Модуляція апоптозу та внутрішньониркових регуляторних систем при експериментальній гострій нирковій недостатності

Потрібно зазначити, що величини обмеженого протеолізу виявили негативну кореляційну залежність з активністю СОД (rxy = -0,77) в нирках при введенні каптоприлу на фоні розвитку ГНН. Також встановлена оберненопропорційна кореляційна залежність між фрагментацією ДНК і активністю СОД (rxy = -0,98) в нирках за аналогічних умов.

Наше дослідження показало, що каптоприл має антиоксидантну активність і спричиняє в нирковій тканині достовірне зниження інтенсивності протеолітичної активності, накопичення метаболітів оксиду азоту і підвищення активності системи антиоксидантного захисту (СОД). Отже, нами був встановлений також і антиапоптозний ефект каптоприлу, який виразився в зменшенні ступеня деградації ДНК. Таким чином, отримані дані свідчать, що тканинна ангіотензинова система як на початковій фазі розвитку ГНН, так і за фізіологічних умов являється одним з факторів модуляції апоптозу в нирках. При цьому спостерігається взаємозв'язок між системою NO і РАС, опіоїдними рецепторами і РАС.

Вивчення ефектів простаноїдів - сьогодні вважається одним з перспективних напрямків, який допоможе зрозуміти механізми регуляції міжклітинних комунікацій, в тому числі і в регуляції апоптотичних процесів. Вважають, що оскільки простагландини гальмують апоптоз клітин, то інгібіція їх синтезу нестероїдними протизапальними препаратами (НПЗП) може сприяти нормалізації життєвого циклу клітин в зоні запалення і пригніченню неконтрольованої проліферації пухлинних клітин [Насонов Е.Л.,2000]. Особлива увага НПЗП приділяється як регуляторам апоптозу клітин [Насонов Е.Л.,2000].

В умовах розвитку гострої ниркової недостатності під дією індометацину було відмічено значне збільшення фрагментації ДНК на 1-3-ю добу в порівнянні з експериментальними групами ГНН. Вміст ф-ДНК при паралельному інгібіруванні iNOS та блокуванні циклооксигенази (ЦОГ) був також підвищеним в порівнянні з групами ГНН і практично не відрізнявся від показників груп із застосуванням індометацину. Отже, нами отримано проапоптотичний ефект індометацину в нирках при експериментальній гострій нирковій недостатності. Ми підтвердили, що індометацин, як блокатор переважно ЦОГ-1, реалізує свої нефротоксичні властивості і через ініціювання апоптозу. Ін'єкція блокатора ЦОГ призвела до значного зниження вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в порівнянні з групами ГНН. Так в групі контролю-2 сумарний вміст NOx зменшився в 1,5 рази, кількість NO3 - - в 1,6 рази, а NO2- - не змінилася, в порівнянні з групами ГНН. В експериментальних групах простежувалася така ж тенденція, рівень NOx знижувався в 1,7 рази на кожну добу для 1 моделі і - в 1,5 рази, відповідно, в групах 11 моделі. При цьому динаміка зміни нітрит-іонів виявилася різною. У групах 1 моделі вміст NO2- достовірно не змінювався, а в групах 11 моделі - достовірно зменшувався від 1 до 3-ї доби в 1,6 рази, в 1,9 рази і в 1,6 рази, відповідно.

Отже, блокування циклооксигеназного шляху арахідонової кислоти на фоні розвитку ГНН призводить до значного зниження (але не до базального рівня) вмісту кінцевих метаболітів оксиду азоту в тканині нирок, але при цьому рівень NO2- залишається незмінним тільки при ішемічному впливі. Попереднє введення нітроаміногуанідину достовірно не змінювало вміст метаболітів оксиду азоту в групах ГНН+ бл. iNOS +бл.ЦОГ в порівнянні з групами ГНН+бл.ЦОГ, як для 1, так і для 11 моделей. Отже, дія індометацину реалізується незалежно від NO. Можна передбачити, що регуляторна система оксиду азоту і продукти циклооксигеназного метаболічного шляху між собою діють синергічно та взаємодоповнено.

Мал. 6 - Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок інтактних щурів на фоні блокування активності циклооксигенази.

Саме розвитком індометацин-індукованого апоптозу можна пояснити високий вміст ф-ДНК в клітинах нирок інтактних щурів (Мал.7 ).

Ін'єкція індометацину інтактним тваринам протягом трьох діб спричиняла істотне підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту в порівнянні з контрольною групою. Так, на 1-у добу рівень NO3- збільшився в 1,3 рази, на 2 і 3-ю добу - в 1,6 рази в порівнянні з контролем. Кількість нітрит-іонів підвищувалася від першої до третьої доби, на другу добу рівень NO2- ще відповідав базальному, а на третю - перевищував його в 1,3 рази. Таку протилежну дію індометацину в нормі можна пояснити, передусім, його блокадою ЦОГ-1, що приводить до зниження локального синтезу ендогенних структурних (фізіологічних) простаноїдів. Ізоформа ферменту ЦОГ-1 відповідає за вироблення простаноїдів, що беруть участь в регуляції ниркового кровообігу. Мабуть, пригнічення активності ЦОГ-1 у інтактних щурів викликає стимуляцію системи оксиду азоту, як компенсаторний механізм поліпшення гемодинаміки нирок. Блокування ЦОГ може також призвести до накопичення попередника простаноїдів - арахідонової кислоти, яка стимулює сфінгомієліновий цикл [Perry D.K., Hannum Y.A.,1998]. Нами була встановлена участь сфінгомієлинового сигнального шляху в активації апоптозу при гострій нирковій недостатності (див. далі).

Ми виявили, що циклооксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти відіграє значну роль в регуляції апоптозу в нирках за рахунок впливу на ниркову гемодинаміку (через простаноїди і NO) і на сфінгомієліновий сигнальний шлях. Ця роль є істотною для підтримки гомеостазу нирок в нормі і важливим моментом в розвитку патологічних процесів в цьому органі.

Сфінгомієліновий метаболічний шлях активації апоптозу в нирках. Генератором вторинних посередників, що беруть участь в регуляції апоптозу, є сфінгомієліновий цикл, основні компоненти якого це сфінгомієлін, церамід, сфінгозин і ферменти сфінгомієліназа і церамідаза. Є малочисельні літературні дані, що демонструють зміну вмісту сфінгомієліну, цераміду і сфінгозину в розвитку індукційної фазі гострої ниркової недостатності [Levade T., Jaffrezou J.P.,1999, Мойсеєнко В. О.,2001, Healy А., Dempsey M., Lally C., Ryan M.P.,1998]. Показано, що ішемія спричиняє підвищення рівня сфінгозину і цераміду приблизно на 50 % і передбачається важливе значення їх рівня в індукційній фазі та розвитку постішемічної ГНН [Iwata M., Prington I.H., Zager R.A., 1995].

Недостатньо вивчені механізми передачі апоптозного сигналу з участю сфінгомієлінового шляху при ішемічних пошкодженнях різних органів, в т.ч. нирок. Механізм цієї активації досі не вивчений повністю, однак, на сьогодні в літературі з'явилися дані про залежність активності основного ферменту сфінгомієлинового циклу - сфінгомієлінази - від рівня окислювальних процесів в клітині [Zhang P., Liu B.Jenkins G.M.,1997]. Незважаючи на безперечний зв'язок апоптозу з окислювальними реакціями, даних про вплив сфінгозину на вільнорадикальні процеси при введенні його тваринам в літературі ми не виявили. Зв'язок активності сфінгомієлінази з рівнем протеолітичної активності, з рівнем оксиду азоту і активністю СОД в нирках in vivo в літературі нами також не було виявлено.

Для визначення наявності або відсутності взаємозв'язку сфінгомієліназної активності з апоптотичними процесами проводили дослідження зміни вмісту сфінгомієліну і сфінгозину в нирках при експериментальних моделях ГНН. Встановлено, що в нирках вже через 30 хвилин спостерігалося зниження рівня сфінгомієліну в 1,4 рази в порівнянні з контролем-1. На 1-у добу реперфузії вміст сфінгозину зменшувався ще більше - в 1,7 рази, на 2-у добу - в 2,8 рази, на 3-ю добу - в 2,7 рази. У експериментальних групах “гліцерольної” моделі простежувалася аналогічна тенденція: на 1-у добу розпад сфінгомієліну становив 37,3%, на 2-у добу - 55,3%, на 3-ю добу -54,8 % в порівнянні з контрольною групою. Динаміка зміни даного параметра вказує на максимальний гідроліз сфінгомієліну на 2-3-ю добу розвитку ГНН.

На Мал.8 наведені дані про зміну кількості сфінгозину при ішемії/гіпоксії в тканині нирок щурів. Так, простежувалося підвищення концентрації сфінгозину в нирках контрольної групи-2 в 1,8 рази, в групах однодобових тварин - в 1,7 рази, в групах дводобових тварин - в 2,1 рази, в групах тридобових тварин - в 2,0 рази (1 модель) в порівнянні з контролем. У групах 11 моделі простежувалася аналогічна тенденція: на 1 добу рівень сфінгозину збільшився в 1,6 рази, на 2-у добу - в 1,9 рази і на 3-ю добу - в 1,9 рази. З отриманих результатів виходить, що динаміка підвищення вмісту сфінгозину і розпаду сфінгомієліну є зворотньо- спрямованою і співпадає у часі, тобто максимум показника за сфінгозином відповідає мінімуму показника за сфінгомієлином, що достовірно корелює з високим коефіцієнтом rxy. Тому цілком ймовірно, що джерелом сфінгозину, що накопичується в тканині нирок може бути сфінгомієлін. Також була відмічена позитивна кореляційна залежність між деградацією ДНК і накопиченням сфінгозину в тканині нирок при ГНН. Отримані результати дають основу передбачити, що сфінгозин може виконувати функції інформаційної молекули в нирках при стимуляції програмованої загибелі клітин.

Мал. 7 - Вміст сфінгозину в тканині нирок при експериментальній ГНН.

Отже, експериментальна гостра ниркова недостатність супроводжується деградацією сфінгомієліну та накопиченням сфінгоїдних основ в нирках.

Протилежна динаміка вмісту сфінгомієлину та сфінгозину свідчить про активацію сфінгомієлінового метаболічного шляху. Встановлена негативна кореляційна залежність між гідролізом сфінгомієліну і деградацією ДНК, що опосередковано вказує на взаємозв'язок цих процесів при даних моделях ГНН.

Потрібно зазначити, що сфінгозин виявив цілий ряд кореляційної залежності з показниками обмеженого протеолізу, з активацією СОД, з рівнем NO (див. матрицю кореляційних зв'язків). Так, характер зміни сфінгозину повністю повторював характер зміни протеолізу, тобто позитивно корелював з лізисом як за азоказеїном, так і за азоколом, а кореляція з активністю СОД і вмістом стабільних метаболітів NOх була обернено-пропрорційною.

Оскільки даларгін, налоксон, нітроаміногуанидин і каптоприл мають антиоксидантні властивості, а окислювальні реакції відіграють істотну роль в індукції апоптозу, можна передбачити вплив даних препаратів на метаболізм сфінгозину.

Матриця кореляційних зв'язків між вмістом сфінгозину (СФЗ) і протеолізом, активністю СОД, рівнем NOх в клітинах нирок при ГНН.

У наших дослідженнях введення даларгіну спричиняло достовірне зниження вмісту сфінгозину в нирках в порівнянні з групами ГНН. Так, на 1-у добу зменшився в 1,3 рази, на 2-у добу - в 1,3 рази, на 3-ю добу - в 1,4 рази для груп 1 моделі. У групі контроль-2 сталося незначне зниження - в 1,2 рази. В експериментальних групах 11 моделі зменшення становило 23,5%, 22,8%, 26,4%, відповідно, в одно-, дво- і тридобових тварин. При паралельному введенні антагоніста і агоніста опіоїдних рецепторів зміни вмісту сфінгозину не відбувалося, тобто налоксон повністю усував нефропротекторний ефект даларгіну, що підтверджує участь опіоїдних рецепторів в реалізації антиапоптозної дії їх лігандів.

Дуже яскраво був виражений цитопротекторний ефект антагоніста опіоїдних рецепторів за зниженням вмісту СФЗ в тканині нирок в порівнянні з групами ГНН. Після ін'єкції налоксону вміст СФЗ знизився в 1,3 рази на 1-у добу, в 1,4 рази - на 2-у добу і в 1,4 рази - на 3-ю добу в групах 1 моделі. Через 1год. після ішемії показник зменшився в 1,2 рази. В експериментальних групах 11 моделі спостерігалася аналогічна динаміка зниження вмісту сфінгозину на 21,2%, на 25,9%, на 27,3%.

Характер зміни вмісту сфінгозину (СФЗ) і інтенсивності протеолізу в нирках під дією лігандів опіоїдних рецепторів був односпрямованим, що вказує на цитопротекторні властивості лігандів опіоїдних рецепторів і їх здібності впливати-таки на рівень СФЗ. А взаємозв'язок між вмістом СФЗ і активністю СОД в аналогічних умовах був протилежним.

Отже, при стимульованому апоптозі вплив даларгіну і налоксону приводить до зниження апоптотичних процесів в нирках за рахунок зниження рівня сфінгоїдних основ. Продемонстрована в цих умовах залежність сфінгозину з протеолізом, СОД і NO вказує на те, що даларгін і налоксон також знижують токсичну дію сфінгозину.

Відносно впливу оксиду азоту на рівень сфінгозину і, навпаки, в літературі існують вельми суперечливі дані. Наші експерименти показують, що інгібірування індукованої синтази оксиду азоту спричиняє різке зниження СФЗ в тканині нирок в порівнянні з контрольною групою і помірне зменшення відносно груп ГНН. Так, для груп 1 моделі зниження вмісту СФЗ становило 31,6% на першу добу, на другу добу - 25,1% і на третю добу - 26,5 % в порівнянні з групами ГНН. У контрольній групі-2 кількість СФЗ зменшилась на 21,5%. Отже, інгібіція iNOS зв'язана із зниженням рівня сфінгозину і цілком можна говорити про NO-опосередковану дію СФЗ при ішемії/гіпоксії.

За допомогою селективної блокади активності циклооксигенази продемонстрована непряма участь СФЗ в реалізації програми клітинної загибелі в умовах розвитку ГНН. У наших експериментах було встановлено, що ін'єкція індометацину не впливала на накопичення вільного сфінгозину в нирках експериментальних тварин. Так, вміст СФЗ в нирках щурів 1 і 11 моделей достовірно не відрізнявся від такого показника в групах ГНН. Блокада циклооксигеназного метаболічного шляху призводить до інгібування синтезу простаноїдїв і збереженню підвищеного рівня сфінгозину в нирках при ГНН.

Було встановлено, що в умовах розвитку гострої ниркової недостатності циклооксигеназний метаболічний шлях арахідонової кислоти сприяє активації апоптотичних процесів через накопичення сфінгозину, що є одним з медіаторів апоптозу сфінгомієлинового шляху, але не є NO-опосередкованим.

Каптоприл, з притаманними йому антиоксидантними властивостями, знижував підвищений рівень сфінгозину (СФЗ) в нирках при ГНН. Так, в експериментальних групах 1 моделі зниження вмісту сфінгозину на 1-у добу становило 18,8%, на 2-у добу -10,3%, на 3-ю добу -14,3%, в порівнянні з групами ГНН. У групі контролю-2 не спостерігалося достовірних відмінностей. Для 11 моделі рівень СФЗ знизився в 1,2 рази, в 1,2 рази і в 1,3 рази на 1, 2 і 3-ю добу, відповідно. Зниження рівня СФЗ в нирках під дією каптоприлу достовірно корелювало із зміною вмісту кінцевих метаболітів оксиду азоту, активністю СОД і протеолізу. Отже, блокада АПФ супроводжується пригніченням сфінгомієлінового метаболічного шляху, що пов'язано, насамперед, з поліпшенням окислювально-відновних процесів в клітині і зниженням цитотоксичної дії оксиду азоту.

Таким чином, отримані результати вказують на те, що сфінгомієлиновий метаболічний шлях може являтися ще одним з факторів модуляції апоптозу в нирках при ГНН. Доказана можливість впливу на генерацію вільного сфінгозину через такі внутрішньониркові регуляторні системи, як опіоїдні рецептори, обмін оксиду азоту, ангіотензинову та простаноїдну системи. При цьому спостерігається взаємозв'язок цих систем з активацією ключових ферментів (лактатдегідрогеназа, супероксиддисмутаза) та активацією інших участків обміну (протеолізу) в нирках в умовах стимульованого апоптозу.

Модуляція апоптозу в нирках інтактних тварин через ОР, оксид азоту, ангіотензинову та простаноїдну системи призвела до неоднозначного порушення метаболізму сфінгозину в тканині. Блокада опіоїдних рецепторів в нормі супроводжується менш вираженим накопиченням продуктів розпаду сфінгомієлінового циклу, незалежно від метаболізму оксиду азоту.

Дія нітроаміногуанідину, спрямована на підвищення рівня СФЗ, зв'язана зі зниженням вмісту стабільних метаболітів NO, що відрізняє даний регулятор апоптозу від даларгіну і налоксону. Односпрямовану дію блокаторів активності АПФ і ЦОГ на підвищення рівня СФЗ можна зв'язати з активацією ізоформ NOS і, як наслідок, накопиченням кінцевих продуктів NOx.

Отже, на основі отриманих даних, можно зробити висновок, що при експериментальній ГНН розпад сфінгомієліну зв'язаний із збільшенням кількості сфінгоїдних основ в нирках. Протилежна динаміка вмісту сфінгомієліну і сфінгозину в тканині нирок свідчить про активацію сфінгомієлінази і про накопичення продуктів сфінгомієлінового циклу. Встановлена кореляція при аналізі вмісту сфінгозину та інтенсивності протеолізу, і рівня оксиду азоту, і активності СОД в нирках щурів при ГНН. З чого виходить, що накопичення СФЗ в тканині нирок при ГНН пов'язано з накопиченням метаболітів оксиду азоту, підвищенням активації протеолізу та інгібіцією антиоксидантного ферменту СОД. Якщо підсумовувати результати, отримані при експериментальній ГНН і за фізіологічних умов, то залежність активності сфінгомієлинового шляху від впливу опіоїдних рецепторів, оксиду азоту, ангіотензинової та простаноїдної систем представляється вельми вірогідною.

ЯМР-релаксація протонів тканинної води нирок при стимульованому апоптозі. Час релаксації (Т1 і Т2) є біохімічним показником зміни об'єму клітини [Fullerton G.,1992]. Всі ЯМР-параметри в різній мірі взаємопов'язані, і деякі з них можуть грати важливу роль в ідентифікації тканин і діагностиці хвороб, пов'язаних з порушенням програми клітинної загибелі. Модуляція апоптозу через внутрішньониркові регуляторні системи викликала неоднозначні зміни в релаксації ниркової тканини.

Після розвитку гострої ниркової недостатності було зафіксовано збільшення спін-гратчастої (Т1) і спін-спінової (Т2) складових часу релаксації в тканині нирок у порівнянні з групою контролю. Динаміка зміни показників Т1 і Т2 між групами ГНН-1, ГНН-2 і ГНН-3 виявилася однозначною: із збільшенням від першої до третьої доби. На подовжню (Т1) - релаксацію в тканинах впливають два чинники: вміст всієї тканинної води і здатність макромолекул зв'язувати воду в гідратний шар. Параметр Т2 визначається кількістю дільниць, що приєднують кристалізовану воду, і товщиною гідрованого шару [Ling G.N., Tucser M.,1990]. Подовження Т1- і Т2- часу релаксації свідчить про повільний протонний обмін між вільною та гідрованою фракціями тканинної води, а також про ущільнення шару гідратної води. У моделях гострої ниркової недостатності перерозподіл тканинної води в нирковій тканині відбувався у бік внутрішньоклітинної, з достовірним підвищенням на 10,5 %, на 11,1 %, на 11,8%, відповідно в групах одно -, дво - і тридобових тварин, в порівнянні з контролем.

Отже, на початковій стадії розвитку ГНН в тканині нирок спостерігається тенденція до набухання клітин. Накопичення протонів тканинної води приводить до збільшення об'єму і закисленню середовища. Аналіз кореляційної матриці виявив наявність достовірно значущих кореляцій в нирках між ЯМР-показниками і ступенем фрагментації ДНК.

Відомо, що при гострій нирковій недостатності стимуляція апоптотичних процесів носить періодичний характер і спостерігається декілька піків апоптозу. Перший пік апоптозу припадає на ранню фазу ГНН на 2-3-ю добу, другий пік - на 7-у добу, третій пік - на 14-у добу [Kelly K.J, Molitoris B.A.,2000]. Для підтвердження припущення про зв'язок ЯМР-параметрів з апоптотичними змінами в клітинах була досліджена ЯМР-релаксація на 5-й і 7-й день розвитку ГНН. На 5-у добу розвитку ГНН час релаксації Т1 і Т2 був зниженим і перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної в порівнянні з групами ГНН-2 і ГНН-3 (перший пік апоптозу). На сьому добу розвитку ГНН встановлено підвищення часу релаксації Т1 і зниження часу релаксації Т2 в порівнянні з групами ГНН-2 і ГНН-3, що свідчить про зростання кристалічної фракції води . На 7-у добу розвитку гострої ниркової недостатності спостерігалося незначне набухання клітин нирок, відповідне другому піку апоптозу. На 5-у добу розвитку ГНН не спостерігалося підвищення значення Ра.

Даларгін - синтетичний лей-енкефалін - на протязі трьох діб розвитку ГНН спричиняв достовірне зниження Т1 і Т2 в порівнянні з групами ГНН і контролем, при цьому об'єм клітин знижувався, але його показник не виходив на базальний рівень. При цьому частка внутрішньоклітинної води достовірно зменшується від першої до третьої доби, відповідно, на 5,8 %, на 5,2%, на 6,3 % в порівнянні з групами ГНН. Відмічена позитивна кореляція між Т1, Т2, Ра і фрагментацією ДНК.

При введенні налоксону також встановлено зниження Т1. Перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної, і також простежувалася тенденція до зниження набухання клітин. Встановлена позитивна кореляція Т1, Т2 і Ра з деградацією ДНК.

Ін'єкція каптоприлу супроводжувалася зниженням як показника Т1, так і Т2 ниркової тканини в порівнянні з показниками в групах ГНН. Така динаміка показників характеризується швидким протонним обміном і зменшенням щільності гідрованого шару води , що супроводжується дегідратацією тканини. Під дією каптоприлу перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної, тобто намітилася тенденція до зниження наводнювання клітин нирок. Був виявлений позитивний кореляційний зв'язок між деградацією ДНК і ЯМР-параметрами.

Інгібіція індуцибельної синтази оксиду азоту супроводжувалася зниженням показників Т1 і Т2 у нирках в порівнянні з ЯМР-параметрами тварин з гострою нирковою недостатністю (ГНН), що вказує на швидкий протонний обмін між фракціями води та поширювання гідрованого прошарку. Статистично значуще відбувався перерозподіл тканинної рідини між внутрішньо- та позаклітинним простором у бік останнього. Був також виявлений позитивний кореляційний зв'язок між величинами Т1, Т2, Ра і вмістом фрагментованої ДНК в клітинах нирок.

Отже, можна зробити висновок, що даларгін, налоксон, каптоприл і нітроаміногуанідин, що проявили антиапоптотичну дію, змінюють внутрішньоклітинний об'єм з тенденцією до його зменшення. При цьому показники Т1 і Т2 для кожного препарату змінювалися неоднозначно.

Ми вивчили залежність ЯМР-параметрів від вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в клітинах нирок при експериментальній ГНН. Кореляційний аналіз показав, що існує достовірна залежність між ЯМР-показниками і вмістом метаболітів NOx. В групах ГНН+даларгін: Т1 - NOх (r xy =0,37), Т2 - NOх (r xy =0,66), Ра - NOх (r xy =0,78); ГНН+налоксон: Т1 - NOх (r xy =0,43), Т2 NOх (r xy =0,98), Ра - NOх (r xy =0,92); ГНН+каптоприл: Т1 - NOх (r xy =0,90), Т2 -NOх (r xy =0,99), Ра - NOх (r xy =0,77); ГНН+нітроаміногуанідин: Т1 - NOх (r xy =0,96), Т2 - NOх (r xy =0,84), Ра - NOх (r xy =0,96). Мабуть, в даних умовах об'єм клітини опосередковано залежить оксиду азоту, можливо, через регуляцію іонних каналів.

У дослідженнях на інтактних щурах ін'єкція даларгіну супроводжувалася зниженням показників часу релаксації Т1 і Т2 в порівнянні з контрольною групою. Перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної фракції, тобто простежувалося деяке набухання клітин нирок в порівнянні з контролем. Так, на 1-у добу після ін'єкції даларгіну збільшення Ра становило 4,2%, на 2-у добу - 5,8 %, на 3-ю добу - 8,3%, тобто ефект був залежним від часу. Була виявлена достовірна кореляція між ЯМР-параметрами і фрагментацією ДНК. І+даларгін: Т1 - NOх (r xy =0,77), Т2 - NOх (r xy =0,98), Ра - NOх (r xy =0,92).

Блокування активності АПФ призвело до деякого зниження показника часу релаксації Т1 і Т2 в клітинах нирок у порівнянні з групою контролю. Каптоприл сприяв перерозподілу тканинної води у бік внутрішньоклітинної фракції і незначному набуханню ниркових клітин. Була виявлена кореляційна залежність в динаміці ЯМР-показників і фрагментації ДНК для груп І+каптоприл: Т1- NOх (r xy =-0,98), Т2 - NOх (r xy =-0,88), Ра - NOх (r xy =0,97).

Час релаксації Т1 і Т2 при введенні інгібітора індуцибельної NOS мав залежну від часу тенденцію до зниження, що є характерним для зменшення щільності гідрованої фракції води, параметр Ра плавно підвищувався відносно контрольних значень. Була виявлена кореляційна залежність в динаміці ЯМР-показників і фрагментації ДНК для груп І+нітроаміногуанідин: Т1 - NOх (r xy =-0,68), Т2 - NOх (r xy =0,97), Ра - NOх (r xy =0,88).

Також були встановлені кореляційні зв'язки між ЯМР-параметрами і рівнем стабільних метаболітів NOх, які виявили неоднозначну залежність для даларгіну, каптоприлу і нітроаміногуанідину. Так, на фоні введення даларгіну динаміка зміни ЯМР-характеристик і рівня NOх була односпрямованою. Каптоприл також мав негативний кореляційний зв'язок за часом Т1 і Т2, а зміна клітинного об'єму корелювала позитивно з рівнем NOх. Для нітроаміногуанідину кореляційний зв'язок між ЯМР-параметрами і вмістом кінцевих метаболітів NOх виявився також позитивним. Отже, проапоптотична дія даларгіну, нітроаміногуанідину і каптоприлу на нирки інтактних щурів супроводжується зниженням показників часу релаксації Т1 і Т2 і підвищенням частки внутрішньоклітинної води Ра відносно контролю, тобто деяким набуханням клітин. Для даларгіну і каптоприлу ці процеси протікають на фоні підвищення метаболітів оксиду азоту, а для нітроаміногуанідину - при зниженні рівня NOх.

Індометацин і глібенкламід проявили інший ефект на ЯМР-показники нирок в умовах даних моделей активації апоптозу. Введення індометацину підтримувало підвищене значення показників часу релаксації і достовірно не змінювало перерозподіл тканинної води в порівнянні з групами ГНН. Отже, індометацин підтримує набухання клітин нирок, і при цьому спостерігається позитивна кореляція між ЯМР-показниками і ступенем фрагментації ДНК. ГНН+індометацин: Т1 - ф-ДНК (rxy = 0,68), Т2 - ф-ДНК(rxy = 0,98), Ра - ф-ДНК (rxy = 0,54).

Ін'єкція глібенкламіду супроводжувалася зниженням величини часу релаксації Т1 і Т2, а частка внутрішньоклітинної води Ра достовірно не змінювалася в порівнянні з групами ГНН. Також як і з попередніми препаратами була встановлена позитивна кореляція між ЯМР-показниками і фрагментацією ДНК. ГНН+глібенкламід: Т1 - ф-ДНК (rxy = 0,51), Т2 - ф-ДНК (rxy = 0,64), Ра - ф-ДНК(rxy = 0,61). Отже, індометацин і глібенкламід достовірно не змінюють клітинний об'єм, тобто підтримують незначне набухання клітин ниркової тканини при гострій нирковій недостатності.

Кореляційний аналіз, проведений між ЯМР-параметрами і рівнем кінцевих метаболітів оксиду азоту, встановив достовірний позитивний зв'язок між цими показниками для глібенкламіду і негативну кореляцію за часом релаксації для індометацину. ГНН+глібенкламід: Т1 - NOх (rxy =0,87), Т2 - NOх (rxy =0,94), Ра - NOх (rxy =0,93), ГНН+індометацин: Т1 - NOх (rxy =-0,78), Т2 - NOх (rxy =-0,35), Ра - NOх (rxy =0,82).

Отже, для модуляторів з апоптотичною дією зміна рівня NOх (у бік пониження) не впливає безпосередньо на клітинний об'єм (не спостерігається достовірної зміни) на фоні розвитку ГНН.

У клітинах нирок інтактних щурів налоксон і глібенкламід спричиняли зниження показників ЯМР-релаксації і зберігали незмінним клітинний об'єм (Ра) у порівнянні з групами контролю. Потрібно зазначити, що ступінь апоптозу після ін'єкції налоксону був меншим приблизно в 1,5-2 рази. Певно, для лігандів опіоїдних рецепторів характерні різні механізми запуску суїцидальної програми, що відбилося на показниках ЯМР-релаксації. Судячи по їх різноманітній дії на рівень оксиду азоту, можна передбачити, що зміна клітинного об'єму пов'язана з регуляторною функцією NOх.

Глібенкламід також достовірно знижував показники як Т1, так і Т2, що свідчить про поширення шару гідратної води. Була розглянута кореляційна залежність між ЯМР-параметрами і фрагментацією ДНК. У групах І+глібенкламід динаміка цих параметрів була односпрямованою і кореляція була позитивною. Блокада циклооксигенази супроводжувалася зниженням часу релаксації, але при цьому всередині груп І+індометацин відбувалася недостовірна зміна величини Т1 у бік зниження, а величини Т2 - у бік підвищення. Оскільки в експериментальних групах І+індометацин частка внутрішньоклітинної води відповідала базальному рівню, а вміст фрагментованої ДНК підвищувався, то спостерігалася негативна кореляція. Ми також простежили залежність між ЯМР-показниками і рівнем кінцевих метаболітів оксиду азоту. Встановлено, що введення налоксону і глібенкламіду спричиняє зміну вмісту кінцевих метаболітів NOх і не впливає на клітинний об'єм нирок. Індометацин, спричиняючи підвищення вмісту метаболітів NO достовірно не змінював внутрішньоклітинну частку тканинної води і, відповідно, зміни клітинного об'єму нирок.

Таким чином, проведені експериментальні дослідження показали, що параметри ядерної магнітної релаксації відображають фізико-хімічні властивості клітин тканини і повідомляють важливу додаткову інформацію про стан гомеостазу при патологічних станах, зокрема, в нирках. Зміна ЯМР-параметрів під дією модуляторів про- і антиапоптотичної дії підтверджує наше припущення про участь Н+-механізмів в регулюванні клітинного об'єму. Більш глибокий аналіз внеску різних механізмів апоптозу в зміну клітинного об'єму потребує подальшого глибокого і всебічного вивчення.

ВИСНОВКИ

1. Виявлені біохімічні ознаки активації апоптотичних процесів в нирках при ішемічній і “гліцерольній” моделях гострої ниркової недостатності (ГНН). Відмічено збільшення деградації ДНК (в 5,4 рази) на 2-у добу розвитку гострої ниркової недостатності для обох моделей. Встановлено, що стимуляція програми клітинної загибелі при експериментальній ГНН супроводжується підвищенням активації протеолізу (34,4%), накопичення стабільних метаболітів оксиду азоту и зниженням активності супероксиддисмутази (65%) в тканині нирок.

2. Початкова фаза експериментальної гострої ниркової недостатності супроводжується помірним підвищенням рівню стабільних метаболітів оксиду азоту (в 2,7 рази) із максимальним вмістом на 2-3-ю добу.

3. Виявлена роль активації опіоїдних рецепторів як фактор модуляції апоптозу в нирках. При експериментальній ГНН активація опіоїдних рецепторів супроводжується антиапоптотичний ефектом, а за фізіологічних умов - проапоптотичним.

4. Антиапоптотичний ефект синтетичного лей-енкефаліну - даларгіну реалізується через д1-опіоїдні рецептори з активацією К+АТФ - каналів мітохондрій. За фізіологічних умов проапоптотична дія даларгіну не пов'язана з активацією К+АТФ - каналів мітохондрій і реалізується не через д-опіоїдні рецептори.

5. Антиапоптотичний ефект блокування ангіотензин-перетворюючого ферменту пов'язаний з пониженням деградації ДНК і накопичення сфінгозину, реалізація даного ефекту носить NO- залежний характер.

6. Блокування простаноїдної системи нирок супроводжується підвищенням вмісту фрагментованої ДНК і сфінгозину в тканині нирок при різних моделях ГНН, що вказує на захисний ефект простаноїдів. Проапоптотична дія індометацину не залежить від рівня оксиду азоту

7. Встановлена активація сфінгомієлінового метаболічного шляху в тканині нирок при експериментальній ГНН. Вона супроводжується зниженням вмісту сфінгомієлину і накопиченням вільних сфінгоїдних основ. На основі кореляційного аналізу отримана залежність між рівнем вільних сфінгоїдних основ і активністю супероксиддисмутази (негативна), і активністю лактатдегідрогенази, і протеолітичною активністю тканини, і накопиченням стабільних метаболітів оксиду азоту (позитивна).

8. Встановлено підвищення часу релаксації і частки внутрішньоклітинної води в нирках при експериментальній ГНН. Зміна часу релаксації пов'язана із ущільненням гідратної частки тканинної води. За умов модуляції апоптозу при ГНН через опіоїдні рецептори, обмін оксиду азоту і ангіотензинову систему спостерігалося скорочення часу релаксації і зменшення клітинного об'єму, що вказує на нормалізацію клітинних процесів в нирках. Модуляція апоптозу через простаноїдну систему нирок супроводжується скороченням часу релаксації, але без зміни клітинного об'єму нирок. Зміна ЯМР-параметрів носила NO- залежний характер.

9. За умов норми всі дослідженні препарати (крім глібенкламіду) викликають залежну від часу деградацію ДНК, незалежно від рівня оксиду азоту.

10. Встановлена можливість модуляції апоптотичних процесів через біохімічні регуляторні системи нирок - опіоїдні рецептори, К+АТФ -канали, обмін оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову і простаноїдну, - механізм дії котрих пов'язаний із перерозподілом внутрішньо- та позаклітинної фракції тканинної води нирок.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Комарєвцева І.О., Орлова О.А., Благодаренко Є.А. Вміст оксиду азоту в тканинах нирок при активації апоптозу // Укр. біохім. журнал.-2002.-Т.74, №4а (додаток1).-С.47-50.

2. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Влияние даларгина на содержание стабильных метаболитов оксида азота в почках крыс при активации апоптоза // Укр. біохім. журнал.- 2002.-Т.4,№6.-С.131-135.

3. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Роль NO-синтазы в стимуляции опиатных рецепторов и устойчивости почек к оксидантному стрессу// Укр. біохім. журнал.- 2003.-Т.76,№4.-С.97-101.

4. ОрловаО.А., Комарєвцева І.О., Комарєвцев В.М. Спосіб визначення вмісту окису азота в тканині та біологічних рідинах” №2002032337, 10 жовтня 2002р.

5. Орлова Е.А., Комаревцев В.Н. Определение фрагментации ДНК в клетках почечной ткани // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики. -Луганськ, 2001.-вип.6.-С. 206-208.

6. Орлова О.А. Динаміка зміни концентрації сфінгомієлина і фрагментації ДНК в клітинах ниркової тканини при експериментальній гострій нирковій недостатності // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О.Можаєва. -2001.-№4.-С 60-63.

7. Комаревцев В.Н., Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А., Головченко Н.Н. Биохимические механизмы апоптоза при заболеваниях почек.// Український медичний альманах .-Луганськ.-2001.-Т.4,№5-С. 188-193.

8. Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А. Методика определения сфингомиелина в почечной ткани // Український медичний альманах. Луганськ.- 2001.-Т.4.-№5.-С.120-123.

9. Орлова Е.А. Деградация ядерной дезоксирибонуклеиновой кислоты и ее коррекция даларгином в условиях стимуляции апоптоза // Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2002.-Т.3, №4.- С.58-61.

10. Орлова О.А. Динаміка протеолітичної активності в тканині нирок щурів за умовами окиснювального стресу // Укр.мед.альманах.-Луганськ .- 2002.-Т.5,№ 5.-С.98-99.

11. Орлова Е.А. Протеолитическая активность ткани почек при стимуляции апоптоза на фоне введения даларгина. // Укр.мед.альманах.-Луганськ .- 2002.-Т.5,№ 6.-С.106-108.

12. Орлова Е.А. Анализ нитритов и нитратов в ткани при экспермиментальной острой почечной недостаточности// Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2002.-Т.3, №1.- С.79-82.

13. Орлова Е.А., Клименко В.В., Бриндак Д.В., Высочин М.В., Науменко К.А. О роли сфингозина в передаче сигнала апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности // Український медичний альманах.-Луганськ.-2003.-Т.6,№1.-С.83-85.

14. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. О роли оксидантного стресса в развитии апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности// Укр.мед. альманах.-Луганськ.- 2003.-Т.6,№ 1.-С.83-85.

15. Орлова Е.А.Влияние каптоприла на свободнорадикальные процессы в почках при экспериментальной острой почечной недостаточности// Укр.мед. альманах - Луганськ.-2003.-Т.6,№ 6.-С.116-118.

16. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Коррекция активности ангиотензин-превращающего фермента как способ регуляции апоптоза// Укр.мед.альманах - Луганськ.-2003.-Т.6,№ 4.-С.103-105.

17. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Апоптоз и оксидантный стресс при почечных патологіях// Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2003.-Т.4, №4.- С.68-73.

18. Орлова Е.А. Влияние даларгина на содержание сфингозина, активность СОД и апоптоз, индуцированный ишемией/ реперфузией в почках// Журн. експерім.та клін. фізіології та біохімії.-2004.-№1.-С.34-41.

19. Орлова Е.А. Биохимическая активность налоксона в условиях стимулированного апоптоза// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№2 (додаток).-С.133-136.

20. Орлова Е.А. Взаимосвязь ОР и К+атф -каналов в регуляции апоптоза в почках// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№4.-С.104-107.

21. Орлова Е.А.Роль циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в регуляции апоптоза клеток почек. \\ Укр.мед.альманах - Луганськ.-2004.-Т.7,№ 1 (додаток).-С.21-24.

22. Орлова Е.А., Сенчий В.Н. Н+-протонные механизмы клеточного объема при стимулированном апоптозе в почках по данным ЯМР-релаксометрии// Зб.наук.праць співроб. КМАПО ім.П.Л.Шупіка.-2004.-Вип.3.-С.85-88.

23. Комарєвцева І.О.,Орлова О.А., Комарєвцев В.М., Благодаренко Є.А. Вивчення ролі сфінгомієлинового сигнального шляху активації апоптозу в тканині нирок //Фізіол.ж. (Матер. ХVI з”їзду Українського фізіологічного товариства, м. Вінниця ).-2002.-Т.48,№2.-С.7.

24. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А. Бифункциональный характер действия оксида азота в ткани почек при активации апоптоза// Укр. біохім.ж. -2002.-Т.74, №4а(додаток 1).-С.47.

25. Орлова О.А., Вішницька І.А., Кліменко В.В. и др. Сфінгозин - активна молекула в проведенні сигналу апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності// IX конгрес світової федерації українських лікарських товариств: Зб. наук. праць.-Луганськ-Київ- Чикаго.-2002.- С.274.

26. Орлова Е.А., Фильчуков Д.А., Холина Е.А. Изменение уровня Са2+ в почках при стимулированном апоптозе// Проблеми остеології ( Матер. наук.-практ.конф.).-2003.-Т.6, №4.-С. 69.

27. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Бриндак Д.В., Науменко К. А., Орлова В.В. Різноманітність активності налоксону в нирках при активації апоптозу та в нормі// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№5 (додаток).-С.87.

АНОТАЦІЯ

Орлова О.А. Модуляція апоптозу і внутрішньониркові регуляторні системи при експериментальній гострій нирковій недостатності. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук, за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Київський національний медичний університет ім. О.О.Богомольця. м. Київ, 2005р.

Дисертація присвячена дослідженню ролі біохімічних регуляторних систем - опіоїдних рецепторів, обміну оксиду азоту, КАТФ-каналів, сфінгомієлин-сфінгозинового шляху, ангіотензинової і простаноїдної систем - в модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності. В основу роботи покладено аналіз результатів дослідження в нирках щурів (1575) вмісту фрагментації ДНК, метаболітів оксиду азоту, сфінгомієлину, сфінгозину, активності супероксиддисмутази, лактатдегідрогенази, активації протеолізу, ЯМР-релаксації за умов розвитку гострої ниркової недостатності та фізіологічних умовах.

Виявлені біохімічні і морфологічні ознаки активації апоптотичних процесів в нирках при ішемічній і “гліцерольній” моделях гострої ниркової недостатності (ГНН). Встановлено, що стимуляція програми клітинної загибелі при експериментальній ГНН супроводжується активацією сфінгомієлінового метаболічного шляху, накопиченням стабільних метаболітів оксиду азоту, підвищенням активації протеолізу, зниженням активності супероксиддисмутази в тканині нирок. Розкритий механізм модуляції апоптозу в нирках через активацію опіоїдних рецепторів з участю К+АТФ - каналів мітохондрій при різних моделях ГНН та в нормі. Робота є першою, в якій встановлена можливість модуляції апоптотичних процесів через регуляторні внутрішньониркові системи: опіоїдні рецептори, К+АТФ -канали, обмін оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову і простаноїдну системи, механізм дії котрих пов'язаний із перерозподілом внутрішньо- та позаклітинної фракції тканинної води нирок.

Ключові слова: апоптоз, нирки, модуляція, оксид азоту, сфінгозин, опіоїдні рецептори, К+АТФ - канали, ангіотензин-перетворюючий фермент, циклооксигеназа, ЯМР-релаксація, гостра ниркова недостатність.

Орлова Е.А. Модуляция апоптоза и внутрипочечные регуляторные системы при экспериментальной острой почечной недостаточности. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук, по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. - Киевский национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца. г. Киев, 2005 г.

Диссертация посвящена исследованию роли биохимических регуляторных систем -опиоидных рецепторов, обмена оксида азота, КАТФ -каналов, сфингомиелин-сфингозинового пути, ангиотензиновой и простаноидной систем - в модуляции апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности.

В основе работы лежит изучение степени развития апоптотических процессов в почечной ткани биохимически (по фрагментации ДНК) в сопоставлении с морфологической детекцией (с использованием ядерного красителя Хехст) при стимулировании программируемой клеточной гибели (ишемическая и “глицерольная” модели экспериментальной острой почечной недостаточности). Установление наличия экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота по содержанию стабильных метаболитов оксида азота - нитрит- и нитрат-анионам в ткани почек при разных моделях ОПН. Выявление биохимических механизмов модуляции апоптотических процессов в почках через активацию опиоидных рецепторов. Изучение активности сфингомиелинового метаболического пути в почках в сигналпередающих системах апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности. Рассмотреть ангиотензиновую и простаноидную системы почек как факторы модуляции апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности. Изучить изменение времени релаксации протонов тканевоц воды по данным ЯМР-релаксации при экспериментальной острой почечной недостаточности.

Установлено, что биохимические и морфологические изменения в клетках почек, связанные с активацией апоптотических процессов, носят однотипный качественный и количественный характер как при “ишемия/реперфузионном синдроме”, так и при “глицерольной” модели острой почечной недостаточности. Установлено, что оксид азота имеет бифункциональный характер действия, но на начальной стадии развития ОПН умеренная гиперпродукция оксида азота в почках носит цитотоксический характер. На этиологически разных моделях острой почечной недостаточности установлен вклад опиоидных рецепторов, К+АТФ - каналов, оксида азота, сфингоидных оснований, ангиотензиновой и простаноидной систем в модуляцию апоптотических процессов в почках.

Активация опиоидных рецепторов в почках вызывает различные эффекты в развитии апоптоза: в физиологических условиях - проапоптотический и антиапоптотический - в условиях развития экспериментальной ОПН. Проапоптотический эффект опиоидных рецепторов реализуется не через д-опиоидные рецепторы и не зависит от уровня оксида азота, а их антиапоптотическое действие является NO-зависимым процессом и запускается через д-опиоидные рецепторы с участием К+АТФ - каналов.

Установлена активация сфингомиелинового метаболического пути в ткани почек при экспериментальной ОПН. Она сопровождалась понижением содержания сфингомиелина и накоплением свободных сфингоидных оснований. На основании корреляционного анализа получена зависимость между уровнем свободных сфингоидных оснований и активностью супероксиддисмутазы (отрицательная), и накоплением стабильных метаболитов оксида азота (положительная).Блокада циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты сопровождается повышением содержания фрагментированной ДНК и сфингозина в ткани почек при разных моделях ОПН, что указывает на защитный эффект простаноидов. Антиапоптотический эффект блокирования ангиотензин-превращающего фермента связан с понижением деградации ДНК и накопления сфингозина, реализация данного эффекта носит NO-зависимый характер.

Установлено увеличение времени релаксации и доли внутриклеточной воды почек в условиях стимулированного апоптоза. При модуляции апоптоза в условиях ОПН через опиоидные рецепторы, оксид азота и ангиотензиновую систему наблюдалось понижение времени релаксации и уменьшение клеточного объема, что указывает на нормализацию клеточных процессов в почках. Модуляция апоптоза через простаноидную систему почек сопровождается понижением времени релаксации, но без изменения клеточного объема почек. Изменение ЯМР-параметров носит NO-зависимый характер.

В условиях нормы все препараты (кроме глибенкламида) вызывают времязависимую деградацию ДНК, независимо от уровня оксида азота.

Впервые на основании экспериментальных данных показана возможность модуляции апоптотических процессов через регуляторные внутрипочечные системы: опиоидные рецепторы, К+АТФ - каналы, обмен оксида азота, сфингомиелин-сфингозиновый путь, ангиотензиновую и простаноидную системы, механизм действия которых связан с перераспределением внутри- и внеклеточной фракции тканевой воды почек. Полученные результаты развивают научные представления о биохимических модуляторах апоптотических процессов при патологиях и способствуют новым исследованиям по разработке терапевтических подходов в клинической уронефрологии.

Ключевые слова: апоптоз, почки, модуляция, оксид азота, сфингозин, опиоидные рецепторы, К+АТФ - каналы, ангиотензин-превращающий фермент, циклооксигеназа, ЯМР-релаксация, острая почечная недостаточность.

Orlova Ye.A. Apoptosis modulation end intrarenal regulatory systems in experimental acute renal failure. - Manuscript.

Thesis for a Doctor's degree on speciality 14.01.32 - medical biochemistry. - Kyiv national medical university of O.O.Bohomolets. Kyiv, 2005

The thesis deals with the research of role of opioid receptors, nitric oxide, K ATP-channels, way of sphingomyelin-sphingosine, angiotensin and prostanoid system in apoptosis modulation during experimental acute renal failure development. In the basis of the work there is analysis of results of research of content of DNA fragmentation, nitric oxide metabolites, sphingomyelin, sphingosin, activity of superoxide dismutase, lactate dehydrogenase, proteolysis activation, NMR relaxation in the kidneys of the rats under the condition of acute renal failure and physiological conditions. Biochemical and morphological signs of apoptosis processes activation in kidneys in ischemic and "glycerol" models of acute renal failure (ARF) were revealed. It was assigned that stimulation of apoptosis program in experimental ARF is accompanied by activation of sphingomyelin metabolic way, storing of stable nitric oxide metabolites, increasing activation of proteolysis, decreasing superoxide dismutase activity in kidney tissue. Mechanism of apoptosis modulation in kidneys by means of opioid receptors with K+ATP -channels of mitochondrion's in different models of ARF and in normal conditions was revealed. The work is the first one to reveal the opportunity of apoptosis processes modulation by means of intrarenal regulation systems: opioid receptors, K+ATP- channels, nitric oxide metabolism, sphingomyelin-sphyngosine way, angiotensin and prostanoid systems, mechanism of their action is connected with redistribution of intra- and extra-cellular fractions of tissular water in kidneys.

Key words: apoptosis, kidneys, modulation, nitric oxide, sphingosin, opioid receptors, K+ATP- channels, angiotensin converting enzyme, cyclooxygenase, NMR relaxation, acute renal failure.

Здано до набору 23.09.2005. Підписано до друку 28.09.2005

Формат 60х84 1/16 . Папір офсетний. Друк офсетний.

Умовн. друк. арк. 1,9. Тираж 100. Зам. 300. Замовне.

Віддруковано у видавничому центрі ЛугДМУ.

91045, м. Луганськ, кв. 50 років Оборони Луганська, 1.

Размещено на Allbest.ru