Отримання трансфер-фактору антирабічного та його імунобіологічні властивості

Менш активними виявилися ДЕЛ із клітин лімфатичних вузлів одноразово (ТФл/в-1) та триразово (ТФл/в-3) вакцинованих свиней (ІМ становили 49,24 та 53,66 % відповідно). При обробці тест-клітин розведеннями зразків антигеноспецифічного трансфер-фактору більшими, ніж 1 : 2, пригнічення міграції лейкоцитів виявилося невірогідним (Р > 0,05). Без повторного контакту з рабічним антигеном, пригнічення міграції клітин, інкубованих з ТФ, не спостерігалося. Отже, отримані дані вказують на чіткий прояв антигеноспецифічної індукції препаратами ТФ клітинного імунітету у ксеногенних реципієнтів.

Протективна активність трансфер-фактору антирабічного. Встановлено, що при одноразовому внутрішньом'язовому введенні мишам ТФ, виділеного із селезінок триразово вакцинованих донорів, за добу до зараження вірулентним штамом вірусу сказу CVS, а також одночасно із зараженням спостерігався виразний захисний ефект тестованого зразку. Так, при введенні ТФ у дозі 100 мкл (еквівалентно діалізату 4 х 107 кл) індекс захисту склав 50 %, а при введенні 40 мкл (еквівалентно діалізату 2,5 х 107 кл) - 16,7... 32,4 %. При цьому вищим він був у тварин, яким препарат вводили за добу до зараження. Усі миші, яким ввели неспецифічний ДЕЛ та тварини контрольної групи, загинули. При внутрішньом'язовому введенні ТФ, виділеного з лімфоїдних органів одноразово вакцинованих свиней, у дозі 200 мкл (еквівалентно діалізату 8 х 107 кл) послідовно за 7, 5, 3 та 1 добу до зараження, виживало 83,3 % інфікованих вірусом сказу мишей, що на 50 % перевищувало індекс захисту (ІЗ) тварин, яким ТФ вводили щоденно протягом семи діб до зараження. Слід відзначити, що чотирикратне превентивно-терапевтичне введення ТФ на 3-у і 1-у добу до та на 1-у та 3-у добу після зараження призвело до попередження загибелі 5 із 6 інфікованих мишей (ІЗ становив 83,3 %).

Аналіз отриманих даних показав, що захисний ефект досліджуваних зразків ТФ антирабічного спостерігався як за профілактичного, так і за лікувального його введення. Оптимальним виявилося багатократне введення з інтервалом у дві доби. Застосування ТФ пізніше третьої доби після зараження було неефективним.

Висновки

1. Експериментально обґрунтовано отримання активних зразків трансфер-фактору антирабічного при імунізації свиней-донорів концентрованою культуральною антирабічною вакциною, визначено його імунобіологічну активність щодо модуляції факторів клітинного імунітету у ксеногенних реципієнтів та встановлено протективну дію трансфер-фактору у білих мишей при експериментальній рабічній інфекції.

2. Встановлено, що зразки трансфер-фактору антирабічного, отримані із лімфоїдних органів при триразовому введенні свиням-донорам вакцини КоКАВ, за здатністю стимулювати провідні імунологічні показники, переважають аналогічні зразки при одноразовому введенні вакцини (Р < 0,001). Причому, більш активними виявилися зразки ТФ із селезінок, ніж з лімфовузлів.

3. Здійснено перенос активного клітинного імунітету до збудника сказу від імунних свиней до інтактних реципієнтів (морських свинок та білих мишей). Це підтверджують результати досліджень індукованого стану гіперчутливості сповільненого типу методами РІМЛ та алергійної шкірної проби.

4. Отримані зразки трансфер-фактору антирабічного активують неспецифічні фактори клітинного імунітету, зокрема: стимуляцію продукції пероксиду водню нейтрофілами, фагоцитарну активність поліморфонуклеарних лейкоцитів та макрофагів.

5. Комбіноване застосування антирабічної вакцини КоКАВ та трансфер-фактору антирабічного стимулює бласттрансформацію лімфоцитів у присутності специфічного антигену та мітогену ФГА (Р < 0,001).

6. Одержані зразки трансфер-фактору стимулюють Е-розеткоутворення у нетрипсинізованих та відновлюють його у трипсинізованих тест-лімфоцитів як у нативному, так і розведеному стані - від 1:10 до 1:1000.

7. Зразки трансфер-фактору антирабічного при парентеральному введенні у різні строки проявляють чіткий протективний ефект у білих мишей при відтворенні експериментальної рабічної інфекції. Найбільш виражений протективний ефект (83,3 %) спостерігався при чотириразовому введенні трансфер-фактору до зараження із кратністю один раз на 2 доби та чотириразовому превентивно-терапевтичному введенні його за 3 і 1 добу до та на 1-у і 3-ю добу після зараження.

Пропозиції виробництву

З метою поліпшення імуногенності препаратів, які застосовуються для профілактики сказу, використовувати у якості ад'юванту трансфер-фактор антирабічний, попередньо модифікувавши технологію отримання та схеми застосування відповідних препаратів.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Столюк В.В., Скибіцький В.Г., Березанська А.В. Вплив антирабічного трансфер-фактору на деякі показники клітинного імунітету морських свинок // Науковий вісник НАУ.- Вип. 50.- 2002.- С.189 - 191. (Дисертант провів дослідження, здійснив статиститичну обробку та аналіз отриманих результатів).

2. Столюк В.В., Скибіцький В.Г., Король Д.М.Вивчення впливу ксеногенних еритроцитів і імуномодуляторів на фагоцитарну активність перитонеальних макрофагів мишей // Науковий вісник НАУ, Вип. 63.- 2002.- С.177 - 179. (Дисертант провів дослідження та аналіз отриманих результатів).

3. Столюк В.В. Скибіцький В.Г., Березанська А.В. Вивчення впливу трансфер-фактору, специфічного щодо збудника сказу, на фагоцитарну активність нейтрофілів морських свинок // Ветеринарна медицина України.- 2003.- № 6.- С. 34 - 35. (Дисертант виконав експериментальну частину дослідження та аналіз результатів).

4. Столюк В.В. Оксидативна активність поліморфонуклеарних лейкоцитів під впливом цитокінів // Вісник аграрної науки.- 2003.- № 9.- С. 73 - 74.

5. Столюк В.В., Скибіцький В.Г. Імуномодулюючі властивості трансфер-фактору активного імунітету // Вісник аграрної науки - 2003.- № 10.- С. 32 - 34.. (Дисертант виконав експериментальну частину дослідження, статистичну обробку та аналіз результатів).

6. Столюк В.В. Проблеми культивування вірусу сказу в культурах клітин // Тези доповідей наукової конф. професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів ФВМ НАУ.- К.: НАУ.- 2001.- С. 33.

7. Столюк В.В. Вивчення ад'ювантних властивостей трансфер-фактору, специфічного щодо збудника сказу // Тези доповідей 1 Конф. професорсько-викладацького складу і аспірантів ННІ ВМЯБП АПК.- К.: НАУ. 2002.- С. 93 - 94.

8. Новіцька О.В., Скибіцький В.Г., Чумак Р.М., Столюк В.В. Розробка імуноферментного діагностикуму при сказі // Тези доповідей 1 Конф. професорсько-викладацького складу і аспірантів ФВМ НАУ.- К.: НАУ.- 2002.- С. 70.

Анотація

Столюк В.В. Отримання трансфер-фактору антирабічного та його імунобіологічні властивості. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженню показників клітинного імунітету при антирабічній вакцинації та вивченню імунобіологічної активності трансфер-фактору антирабічного - діалізного екстракту лімфоїдних клітин імунізованих проти сказу свиней. Проведено комплексне дослідження впливу ТФ на фактори клітинного імунітету та індукцію антигеноспецифічної гіперчутливості сповільненого типу щодо збудника сказу у інтактних реципієнтів, а також протективної активності зразків ТФ при експериментальній рабічній інфекції. На основі отиманих результатів досліджень запропоновано схему сенсибілізації свиней-донорів для отримання антигеноспецифічних зразків трансфер-фактору. Встановлено, що одноразова та триразова імунізація забезпечують індукцію трансфер-фактору антирабічного в організмі донорів. Вперше отримано зразки трансфер-фактору активного імунітету проти вірусу сказу. Більш активними

виявилися зразки, отримані із селезінок триразово вакцинованих свиней. Доведено можливість індукції активного клітинного імунітету до збудника сказу у ксеногенних реципієнтів за допомогою трансфер-фактору антирабічного, а також визначено потективну активність отриманих зразків ТФ антирабічного при сказі тварин. Встановлено, що внутрішньом'язове введення ТФ до та після зараження вірулентним штамом вірусу сказу призводить до виживання 50 - 83,3 % заражених мишей. Виявлена антигеноспецифічність, імуномодулююча та протективна активність трансфер-фактору антирабічного створюють основу для подальших досліджень у даному напрямку та вказують на перспективи використання даного препарату у системі боротьби зі сказом.

Ключові слова : сказ, клітинний імунітет, трансфер-фактор, імуномодулятори, інтерлейкіни.

Аннотация

Столюк В.В. Получение трансфер-фактора антирабического и его иммунобиологические свойства. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2003.

Диссертация посвящена исследованию факторов клеточного иммунитета при антирабической иммунизации и изучению иммунобиологической активности трансфер-фактора антирабического (ТФ) - диализированного экстракта лимфоидных клеток вакцинированных против бешенства свиней. Проведено комплексное исследование влияния ТФ на факторы клеточного иммунитета и индукцию антигеноспецифической гиперчувствительности замедленного типа относительно возбудителя бешенства у интактных реципиентов, а также протективной активности образцов ТФ при экспериментальной рабической инфекции. На основании полученных результатов предложена схема сенсибилизации свиней-доноров для получения трансфер-фактора антирабического. Установлено, что однократное и трехкратное введение антирабической вакцины КоКАВ обеспечивают индукцию активного антирабического трансфер-фактора в организме доноров ДЭЛ. Впервые получены образцы трансфер-фактора активного иммунитета к вирусу бешенства. Доказана возможность индукции клеточного иммунитета к возбудителю бешенства у ксеногенних реципиентов с помощью трансфер-фактора антирабического.

Выявлено, что внутримышечное введение ТФ до и после заражения вирулентным штаммом вируса бешенства обеспечивало выживание 50 - 83,3 % зараженных мышей. Выявленная антигеноспецифичность, иммуномодулирующая и протективная активность трансфер-фактора антирабического создают предпосылки для дальнейших исследований в данном направлении и указывают на перспективы использования его в системе борьбы с бешенством.

Ключевые слова: бешенство, клеточный иммунитет, трансфер-фактор, иммуномодуляторы, интерлейкины.

Summary

Stolyuk V.V. Obtaining of rabies specific transfer-factor and its immunobiological properties. - Manuscript.

Thesis on PhD degree on speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virology. - National Agrarian University, Kyiv, 2003.

The dissertation is devoted to investigation of indexes of cellular immunity in rabies vaccination and studying of immunological activity of rabies specific transfer-factor (TF) - dialyzable lymphocyte extracts (DLE) obtained from vaccinated pigs. In the process of investigation ascertained, that threefold injection of concentrated rabies vaccine CоCАV caused more intensive activation of cellular and humoral immunity factors, than single (P < 0,001) and the reactions of antigen-specific delayed hypersensitivity were more significant in threefold vaccinated pigs, as confirmed by results of allergic skin test and reaction of inhibition of leukocyte migration.

Indexes of test-leucocytes migration were less in samples from threefold vaccinated pigs in inhibition migration assay. Obtained from pigs-donors samples showed characteristic properties when injected to the intact recipients.

Rabies specific transfer-factor carried out transferring of rabies-specific delayed hypersensitivity. It was confirmed in the skin test by thickening of crumb folds in mice treated by different samples of TF. As ascertained, the thickness of crumb folds in animals, treated by TF, derived from spleens of threefold vaccinated pigs, was significantly higher (P < 0,01), than in mice treated by TF, obtained from spleen cells and lymphatic nodes of once vaccinated pigs. Nonspecific samples of DLE didn't induce thickening of the crumb folds of tested mice in response to intradermal injection on specific allergen.

They also stimulated production of inhibition migration factor in intact spleen leukocytes population, pretreated by tested TF samples and rabies virus antigen. The results of aminoacid analysis showed, that the highest content had glutamine - 28,8 mg/100ml, less - proline - 26,1 mg/100ml and leucine - 21,4 mg/100ml.

An investigation of immunobiological properties of rabies-specific transfer-factor demonstrated stimulation in vitro of the respiratory burst and Н2О2 production by rabbit neutrophilic granulocytes. Thus, in comparison with recombinant б- and г-interferons, respiratory burst stimulation by TF was higher (P < 0,01), that confirmed in increasing of cultural media optical density.

Intramuscular injection of transfer factor to the intact mice caused enhancing of phagocytosis activity of their peritoneal macrophages. As ascertained, the part of active phagocitic macrophages was higher in samples of peritoneal exudates, obtained from mice, treated with undiluted transfer-factor, less - from animals, simultaneously treated by rabies specific TF and recombinant б- and г-interferons preparation.

Combined subcutaneous injection of TF and rabies vaccine caused increasing of peripheral blood neutrophils phagocytosis in guinea pigs. It was found, that neutrophils phagocitic activity was increased in groups of mice, where rabies specific transfer-factor was injected one day before the first vaccination. The least phagocitosis activity was in animals, treated by vaccine without TF.

A research of adjuvant properties rabies-specific transfer-factor ascertained, that either simultaneous injection of TF preparation and CoCAV to the guinea pigs or 24 hours before and after vaccination stimulated Т-lymphocyte production, especially Т-helpers. As found, T-helpers containing in peripheral blood of animals in tested groups was higher, than in control, which received only rabies vaccine (P < 0,001). Changes in containing of Т-supressors in animals of tested groups wasn't significant (P > 0,05).

An investigation of influence of TF on lymphoblast formation showed, that threefold combinated rabies vaccine and DLE, obtained from spleen of vaccinated pigs caused significant increasing blasttransformation of tested lymphocytes either in presence of specific antigen or phytohemaglutinine. The most effective was simultaneous injection of DLE, obtained from spleens of threefold vaccinated pigs and CoCAV.

A research of E-rosette formation in test-lymphocytes showed, that TF samples, obtained from lymphoid cells of vaccinated pigs had an property to restore an ability of test-lymphocytes, pretreated by tripsine solution to form E-rosette. As found, there were great dimensions of TF activity. Thus, the most active were samples, obtained from lymphoid cells of threefold vaccinated pigs, the least - samples from lymph nodes of single vaccinated donors. Mixed preparation obtained by combination of spleen and lymph nodes derivates from single vaccinated donors was also significantly effective.

In the assay of protective activity, ascertained, that either pre- or postexposure intramuscular injection of TF induced survival of 50 - 83,3 % of experimentally CVS-infected mice. Protection of rabid mice depended on the dose of injected TF, the frequency of injection and schedule of usage. As found, the most effective was fourfold preexposure injection of transfer-factor with two days intervals. When injected after third day post exposure, it was found ineffective. Rabid mice in the control groups showed typical development of generalized paralysis and died by 9 - 10th day.

Found specificity, immunomodulating and protecting activities inspire further investigations on the field of rabies-specific transfer factor and provide the possibility to use this immunomodulator for improving of rabies management system.

Key words: rabies, cellular immunity, transfer-factor, immunomodulators, interleukins.

Размещено на Allbest.ru