA-DR) у процесі антигенної презентації.

Таблиця 6 Експресія маркерів CD і антигенів HLA після УФО (Mm,%)

Примітка: Р₁, Р₂- вірогідності розходження показників з контролем та між показниками при опроміненні in vitro та in vivo; * - розходження не вірогідні (<95%).

Визначення описаних параметрів (n=14) методом непрямої імунфлюоресценції проводили: у крові до УФО (контроль); після опромінення крові in vitro (експозиційна доза - 1,12кДж/м²) та через 24 години після УФО шкіри (площа опромінення - 200см², експозиційна доза 1,12кДж/м² - 4-5 МЕД). При УФО крові вірогідно спостерігали падіння чисельності лімфоцитів (табл. 6) і рівнів експресії HLA обох типів, що варто пояснювати прямим фотогенним пригніченням клітинного метаболізму і припиненням як процесів MHC-I аутоантигенного представлення, так і презентації чужорідних антигенів АПК.

При УФО шкіри чисельність CD8+ кліток вірогідно зростала, що могло забезпечуватися не тільки класичними -клітинами, але й -лімфоцитами, інтраепітеліальна популяція яких CD8-позитивна (Г.Н.Дранник, 1999). При in vivo-опроміненні спостерігалося також вірогідне зростання чисельності CD16+ клітин, що свідчить про ріст чисельності NK і інших цитотоксичних лімфоцитів, у тому числі - і лимфокін-активованних (ЛАК) форм (A.Roitt et al., 1998) та їхньої активації, на користь чого свідчить вірогідне зростання рівня експресії CD25.

При УФО in vivo рівень експресії МНС-І наростає. Варто припускати, що дія доз у діапазоні 4-5МЕД виявляється у формі інтенсифікації антигенного autoself-представлення, що можна розглядати як один з механізмів протиапоптотичного захисту клітин в умовах зростання кілерної активності імунних ефекторів.

У контексті висловленого припущення знаходиться виявлена нами динаміка зростання експресії CD95 при УФО як in vitro, так і in vivo. Виявлені факти змушують припускати, що УФО запускає каскадні клітинні реакції, ефекти яких зводяться до індукції цитотоксичної елімінації власних клітин шляхом апоптотичної індукції з боку цитотоксичних аутолімфоцитів (NK, ЛАК- та К-клітин).

У зв'язку з цим далі було доцільним дослідити можливість такої фотогенної лімфоцит-залежної елімінації при впливі УФР. В даний час мається, принаймні, дві основних точки зору на механізм елімінації еритроцитів. Перша, класична, базується на механічних поглядах про динаміку деформуємості еритроцита (А.В.Шашкін, І.А.Терсков, 1986). Друга зв'язана з уявленнями про активну та цілеспрямовану елімінацію з попереднім розпізнанням старіючих клітин (R.K.Saxena, 2000).

Розпізнання та фагоцитування старих еритроцитів відбувається в селезінці і кістковому мозку, де часто супроводжується фрагментацією червонокрівців. У наших спостереженнях при інкубуванні in vitro чисельність еритроцитів падала логістично (по S-подібному закону), при цьому практично лінійно зростала частка ехіноцитів, що досягла до 21 доби 100% (табл. 7). Ехіноцит є однієї з форм існування еритроцита в умовах енергетичної кризи в клітині. При цьому ключова роль у генезі таких форм, очевидно, належить білкам внутрішнього білкового цитоскелету мембрани (Zhaoab et al., 2000).

Динаміка частки ехіноцитів, що спостерігалася, свідчить про процеси вгасання метаболізму в клітинах, родинних тим, що протікають при фізіологічному старінні клітини.

Таблиця 7 Чисельність популяції еритроцитів та ехіноцитів після УФО (n=22)

Примітка: Р₁ - вірогідність розходження з 1-ою добою спостереження; Р₂ - вірогідність розходження між зразками на 21-у добу збереження і зразками при додаванні свіжої та 21-добової плазми; * - розходження не вірогідні.

При цьому спостерігається зниження рівня експресії HLA-I, що позбавляє клітину можливості гальмувати запуск цитотоксичного акту з боку кілерних клітин. Зниження рівня енергетичного обміну має ще один важливий наслідок - падіння інтенсивності функціонування транслоказних систем (C.Zou et al., 1998), що забезпечують асиметрію розподілу фосфатидилсерину в нормоцитарній мембрані. Ці й інші зміни поверхневої картини клітини служать ознаками “старості” еритроциту. У наших умовах при інкубації такі зміни повинні були наростати пропорційно часу інкубації популяції in vitro. Процес розпізнання старих еритроцитів, ефекторною ланкою якого є лімфоїдні клітини, варто розглядати як один зі шляхів керованої елімінації. В умовах нашого експерименту в якості повноцінних лімфоїдних клітин використовували лімфоїдні клітини з отриманої ex tempore аутологічної плазми (АП).

При додаванні 21-добової АП достовірних змін чисельності 3-х тижневих еритроцитів не спостерігали. При додаванні свіжої АП спостерігали падіння чисельності еритроцитів, супроводжуване появою мікротелець діаметром 1-4мкм. Описані явища процесуально схожі з процесом беззапального фагоцитування клітинних елементів при ПКЗ. Для старих еритроцитів цілком можна припускати наростаючу експозицію фосфатиділсерину на поверхні клітини, що зв'язано з порушенням цитоскелету мембрани та енергетики клітини. Така експозиція є головним пусковим механізмом заключної фази апоптоза. В зв'язку з цим необхідно відзначити, що еритроцит, з одного боку, може бути об'єктом, що перетерплює "апоптоз у ході", який стартував на онтогенетичному рубежі нормобласта до його денуклеації.

Виявлені нами факти свідчать про те, що при УФО, крім прямого фотогенного руйнування клітин, дуже важливим фактором, що визначає перерозподіл клітинних популяцій, є взаємоспряжені процеси зміни поверхневої картини клітин-мішеней і модифікація клітин-ефекторів, що забезпечують цитотоксичний, у тому числі - апоптогенний ефект.

Висловлені припущення дозволяють під новим кутом зору розглядати цитологічні зрушення після УФО. Таке припущення про можливість використання цитологічних параметрів у якості первинних оцінних критеріїв виразності УФ-фотогенної імуносупресії підтвердилося при ретроспективному дослідженні цитологічних показників двох груп фтизіатричних хворих, що проходили курс лікування в зимовий і літній сезони року. Фотогенна стимуляція клітинної ланки імунітету, реакція якого забезпечується інтерлейкіновим каскадом ІЛ-1 і переважною проліферацією Th1, супроводжується продукцією прозапальних цитокінів (ІЛ-2, -TNF і ін.) і ростом CD8+ лімфоцитів. Саме таке зростання Т-супресорів було виявлено нами в попередніх спостереженнях, що є доводом на користь зробленого припущення.

Аналіз результатів наших спостережень вірогідно (P<0,05) виявив також підвищення еозинофілів, загального числа лейкоцитів (у т.ч. лімфоцитів і моноцитів), що характеризують напруженість запальних реакцій. Зростання числа моноцитів приводить до інтенсифікації процесів антигенного представлення, однак цей процес після УФО також може перетерплювати трансформацію з форми класичного імуногенезу у толерогенез (J.C.Simon et al., 1991) при участі системи природних супресорних клітин (С.О.Кусмарцев і співавт., 1994).

Як видно, не усі виявлені нами зрушення свідчать про превалювання клітинного типу імунної реакції. Якщо ріст числа лімфоцитів і моноцитів представляється можливим зв'язати з виявленим вище ефектом наростання CD16+ кліток, що володіють загальною рисою - ефекторним потенціалом, то зростання еозинофілів варто відносити до класичної ознаки Тh2 (гуморального) типу реагування. Деякі автори (J.C.Simon et al., 1990) повідомляють про патогенетичну реалізацію УФ-фотогенної імуносупресії за участю клітин Лангерганса саме по шляху активації Th2. Їх цитокіновий профіль, що включає ІЛ-4, корелює з ефектом еозинофілії.

Облік цих даних свідчить про залучення при впливі УФР в загальну картину імунного реагування патогенетичних ланок як клітинного, так і гуморального імунітету. При цьому не виключається можливість наявності визначених типів УФ-фотогенного імунного реагування з превалюванням клітинних чи гуморальних компонентів.

Зазначені факти дозволили нам сформувати концептуальний базис для аналізу результатів клінічної частини роботи, що складається з наступних припущень: 1)сезонність кліматолікування дуже істотна і пов'язана з імунотропністю УФО; 2)імунотропні реакції організму можуть бути вагомо взаємозалежні зі стандартними цитологічними параметрами крові (еозинофіли, моноцити, лімфоцити); 3)варто припускати наявність мінімум двох типів фотогенного імунного реагування, патогенетично зв'язаних із клітинним та гуморальним імунітетом, селективне превалювання яких визначається ідіопатичними (генетичними) причинами, у зв'язку з чим треба також припускати сполучення форм (типів) фотогенного імунного реагування з типами конституції.

У зв'язку з цим біохімічні особливості обстежених контингентів були розглянуті в контексті їхнього конституціонального типувания. У нозологічній групі хворих сколіозом рівень ГАГ сечі у дітей ІІТК істотно перевищував цей параметр для дітей ІТК (57,5±3,6 і 39,0±2,8 мкмоль/доб відповідно). Зміст норадреналіну сечі вище 1,9 мг/л було виявлено в 78% дітей ІТК і в 25% дітей ІІТК. Розходження зазначених критеріїв, таким чином, не були нозологічно інваріантні. Аналіз параметрів загального аналізу крові також свідчив про відсутність достовірних розходжень між однотипними параметрами між групою здорових дітей, дітей хворих сколіозом і хронічним ревматизмом без обліку поділу їх на ТК.

У контексті нашої роботи важливими для нас були вірогідні розходження, виявлені далі між ТК усередині нозологічних груп з урахуванням динаміки геліотерапії. Аналіз показників загального аналізу крові дозволив нам виявити ряд важливих закономірностей, що істотно розрізняють між собою саме ТК, а не нозологічні групи обстежених дітей. Найбільш виражені зрушення були виявлені в групі дітей, хворих хронічним тонзилітом із зони радіонуклідного забруднення.

Виявлені нами закономірності стосувалися не стільки абсолютних значень параметрів, скільки їхньої динаміки. До таких параметрів, динаміка яких після курсу геліотерапії істотно відрізнялася між ТК усередині нозологічних груп, відносилися: чисельність еритроцитів, загальна чисельність лімфоцитів, кількість моноцитів.

Тільки для цих трьох параметрів нам вдалося показати вірогідність розходження в динаміці геліотерапії для всіх нозологічних груп, включаючи здорових дітей. У зв'язку з виявленим фактом, саме ці параметри стали для нас об'єктом подальшого більш ретельного вивчення й аналізу.

У першу чергу звертає на себе увага розходження між динамікою чисельності еритроцитів. При надходженні на санаторно-курортне лікування (оздоровлення) середній показник чисельності еритроцитів (табл. 9) для різних ТК (усередині однієї нозологічної групи) вірогідно не розрізнявся. Однак після геліотерапії чисельність еритроцитів у дітей ІТК вірогідно знижувалася для всіх нозологій. Наявність вірогідних протифазних зрушень чисельності еритроцитів, інваріантних нозологічно, змусило нас припускати, що розходження обумовлені саме ТК, а не конкретним станом організму. Виявлена динаміка чисельності еритроцитів була настільки показова, що дала можливість дати попередню класифікацію типів УФ-реагування у формі “УФ-еритропенічного” та “УФ-еритрорезистивного” типів для І та ІІ ТК відповідно.

Патогенетичні причини виявленого ефекту випливало шукати, насамперед, у самих характеристиках еритроцитів у кожного ТК в динаміці його УФ-реагування з обліком нозологічних груп. Однак до початку курортного лікування для дітей I і II ТК між критерієм чисельності еритроцитів з одного боку, а з іншого боку - показниками Na⁺ і K⁺ кліток і ШОЕ не було виявлено вагомих коефіцієнтів кореляції (модуль r0,2) для кожної з пар параметрів. Це, з урахуванням даних експериментальної частини роботи, остаточно переконує в необхідності шукати патогенетичні причини УФ-фотогенного падіння чисельності еритроцитів поза властивостями самих клітин.

Динаміка лімфоцитів і макрофагів мала характерні риси, які дуже нагадують такі для вже розглянутої динаміки еритроцитів. Об'єднана в інтегральні сукупності динаміка досліджених параметрів приведена в табл. 8.

Таблиця 8 Інтегральна динаміка (рангове усереднення по нозологіям) числа еритроцитів, лімфоцитів, моноцитів периферичної крові дітей різних ТК

Примітка: параметри чисельності: Ер - еритроцитів, Л - лімфоцитів...