Модуляція апоптозу та внутрішньониркових регуляторних систем при експериментальній гострій нирковій недостатності

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

14.01.32 - медична біохімія

УДК : 616.45-0001.1/.3-02: 546.-21:591

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

АВТОРЕФЕРАТ

МОДУЛЯЦІЯ АПОПТОЗУ І ВНУТРІШНЬОНИРКОВІ РЕГУЛЯТОРНІ СИСТЕМИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ НИРКОВІЙ НЕДОСТАТНОСТІ

ОРЛОВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Комаревцева Ірина Олександрівна, завідувач кафедри медичної хімії Луганського державного медичного університету МОЗ України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Левицький Євген Леонідович, провідний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології АМН України (Київ);

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, завідувач кафедри загальної патофізіології Одеського державного медичного університету;

доктор біологічних наук, професор Дмитренко Микола Петрович, завідувач біохімічної лабораторії Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя (Київ).

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, відділ біохімії (Київ).

Захист дисертації відбудеться 01.12.2005 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.07 при Національному медичному університеті ім. О.О.Богомольця (м. Київ, пр.Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (м. Київ, пр. Перемоги, 34, фізико-хімічний корпус НМУ).

Автореферат розісланий 01.11.2005 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Толстих О.І.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гостра ниркова недостатність (ГНН), викликана ішемією/гіпоксією, проявляється складним симптомокомплексом патофізіологічних змін в нирках. Одним з них є апоптоз. У зв'язку з вивченням апоптозу виникла необхідність перегляду ряду концептуальних основ в біохімічних механізмах ниркових патологій [Єрмоленко В.М.,2000, De Broe M.E., 2001, Noiri E., 2001, Ueda N.,2000].

Ішемія/гіпоксія в органах та клітинах викликає апоптоз через зміни ва мітохондріях, внаслідок утворення вільних радикалів, проникності мітохондріальної мембрани та виділенню апоптогенных факторів, таких як цитохром с і білків сімейства Вс1-2. Є дані про залучання опіоїдних рецепторів до протекторних механізмів „ішемія/реперфузійного” синдрому, так званого феномену „ішемічного прекондиціювання” [Реброва Т.Ю. , Маслов Л.Н., Лишманов А.Ю, 2001, Лишманов Ю.Б., Маслов Н.М., 2003, Krick S., Platoshyn O., Sweeney M, 2001]. Замість колишніх уявлень про загибель клітин багатоклітинного організму як негативне по значущості явище, що ідентифікується з некрозом, сформувався новий погляд, згідно з яким загибель частини клітин в межах організму є закономірним і необхідним процесом , саме існування багатоклітинного організму має на увазі баланс життя і смерті на рівні клітинних популяцій, що його складають.

Біохімічні механізми регуляції апоптозу дуже складні і, як показали дослідження останніх років, практично не змінилися в процесі еволюції, що дає основу судити про фундаментальну біологічну роль апоптозу.

Механізми розвитку апоптозу, його індуктори і супресори вивчаються на експериментальних моделях. Однією з класичних експериментальних моделей апоптозу в нирках є гостра ниркова недостатність (ГНН).

При гострій нирковій недостатності (ГНН) ішемічного, токсичного або обструктивного генезу апоптоз розвивається в клітинах канальців. У цих випадках має місце і некроз клітин, і ще невідомо, який з цих двох ініційованих механізмів загибелі клітин є ведучим. При різних фазах ГНН швидкість апоптозу нерівномірна: він може персистирувати або сповільнюватися [Wang W,2003]. Апоптоз при ГНН також може розвиватися як адекватна відповідь на пошкодження. У цих випадках це розглядається як фізіологічний баланс контролю і заборони перебільшеної компенсаторної проліферації.

При гострій нирковій недостатності змінюється експресія і позаклітинних, і внутрішньоклітинних чинників регуляції апоптозу.

Актуальність проблеми полягає в можливості корекції цього процесу при різних захворюваннях, в тому числі ниркових. Відомо, що запуск клітинної загибелі, що програмується, здійснюється як специфічними сигналами (цитокинами, гормонами), так і неспецифічними (радіація, гіпертермія, ішемія, окислювальний стрес) [Goligorsky M.S, 2002]. Причому, може відбуватися як індукція апоптозу, так і його супресія. Порушення регуляції апоптозу приводить до виникнення різних захворювань, пов'язаних з посиленням або, навпаки, ингібуванням апоптозу. І, навпаки, деякі захворювання можуть приводити до виражених порушень регуляції апоптозу, які спричиняють розвиток запалення, імунодефіциту, анемії, поліорганної недостатності і т.і. Отже, вивчення біохімічних механізмів регуляції даного процесу при різній патології дозволить певним чином впливати на окремі його етапи з метою їх корекції. Можна виділити два напрямки у вивченні апоптозу. З одного боку, досліджуються існуючі сигнальні і рецепторні шляхи, що регулюють апоптоз. Ці дані можна використати, застосовуючи ендогенні медіатори. З іншого боку, ведеться пошук речовин, здатних направлено впливати на процеси апоптозу, пригноблюючи або активуючи його. Відомі на сьогодня морфологічні і біохімічні маркери апоптозу повинні в перспективі сприяти більш глибокому розумінню механізмів патогенезу захворювань, поліпшенню диференціальної діагностики і створенню принципово нових напрямів терапії.

Мета дослідження. Встановити роль біохімічних регуляторних систем нирок - опіоїдних рецепторів, обміну оксиду азоту, КАТФ-каналів, сфінгомієлин-сфінгозинового шляху, ангіотензинової і простаноїдної - в модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності.

Завдання дослідження:

1. Розробити моделі стимульованого апоптозу в умовах експериментальної гострої ниркової недостатності (ГНН) (преренально-гемодинамичної; ренальної ) з біохімічною верифікацією патологічного процесу.

2. Вивчити ступінь розвитку апоптотичних процесів біохімічно за ДНК-фрагментацією в зіставленні з морфологічною детекцією при використанні ядерного барвника Хехст в нирковій тканині за умов розвитку експериментальної гострої ниркової недостатності.

3. З'ясувати наявність експресії індуцибельної синтази оксиду азоту за вмістом стабільних метаболітів оксиду азоту нітрит- і нітрат-аніонів в тканині нирок при різних моделях гострої ниркової недостатності.

4. Виявити біохімічні механізми модуляції апоптотичних процесів в нирках через активацію опіоїдних рецепторів.

5. Встановити роль опіоїдних рецепторів в регуляції К+АТФ-каналів мітохондрій в нирках за умов стимульованого апоптозу.

6. Розглянути ангіотензинову і простаноїдну системи нирок як фактори модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності.

7. Вивчити активність сфінгомієлінового метаболічного шляху в нирках, як одного з сигнальних шляхів апоптозу при експериментальних моделях ГНН.

8. Провести кореляційний аналіз взаємозв'язку між активацією сфінгомієлінового метаболічного шляху і активністю ключових ферментів (лактатдегідрогенази, супероксиддисмутази) , і активацією інших участків обміну (протеолізу) в нирках в умовах стимульованого апоптозу.

9. Вивчити ЯМР-релаксацію протонів тканинної води нирок при експериментальній гострій нирковій недостатності.

10. Дослідити ЯМР-параметри в нирках за умов модуляції апоптозу.

Об'єкт дослідження: нирки, плазма крові, сеча білих щурів статевого віку при експериментальних моделях гострої ниркової недостатності.

Предмет дослідження: стан апоптотичного процесу в нирках при експериментальних моделях гострої ниркової недостатності.

Методи дослідження: спектрофотометричний, електрофорез, диференціальне центрифугування, тонкошарова хроматографія, ЯМР-релаксометрія, флуоресцентна мікроскопія та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що біохімічні і морфологічні зміни в клітинах нирок, пов'язані з активацією апоптотичних процесів, мають однотиповий якісний та кількісний характер як при „ішемія-реперфузійному синдромі”, так і при „гліцерольній ” моделі гострої ниркової недостатності. Модифікований метод визначення вмісту оксиду азоту за його кінцевими метаболітами - нітрит- і нітрат-аніонам в тканинах і біологічних рідинах. Вперше на різних моделях ГНН встановлена активація метаболічного шляху сфінгомієлину , що пов'язано із зниженням вмісту сфінгомієлину і підвищенням рівня вільних сфінгоїдних основ в тканині нирок. Вперше виявлено кореляційний зв'язок між активацією метаболічного шляху сфінгомієлину і активністю ключових ферментів (лактатдегідрогеназа, супероксиддисмутаза), активацією протеолізу в тканині нирок за умов стимульованого апоптозу. Вперше в опитах in vivo показано інгібіторну дію даларгіну, каптоприлу і стимулюючу дію індометацину на програму клітинної загибелі в умовах розвитку ГНН. Вперше на моделях ГНН розкрито антиапоптотичний механізм стимуляції д-опіоїдних рецепторів через активацію К+АТФ - каналів мітохондрій і активацію NO - синтази і - проапоптотичний механізм в нирках інтактних щурів, котрий реалізується не через д-опіоїдні рецептори. Встановлено, що на початковій стадії розвитку ГНН помірна гіперпродукція оксиду азоту в нирках носить цитотоксичний характер. Але підвищений вміст оксиду азоту при інгібуванні індуцибельної NO-синтази вказує на його компенсаторну роль. Отримані дані дозволяють судити про біфункціональний характер дії оксиду азоту при експериментальній гострій нирковій недостатності. Вперше отримано ЯМР-показники ниркової тканини за умов розвитку експериментальної ГНН і при модуляції програми клітинної загибелі. Встановлено, що модуляція апоптозу через регуляторні внутрішньониркові системи пов'язана із зміною ЯМР-релаксації протонів тканинної води.

Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків та рекомендацій. Обґрунтованість і достовірність роботи забезпечена значним об'ємом експериментальних досліджень: 1 модель гострої ниркової недостатності - 324 щурів, 11 модель гострої ниркової недостатності 288 щурів, експериментальні групи 1 моделі із застосуванням модуляторів 396 щурів, експериментальні групи 11 моделі із застосуванням модуляторів - 396 щурів, експериментальні групи інтактних тварин із застосуванням модуляторів 351 щурів; із застосуванням сучасних і високочутливих методів: ЯМР-релаксометрія, флуоресцентна мікроскопія і спектрофотометрія; аналізу і інтеграції експериментальних даних.

Наукова значущість роботи. На етіологічно різних моделях гострої ниркової недостатності встановлено вклад опіоїдних рецепторів, К+АТФ - каналів, оксиду азоту, сфінгоїдних основ, ангіотензинової і простаноїдної систем в модуляцію апоптотичних процесів в нирках, що дозволить поглибшити знання про програму клітинної загибелі на молекулярному рівні і встановити ії роль в патогенезі ГНН. Активація опіоїдних рецепторів в нирках викликає різні ефекти в розвитку апоптозу: у фізіологічних умовах - проапоптотичний та антиапоптотичний - за умов розвитку експериментальної ГНН. Проапоптотичний ефект опіоїдних рецепторів реалізується не через д-опіоїдні рецептори і не залежить від рівня оксиду азоту, а їх антиапоптотична дія є NO- залежним процесом і запускається через д-опіоїдні рецептори з участю К+АТФ - каналів. Про/антиапоптотична дія препаратів - даларгіну, каптоприлу, нітроаміногуанідину, індометацину може бути корисною при фармакологічних дослідженнях, пов'язаних із використанням даних препаратів в експериментальній і клінічній практиці. Розуміння ролі оксиду азоту в регуляції апоптозу розкриє шляхи фармакологічної корекції донаторами або блокаторами ендогенного оксиду азоту в клінічній практиці. Вивчення показників ЯМР-релаксації протонів тканинної води нирок в аспекті розвитку апоптозу, з одного боку, дозволить розкрити Н+- механізми регуляції клітинного об'єму , а з іншого - підведе патогенетичну базу ГНН під діагностику ступеня ниркової патології методом ЯМР-релаксометрії. Вперше на основі експериментальних даних показана можливість модуляції апоптотичних процесів через регуляторні внутрішньониркові системи: опіоїдні рецептори, К+АТФ - канали, обмін оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову та простаноїдну системи, механізм дії котрих пов'язаний із перерозподілом внутрішньо- і позаклітинної фракції тканинної води нирок. Отримані результати розвивають наукові представлення про біохімічну модуляцію апоптотичних процесів при патологіях та сприяють новим дослідженням по розробці терапевтичних заходів в клінічній уронефрології.

Практичне значення отриманих результатів. Впровадження отриманих результатів в практику здійснюється такими шляхами:

розроблені і модифіковані автором методики застосовуються при проведенні клініко-лабораторних і наукових досліджень в Науково-дослідному центрі Луганського державного медичного університету та ряді медичних установ м. Луганська;

матеріали дисертації опубліковані в друкарських роботах, докладалися на з'їздах і науково-практичних конференціях;

результати роботи використовуються у навчальному процесі при вивченні докторантами, аспірантами і науковими співробітниками методів біохімічного аналізу тканин і клітинних культур;

характеристика ряду лікарських препаратів, що широко використовуються при ниркових патологіях, може розглядатися через регуляцію процесів апоптозу (як індуктори, так і супресори), що внесе позитивний вклад в клінічну практику;

ЯМР-параметри тканини можуть бути використані при оцінці гомеостазу нирок при введенні препаратів із різною про/антиапоптотичною спрямованістю.

Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною роботою автора, яка провела експериментальні дослідження на щурах (1575) по визначенню в нирках фрагментації ДНК, вмісту метаболітів оксиду азоту, сфінгомієлину, сфінгозину, активності ключових ферментів, протеолізу, ЯМР-релаксації за умов стимульованого апоптозу та при його модуляції.

Автором проведено інформаційний пошук та аналіз літературних джерел. Самостійно оцінила та проаналізувала отримані результати досліджень з використанням засобів статистики, кореляційного аналізу. Інтерпретація отриманих результатів, основні положення та висновки, які представлені до захисту, належать авторові. Підготовлено самостійні, а також сумісні друковані роботи. Автор щиро вдячний за допомогу і спільну роботу: Комарєвцевій І.О., Макогон Н.В.

Впровадження результатів дослідження. Результати досліджень, що ввійшли до дисертації, докладені на XVI З'їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002), XI Конгресі міжнародного товариства українських лікарів (Луганськ, 2002), VIII З'їзді Українського біохімічного товариства (Чернівці, 2002), Науково-практичній конференції (Євпаторія, 2003), Всеукраїнській з міжнародною участю науково-практичної конференції “Впровадження досягнень теоретичної медицини в практику охорони здоров'я” (Київ, 2004), Науково-практичній конференції, присвяченій 10-річчю Луганського державного медичного університету (Луганськ, 2004).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 27 наукових роботах, з них 10 без співавторів, 21 публікація основного вмісту дисертації в наукових виданнях, затверджених ВАК України.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, 7 розділів, висновків, списку літератури, додатку. Викладена на 301 сторінці, містить 85 таблиць, ілюстрована 12 малюнками. Список літератури включає 517 найменувань.

Робота виконана на кафедрі медичної хімії Луганського державного медичного університету (зав.кафедри д.м.н., проф. І.О. Комаревцева). Науковий консультант - д.м.н., професор І.О. Комаревцева.

2. ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали досліджень. У експериментальній частині роботи були використані білі щури-самці 16-18-ти тижневого віку, маса тварин складала m=250±50 мг. Тварин тримали в стандартних умовах віварію. У експериментах було використано 1575 тварин. Гостру ниркову недостатність (ГНН) формували двома моделями. 1 модель - ішемія /реперфузія- шляхом двостороннього перетискання ниркової ніжки протягом 30 хвилин [Liberthal W., Menza S., Levine J.,1998]. Операцію проводили під тіопенталовим наркозом в дозі 10 мг/мл, в стерильних умовах. У контрольних тварин проводили двосторонні надрізи шкіри і м'язів в ділянці спини. 11 модель- “гліцерольна” - шляхом двостороннього внутрішньом'язового введення 50% розчину гліцеролу з розрахунку 10 мл на 1кг ваги тварини [Nath K. A., Bella G., Vercellotti G.M., et al.,1992]. Контрольним тваринам вводили відповідний об'єм фізіологічного розчину. Тварин спостерігали в ранній період розвитку ГНН через 1 годину після ішемії (контроль-2) і протягом 1, 2, 3-х діб (ГНН-1, ГНН-2, ГНН-3). Декапітацію тварин проводили під легким ефірним наркозом. Модуляцію апоптозу через внутрішньониркові регуляторні системи проводили за наступною схемою. Даларгін (синтетичний лей-енкефалін D-Ala2 ,Lue5 ,Arg6 ) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 100 мкг/кг маси тварини за 20 хвилин до операції (до ін'єкції гліцеролу) і протягом 1, 2, 3-х діб розвитку ГНН, одноразово. Інтактним тваринним даларгін та інші препарати вводили аналогічно протягом 1, 2, 3-х діб одноразово. Ін'єкцію налоксону в дозі 0,5 мг/кг вводили внутрішньоочеревинно за 20 хвилин до формування ГНН і протягом періоду спостереження, одноразово. Інгібітор iNOS (індуцибельної синтази оксиду азоту) - аміногуанідин нітрат вводили внутрішньоочеревинно в дозі 10 мг/кг. Ін'єкцію інгібітору здійснювали за 20 хвилин до розвитку ГНН і на протязі перших трьох діб ГНН, одноразово. Блокування ангіотензин-перетворюючого ферменту на фоні розвитку ГНН здійснювали шляхом попереднього введення каптоприлу в дозі 1,3 мг/кг. Препарат вводили внутрішньоочеревинно протягом 1, 2, 3-х діб, одноразово. Для блокади циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти використали індометацин в дозі 5 мг/кг, який заздалегідь розчиняли в спиртовому розчині. Селективне інгибування К+АТФ - каналів викликали ін'єкцією глібенкламіду в дозі 0,3 мг/кг, аналогічно. При паралельному введенні препарат №1 вводили за 40 хвилин до формування ГНН, а препарат №2 - за 20 хвилин. Протягом 1, 2 і 3-х діб розвитку ГНН ін'єкцію препарату №2 проводили через 20 хвилин після введення препарату №1, одноразово. Інтактним тваринам вводили препарати за аналогічною схемою.

Методи досліджень. Для підтвердження розвитку гострої ниркової недостатності у щурів визначали рівень клубочкової фільтрації за кліренсом креатиніну, активність гамма-глутамілтранспептидази в плазмі крові. Морфологічні дослідження ниркової тканини проводили загальновизнаними гістологічними методами. Нирки щурів фіксували в розчині формальдегіду, заливали в парафін, готували зрізи і проводили забарвлення за допомогою гематоксиліну-еозину.

Для визначення низькомолекулярних фрагментів ДНК нами був використаний метод гель-електрофорезу[Cain K., Inayat-Hussain S.H., Wolfe J.T., Cohen G.M.,1994] та метод спектрофотометричного визначення фрагментованої ДНК в нашій модифікації. Метод заснований на кольоровій реакції накопичених в клітинах нирок низькомолекулярних фрагментів ДНК, екстрагованих в розчин з низькою іонною силою, з дифеніламіновим реагентом [Messmer U.K., Verena A.B.,1996]. Суть модифікації полягала в тому, що з проби заздалегідь віддалялися некротичні уламки ДНК. Морфологічну детекцію апоптозу проводили з використанням ядерного флюоресцентного барвника Хехст [Cohen J.J. ,1993]. Експеримент був проведений в науковій лабораторії Інституту фізіології ім. А.А. Богомольця.

Вміст оксиду азоту визначали за його стабільними метаболітами нітрит- і нітрат-аніонами з використанням реактиву Грисса [Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al.,1982]. Для проведення даного аналізу нами була модифікована методика, яка дозволяє визначати нітрит- і нітрат-аніони в одній пробі. Оскільки реакція діазотування є специфічною тільки для нітритів, то для визначення нітрату необхідне їх попереднє відновлення. Як відновник нами був використаний цинковий пил.

Виділення сфінгомієлину з тканини проводили поетапно. На першому етапі витягували загальну ліпідну фракцію з ниркової тканини за методом Фолча [Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н., 1985]. На другому етапі виділяли фракцію фосфоліпідів із загальної ліпідної фракції за методом Васьковського [Лемешко В.В, Бровкович В.М., Листопад А.П., 1991]. Вміст сфінгомієлину визначали в елюатах проб після розділення фракції загальних фосфоліпідів методом тонкошарової хроматографії на стандартних пластинках “Silufol” в системі розчинників хлороформ: метанол: вода (65:30:5). Фракцію сфінгомієлину з пластинок еюлювали сумішшю розчинників хлороформ: метанол (2:1). Кількість сфінгомієліну визначали за методом Чена [Chan Ch., Goldcorn T., 2000]. Пробу сфінгомієліну спалювали до неорганічного фосфату, потім проводили кольорову реакцію з хромогенним реагентом. Оптичну щільність забарвлених проб вимірювали при л = 700 нм. Вміст неорганічного фосфату визначали за калібрувальною кривою стандартного розчину КН2РО4.

Для виділення вільного сфінгозину нами був використаний метод, заснований на екстракції сфінгоїдних основ діетиловим ефіром, в нашій модифікації. Модифікація полягала у відсутності етапу гідролізу сфінгомієлінів. Кількісно пул вільного сфінгозину визначали за методом Lauter - Trams, заснованого на утворенні забарвленого комплексу сфінгозину і метилоранжу [Lauter C.J., Trams C.G.,1962]. Проби спектрофотометрували при л = 415 нм. Кількість вільного сфінгозину визначали за калібрувальною кривою стандартного розчину сфінгозину (Amersham).

Визначення активності супероксиддисмутази проводили біохімічним методом по її здатності інгібувати накопичення продукту аутоокислення адреналіну в лужному середовищі, який поглинає при л =347 нм [Сирота Т.В.,1999]. Методом диференціального центрифугування з гомогената виділяли мітохондріальну фракцію. Ступінь інгібування ферментом швидкості аутоокислення адреналіну розраховували за формулою. Визначення активності лактатдегідрогенази проводили за стандартною біохімічною методикою з використанням 2,4-динітрофенілгідразина.

Визначення протеолітичної активності тканини нирок проводили з використанням азосполук ферментів казеїну і колагену, які є маркерами лізису високомолекулярних білків і колагену. У лужному середовищі рН ці азосполуки виступають як субстрати для визначення активності протеїназ. Екстинкцію проб вимірювали при л =440 нм і перераховували за формулою на 1 час інкубації і 1 г тканини.

Активність гамма-глутамілтранспептидази в сироватці крові щурів визначали з використанням спеціального набору [Nielsen L.G., 1987]. Активність ферменту визначали методом постійного часу.

Дослідження зміни часу релаксації протонів тканинної води нирок проводили методом ЯМР-релаксометрії на ядрах 1Н, in vitro (ЯМР-релаксометр фірми “Вruker”). Нирки на льоду подрібнювали на тонкі зрізи, потім їх осушували. Нирки зважували на електронній вазі “Sartorius” (ФРГ) і для ЯМР-досліджень були взяті однакові наважки, маса яких становила 750±5 мг. Скляну пробірку (діаметр 10 мм) з тканиною вміщували в комірку ЯМР-релаксометра для вимірювання релаксації протонів тканинної води.

Т1 визначали за методом “inversion-recovery”, використовуючи 180о - Т - 90о пульсову послідовність по 40 точках, а Т2 - за методом CPMG. Після визначення Т1 і Т2, показники розкладали на біекспоненти і розраховували Ра і Рв, що характеризують внутрішньоклітинний і позаклітинний об'єм тканинної води, відповідно. Ці дані, як і визначення Т1 і Т2, оброблялися автоматично персональним комп'ютером “Minispec” за допомогою серійного інтерфейсу RS і 232С по програмних пакетах фірми “Bruker”.

Таким чином, нами були використані методики, що дозволяють виявити біохімічні зміни в тканині нирок, плазмі, сироватці крові, сечі в умовах розвитку гострої ниркової недостатності і стимуляції апоптотичних процесів. Сумісний підхід морфологічної та біохімічної детекції апоптозу в нирках дозволив встановити правильність вибраних моделей для вивчення стимуляції програми клітинної загибелі та її модуляції при даному синдромі.

Статистична обробка даних проводилася з використанням оригінальної програми Microsoft Excel 97 традиційними методами варіаційної статистики. Достовірність відмінності середніх оцінювали з використанням t-критерію Ст?юдента.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Детекція апоптозу в тканині нирок при експериментальній ГНН. У наших дослідженнях при різних моделях гострої ниркової недостатності були виявлені морфологічні ознаки розвитку апоптозу. У зрізах нирок дослідних тварин (на 2 і 3-ю добу), забарвлених флуоресцентним барвником нуклеїнових кислот Хехст 33342, була присутня значна кількість клітин, здатних до апоптозу. Виявлено характерні для різних стадій апоптозу зміни ядер. На першій стадії апоптозу спостерігалася конденсація ядерного хроматину і його розташування по периферії ядра у вигляді кілець, півкілець або серпів. Друга стадія супроводжувалася зменшенням розмірів ядер, зміною їх форми і фрагментацією. Фазово-контрастна мікроскопія показала, що клітини з апоптотичними змінами часто були зменшені в розмірах і відділені від пласта ниркових клітин. У зрізах нирок контрольних тварин відзначені вище зміни практично не виявлялися.

Нами було встановлено, що рання фаза розвитку гострої ниркової недостатності супроводжувалася підвищеною кількістю низькомолекулярних фрагментів ДНК в клітинах нирок (за методом гель-форезу та дифеніламінового тесту). З наведених даних (Мал. 1 ) витікає, що в експериментальних групах І моделі (ішемія/реперфузія) і ІІ моделі (“гліцерольна”) спостерігається підвищений вміст фрагментованої ДНК в порівнянні з групою контролю-1. І модель: на 1 добу - в 3,5 рази, на 2 добу - в 5,4 рази, на 3 добу - в 4,4 рази. У групі 60-ти хвилинної постішемії (контроль-2) встановлено недостовірне підвищення деградації ДНК. У групах ГНН ІІ моделі наростання фрагментації ДНК відбувалося різкіше, ніж в групах І моделі. Динаміка вмісту фрагментованої ДНК в клітинах нирок мала максимум на 2 добу (для 1 і 11 моделей). Отже, початкова фаза розвитку гострої ниркової недостатності супроводжується активацією апоптотичних процесів в нирках з піком на 48-72 год. після реперфузії.

Мал. 1 - Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при експериментальній ГНН.

Найбільш інтенсивно апоптотичні процеси проходили у тварин ІІ моделі, що відповідає максимальній кількості низькомолекулярних фрагментів ДНК, в порівнянні з групами 11 моделі.

Таким чином, наші біохімічні та морфологічні дослідження підтвердили, що початкова фаза розвитку ГНН в тканині нирок супроводжується кількісними і якісними змінами, характерними для апоптотичної форми клітинної загибелі.

У літературі, присвяченій активації апоптозу при ГНН, практично немає даних про зміну активності ферментів антиоксидантної системи, вмісту NO?, протеолітичної активності тканини нирок.

Гостра ниркова недостатність супроводжується істотною активацією тканинного протеолізу: інтенсивність протеолітичної деградації високомолекулярних білків збільшувалася на 18,1% (1 доба), на 34,2 % (2 доба), на 20,9 % (3 доба) для експериментальних груп 1 моделі в порівнянні з контролем-1. А колагеназна активність ниркової тканини протягом перших трьох діб реперфузії підвищилася в 1,2 рази.

При “гліцерольній” моделі також спостерігалася активація протеолізу, але з більшою інтенсивністю як за азоколом, так і за азоказеїном. Це можна пояснити додатковим до гіпоксії впливом токсичної дії гліцеролу на клітини ниркової тканини. Так, протягом розвитку ГНН від 1 до 3-ї доби лізис азоказеїну підвищувався на 30,5%, на 32,9%, на 28,7%, а лізис азоколу - в 1,3 рази, в 1,3 рази, в 1,2 рази. Отже, ішемія / гіпоксія нирок супроводжується посиленням активації протеолізу в тканині. Цей факт може вказувати на збільшення окислених білків, як перших мішеней для протеаз та на перевищення катаболічних процесів над анаболічними на останній стадії розвитку програмованої загибелі клітин.

Нами була встановлена позитивна кореляційна залежність між лізисом високомолекулярних білків (rxy=0,80) і колагену (rxy=0,96) і ступенем фрагментації ДНК в нирках.

Одна з ліній захисту проти оксидантного стресу в нирках представлена внутрішньоклітинними ферментами-антиоксидантами, такими як супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатіонпероксидаза і глутатіонредуктаза. В літературі практично немає даних про зміну активності антиоксидантних ферментів при експериментальній гострій нирковій недостатності в її ранній фазі розвитку. Паралельно з активацією гліколізу в клітинах ниркової тканини відбувалося різке зниження активації СОД. Результати свідчать, що у тварин спостерігалося виражене порушення активності СОД: на 1-у добу після реперфузії ферментативна активність знизилася в 2,7 рази, на 2-у добу - в 4,5 рази і на 3-ю добу - в 3,3 рази. Через 1 годину після ішемії також спостерігалося зменшення активності СОД в 1,6 рази, в порівнянні з групою контролю. В експериментальних групах 11 моделі динаміка виявилася подібною: в 2,7 рази, в 4,8 рази і в 3,6 рази, відповідно на 1, 2 і 3-ю добу. Отже, на початку розвитку ГНН ферментативна активність СОД сильно пригнічена, що не може не позначитися на всій антиоксидантній системі клітин. Виходячи з отриманих нами даних про посилення активації протеолізу, можна пояснити зниження ферментативної активності СОД за рахунок її металокаталізованого окислення (МКО) [Мещишен І.Ф., Польовий В.П.,1999]. Нами встановлено кореляційний зв'язок між активністю СОД і активацією протеолізу (rxy=-0,73), між активністю СОД і фрагментацією ДНК (rxy=-0,99) з досить високими коефіцієнтами кореляції.

Отже, за отриманими даними можна зробити висновок, що порушення ферментативної активності СОД та активації тканинного протеолізу нирок порівняний із ступенем деградації ДНК і , відповідно, з активацією апоптотичних процесів.

Особлива роль в регуляції процесів клітинної загибелі належить оксиду азоту (NO), який може виступати як чинник виживання або служити сигналом загибелі, в залежності від концентрації та типу клітин. Паралельно із зростанням числа клітинних функцій, регульованих NO, збільшується і список захворювань, пов'язаних з порушенням синтезу і /або виділення NO [Malyshev I.Yu.,Manukhina E.B.,1999]. На сьогодні точно не встановлено цитотоксичний або цитопротекторний ефект виявляє NO при ГНН.

Нами було встановлено, що після розвитку гострої ниркової недостатності в експериментальних групах 1 моделі спостерігалося значне збільшення концентрації стабільних метаболітів NO2- і NO3- в тканині нирок в порівнянні з групою контролю. При цьому динаміка зміни NO виявилася неоднозначною: із збільшенням рівня NO від 1 до 2-ї доби і деяким зниженням до 3-ї доби. У експериментальних групах 11 моделі ГНН також спостерігалася помірна генерація NO. Динаміка рівня NOх була аналогічною: від 1 до 2-ї доби - плавне збільшення, а на 3-ю добу - плавне зниження показника. Відомо, що при розвитку патологічних процесів, що проходять на фоні ішемії і гіпоксії в клітинах тканин посилюється синтез NO, NO2-, NO3- і, одночасно, підвищується активність нітритредуктазної системи, як адаптаційні механізми.

Зміна вмісту нітрит- і нітрат-іонів в тканині нирок при гострій нирковій недостатності виявилася різною. Концентрація NO2- в групах одно-, двох- і тридобових тварин 1 моделі була достовірно знижена в порівнянні з контрольною групою, мінімум цього показника спостерігався на 3-ю добу. При “гліцерольній” моделі вміст нітрит-аніонів знижувався, але недостовірно і був нижче базального рівня. Вміст нітрит- і нітрат-аніонів в сечі і плазмі щурів виявився також підвищеним в порівнянні з групою контролю. Так, при експериментальній ГНН збільшення NOх в сечі однодобових тварин становило 17,2%, дводобових - 21,3%, тридобових - 25,9%. Ми також проаналізували сумарний вміст стабільних метаболітів оксиду азоту в безбілкових пробах плазми. Встановлено, що у експериментальних щурів 1 і 11 моделей він був достовірно підвищеним в порівнянні з групою контролю-1.

При порівнянні загального вмісту NOх в плазмі крові і сечі щурів було виявлено, що рівень NO2- в плазмі достовірно підвищувався від 1 до 3-ї доби, а в сечі на першу добу спостерігалося зниження і тільки на третю добу - перевищення контрольних значень.

Отже, гостра ниркова недостатність (ГНН) супроводжується підвищеним вмістом оксиду азоту в тканині нирок, сечі і плазмі. При цьому рівень нітритів в тканині недостовірно знижується, а рівень нітрату достовірно підвищується. Дані результати дозволяють передбачити, що в початковій фазі ГНН цитотоксичний ефект оксиду азоту може превалювати над цитопротекторним, можливо, внаслідок утворення пероксинітриту [Walker L.M., York J.L., Imam S.Z. et al., 2001]. Була виявлена позитивна кореляційна залежність між деградацією ДНК і накопиченням нітрит- і нітрат-аніонів (rxy=0,89), негативний кореляційний зв'язок між активністю СОД і накопиченням сумарних метаболітів оксиду азоту (rxy=-0,76) і позитивна кореляційна залежність між вмістом стабільних метаболітів оксиду азоту і активацією протеолизу високомолекулярних білків і колагену (rxy=0,95, rxy=0,78).

Є літературні дані, що інгібування iNOS у щурів перед формуванням ниркового ішемічного пошкодження призводить до певного захисту нирок [Cuzzocrea S.et al. 2000, Ling H., Edelstein Ch., Gengaro P., 1999]. З метою виявлення біфункціональної дії оксиду азоту при ГНН ми провели інгибування iNOS і вивчили активацію протеолізу, активність СОД і ступінь деградації ДНК. Наші дослідження встановили, що ініціювання активації протеолізу, фрагментації ДНК і інгібування СОД можуть бути значно скасовані ингібіцією iNOS-синтази, можливо, внаслідок супресії продукції пероксинітриту.

В експериментальних групах гострої ниркової недостатності 1 і 11 моделей ін'єкція інгібітора iNOS кількісно знизила рівень фрагментації ДНК в нирках в порівнянні з групами гострої ниркової недостатності, однак, цей показник не досяг базального рівня (Мал.2).

Мал. 2 - Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при інгібуванні активності iNOS на фоні розвитку ГНН.

Так, на 1- у добу спостерігалося зниження деградації ДНК в 1,2 рази (1,3 рази), на 2-у добу - в 1,3 рази (1,3 рази), на 3-ю добу - в 1,2 рази (1,2 рази) для груп 1 моделі (11 моделі). Така динаміка дозволяє передбачити, що інгібіція iNOS дещо знижує рівень апоптозу, мабуть, за рахунок ослаблення токсичної дії пероксинітриту, а, отже, регуляторна роль оксиду азоту в умовах ішемії/реперфузії і гіпоксії спрямована на нормалізацію клітинних процесів. Разом з тим оксид азоту не в змозі забезпечити повний багаторівневий захист від негативних наслідків програмованої клітинної загибелі, що підтверджується підвищеним вмістом фрагментованої ДНК в клітинах нирок в умовах гострої ниркової недостатності.

Наші експерименти з попереднім введенням щурам нітроаміногуанідину показали позитивний ефект інгібування iNOS на інтенсивність протеолізу і активність СОД, в порівнянні з групами гострої ниркової недостатності. Інтенсивність протеолізу виявилася зниженою, активність СОД при цьому була достовірно підвищеною, що можна зв'язати з цитотоксичною дією оксиду азоту (або накопичення пероксинітриту) і поліпшенням стану антиоксидантного захисту при інгібіції індуцибельної NO-синтази. Біфункціональний характер дії оксиду азоту полягає в тому, що підвищений вміст його метаболітів на ранній стадії ГНН є елементом компенсаторної реакції, але на тлі розвитку оксидантного стресу (за літературними даними)[ Walker L.M., York J.L., Imam S.Z. et al.,2001] ця роль оксиду азоту перетворюється на негативну (можливо внаслідок накопичення пероксинітриту).

Роль опіоїдних рецепторів в модуляції апоптозу в тканині нирок. Встановлено, що ендогенна опіоїдна система бере участь практично у всіх процесах життєдіяльності організму. Між тим опіатергічній модуляції апоптозу в нирках в експериментальній і клінічній літературі приділяється мало уваги.

Опіоїдні рецептори широко представлені на периферії. Вони знайдені в нирках [Stein C.M.D,1995], що підтверджено нашими власними дослідженнями.

Спектр дії синтетичного лей-енкефаліну даларгіну досить широкий і відображує функції регуляторних пептидів, направлених на підтримку гомеостазу. Препарат володіє гіпотензивною, антистресовою, антиішемічною, антигіпоксичною та іншими діями [Куковська І .Л.,1998, Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б.,2002]. Можна передбачити, що маючи антиоксидантні властивості, даларгін буде впливати і на процеси апоптозу [Diao C.T., Li L., Lau S.Y., et al. ,2000, Singhal P.C., Sharma P., Sanwal V., et al.,1998]. Результати досліджень з даларгіном приведені на Мал.3, з якого виходить, що синтетичний лей-енкефалін істотно знижує ступінь деградації ядерної ДНК в експериментальних групах тварин (ГНН+дал) в порівнянні з групами ГНН. Так, в групах I моделі в першу добу вміст ф-ДНК знизився на 25,1 %, на другу добу - на 20,4 % і на 3-ю добу - на 27,1 %. У групах II моделі спостерігалася аналогічна тенденція: на 1- у добу - на 20,5%, на 2-у добу - на 40,3 %, на 3-ю добу - на 34,4 %. Отже, намітилася тенденція до поліпшення функціонального стану клітин на 2-3-ю добу. У контрольній групі-2 (для 1 моделі) достовірних змін не спостерігалося. При паралельному введенні даларгіну і налоксону не спостерігалося зниження фрагментації ДНК в групах як I, так і II моделей, вміст ф-ДНК відповідав таким показникам в групах ГНН. Тобто попереднє блокування опіоїдних рецепторів (ОР) налоксоном усувало антиапоптозний ефект даларгіну, що вказує на рецептор-залежний механізм дії агониста.

Мал. 3 - Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при модуляції апоптозу при експериментальній ГНН.

Протилежними виявилися результати в групах інтактних тварин (І-1, І-2, І-3) після введення агониста опіоїдних рецепторів. У порівнянні з контролем - 1 спостерігалося різке збільшення ступеня деградації ДНК в клітинах ниркової тканини після ін'єкції даларгіну. При тривалому введенні даларгіну від 1 до 3-ї доби - плавне підвищення вмісту ф-ДНК (Мал.4). Якщо порівнювати показники груп І-1, І-2, І-3 з показниками експериментальних груп гострої ниркової недостатності, то простежується підвищення їх значень. Для групи І-1 вміст ф-ДНК збільшився на 3,9 % (8,3 %), для групи І-2 - на 2,1 % (0,9 %) (недостовірно), для групи І-3 - на 9 % (8,2 %) для І моделі (для II моделі), відповідно. Попередня блокада опіоїдних рецепторів повністю усувала проапоптозну дію даларгіну в нирках інтактних щурів, що вказує на опіоїд-рецепторно-залежний розвиток апоптозу. Таку дію синтетичного опіоїда можна охарактеризувати як модуляція апоптозу через периферичні опіоїдні рецептори [Singhal P.C., Kapasi A.A., Franki N.,2000].

Таким чином, ми зіткнулися з різними ефектами опіоїдних рецепторів на процеси апоптозу в фізіологічних умовах та при ішемії/гіпоксії. Оскільки ефекти даларгіну реалізуються через два типи рецепторів д- і м-, ми передбачили, що стимуляція апоптозу даларгіном в нормі і його інгибування за умов гострої ниркової недостатності реалізується через різні опіоїдні рецептори.

Для підтвердження цього припущення ми застосували глібенкламід - блокатор АТФ-чутливих К+-каналів, стимуляція яких даларгіном здійснюється через д 1- опіоїдні рецептори [Лишманов Ю.Б., Маслов Н.М., 2003].

Глібенкламід блокував протекторну дію даларгіну в групах моделі ішемії/реперфузії, що вказує на участь д1- опіоїдних рецепторів в реалізації антиапоптотичного механізму через активацію АТФ-чутливих мітохондріальних К+-каналів (Мал.5).

Мал. 4 - Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок інтактних щурів на фоні введення даларгіну, налоксону, каптоприлу, індометацину.

Стимуляція апоптозу даларгіном у інтактних тварин, мабуть, реалізується через м - рецептори, на що вказує відсутність блокуючого ефекту під дією глібенкламіду (Мал.6). Отже ще одним фактором модуляції апоптозу в нирках можуть бути мітохондріальні К+АТФ - канали.

Мал. 5 - Вміст фрагментованої ДНК в нирках на фоні блокування К⁺_АТФ - каналів при ГНН.

Вміст фрагментованої ДНК в нирках на фоні блокування К+АТФ - каналів при ГНН.

Чи пов'язаний антиапоптозний ефект екзогенного опіоїду з активацією NO- синтаз? Ми провели дослідження впливу даларгіну на рівень метаболітів оксиду азоту. Попередня стимуляція опіоїдних рецепторів даларгіном сприяла значному зниженню сумарного рівня NOх у всіх експериментальних групах ГНН. При цьому зменшення склало: в контролі-2 - 31,7%, на 1-у добу - 42,5%, на 2-у добу - 47,3%, на 3-ю добу - 27,3% в порівнянні з групою контролю (1 модель). Для експериментальних груп 11 моделі спостерігалося наступне зменшення концентрації NOх: на 1 добу - 22,5%, на 2 добу - 15,6%, на 3 добу - 15,3%. Динаміка вмісту окислених метаболітів NO була різною: вміст нітрат-аніонів -NO3- під впливом даларгіну зменшився, але його значення не перевищувало таких в групі контролю, а концентрація нітрит-аніонів - NO2- достовірно збільшувалася і перевищила такі контрольні значення (для 1 моделі). Для експериментальних груп II моделі динаміка вмісту NO3- - іонів мала аналогічну динаміку, а для NO2- - іонів збереглася тенденція до збільшення концентрації. Отже, виражений антирадикальний ефект даларгіну супроводжувався істотним зниженням синтезу і/або звільнення NO. Також встановлено протигіпоксичну дію даларгіну за зниженням рівня лактату в нирковій тканині щурів при різних моделях ГНН.

Вміст фрагментованої ДНК в нирках інтактних щурів на фоні блокування К+АТФ - каналів.

При паралельному введенні щурам налоксону і даларгіну спостерігалося скасування ефекту даларгіну щодо вмісту оксиду азоту, це вказує на реалізацію його ефектів через опіоїдні рецептори. Отже, регуляція системи оксиду азоту в тканині нирок можлива за участю опіоїдних рецепторів. Попередня інгібіція індуцибельної NO-синтази не відбилася на вмісті метаболітів оксиду азоту під дією даларгіну, що вказує на його здатність стимулювати інші ізоформи NO-синтази.

У групах інтактних щурів після активації опіоїдних рецепторів (ОР) екзогенним опіоїдом вміст NOх в нирках плавно збільшувався від 1 до 3-ї доби в порівнянні з групою контролю-1. Достовірні зміни спостерігалися тільки на третю добу. Попереднє введення налоксона усувало ефект даларгіну, пов'язаний з накопиченням NO. Отже, за фізіологічних умов підвищення продукції оксиду азоту під дією екзогенного лей-енкефаліну опосередковано через активацію опіоїдних рецепторів (ОР) тільки при тривалому введенні (після трьох діб).

Попереднє інгібування iNOS-синтази не відбилося на вмісті метаболітів оксиду азоту під дією даларгіну в нирках інтактних щурів. Отримані результати можна пояснити тим, що, опіоїдні рецептори беруть участь у підтримці рівня оксиду азоту за рахунок активації конститутивної NOS, яка є істотною для забезпечення нормалізації гемодинаміки в нирках. В умовах норми спільне введення нітроаміногуанідину і даларгіну не змінило рівень вмісту метаболітів оксиду азоту в тканині нирок. Можна заключити, що біохімічна активність даларгіну в нормі пов'язана із запуском програми клітинної загибелі через інші опіоїдні рецептори і не опосередкована участю оксиду азоту, а в умовах стимульованого апоптозу (моделі ГНН), навпаки, направлена на виживаність клітин і пригнічення в них апоптотичних процесів через активацію д1- опіоїдних рецепторів з участю системи оксиду азоту.

Не менш цікавий результат наших досліджень, пов'язаний з лігандами ОР, був виявлений в дослідах з введенням антагоніста ОР - налоксону перед нирковим пошкодженням. Блокада опіоїдних рецепторів (ОР) налоксоном призвела до значного зниження деградації ДНК у порівнянні з групами гострої ниркової недостатності. Так, для I моделі в групі контролю-2 не спостерігалося змін у вмісті ф-ДНК, на 1-у добу зниження становило 20,3%, на 2-у добу - 14,8%, на 3-ю добу - 20,8% від таких показників в групах ГНН-1, ГНН-2, ГНН-3, відповідно. У групах II моделі на 1-у добу -13,5%, на 2-у добу -18,4%, на 3-ю добу-17,9%. Після ін'єкції налоксону у інтактних щурів спостерігалося підвищення фрагментації ДНК, але меншим, ніж при введенні даларгіну. На першу добу деградація ДНК підвищилася в 2,5 рази, на другу - 2,4 рази і на третю - в 2 рази, в порівнянні з контролем.

Отже, налоксон як антагоніст даларгіну також сприяє зниженню деградації ДНК в клітинах нирок в умовах стимульованого апоптозу, але його антиапоптозна дія виражена слабкіше в порівнянні з екзогенним лей-енкефаліном. Виявлені ефекти можуть бути пов'язані з неспецифічною мембранопротекторною дією і специфічного зв'язування з опіоїдними рецепторами [Головко А.И., Головко С.И., Леонтьева Л.В.,2003]. Реалізація цих ефектів налоксону, очевидно, буде визначатися дозою, що вводиться, а також відмінностями в аффінності і щільності розподілу різних підтипів м-ОР. Тому є підстави вважати, що налоксон, хоча і відноситься до антагоністів ОР, але, виявляючи часткові властивості агонистів, може впливати і на регуляцію програми клітинної загибелі.

Таким чином, модуляція програми клітинної загибелі у вибраних нами моделях ГНН через опіоїдні рецептори спрямована на захист клітин нирок і пригніченню процесів апоптозу. Цитопротекторний ефект агонистів і антагоністів ОР являється NO - опосередкованим. А за фізіологічних умов біохімічна активність лігандів ОР поєднана з запуском програми клітинної загибелі, механізм їх дії реалізується незалежно від рівня оксиду азоту.

Ренін-ангіотензинова та простаноїдна системи нирок як фактори модуляції апоптозу. Ангіотензин 11 (АТ 11) грає важливу роль в розвитку і прогресуванні ГНН. Чи існує залежність між рівнем АТ11 і апоптозом в нирках? Як в експериментальних моделях, так і в клінічних дослідженнях встановлено підвищення ниркового рівня АТ 11. Підвищена активація ангіотензину 11 при ГНН є джерелом АФК і NO. Тому обговорювати питання про регуляцію апоптозу в умовах блокади РАС слід з урахуванням тісної взаємодії останньої з вільнорадикальними процесами в нирковій тканині, тим більше, що про зв'язок антиоксидантного ефекту даного препарату на нирки при ГНН відомо мало.

Блокада активності АПФ призвела до зниження деградації ядерної ДНК в клітинах нирок в двох моделях ГНН. Так, на 1-у добу після реперфузії фрагментація ДНК зменшилася в 1,2 рази, на 2-у добу - в 1,3 рази, на 3-ю добу - в 1,2 рази. У групах II моделі показники були наступними: на 1- у добу - в 1,2 рази, на 2-у добу - в 1,4 рази, на 3-ю добу - в 1,5 рази в порівнянні з групами ГНН (Мал.3). апоптотичний ішемічний нирковий недостатність

Введення експериментальним тваринам каптоприлу супроводжувалося достовірним зниженням протеолітичної активності як за азоказеїном, так і за азоколом, в порівнянні з групами ГНН в I і II моделях. Активність СОД значно підвищувалася від 1 до 3-ї доби, в I моделі - в 1,3 рази, в 1,5 рази, в 1,2 рази; у II моделі - в 1,3 рази, в 1,4 рази, в 1,3 рази, відповідно, в порівнянні з групами ГНН. При аналізі показників системи NO встановлено, що під впливом каптоприлу дещо знизилося накопичення і/або утворення кінцевих метаболітів оксиду азоту. При цьому рівень оксиду азоту зберігався підвищеним, тобто блокада ангіотензин-перетворюючого ферменту не послабила активацію процесів синтезу NO в нирках, схильних до ішемії/гіпоксії.

Основним механізмом дії каптоприлу на систему NO у експериментальних тварин з'явилася, очевидно, блокада АПФ. За літературними даними ангіотензин 11 здійснює стимулюючу дію на утворення супероксидних радикалів, які реагують з NO, зв'язуючи його і утворюючи оксидант пероксінітратну кислоту [Taal M.W., Brenner B.M.,2000, Lodha S., Dani D., Mehta R. et al.,2002]. Очевидно, при блокаді АПФ спостерігається зниження утворення активних форм кисню (АФК) і активних форм азоту (АФА), що приводить до зниження накопичення продуктів метаболізму NO. Попереднє інгібування iNOS до ін'єкції каптоприлу не призвело до достовірних змін вмісту сумарних метаболітів NO в нирках в порівнянні з групами ГНН + каптоприл як для 1, так і для 11 моделей ГНН. Але якщо порівняти групи паралельного блокування і блокади АПФ з групами інгібіції iNOS, то простежується значне достовірне збільшення рівня NO. Так, в групі контролю-2 (1 модель) приріст NO становив 28,3% (31,2%), на 1-у добу - 49,8% (44,5%), на 2-у добу - 56,1% (55,2%), на 3-ю добу - 51,3% (48,4%) для груп ГНН+каптоприл, (для груп ГНН + бл.iNOS + каптоприл). У експериментальних групах 11 моделі аналогічні показники були наступними: на 1-у добу - 58,5% (53,3%), на 2-у добу - 47,3% (51,6%), на 3-ю добу - 44,9% (50,4%) для відповідних груп. А гіперпродукція оксиду азоту, що зберігається при блокаді АПФ, може бути пов'язана з накопиченням брадикінину. На сьогодні внесок брадикінину в ефект інгібіторів АПФ продовжує обговорюватися [Fillipatos G.,Uhal B.D. ,2003]. Але за накопиченими експериментальним даними можна припустити, що сприятливі апототичні ефекти інгібіторів АПФ, мабуть, пов'язані не тільки із зменшенням активних форм кисню і ослабленням ОС, але й внаслідок підвищення рівня брадикінину, що впливає на продукцію NO. Для підтвердження цієї гіпотези ми провели серію дослідів з інтактними щурами. Після ін'єкції каптоприлу в нирках цих тварин спостерігалося підвищення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в порівнянні з контрольною групою, з групами інгібування iNOS, яке кількісно наближалося до рівня NO в експериментальних групах ГНН. При цьому спостерігалася активація апоптотичних процесів. Так, на 1-у добу значення NOх підвищилося на 32,4%, на 2-у добу - на 36,5%, на 3-ю добу - на 38,4%, в порівнянні з контролем. При цьому вміст нітритів дещо знизився. Тенденція до активації NO- системи в нирках зберігалася й після попередньої інгібіції iNOS. Вміст стабільних метаболітів в цих групах відповідав таким показникам в групах з блокадою АПФ. Отже, блокада АПФ супроводжується у інтактних щурів активацією інших ізоформ NOS, яка, можливо, опосередковується через накопичення брадикінину.