Структура деяких органів нервової та імунної систем за умов демієлінізації та ремієлінізації

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет імені О.О. Богомольця

УДК: 616.831-005.8-004+616.411+616.438]-018-08:615.849.19

Структура деяких органів нервової та імунної систем за умов демієлінізації та ремієлінізації

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Мельник Наталія Олексіївна

Київ 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Науковий консультант член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Чайковський Юрій Богданович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри гістології та ембріології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Скибо Галина Григорівна, Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, завідуюча відділом цитології;

доктор медичних наук, професор Сільченко Валерій Петрович, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра патологічної та топографічної анатомії, завідувач кафедри;

доктор медичних наук, професор Сирцов Вадим Кирилович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач кафедри.

Провідна установа Дніпропетровська державна медична академія, кафедра цитології та ембріології, МОЗ України, м. Дніпропетровськ.

Захист відбудеться “ 24 ” травня 2005 р. о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, проспект Перемоги, 34, морфологічний корпус).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “_23_” квітня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук, професор Грабовий О.М.

демієлінізація нервовий імунний інтерферон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Демієлінізуючі захворювання - це найбільш поширені захворювання центральної (ЦНС) та периферійної (ПНС) нервової систем, у яких основним патоморфологічним проявом є руйнування мієлінової оболонки нервових волокон. Останніми роками відмічена стійка тенденція до збільшення частоти демієлінізуючих захворювань (Віничук С.М., Мяловіцька О.А., 2001). На сьогоднішній день доведено, що в основі етіології демієлінізуючих захворювань лежить взаємодія пошкоджуючих факторів зовнішнього середовища та спадкової схильності (Бутенко Г.М., 2002; Завалишин И.А., Головкин В.И., 2000; Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н., 1997). До числа найбільш розповсюджених демієлінізуючих захворювань у ЦНС відноситься розсіяний склероз (РС) (Пономарев В.В., 2002). Не дивлячись на більш ніж сторічне вивчення РС, етіологія цього захворювання залишається не вивченою, не достатньо досліджені патогенез активної та ремітуючої стадій цього захворювання (Лисяный Н.И., 2003). Більшість дослідників РС вважають, що ключовим механізмом патогенезу хвороби є демієлінізація, яка ініціюється аутоімунними процесами. Це призводить до реакції проти власних антигенів мієлінових оболонок нервових волокон (Дранник Г.Н., 1999; Лисяний Н.И., Горобец О.Б., 1994). В останні роки з'являються дані наукової літератури, які характеризують демієлінізуючі захворювання як аутоімунні нейродегенеративні, що супроводжуються пошкодженням нейронів, яке призводить до атрофії ЦНС та стійкого неврологічного дефіциту (Негрич Т.І., 2004; Заприянова Э., Сотников О.С., Сергеева С. С., Делева Д., Филчев А., Султанов Б., 1998).

Найбільш ефективними імунокорегуючими препаратами при демієлінізуючих захворюваннях є рекомбінантні в-інтерферони (препарати “Ребіф”, “Бетаферон”), які мають високу вартість і вимагають тривалого використання для отримання бажаного ефекту (Гусев Е.И., Бойко А.Н., 2000; Wang X., 2000). Експериментальні дослідження з вивчення органів ЦНС та центральних і периферійних органів імунітету після використання таких препаратів у науковій літературі відсутні.

Досить давно для лікування таких захворювань використовують фізичні фактори, зокрема лазерне опромінення (ЛО) (Гамалея Н.Ф., 1972; Атаманова Е.В., 1998; Паненко А.В., Подвысоцкий А.А., 1998; Тондий О.Л., 1998). Під впливом різноманітних фізіотерапевтичних факторів (УФ-опромінення, ультразвук), які були проведені на ділянку тіла щурів у проекції селезінки, спостерігали посилення гуморального імунітету, мітотичну активність та диференціацію лімфоцитів (Мидленко В.И., Архипов Т.С., Ибрагимов Е.К., 1990). Імуностимулюючий ефект локальної дії фізичних факторів на імунокомпетентні органи був підтверджений і в клінічних дослідженнях (Пономаренко Г.Н., 1998). Загалом, більшість даних з наукової літератури про використання ЛО в медицині були отримані при клінічних дослідженнях. Експериментальні дослідження впливу ЛО на стан органів імунітету за умов демієлінізації відсутні.

Загальновизнаною експериментальною моделлю для вивчення етіології, лікування та профілактики демієлінізуючих захворювань ЦНС є експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ) (Марков Д.А., Абрамчик Г.В., 1978; Марков Д.А., Пашковская М.И., 1979; Лися-
ний М.І., Маркова О.В., Бєльська Л.М., 2001; Zaprianova E., Deleva D., Filchev A., 1998).

Усе вище викладене свідчить про необхідність проведення комплексних досліджень на мікроскопічному та субмікроскопічному рівнях органів ЦНС та центральних і периферійних органів імунної системи з використанням моделі демієлінізуючого захворювання - ЕАЕ. З метою пошуку ефективних методів лікування патологічного процесу - демієлінізації, важливе значення можуть мати дослідження використання рекомбінантного в-інтерферону-1а та лазерного опромінення у різних дозах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана на кафедрі гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця у відповідності з основним планом науково-дослідних робіт кафедри “Вивчити регенерати шкіри та реактивні зміни нервової системи за умов дії деяких фізіологічних та патологічних факторів”, № держреєстрації 0100U002640 (здобувач - відповідальний виконавець теми), 2000-2002 рр. та “Вивчити органи імунного захисту та регенерати шкіри за умов деяких патологічних та відновлювальних процесів”, № держреєстрації 0103U000876 (здобувач - відповідальний виконавець теми), 2003-2005 рр.

Мета і задачі дослідження. Визначити морфологічні зміни органів центральної нервової та імунної систем за умов демієлінізації, ремієлінізації та імунотропних впливів рекомбінантного в-інтерферону-1а і ЛО для отримання оптимальних умов відновлення в ЦНС. Досягнення цієї мети базувалося на вирішенні наступних задач:

1. Вивчити на мікроскопічному та субмікроскопічному рівнях морфологічні зміни у стовбурі головного мозку, мозочку та спинному мозку щурів з ЕАЕ та порівняти отримані дані з будовою відповідних органів у інтактних щурів.

2. Визначити на мікроскопічному рівні морфологічні зміни та зміни складу лімфоцитів у центральному органі імунного захисту - тимусі та периферійному органі імунітету - селезінці у щурів з ЕАЕ і порівняти отримані дані з будовою та складом лімфоїдної популяції у тимусі та селезінці інтактних тварин.

3. Дослідити на мікроскопічному та субмікроскопічному рівні зміни у складі органів ЦНС під впливом різних доз рекомбінантного в-інтерферону-1а (препарату “Ребіф”) у ранні та віддалені терміни і порівняти з будовою цих же органів у інтактних щурів та контрольних щурів - з ЕАЕ.

4. Визначити на мікроскопічному рівні особливості будови та зміни лімфоїдної популяції в органах імунного захисту (тимуса та селезінки) після застосування різних доз рекомбінантного в-інтерферону-1а (препарату “Ребіф”) у ранні та віддалені терміни і порівняти з будовою та складом лімфоїдної популяції цих же органів у інтактних щурів і контрольних щурів - з ЕАЕ.

5. Визначити на мікроскопічному та субмікроскопічному рівнях зміни у складі органів ЦНС під впливом різних доз ЛО у ранні та віддалені терміни і порівняти з будовою цих же органів інтактних щурів і контрольних щурів - з ЕАЕ.

6. Дослідити на мікроскопічному рівні особливості будови та зміни у складі лімфоїдної популяції центрального (тимуса) і периферійного (селезінка) органів імунного захисту після застосування різних доз ЛО у ранні та віддалені терміни і порівняти з будовою та вмістом різних форм лімфоцитів цих же органів у інтактних щурів і контрольних щурів - з ЕАЕ.

7. Розробити експериментальний метод направленої дії препарату “Ребіф” та ЛО при демієлінізації нервових волокон у ЦНС з метою прискорення ремієлінізації нервових волокон.

Об'єкт дослідження - нейрони стовбура головного мозку, клітини Пуркін'є мозочка та нейрони сірої речовини поперекового відділу спинного мозку; центральний орган імунного захисту - тимус та периферійний орган імунного захисту - селезінка у інтактних щурів, щурів з експериментальним алергічним енцефаломієлітом та після використання препарату “Ребіф” і ЛО у різних дозах.

Предмет дослідження - морфологічні зміни тіл нейронів і мієлінових нервових волокон, зміни у будові та складі лімфоїдної популяції у тимусі та білій пульпі селезінки за умов введення різних доз препарату “Ребіф” і використання ЛО у різних дозах у ранні та віддалені терміни.

Методи дослідження - неврологічні - для дослідження клінічної картини ЕАЕ у щурів; загальногістологічні - для визначення морфологічних змін стану судин гемомікроциркуляторного русла (ГМЦР) стовбура головного мозку, мозочка та поперекового відділу спинного мозку, для вивчення змін у будові тимуса та білої пульпи селезінки; нейрогістологічні - для вивчення стану тіл нейронів стовбура головного мозку, поперекового відділу спинного мозку та клітин Пуркін'є мозочка; ультрамікроскопічні - для визначення особливостей стану мієлінових нервових волокон у інтактних щурів, за умов ЕАЕ та після проведення ін'єкції препарату “Ребіф” і ЛО у різних дозах; морфометричні методи - для визначення індексу Гертвіга (ІГ) тіл нейронів у органах ЦНС, для отримання співвідношення площі осьового циліндру та мієлінової оболонки нервових волокон, для визначення співвідношення площі кіркової та мозкової речовини часточок тимуса і отримання відсоткових співвідношень різних відділів білої пульпи селезінки, для проведення аналізу лімфоїдної популяції тимусу та селезінки, для статистичної обробки і порівняння отриманих морфометричних показників у інтактних, контрольних та експериментальних тварин після використання препарату “Ребіф” та проведення лазерного опромінення.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше за допомогою світлооптичних досліджень отримані нові наукові дані про кількісні та якісні зміни стану тіл нейронів у складі стовбура головного мозку, клітин Пуркін'є у мозочку та тіл нейронів у поперековому відділі спинного мозку при ЕАЕ та введенні різних доз препарату “Ребіф” і використання ЛО у різних дозах.

За допомогою ультрамікроскопічних та морфометричних методів дослідження отримані нові дані щодо змін стану мієлінових нервових волокон при ЕАЕ після використання препарату “Ребіф” та ЛО у різних дозах.

Вперше відмічена динаміка змін морфо-функціонального стану різних відділів часточок тимуса та білої пульпи селезінки при ЕАЕ після введення препарату “Ребіф” і застосування ЛО у ранні та віддалені терміни дослідження.

Отримані нові дані щодо особливостей змін лімфоїдної популяції у складі трьох зон часточок тимуса - субкапсулярній, кірковій речовині та мозковій речовині за умов ЕАЕ та після проведення ін'єкцій препарату “Ребіф” у різних дозах і використання ЛО у різних дозах у ранні і віддалені терміни.

Досліджені зміни кількісного складу різних форм лімфоцитів у трьох зонах білої пульпи селезінки - периартеріальній, реактивному центрі та маргінальній при ЕАЕ та після введення препарату “Ребіф” і застосування ЛО при різних дозах та різних термінах дослідження.

Вперше визначена динаміка кількісних змін дегенеративних форм великих, середніх і малих лімфоцитів у тимусі та білій пульпі селезінки щурів при ЕАЕ, після введення препарату “Ребіф” і використання ЛО у різних дозах у ранні та віддалені терміни дослідження.

За допомогою експериментального дослідження вперше отримані оптимальні умови використання препарату “Ребіф” з метою ремієлінізації нервових волокон у щурів з ЕАЕ та отриманий патент на корисну модель “Спосіб ремієлінізації нервових волокон при експериментальному алергічному енцефаломієліті”(№3911, 7 G09В23/28).

Вперше отриманий оптимальний режим застосування ЛО для прискорення ремієлінізації нервових волокон у ЦНС при ЕАЕ та отриманий патент на винахід “Спосіб демієлінізації нервових волокон” (№45240А, Україна, МПК А61N5/06).

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що вивчення реактивних змін тіл нейронів і мієлінових оболонок нервових волокон та отримання оптимальних умов прискорення відновлювальних процесів у ЦНС можуть бути враховані в клінічній практиці: невропатології, нейрохірургії.

Визначення змін кількісного складу лімфоїдної популяції у тимусі та селезінці за умов імунокореції має суттєве значення для розробки стратегії лікування, зокрема, для використання імуносупресивних препаратів та їх різних доз.

Використання препарату “Ребіф” у щурів з ЕАЕ має практичне значення для проведення подальших експериментальних досліджень і може слугувати моделлю ремієлінізації нервових волокон (на дані результати був отриманий деклараційний патент на корисну модель).

Обґрунтована доцільність проведення ЛО у відповідних проекціях, що може бути використано для експериментальних досліджень (на дану методику був отриманий деклараційний патент на винахід) та у клінічній практиці після проведення відповідних розрахунків оптимальної дози ЛО.

Результати досліджень можуть застосовуватись при вирішенні прикладних задач гістології, цитології, імунології і патоморфології. Отримані результати дослідження впроваджені у навчальний процес на кафедрі нервових хвороб НМУ імені О.О. Богомольця та у Науково-дослідному лабораторному центрі (НДЛЦ) Національного медичного університету імені О.О. Богомольця.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проводила наукову розробку всіх отриманих результатів даної роботи. Дисертація є особистою роботою, в якій автором була визначена мета і завдання дослідження, проаналізовано понад 800 літературних джерел та патентна інформація з даної теми. Автор самостійно визначала клінічні ознаки ЕАЕ у щурів, проводила забір матеріалу, фіксацію та наступне ущільнення матеріалу, отримання гістологічних зрізів, їх забарвлення з використанням загальногістологічних, нейрогістологічних методів дослідження. Самостійно провела морфометричні та статистичні методи дослідження. Автор самостійно проводила фотографування гістологічних препаратів на мікроскопі та на ультрамікроскопах ЭМ 125К та ЭМВ 100Б.

Дисертант самостійно написала усі розділи дисертації, зробила висновки та визначила практичні рекомендації, що були відображені у запропонованих деклараційному патенті на винахід та деклараційному патенті на корисну модель. Підготовка статей, оформлення дисертаційної роботи проведені автором самостійно. Автор апробувала результати досліджень. У наукових публікаціях результатів дисертації за участю співавторів дисертанту належить основна частина внеску.

Дисертант щиро вдячна за цінні поради та допомогу у отриманні експериментальної моделі (ЕАЕ) професору, завідувачу наукового відділу нейроімунології Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України М.І. Лисяному.

Автор вдячна співробітникам відділу електронної мікроскопії НДЛЦ НМУ імені О.О. Богомольця за допомогу у проведенні ущільнення та отриманні ультрамікроскопічних зрізів нервової тканини.

Дисертант висловлює подяку за надання гелій-неонового лазера та допомогу у проведенні лазерного опромінення тварин співробітникам Інституту прикладних проблем фізики та біофізики НАН України старшому науковому співробітнику Ю.С. Плаксію та науковому співробітнику С.О. Мамілову.

За надання можливості використання програмного пакету VIDAS-2.5 (Kotron Elektronik, Німеччина), дисертант вдячна авторам - розробникам диференціації різних класів клітин лімфоїдної популяції - ректору Запорізького державного медичного університету, завідувачу кафедри патофізіології Ю.М. Колесніку та професору кафедри патологічної фізіології А.В. Абрамову.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були повідомлені на засіданнях кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, на науково-методичній конференції “Нейроімунологія в неврології та нейрохірургії” ( Київ, 2000), на науковій конференції анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів (Івано-Франківськ, 2000), на науковій конференції “Актуальні питання морфогенезу (Чернівці, 2001), на XV Міжнародній науково-практичній конференції “Применение лазеров в медицине и биологии” (Харків, 2001), на ІІ Міжнародній конференції молодих вчених і спеціалістів “Оптика - 2001” (Санкт-Петербург, 2001), на VI Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2002), на “Колосовських читаннях” (Санкт-Петербург, 2002), на ІІІ Національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Київ, 2002), на І Всеукраїнській науково-практичній конференції “Аутоімунні захворювання: імунопатогенез, імунодіагностика, імунотерапія” (Київ, 2003), на Міжнародній конференції “Лазерная физика и применения лазеров” (Мінськ, 2003), на міжнародній науково-практичній конференції “Мікроциркуляція в морфологічному і клінічному аспектах” (Івано-Франківськ, 2003), на науково-практичній конференції морфологів “Роль імунної, ендокринної та нервової систем у процесах морфогенезу та регенерації” (Запоріжжя, 2003), на VII Конгресі патологів України (Івано-Франківськ, 2003), на ІІІ Міжнародній конференції молодих вчених і спеціалістів “Оптика - 2003” (Санкт-Петербург, 2003), на 58 науково-практичній конференції студентів та молодих вчених НМУ імені О.О. Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2003), на науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження М.І. Зазибіна “Гістологія та ембріогенез периферійної нервової системи” (Київ, 2004), на науковій конференції студентів та молодих учених з міжнародною участю (Вінниця, 2004), на І Всеукраїнській науковій конференції “Карповські читання” (Дніпропетровськ, 2004), на науково-практичній конференції “Гістологія на сучасному етапі розвитку науки” (Тернопіль, 2004), на Міжнародній конференції “Лазерно-оптические технологии в биологии и медицине” (Мінськ, 2004). Також експонувалися на Національній виставці “Милосердя 2002” (Київ, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 56 наукових праць, серед яких 20 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 34 роботи опубліковано у матеріалах наукових з'їздів та конференцій. За результатами дисертаційної роботи автор має один деклараційний патент на винахід “Спосіб демієлінізації нервових волокон” (№45240А, Україна, МПК А61N5/06) та один деклараційний патент на корисну модель “Спосіб ремієлінізації нервових волокон при експериментальному алергічному енцефаломієліті” (№3911, 7 G09В23/28).

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 358 сторінках (основного тексту - 277 сторінок) та складається зі змісту, переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, розділу, в якому охарактеризовані матеріал і методи дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків, списку використаної літератури та додатку.

Дисертація проілюстрована 144 рисунками та 72 таблицями, додаток містить 12 таблиць. Список літератури включає 501 джерело вітчизняних та зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Всього в роботі було використано 122 дослідні тварини, маса тіла яких була 220-250 г, з них 100 дослідних, 14 контрольних та 8 інтактних щурів. Були використані 2 строки - через 21 добу та через 39 діб після ініціації ЕАЕ.

З 14 доби після індукції ЕАЕ, починали вводити препарат “Ребіф” підшкірно у ділянці спини тварини. Розрахунок дози препарату “Ребіф” проводили згідно прийнятих доз, які використовуються у лікуванні РС (Wagstaff A.J., Goa K.L., 1998; Лисяный Н.И., 2003). Для людини необхідне введення єдиної внутрішньом'язової дози у 22 мкг або 44 мкг препарату. Для дослідження цього препарату були використані 3 дози:

1) по 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів, загальна кількість отриманого препарату кожною твариною - 2,2 мкг (18 тварин);

2) по 1,1 щоденно протягом 3 днів, загальна кількість отриманого препарату - 3,3 мкг (17 тварин);

3) по 0,55 мкг через день протягом 15 діб, загальна кількість отриманого препарату 4,4 мкг (17 тварин).

Розрахунок дози ЛО проводили згідно рекомендацій з використання гелій-неонового лазера у фізіотерапевтичних цілях (Москвина С.В., Буйлина В.А., 2000). Для вивчення впливу лазерного опромінення при демієлінізації був використаний гелій-неоновий лазер з потужністю 2 мВт, л=632 нм, Львівського заводу, марки ЛГН-206 - лазер газовий напускний. Перед використанням лазера тваринам зістригали хутро у ділянці шкіри, на яку проводили опромінення, а для того, щоб щур не змінював положення тіла під час сеансу ЛО, використовували ефірний наркоз. Для вивчення впливу дози ЛО на демієлінізацію було використано 3 групи тварин:

1) тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 3 хвилини ділянки тіла у проекції тимуса та селезінки, щоденна доза впливу лазера складала 0,72 Дж/смІ, сумарна доза впливу ЛО дорівнювала 3,6 Дж/смІ (17 тварин);

2) тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 5 хвилин ділянки тіла у проекції тимуса та селезінки, щоденна доза впливу лазера складала 1,2 Дж/смІ, сумарна доза впливу ЛО дорівнювала 6 Дж/смІ (17 тварин);

3) тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 6 хвилин ділянки тіла у проекції тимуса та селезінки, щоденна доза впливу лазера складала 1,44 Дж/смІ, сумарна доза впливу ЛО дорівнювала 7,2 Дж/смІ (14 тварин).

Об'єктами світлооптичного дослідження з наступним морфометричним аналізом служили органи ЦНС - стовбур головного мозку, мозочок та поперековий відділ спинного мозку щурів (L₇ - S₁) і органи імунного захисту - тимус та селезінка, через 21 добу та через 39 діб після ініціації ЕАЕ. Парафінові зрізи, товщиною 4-6 мкм отримували за допомогою роторного автоматичного мікротому НМ360 (Carl Zeiss Jena Gmbh). Зрізи органів ЦНС забарвлювали діамантовим крезиловим фіолетовим, толуїдиновим блакитним за методом Ніссля та гематоксиліном і еозином. Гістологічні препарати тимуса та селезінки забарвлювали азурII-еозином за А. Максимовим і гематоксиліном та еозином.

Отримані результати досліджені за допомогою аналізатора зображення з використанням комп'ютерних морфометричних програм. У процесі вибору методик дослідження враховано рекомендації Міжгалузевого Комітету з Нейротоксикології (Erinoff L., 1995). Морфометричне дослідження проводили за допомогою аналізатора зображень, який складається з мікроскопа Olympus BX51 з цифровою камерою С-4040zoom та персонального комп'ютера. Для вимірювання метричних характеристик використовували програмне забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00) в інтерактивному режимі з використанням об'єктиву 20, 40 і окуляра 10. Для калібрування при аналізі зображень використовували об'єкт-мікрометр фірми “E.LEITZ WETZIAR”.

Були вивчені всі різновиди перикаріонів стовбура головного мозку та спинного мозку і клітин Пуркін'є мозочка. Визначали показники площі (S) та периметра профільного поля перикаріона, його ядра та показники співвідношення площ ядра і цитоплазми. Крім цього, визначали відсоток нейронів з реактивними змінами і відсоток з деструктивними змінами. Реактивні та деструктивні зміни спостерігались у зміні форми контуру цитоплазми та ядра тіла нейрона, їх інтенсивності забарвлення та особливостей розміщення хроматофільної речовини.

Обчислення площ осьового циліндру та мієлінової оболонки проводили на поперечних зрізах нервових волокон сканованих зображень електронних мікрофотографій у інтерактивному режимі за допомогою програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00).

Морфометричний аналіз тимуса та селезінки проводили за допомогою двох різних методик:

1) вимірювання площ співвідношення кіркової та мозкової речовини часточок тимуса проводили за допомогою програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00) в інтерактивному режимі з використанням об'єктиву 20, 40 і окуляра 10;

2) вимірювання площ співвідношення білої та червоної пульпи селезінки проводили за допомогою програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00) в інтерактивному режимі з використанням об'єктиву 20, 40 і окуляра 10;

3) обчислення клітинного складу тимуса та селезінки проводили, використовуючи програму автоматичного аналізу клітин лімфоїдної популяції, яка була запропонована колективом авторів (Абрамов А.В., Колесник Ю.М., Любомирская В.А., Камишний А.М., 2002).

Аналізували випадкові зрізи з різних частин часточок тимуса (субкапсулярної зони, внутрішньої частини кортикальної зони та мозкової речовини) та білої пульпи селезінки (периартеріальної зони, реактивного центру та маргінальної зони). Дослідження морфометричних та денситометричних характеристик лімфоїдної популяції проводили за допомогою комп'ютерної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kotron Elektronik, Німеччина). Зображення, яке отримували на мікроскопі AXIOSKOP, за допомогою високочутливої камери COHU-4722 (COHU Inc., США) були введені в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kotron Elektronik, Німеччина) та були оцифровані по денситометричній шкалі з 256 градаціями сірого кольору.

В результаті класифікаційного аналізу було виділено 9 класів клітин лімфоїдної популяції тимуса та селезінки: 1-й клас - лімфобласти; 2-й клас - лімфобласти з ознаками деструкції; 3-й клас - великі лімфоцити; 4-й клас - великі лімфоцити з ознаками деструкції; 5-й клас - середні лімфоцити; 6-й клас - середні лімфоцити з ознаками деструкції; 7-й клас - малі лімфоцити; 8-й клас - малі лімфоцити з ознаками деструкції; 9-й клас - лімфоцити в стані апоптозу (апоптичні тільця). Окрім вищевказаних характеристик лімфоїдних клітин була розрахована загальна кількість клітинних елементів у тій чи іншій зоні тимуса та білої пульпи селезінки.

Для обчислення похідних параметрів і коефіцієнтів та статистичного аналізу використовували програми Microsoft ® Excel 2000.

Результати дослідження та їх обговорення. Клінічні симптоми, що виникали у щурів через 21 та 39 діб після ініціації ЕАЕ подібні до описаних раніше у літературі (Лисяний М.І., Маркова О.В., Бельська Л.М., 2001). Дослідження клінічних ознак ЕАЕ у щурів після проведення різних лікувальних впливів дозволяють встановити, що максимальний ефект покращення стану тварин дає препарат “Ребіф” у дозі 0,55 мкг за добу протягом 2 тижнів. Проведення ЛО дає позитивний вплив на зменшення клінічних симптомів ЕАЕ через 39 діб після опромінення по 5 та 6 хвилин протягом 5 днів. У науковій літературі відсутні дані, які висвітлюють визначення клінічних симптомів ЕАЕ після введення препарату “Ребіф” та після проведення ЛО. Визначення особливостей морфологічного стану органів ЦНС та імунного захисту на мікроскопічному та субмікроскопічному рівнях при ЕАЕ і після введення препарату “Ребіф” і застосування ЛО підтверджують отримані дані клінічного спостереження.

Дослідження стану тіл нейронів у стовбурі головного мозку, мозочку та поперековому відділі спинного мозку дало змогу визначити різні ступені пошкодження перикаріонів та різну кількість пошкоджених тіл нейронів в залежності від терміну дослідження та умов експерименту. Детальний аналіз відсоткових співвідношень перикаріонів з помірними та виразними змінами, що були проведені при ЕАЕ дає підстави стверджувати, що найбільш глибокі патологічні зміни спостерігаються у клітинах Пуркін'є мозочку, де визначається найбільший відсоток перикаріонів цих клітин з виразними змінами у порівнянні зі станом тіл нейронів інших відділів ЦНС. У щурів на ранньому терміні дослідження спостерігається найбільший відсоток клітин Пуркін'є з виразними змінами після введення препарату “Ребіф” у дозах 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів та 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів, а також після проведення ЛО по 3, 5 та 6 хвилин за один сеанс на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки протягом 5 днів. Проте, у всі терміни дослідження спостерігається найбільша кількість незмінених клітин Пуркін'є у порівнянні з нейронами стовбура головного мозку та поперекового відділу спинного мозку.

Найбільший відсоток нейронів з помірними змінами після введення препарату “Ребіф” спостерігається у складі стовбура головного мозку. У цьому ж відділі ЦНС визначається менша кількість незмінених тіл нейронів. Поперековий відділ спинного мозку у ранні терміни дослідження має більшу кількість незмінених перикаріонів, а чисельність тіл нейронів з виразними змінами подібна до кількості таких перикаріонів у стовбурі головного мозку.

Через 39 діб у щурів з ЕАЕ визначається підвищений вміст перикаріонів з помірними змінами. Після введення препарату “Ребіф” у дозах 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів покращуються відновлювальні процеси - підвищується кількість незмінених перикаріонів - їх найбільша кількість у складі мозочка. Після введення препарату “Ребіф” у дозах 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів відновлювальні процеси визначаються у складі стовбура головного мозку, де є найбільша кількість незмінених тіл нейронів. Після введення препарату “Ребіф” у дозах 0,55 мкг через день протягом 15 днів значно поліпшується стан перикаріонів нервових клітин у всіх відділах ЦНС, що були досліджені, найбільша чисельність незмінених тіл нейронів спостерігається у стовбурі головного мозку. За цих же умов експерименту у мозочку визначаються перикаріони з виразними змінами.

Після проведення ЛО по 3, 5 та 6 хвилин за один сеанс на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки протягом 5 днів, через 39 діб спостерігається дозазалежний ефект відновлення тіл нейронів. Найкраще відновлювальні процеси проходять у складі стовбура головного мозку (найбільша кількість незмінених перикаріонів спостерігається після проведення ЛО по 5 хвилин за один сеанс на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки протягом 5 днів). У складі мозочка проходить поліпшення стану тіл клітин Пуркін'є після використання ЛО по 5 хвилин за один сеанс на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки протягом 5 днів. Відновлення стану перикаріонів нервових клітин у поперековому відділі спинного мозку краще проходить після використання ЛО по 6 хвилин за один сеанс на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки протягом 5 днів. Але, на відміну від використання препарату “Ребіф”, після використання ЛО у всіх відділах ЦНС спостерігаються тіла нейронів з виразними змінами. Якщо порівнювати вплив препарату “Ребіф” у різних дозах та ЛО, то можна визначити, що ЛО має менший ефект на відновлення тіл нейронів у всіх відділах ЦНС, ніж використання препарату пролонговано - у дозі 0,55 мкг через день протягом 15 днів. Отримані відсоткові співвідношення незмінених перикаріонів та перикаріонів з помірними та виразними змінами представлені у таблиці 1.

Таблиця 1

Відсоткові співвідношення незмінених тіл нейронів та тіл нейронів з помірними та виразними змінами

Збільшення чисельності перикаріонів з помірними змінами на ранніх термінах дослідження, на нашу думку, вказує на активацію синтетичних процесів. Це твердження базується на ряді досліджень, у яких при незначних пошкодженнях нейронів відмічається збільшення та набряк ядра. На думку авторів, це пов'язано з компенсаторною реакцією нейрона, яка направлена на збільшення площі поверхні ядра у зв'язку з активацією синтетичних процесів, що необхідні для синтезу групи білків, які беруть участь у відновленні пошкоджених структур нейрона. Ознака синтетичної активності нейрона - зміна стану ядерця. При активації синтетичних процесів воно змінює свою локалізацію - зміщується до ядерної оболонки та збільшується у розмірах (Hyden H., 1960). У такому випадку тіла нейронів набувають вигляду “риб'ячого ока” (Friede R.L., Samorajski T., 1970; Ярыгин Н.Е., Ярыгин В.Н., 1973; Яценко В.П., 1984, 1989). Саме такі змінені перикаріони були визначені через 39 діб після різних лікувальних впливів. Хроматоліз, у більшості випадків, вказує на активацію білкового синтезу для власних потреб клітини. За даними деяких авторів (Бродский В.Я., Арефьева А.М., Кузнецова Л.П., 1966; Белецкий В.К., 1967; Жаботинский Ю.М., 1967) за умов хроматолізу нейрон, за своєю функціональною активністю та синтетичними процесами, ніби повертається до стану нейробласта.

Таким чином, ряд ознак, які були визначені у перикаріонах з помірними змінами - збільшення розмірів ядра, зміщення ядерця до ядерної оболонки та хроматоліз дозволяє зробити висновок про активацію відновлювальних процесів при ЕАЕ у пізні терміни дослідження. При значних ушкодженнях нейрона спостерігається пікноз та рексис ядра (Cammermeyer J., 1960; Жаботинский Ю.М., 1967). Отримані дані експерименту вказують на більш глибокі патологічні зміни клітин Пуркін'є у складі мозочка, ніж тіл нейронів у інших відділах ЦНС. Наявність перикаріонів клітин Пуркін'є з виразними змінами навіть після довготривалого використання препарату “Ребіф” вказує на необхідність тривалого відрізку часу для їх відновлення. Можливо, ця частина клітин з виразними змінами, навіть після пролонгованої дії препарату, не зможе повністю відновитись.

Показовою ознакою змін тіл нейронів є індекс Гертвіга, який визначає зміну площі ядра та цитоплазми перикаріону (Клишов А.А., 1966; Геращенко С.Б., 2003). Збільшення значення індексу Гертвіга у всіх відділах ЦНС спостерігається у ранні терміни дослідження. Індекс Гертвіга для тіл нейронів з виразними змінами іноді збігається зі значенням ІГ для незмінених тіл нейронів, що вказує на рівномірне зменшення площі цитоплазми та площі ядра з даними патологічними змінами. У зв'язку з такими особливостями кількісних значень ІГ для незмінених перикаріонів та перикаріонів з виразними змінами, ІГ не можна вважати ознакою дегенеративних або репаративних процесів у повній мірі. Індекс Гертвіга може бути важливим для діагностики стану тіл нейронів з помірними змінами.

Для визначення взаємозв'язку патологічних змін тіл нейронів та мієлінових нервових волокон досліджували стан мієліну при ЕАЕ та після проведення ін'єкцій препарату “Ребіф” та ЛО. Результати вивчення стану мієлінових оболонок нервових волокон при ЕАЕ через 21 добу та через 39 діб, що були отримані у даній роботі, співпадають з результатами інших наукових робіт (Заприянова Э., Сотников О.С., Сергеева С.С., Делева Д., Филчев А., Султанов Б., 1998; Zaprianova E., Deleva D., Filchev A., 1998). Руйнування мієлінової оболонки за умов ЕАЕ має певну специфічність - це пропорційна зміна об'єму осьового циліндру та мієлінової оболонки на поперечних зрізах, що, можливо, пов'язана з вираженою агрегацією високомолекулярних компонентів та зниженням осмотичного тиску аксоплазми. За результатами цих же авторів, розшарування мієліна викликається конденсацією конформаційно змінених нейробілків, що призводить до зниження осмотичного тиску аксоплазми і відповідного набряку глибоких (периаксональних) шарів гліоплазми.

Після проведення ін'єкцій препарату “Ребіф” у ранні терміни дослідження спостерігались значно менші ознаки руйнування мієліну. Більшість мієлінових нервових волокон була відносно збереженою. Спостерігались незмінні аксолеми та гліолеми, що, можливо, є умовою прискорення регенерації мієлінового нервового волокна. Схожа думка, щодо важливості збереження аксолеми та гліолеми при ЕАЕ була висловлена раніше (Заприянова Э., Сотников О. С., Сергеева С. С., Делева Д., Филчев А., Султанов Б., 1998). Після проведення ЛО активні відновлювальні процеси у складі мієлінових оболонок були визначені лише через 39 діб після ініціації ЕАЕ. Після проведення ЛО у різних дозах у ранні терміни дослідження дегенеративні процеси мієлінових оболонок були подібні до змін мієлінових оболонок через 21 добу після ініціації ЕАЕ.

Отримані авторами морфологічні дані свідчать про те, що підтримка стабільності структур мієлінової оболонки в значній мірі залежить від стану осьового циліндру аксона, а в кінцевому рахунку - від нормального функціонування всього нейрона. Демієлінізація, можливо, є вторинним проявом патологічної зміни нейронів, що підтверджується проведеними дослідженнями з використанням методів магнітного резонансу та конфокальної мікроскопії (Collins D., Francis G., 1997; Trapp B., Peterson J., Ransohoff R., 1998).

Отже, отримані нами результати дослідження збігаються з думкою цілої низки авторів, що підтверджують значення стану нейронів для збереження цілісності мієлінової оболонки при розсіяному склерозі, а ушкодження мієліну є вторинним явищем (Zaprianova E., 1996). Тому, розсіяний склероз, вірогідно, є первинним нейрональним, а не первинним демієлінізуючим захворюванням (Waxman S., 2000).

Розвиток демієлінізуючого процесу у ЦНС у великій мірі виникає завдяки дефекту гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ). Ця думка була підтверджена численними дослідженнями, у яких визначили той факт, що на перебіг патологічного процесу впливають будь-які неспецифічні фактори, що підвищують проникність ГЕБ, і таким чином, сприяють потраплянню антигенів мієліну у кров (Лисяний Н.И., 1999). В основі отримання експериментальної моделі - ЕАЕ - є введення білків мієлінових оболонок, що є ще одним підтвердженням значення збільшення проникності стінки кровоносних судин для розвитку демієлінізації. На ранніх термінах дослідження - через 21 добу після ініціації ЕАЕ - розширюються кровоносні судини гемомікроциркуляторного русла (ГМЦР) в органах ЦНС і спостерігається інфільтрація оточуючої нервової тканини форменими елементами крові. Отримані особливості судинних реакцій у ЦНС на ранніх термінах дослідження збігаються з даними літератури (Заргарова Т.А., Фаворова О.О., 1999). На думку деяких учених стан імунологічної толерантності підтримується виключно станом бар'єрних функцій ендотелія (Марков Д.А., Леонович А., Корин М., 1976; Лисяний Н.И., 1999, 2003).

Вплив препарату “Ребіф” на стан судин в органах ЦНС раніше не досліджувався. Найкращий позитивний вплив на судини ГМЦР та на зменшення ознак інфільтрації, препарат має при пролонгованому використанні (протягом 15 діб через день у дозі 0,55 мкг за одну ін'єкцію). ЛО дає позитивний ефект лише через 39 діб після ініціації ЕАЕ та проведенні опромінення по 5 або 6 хвилин на ділянку тіла у проекціях тимуса та селезінки протягом 5 діб. Отримані результати дослідження збігаються з раніше проведеними дослідженнями впливу ЛО на стан судин як в органах нервової системи, так і в органах інших систем, де автор відмічає покращення гемодинаміки після використання ЛО (Юрах Е.М., 1983, 1991).

Проведені морфологічні та морфометричні дослідження стану тимуса та селезінки вказують на активну участь цих органів імунного захисту у патоморфологічних змінах органів ЦНС при ЕАЕ. На ранньому терміні дослідження у тимусі спостерігається зростання площі мозкової речовини, а у кірковій речовині визначаються скупчення малодиференційованих клітин, які зовні нагадують “вузлики”. Дані структурні зміни часточок тимуса співпадають з даними літератури, де були визначені характерні зміни, притаманні саме аутоімунній патології (плазматизація на фоні атрофічних процесів, наявність активних зародкових центрів, лімфоїдних “вузликів”) (Овнатанян К.Т., Агте В.С., Пужайло В.И., 1971; Матвеева Т.В., 1974). Підтвердженням отриманих нами даних про те, що тимус бере активну участь у аутоантигенній реакції при ЕАЕ є наукові роботи, у яких доведена наявність у складі тимуса антигенів, подібних до антигенів нервової тканини (Белокрылов Г.А., Житнухин Ю.Л., Софронов Б.Н., 1976). Це, на думку авторів, може викликати утворення антитіл проти антигенів нервової тканини при порушеннях гомеостазу тимуса.

Після використання ЛО на ранніх стадіях розвитку демієлінізації спостерігали велику кількість розширених капілярів у кірковій речовині тимуса, що може бути пояснено науковими даними про появу розширених кровоносних судин ГМЦР після використання гелій-неонового лазеру (Юрах Е.М., 1991). Автор вказує, що ЛО не впливає на власний тонус м'язів судин, а вазоделятуючий ефект зумовлений дією біологічно активних речовин, що виділяються тканинними базофілами, у яких збільшується дегрануляція після застосування ЛО.

Через 21 добу після ініціації ЕАЕ та після проведення лікувальних впливів щільність розміщення клітин лімфоїдної популяції підвищується у субкапсулярній зоні та глибокій ділянці кіркової речовини часточок тимуса, що можна пояснити підвищеною проліферацією Т-лімфоцитів та зниженням міграційних властивостей цих клітин. Найбільша щільність клітин лімфоїдної популяції у субкапсулярній зоні та глибокій ділянці кіркової речовини часточок тимуса спостерігається після використання ЛО. У мозковій речовині лише після використання ЛО по 3 хвилини у проекціях тимуса та селезінки протягом 5 сеансів визначається зменшення кількості лімфоцитів, що може бути пов'язане з активацією міграції лімфоцитів. Через 39 діб після ініціації ЕАЕ та після проведення лікувальних впливів препарат “Ребіф” у дозі 0,55 мкг у короткотривалій та пролонгованій дії викликає зменшення чисельності клітин лімфоїдної популяції у часточках тимуса, що можливо пов'язане зі зменшенням проліферативної активності цих клітин, оскільки відомо, що рекомбінантний в-інтерферон-1а зумовлює імуносупресивну дію (Wagstaff A. J., Goa K.L., 1998). Вплив ЛО призводить до підвищення чисельності лімфоцитів у всіх зонах часточок тимуса, які були досліджені.

У субкапсулярній зоні у всіх експериментальних групах тварин спостерігається зменшення кількості малих лімфоцитів у порівнянні з їх кількістю у інтактних тварин. Через 21 добу після введення препарату “Ребіф” по 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів та по 1,1 мкг кожного дня протягом 3 днів кількісний склад лімфобластів, великих, середніх та малих лімфоцитів подібний до вмісту цих же клітин у субкапсулярній зоні тимуса тварин з ЕАЕ. Через 39 діб у даній зоні визначається різке зменшення вмісту малих лімфоцитів, окрім експериментальної групи тварин, що отримувала препарат “Ребіф” по 0,55 мкг через день протягом 15 діб. Поряд зі зменшенням кількості малих лімфоцитів через 39 діб спостерігається збільшення кількості лімфобластів та великих лімфоцитів у групах тварин, які отримували препарат “Ребіф” по 0,55 мкг кожний день протягом 4 днів та по 1,1 мкг кожний день протягом 3 днів (рис. 1).

Рис. 1 Гістограма розподілення клітин лімфоїдної популяції у відсотках у складі субкапсулярної зони часточок тимуса після введення препарату “Ребіф”. 1 група - тварини з ЕАЕ; 2 група - тварини, яким вводили препарат “Ребіф” по 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів; 3 група - тварини, яким вводили препарат “Ребіф” по 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів; 4 група - тварини, які отримували препарат “Ребіф” по 0,55 мкг через день протягом 15 днів; 5 група - інтактні тварини

Клітинний склад субкапсулярної зони у складі часточок тимуса наближений до норми у тварин, які отримували ін'єкції препарату “Ребіф” пролонгловано. Отже, препарат “Ребіф” у невеликих дозах зменшує чисельність малих лімфоцитів у субкапсулярній зоні часточок тимуса у віддалений термін дослідження, що, можливо, пов'язано з активацією міграційних процесів малих лімфоцитів та імуносупресивною дією препарату.

Через 21 добу після введення препарату “Ребіф” по 0,55 мкг кожного дня протягом 4 днів та по 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів кількісний склад лімфобластів, великих, середніх та малих лімфоцитів у внутрішній частині кіркової речовини подібний до вмісту цих же клітин у кірковій речовині тимуса тварин з ЕАЕ у цей же термін дослідження. У складі внутрішньої частини кіркової речовини часточок тимуса спостерігається зменшення вмісту малих лімфоцитів та збільшення кількості середніх лімфоцитів, особливо відчутно через 39 діб після індукції ЕАЕ та введення препарату “Ребіф” по 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів та по 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів. Наближення клітинного складу внутрішньої частини кіркової речовини часточок тимуса до норми визначається у тварин, які отримували препарат “Ребіф” протягом 15 діб (група 4). Препарат “Ребіф” у невеликих дозах зменшує чисельність малих лімфоцитів у віддалений термін дослідження у внутрішній частині кіркової речовині часточок тимуса, що, можливо, пов'язано з активацією міграційних процесів малих лімфоцитів та імуносупресивною дією препарату.

Через 21 добу після ініціації ЕАЕ у складі мозкової речовини часточок тимуса спостерігається різке зменшення кількості малих лімфоцитів у тварин, що отримували препарат “Ребіф” протягом тижня (групи 2, 3). У цих же групах спостерігали різке підвищення вмісту великих та середніх лімфоцитів даної досліджуваної зони. Подібні зміни клітинного складу мозкової речовини часточок тимуса були визначені і через 39 діб після індукції ЕАЕ та після проведення ін'єкцій препарату протягом 15 діб, проте вони мали менш виражений характер (рис.2).

У мозковій речовині зменшення кількості малих лімфоцитів, на нашу думку, пов'язане з активацією міграційних процесів. З джерел наукової літератури відомо, що інтерферон-в-1а не викликає загального пригнічення імунної системи (Wagstaff A.J., Goa K.L., 1998), тому зрозуміла активація проліферативної активності великих та середніх Т-лімфоцитів при введенні препарату “Ребіф” у всіх зонах часточок тимуса. При довготривалому використанні препарату “Ребіф” кількісний склад лімфоцитів у часточках тимуса наближується до норми. У науковій літературі відсутні дані щодо клітинного складу лімфоїдної популяції часточок тимуса після введення препарату “Ребіф”.

Рис. 2 Гістограма розподілення клітин лімфоїдної популяції у відсотках у складі мозкової речовини часточок тимуса після введення препарату “Ребіф”. 1 група - тварини з ЕАЕ; 2 група - тварини, яким вводили препарат “Ребіф” по 0,55 мкг щоденно протягом 4 днів; 3 група - тварини, яким вводили препарат “Ребіф” по 1,1 мкг щоденно протягом 3 днів; 4 група - тварини, які отримували препарат “Ребіф” по 0,55 мкг через день протягом 15 днів; 5 група - інтактні тварини

Після використання ЛО через 21 та через 39 діб після ініціації ЕАЕ у складі субкапсулярної зони кількісний склад клітин лімфоїдної популяції має тенденцію до зменшення чисельності клітин у пізній термін дослідження. Через 39 діб невелике зменшення чисельності малих лімфоцитів було найбільш відчутним у групі тварин, які отримували лазерне опромінення по 3 хвилини, та найменш відчутним після ЛО по 6 хвилин у проекції тимуса і селезінки протягом 5 днів. Також через 39 діб після ініціації ЕАЕ та використання лазерного опромінення спостерігали невелике збільшення кількості середніх лімфоцитів, чисельність великих лімфоцитів практично не змінювалась.

Після використання лазерного опромінення кількість малих лімфоцитів у внутрішній частині кіркової речовини практично не змінювалась, а чисельність середніх лімфоцитів підвищувалась пропорційно дозі ЛО - найбільша кількість середніх лімфоцитів була при невеликій дозі ЛО, особливо у щурів через 39 діб після ініціації ЕАЕ (рис. 3).

Рис. 3 Гістограма розподілення клітин лімфоїдної популяції у відсотках у складі внутрішньої частини кіркової речовини часточок тимуса після проведення ЛО. 1 група - контрольні тварини з ЕАЕ; 2 група - тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 3 хвилини на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки; 3 група - тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 5 хвилин на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки; 4 група - тварини, яким проводили 5 сеансів протягом 5 днів по 6 хвилин на ділянку тіла у проекції тимуса та селезінки; 5 група - інтактні тварини

У складі мозкової речовини часточок тимуса спостерігається зменшення чисельності малих лімфоцитів у всіх групах тварин, окрім групи з раннім терміном дослідження, щурам якої проводили ЛО у дозі по 6 хвилини (група 2). Поряд зі зменшенням чисельності малих та середніх лімфоцитів визначається різке підвищення чисельності великих лімфоцитів, яке визначили у ранні та пізні терміни дослідження з використанням великих доз ЛО (по 5 та 6 хвилин) (рис. 4).