Отримання трансфер-фактору антирабічного та його імунобіологічні властивості

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Отримання трансфер-фактору антирабічного та його імунобіологічні властивості

Столюк Валерій Васильович

Київ 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор Скибіцький Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Галатюк Олександр Євстафійович, Державний агроекологічний університет, завідувач кафедри заразних хвороб тварин

кандидат ветеринарних наук, доцент Постой Віктор Петрович, Національний аграрний університет, в. о. завідувача кафедри епізоотології та інфекційних хвороб

Провідна установа - Білоцерківський державний аграрний університет, кафедра мікробіології, вірусології та зоології Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист дисертації відбудеться “ 16 ” січня 2004 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, аудиторія 65

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці НАУ за адресою: 03041, м.Київ-41, вул. Героїв оборони, 13, навчальний корпус 4, к. 41

Автореферат розісланий “ 12 ” грудня 2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Міськевич С.В.

1. Загальна характеристика роботи

сказ імунітет вакцинація антирабічний

Актуальність теми. Сказ залишається однією із найнебезпечніших антропозоонозних інфекцій і створює постійну епізоотичну та епідемічну напругу у багатьох регіонах України. Незважаючи на значний арсенал запропонованих засобів діагностики та профілактики сказу, ряд важливих питань залишається не виясненими. Це стосується, зокрема, дослідження клітинного імунітету. На фоні досить детальних досліджень гуморального імунітету (Xuan X, 1998; Albas A., Pardo P.E., 1998; Gomes A.A., Bernardi F. 1998; Lalosevic D. et al., 1999), фактори клітинного захисту вивчені недостатньо. У той же час, як свідчить аналіз сучасних даних щодо механізмів імунітету відносно різноманітних внутрішньоклітинних патогенів, з великою долею ймовірності можна апріорно стверджувати про важливість клітинного імунітету при сказі, збудник якого в процесі репродукції модифікує антигенний склад цитоплазми уражених клітин, що безперечно сприяє їх ранній ідентифікації та знешкодженню спеціалізованими клітинами, зокрема Т-лімфоцитами. Не випадково останнім часом багато вчених приділяють значну увагу пошуку різноманітних речовин, котрі стимулювали б імунокомпетентні клітини, та пропонують препарати на їх основі. Серед останніх добре зарекомендували себе препарати на основі трансфер-фактору. Їх з успіхом використовують, зокрема, для лікування герпетичних інфекцій у людини (“Biomune Plus”, “Supercolostrum” та ін.) (Fudenberg H.H., Fudenberg H.L., 1989; Lawrence H.S., Borkowsky W., 1995). Враховуючи ряд суттєвих переваг трансфер-фактору над іншими імуномодуляторами, зокрема, оперативність створення ним активного імунітету, відсутність у його складі трансплантаційних антигенів, гіпоалергенність, безпечність застосування та низьку вартість, доцільним стає питання щодо отримання трансфер-фактору антирабічного та вивчення його імунобіологічних властивостей на предмет можливого використання в процесі розробки відповідних препаратів та їх застосування в практиці боротьби зі сказом.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація є частиною комплексних досліджень за темою: “Вивчення клітинного імунітету тварин з метою теоретичного та експериментального обґрунтування засобів і методів імунокорекції” (номер державної реєстрації 0101U01755).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - отримати трансфер-фактор антирабічний та дослідити його імунобіологічну активність.

Відповідно до мети роботи були поставлені такі наукові завдання:

- розробити метод сенсибілізації свиней-донорів трансфер-фактору ;

- дослідити показники імунітету при антирабічній імунізації ;

- отримати антигеноспецифічні зразки трансфер-фактору активного імунітету проти збудника сказу та визначити їх імунобіологічну активність ;

- здійснити перенесення гіперчутливості сповільненого типу до збудника сказу від сенсибілізованих донорів (свиней) до інтактних ксеногенних реципієнтів (морських свинок та білих мишей) за допомогою трансфер-фактору антирабічного;

- дослідити протективну активність трансфер-фактору при сказі на білих мишах.

Об'єкт дослідження. Зразки діалізних екстрактів лімфоцитів свиней-донорів, імунізованих проти сказу за різними схемами, та препарат на основі рекомбінантних б- і г-інтерферонів - Комбіферон.

Предмет дослідження. Реакції клітинного імунітету свиней та морських свинок при антирабічній імунізації, імунобіологічні властивості отриманих зразків діалізних екстрактів лімфоцитів вакцинованих проти сказу свиней та препарату Комбіферон.

Методи дослідження. Поставлені в роботі завдання вирішувалися експериментально з використанням вірусологічних, імунологічних, біохімічних та статистичних методів досліджень.

Наукова новизна роботи. Вперше отримано зразки трансфер-фактору (ТФ) антирабічного із селезінок і лімфатичних вузлів одно- і триразово вакцинованих свиней антирабічною вакциною КоКАВ та вивчено їх імунобіологічну активність щодо індукції активного клітинного імунітету у ксеногенних реципієнтів проти вірусу сказу.

Визначено активність зразків ТФ антирабічного при тестуванні in vitro та in vivo, одержаних при одно- і триразовому введенні вакцини, та доведено перевагу їх активності за триразової вакцинації з інтервалом у сім діб.

Встановлено, що внутрішньом'язове введення ТФ у різні строки відносно зараження вірулентним штамом вірусу сказу забезпечує виживання 50 - 83 % мишей при експериментальній рабічній інфекції.

Практичне значення одержаних результатів.

Результати досліджень, представлені в роботі, можуть бути використані з метою вдосконалення технологій конструювання та застосування антирабічних препаратів.

Матеріали проведених експериментальних та теоретичних досліджень впроваджені в навчальний процес під час викладання вірусології.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному проведенні теоретичних та практичних експериментальних досліджень, аналізі та підготовці матеріалів до опублікування. У процесі виконання ряду досліджень науково-консультативну допомогу надавали : д. б. н. Чумак Р. М. (Національний аграрний університет, Київ), к. мед. н. Стахович В.І. (Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, Київ), к. мед. н. Антонова Л.О. (НДІ інфекційних хвороб МОЗ України, Київ), Карась О.Я. (Інститут ветеринарної медицини УААН).

Апробація результатів досліджень. Основні результати досліджень доповідалися на трьох наукових конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів Національного аграрного університету в 2001 - 2003 рр.

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 8 наукових праць, в тому числі 5 - у фахових виданнях, означених переліком ВАК України, в яких викладені основні положення дисертаційної роботи.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 131 сторінці машинописного тексту і містить вступ, основну частину (4 розділи), висновки, пропозиції та бібліографічний список. Робота має 23 таблицю, 6 рисунків. Бібліографічний список включає 255 джерел, у тому числі 205 зарубіжних.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень

Роботу виконано на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету. Окремі дослідження проведено у лабораторіях Інституту інфекційних хвороб МОЗ України, лабораторіях імунології та біохімії НДІ екогігієни і токсикології ім. Л.С. Медведя МОЗ України, навчально-дослідних господарствах НАУ (“Великоснітинське” та Агрономічна дослідна станція), розташованих відповідно у Фастівському та Васильківському районах Київської області.

Як тварин-донорів трансфер-фактору антирабічного використали свиней породи велика біла, масою тіла 80 - 90 кг, віком 7 - 8 міс., а як тварин-реципієнтів - білих нелінійних мишей масою 18 - 20 г та нелінійних морських свинок масою 250 - 300 г. Всього використано 20 голів свиней, 100 морських свинок та 300 білих мишей.

Для імунізації свиней з метою отримання трансфер-фактору та вивчення реакцій клітинного та гуморального імунітету при введенні антирабічної вакцини застосовували інактивовану концентровану антирабічну культуральну вакцину КоКАВ, виготовлену із культури виробничого штаму вірусу сказу “Внуково-32”, виробництва НДІ поліомієліту та вірусних енцефалітів РАМН. Як антиген при вивченні протективних властивостей трансфер-фактору антирабічного використовували вірулентний штам вірусу сказу CVS. При вивченні ад'ювантних властивостей препарату трансфер-фактору за антирабічної імунізації лабораторних тварин застосовували вакцину антирабічну інактивовану суху культуральну із штаму “Щолково 51-К” серія № 2 (Херсонська державна біофабрика). Як алерген для постановки реакції гіперчутливості сповільненого типу було взято вакцину КоКАВ та інактивований вірус сказу штаму CVS.

При проведенні досліджень за принципом аналогів сформували три групи свиней, по 6 голів у кожній. Тварин першої групи імунізували одноразовим введенням вакцини. Свиням другої групи вакцину вводили триразово - на першу, сьому та 21-у добу, а третьої групи (контроль) замість вакцини вводили стерильний апірогенний 0,85% розчин NaCl. Препарат вводили внутрішньом'язово в дозі 1,5 см3 у привушній ділянці каудального косого м'яза голови. У тварин відбирали кров до ін'єкції, через 6 діб після першого та через 6 діб після третього введення вакцини з метою визначення антирабічних антитіл.

Забій тварин першої групи і відбір матеріалу для виготовлення діалізного екстракту лімфоцитів проводили на 7 добу після одноразового введення вакцини, другої - на 7 добу після третьої вакцинації, третьої - одночасно з тваринами другої групи. Забивали по 3 свині з кожної групи.

Визначення концентрації антитіл у сироватці крові піддослідних тварин, специфічних щодо вірусу сказу, проводили за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу із застосуванням тест-системи діагностичної імуноферментної “ІФА RABIES AB”, виготовленої в лабораторії ветеринарної мікробіології, вірусології та імунобіотехнології НАУ (ТУУ 24.4).

Стан гіперчутливості сповільненого типу у тварин-донорів визначали за допомогою алергійної проби при внутрішньошкірному введенні 0,01 імунізуючої дози рабічного антигену та in vitro - в реакції інгібіції міграції лейкоцитів (РІМЛ) у пластикових чашках Петрі під шаром агарози за методикою Г.Фрімеля (1987). Постановку шкірної проби та відбір крові для РІМЛ проводили через 6 діб після одноразового та триразового введення вакцини.

У вакцинованих свиней визначали такі показники імунітету : вміст лімфоцитів та їх субпопуляцій (Т-теофілінрезистентних та Т-теофілінчутливих, В- і 0-клітин) - за розеткоутворенням з еритроцитами барана за методикою И.А. Бакулова (1998) та Г.Фрімеля (1987), загального білку - за методом біуретової реакції, а його фракцій у сироватці крові - методом електрофорезу на папері (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Концентрацію циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) визначали в динаміці: до вакцинації, на першу, другу, третю, сьому та 21-у добу після вакцинації методом ПЕГ-преципітації (Digeon M., Bach J., 1977). Розмір імунних комплексів визначали згідно скринінг-тесту за оцінкою патогенних властивостей ЦІК (Стручков П.В. и др., 1985). Трансфер-фактор отримували з діалізованих екстрактів лімфоцитів органів лімфоїдної системи свиней, у яких відзначався стан виразної сенсибілізації. Клітини руйнували шляхом десятикратного заморожування - відтанення при температурах відповідно - 400 С та + 370 С у присутності панкреатичної ДНКази-1 і MgSO4. Ряд зразків препарату піддавали обробці ультразвуком при частоті 22 кГц протягом 10 секунд двократно (Lawrence H.S. et al., 1974). Після осадження клітинного детриту екстракт діалізували при 40 С протягом 24 годин проти стерильної апірогенної дистильованої води. Досліджували наступні зразки ДЕЛ - ТФС-1 (виділений із селезінок одноразово вакцинованих свиней), ТФл/в-1 (виділений із лімфатичних вузлів триразово вакцинованих свиней), ТФС-3 та ТФл/в-3 (виділені із відповідних лімфоїдних органів триразово вакцинованих свиней) і Рабіфарм - комбінований ДЕЛ селезінок та лімфатичних вузлів одноразово вакцинованих свиней. Кожний зразок діалізату перевіряли на стерильність шляхом посіву на м'ясо-пептонний агар (МПА). Препарати зберігали у морозильній камері при -18є С.

Амінокислотний склад препарату визначали методом іоннообмінної хроматографії на автоматичному амінокислотному аналізаторі ААА - 339 М, виробництва “ Мікротехнс ” (Прага) за методикою D.H. Spackman et al. (1968).

Для перенесення гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ) з викорстанням отриманих зразків трансфер-фактору реципієнтами слугували нелінійні морські свинки та білі миші. Одна доза ТФ відповідала діалізату 4 х 108 клітин. ТФ морським свинкам вводили підшкірно. Через шість діб після сенсибілізації кожній свинці внутрішньошкірно на внутрішній поверхні стегна вводили по 0,05 мл антирабічної вакцини КоКАВ в розведенні 1 : 10. Білим мишам зразки антигеноспецифічного та неспецифічного трансфер-фактору вводили внутрішньочеревно в тій же дозі. Через шість діб в плюсневий м'якуш правої лапи вводили по 0,05 мл антирабічної вакцини КоКАВ у розведенні 1 : 10, а у м'якуш лівої - стерильний апірогенний 0,85 % розчин NaCl в тому ж об'ємі. Товщину шкірної складки вимірювали перед введенням алергену та через 24, 48, 72, 96 годин після введення до повного зникнення набряку та еритеми. Результати перенесення стану ГСТ ксеногенним реципієнтам визначали за допомогою реакції інгібіції міграції лейкоцитів, оброблених досліджуваними зразками ТФ, у пластикових чашках Петрі під шаром агарози за методом Г.Фрімель (1987). Для сенсибілізації лейкоцитів селезінок інтактних мишей застосовували зразки трансфер-фактору антирабічного, отримані із лімфоїдних органів одноразово (ТФС-1, ТФл/в-1) та триразово (ТФС-3, ТФл/в-3) вакцинованих свиней.

Здатність Т-лімфоцитів до формування Е-розеток під впливом ТФ вивчали у реакції розеткоутворення з еритроцитами барана та відновлення розеткоутворення у трипсинізованих клітин за методикою И.А. Бакулова (1998).

Інтенсивність бластоутворення тест-лімфоцитів периферійної крові морських свинок, сенсибілізованих ТФ та антирабічною вакциною КоКАВ, досліджували за допомогою реакції бластоутворення лімфоцитів у присутності специфічного антигену та фітогемаглютиніну, рекомендованою Arala-Chaves M.P. et al. (1987).

Визначення впливу тестованих зразків ТФ на фагоцитарну активність нейтрофілів морських свинок та перитонеальних макрофагів мишей проводили мікроскопічним методом (Бакулов И.А., 1998). Як об'єкт фагоцитозу використовували суспензію дріжджів. Вираховували активність та індекс фагоцитозу.

Вплив ТФ антирабічного і рекомбінантних б- та г-інтерферонів (Комбіферон) на оксидативну активність поліморфонуклеарних лейкоцитів (ПМНЛ) кролів вивчали за продукцією пероксиду водню і окисленні ним фенолового червоного (Pick E., Keisari Y., 1980). Ад'ювантні властивості ТФ досліджували на морських свинках, при введенні тестованих зразків ТФ за добу, одночасно та на наступну

добу після імунізації тварин антирабічною вакциною КАВ. Вакцину вводили триразово : на першу, сьому та 28-у добу. Кров відбирали за дві доби перед початком досліду і через п'ять діб після другої та третьої вакцинації, в якій досліджували гематологічні та імунологічні показники: загальну кількість лімфоцитів, Т- теофілінрезистентних і Т-теофілінчутливих, інтенсивність бластоутворення під впливом ФГА і специфічного антигену ( Бакулов И.А., 1998).

Протективні властивості зразків ТФ визначали на 14 групах нелінійних білих мишей по 6 тварин в кожній. Досліджувані зразки ТФ вводили за різними схемами до, одночасно та після зараження. Зараження тварин проводили вірулентним штамом вірусу сказу (CVS), який вводили внутрішньом'язово в дозі 200 мкл (100 LD50), який готували із 20% мозкової суспензії мишей, заражених інтрацеребрально, при розведенні 1:100

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за комп'ютерною програмою MS Excel. Середню арифметичну (М) визначали за функцією СРЗНАЧ; стандартне відхилення (у) - за функцією СТАНДОТКЛОН; помилку середньої арифметичної (m) - за формулою :

m = у / v n ;

Вірогідність різниці між середніми показниками у тварин досліджуваних груп визначали за функцією ТТЕСТ.

Результати власних досліджень

Дослідження імунітету тварин-донорів трансфер-фактору. На початку досліджень здійснили імунізацію свиней-донорів трансфер-фактору антирабічною вакциною. Дослідження реакцій клітинного імунітету за антирабічної імунізації показали, що більш виражена алергійна реакція спостерігалась у тварин, яким антирабічну вакцину КоКАВ вводили триразово. Товщина шкірної складки на 48-у годину після внутрішньошкірного введення алергену набула у них максимального значення та становила 1,72 ± 0,045 см і перевищувала аналогічний показник до вакцинації на 1,35 см та на 0,47 см - показники одноразово вакцинованих свиней (Р < 0,01). У всіх дослідних тварин потовщення шкірної складки супроводжувалося еритемою та локальною гіпертермією, які зникали через 96 - 120 годин.

Крім алергійної проби здійснили постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів (РІМЛ) периферійної крові. Середня маса спроектованих зон міграції лейкоцитів тварин контрольної групи становила 11,01 ± 0,969 мг, першої дослідної групи - 7,10 ± 0,592 мг, а індекс міграції (ІМ) після одноразового введення вакцини становив у присутності антигену 0,65 ± 0,086. Після третього введення вакцини середня маса спроектованих зон міграції лейкоцитів у свиней другої групи становила 6,28 ± 0,432 мг, а ІМ - 0,58 ± 0,063. Різниця за ІМ лейкоцитів після одноразової та триразової вакцинації була невірогідною. Отримані в РІМЛ показники сенсибілізації свиней-донорів ДЕЛ підтверджують дані алергійної проби та свідчать про перевагу її інтенсивності при триразовому введенні антирабічної вакцини.

Дослідження кількості лімфоцитів крові свиней показало їх збільшення вже на першу добу після вакцинації (Р < 0,001), а на третю добу цей показник набув максимального значення. Подібна тенденція спостерігалася і щодо Т- і В-лімфоцитів (табл. 1). Активація теофілінчутливих Т-клітин спостерігалась на 14-у і 21-у добу, що виражалась у зростанні їх абсолютної кількості до 1,12 ± 0,054 Г/л (Р < 0,001). Після триразового введення вакцини свиням другої групи загальна кількість лімфоцитів периферійної крові на третю добу перевищувала на 1,70 Г/л аналогічний показник, отриманий після одноразової вакцинації (Р < 0,001). Коливання відносної кількості В-лімфоцитів були незначними (Р > 0,05), однак абсолютна їх кількість вірогідно перевищувала аналогічні показники однократно вакцинованих тварин. Максимального значення кількість В-лімфоцитів набула на сьому добу і становила 3,62 ± 0,369 Г/л, що вірогідно перевищувало показники до імунізації (Р < 0,001) і аналогічні показники після одноразового введення вакцини (Р < 0,01). Абсолютна кількість Т-теофілінрезистентних клітин (хелперів) на третю та сьому добу перевищував відповідно на 2,11 та 4,87 Г/л аналогічні показники після одноразової вакцинації (Р < 0,001).

Таблиця 1 Вміст лімфоцитів та їх популяцій в периферійній крові свиней після одноразового введення антирабічної вакцини