Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЛІПОПОЛІЦУКРИДИ ТА ПОЗАКЛІТИННІ ГЛІКОПОЛІМЕРИ RALSTONIA SOLANACEARUM: СКЛАД, СТРУКТУРА І БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ

Броварська Оксана Степанівна

УДК 579.841.11.222:632.35

03.00.07 - мікробіологія

Київ - 2007

Дисертацією є рукопис.

Дисертаційна робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

кандидат біологічних наук Моложава Ольга Станіславівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, асистент кафедри мікробіології і загальної імунології

Захист відбудеться „19” вересня 2007 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Д 03680 МСП, Київ, вул. Заболотного, 154

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

ліпополіцукриди позаклітинний глікополімер

Актуальність проблеми. Ralstonia solanacearum є одним з найбільш шкідливих фітопатоненів, які проявляють на рослину різноманітну дію - від в'янення до відставання у рості. Вони характеризуються широким спектром хазяїв, уражуючи до 200 видів рослин, серед яких ряд економічно важливих сільськогосподарських культур: пасльонові, бобові, складноцвітні. Таксономічне положення представників R. solanacearum дискутується на протязі багатьох років і на сьогодні остаточно не встановлено. Наявність обґрунтованих на молекулярному рівні класифікаційних схем є надзвичайно необхідним для розмежування штамів фітопатогенних бактерій при епіфітотіях, розробці експрес-методів діагностики захворювань, моніторингу розповсюдженості і міграції серотипів шкодочинних бактерій в різних географічних зонах і вирішення питань їх систематики. Тривалий час представників R. solanacearum відносили до роду Pseudomonas. У 1992 році E. Yabuuchi з співавт. на основі нуклеотидних послідовностей 16S рРНК, значень ДНК-ДНК гомології, складу клітинних ліпідів та жирних кислот, а також фенотипових характеристик запропонували новий рід Burholderia, в який ввели поряд з solanacearum шість наступних видів Pseudomonas: cepacia, mallei, pseudomallei, caryophylli, gladioli, pickettii. У 1995 році ці ж автори перекласифікували представників B. solanacearum в новий рід Ralstonia, який включає R. pіckettii i R. eutropha. Але, разом з тим, автори зазначали, що гетерогенність штамів R. solanacearum потребує подальших досліджень для з'ясування таксономічного положення представників виду і ймовірно, що ця перекласифікація не буде останньою. Тому актуальним є пошук інших, більш консервативних ознак для віднесення штамів R. solanacearum до біотипів та геномотипів і створення універсальної класифікаційної схеми представників виду R. solanacearum. Одним з визнаних хемотаксономічних критеріїв, який визначає філогенетичну спорідненість між бактеріями та дає можливість прослідкувати шляхи їх еволюції, є ліпополіцукриди (ЛПЦ), склад і властивості окремих структурних компонентів яких: О-специфічний поліцукрид (О-ПЦ), олігоцукрид кору (ОГ-кору) і ліпід А, можуть бути використані для диференціації таксонів різного рівня, оскільки характеризуються різним ступенем еволюційно обумовленої консервативності. Наявність такої гетерогенності молекули обумовлює поліфункціональність ЛПЦ. Вони визначають не тільки антигенні властивості клітини, але й відіграють важливу роль у визначенні специфічності каналів, які відповідають за транспорт необхідних для росту клітин речовин, захищають її від летальної дії антибіотиків, детергентів, отрути, діють як рецепторні ділянки для деяких специфічних бактеріофагів і бактеріоцинів, проявляють імуномодулюючу дію. Разом з позаклітинними глікополімерами, ЛПЦ приймають участь в патогенезі, викликаючи захворювання рослин. Для розуміння механізмів індукції і розвитку різних біологічних активностей і функціонування на молекулярному рівні ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів необхідні знання щодо їх хімічної структури. Але лише незначна кількість робіт присвячена вивченню хімічних особливостей і біологічних властивостей глікополімерів R. solanacearum.

Тому вивчення складу, будови, серологічних, ендотоксичних і фітотоксичних властивостей ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів на молекулярному рівні буде сприяти розумінню складних біологічних процесів, які здійснюються за їх участю, вирішенню питань систематики представників виду R. solanacearum, а також формуванню науково-обгрунтованих підходів одержання на їх основі препаратів різного спектру дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відділі біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України і включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт інституту за темами:

· “Вивчити структурні і позаклітинні глікополімери, а також ферменти мікробної клітини з метою створення нових підходів хемосистематики і розробки нових біотехнологій (1988-1992 рр., № держ. реєст. 0.188.0.052916);

· “Вивчення молекулярних механізмів функціонування глікополімерів і карбоксилаз, розробка біотехнологій препаратів для практичного застосування” (1993-1997 рр., завдання 07/11);

· “Вивчення залежності біологічної активності глікополімерів мікробної клітини від їх фізико-хімічних та структурних особливостей. Розробка нових стратегій використання глікополімерів” (1998 - 2002 рр., № держ. реєстр. 0198V008078, шифр теми за планом інституту 07.20);

· “Дослідження молекулярних основ функціональної та біологічної активності полімерів (ліпо-, поліцукридів, ферментів) мікробної клітини (2002-2007 рр. № держ. реєстр., 0103U0005876, шифр теми за планом інституту 07.80)”

· “Вплив фізичних та хімічних факторів на структурні особливості і біологічну активність ліпополіцукридів (ендотоксинів)” (2001 - 2002 рр., № проекту Держ. фонду фунд. досліджень 05.07/00012).

Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було виділити, вивчити закономірності складу, будови, імунохімічні і біологічні властивості ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів семи штамів R. solanacearum - представників різних біоварів, які відрізняються між собою за географічним походженням і рослиною-хазяїном.

Відповідно до поставленої мети були сформульовані такі задачі:

- провести виділення, очистку і хімічну ідентифікацію (моноцукридний, гексозамінний, амінокислотний і жирнокислотний склад) ЛПЦ, їх структурних компонентів, а також позаклітинних глікополімерів;

- встановити хімічну структуру О-специфічних поліцукридних ланцюгів ЛПЦ деяких штамів;

- провести імунохімічні дослідження ЛПЦ;

- отримати модифіковані форми ЛПЦ та дослідити внесок окремих структурних компонентів молекули ЛПЦ в прояв біологічної активності (токсичність, пірогенність, антигенність).

- Вивчити фітотоксичну дію ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів.

Об'єкт дослідження - ліпополіцукриди і позаклітинні глікополімери представників фітопатогенного виду R. solanacearum - гетерогенного за біологічними властивостями, в систематиці якого на сьогодні багато невирішених питань.

Предмет дослідження - хімічний склад ЛПЦ, їх структурних компонентів та позаклітинних глікополімерів, структура О-ПЦ, антигенна, токсична, пірогенна та деякі інші види біологічної активності.

Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, біохімічні, фізико-хімічні, імунологічні та статистичні методи, а також методи контролю пірогенності і токсичності досліджуваних ЛПЦ.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчені ЛПЦ і позаклітинні глікополімери семи досліджуваних штамів R. solanacearum.

При порівняльному вивченні окремих структурних компонентів макромолекули ЛПЦ досліджуваних бактерій встановлена дивергенція їх властивостей в порядку: ліпід А - О-ПЦ - олігоцукрид кору. Найбільші розходження спостерігались у моноцукридному складі олігоцукриду кора, який був представлений чотирма хемотипами, в той час як О-ПЦ і ліпід А - двома.

Встановлено, що структури О-ПЦ ЛПЦ R. solanacearum 7859 і 6524 представлені лінійними тетрацукридними ланцюгами, які включають три залишки б-L-рамнози і один залишок N-ацетилглюкозаміну.

ЛПЦ представників R. solanacearum в гомологічних системах проявляють активність антигену. В гетерологічних системах виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів, які характеризуються як однаковими структурами О-ПЦ (8115, 750, 6524, 7859), так і такими, що відрізняються (7864, 8169, 5712).

Встановлено, що ЛПЦ R. solanacearum проявляють токсичність на два порядки нижчу, ніж ЛПЦ E.coli O55:B5, і пірогенність, аналогічну або навіть більшу, ніж “Пірогенал” - фармацевтичний препарат.

Показано, що модифікація ЛПЦ шляхом сукцинилювання, дефосфорилювання і дезацилювання призводить до повної втрати таких ендотоксичних активностей, як токсичність і пірогенність.

Вперше встановлено, що ацетилювання, дефосфорилювання та дезацилювання не впливає на серологічну активність ЛПЦ, в той час як сукцинилювання призводить до її повної втрати.

Вперше показано, що позаклітинні глікополімери R. solanacearum, домінуючими моноцукридами яких є рамноза, глюкоза і маноза, проявляють фітотоксичну дію.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані щодо хімічного складу і особливостей будови ЛПЦ та їх структурних компонентів, які характеризуються різним ступенем еволюційно обумовленої консервативності бактерій, можуть бути використані для розробки нових підходів в систематиці і таксономії для диференціації таксонів різного рівня, а також при дослідженнях фізіології та механізмів патогенезу хвороб рослин, які викликаються представниками R. solanacearum. Виявлені особливості структури О-ПЦ, які складають молекулярну основу для серологічної диференціації штамів R. solanacearum, можуть бути використані при створенні універсальної класифікаційної схеми представників цього виду.

Результати досліджень щодо одержання модифікованих форм ЛПЦ, які повністю втратили токсичність і пірогенність, в майбутньому можуть бути використані при створенні нових нетоксичних терапевтичних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Дисертантом особисто зібрана і проаналізована література з теми дисертації, розроблені методичні підходи щодо виконання поставленої мети, експериментального її обґрунтування, узагальнення одержаних результатів. Основні експериментальні дані були одержані здобувачем особисто: напрацьована бактеріальна маса 7 досліджуваних штамів R. solanacearum, з яких виділені ЛПЦ і їх структурні компоненти. Проведено фракціонування позаклітинних глікополімерів. Визначений вміст вуглеводів, нуклеїнових кислот, білку в досліджуваних препаратах. Проведений аналіз моноцукридного, амінокислотного, гексозамінного та жирнокислотного складу виділених препаратів ЛПЦ. Вивчена пірогенна та токсична дія нативних і модифікованих ЛПЦ. Здобувач самостійно одержала антисироватки до досліджуваних штамів R. solanacearum і провела імунохімічні дослідження. Встановлення структури О-ПЦ досліджуваних штамів (методом 1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопії) проведено спільно з д.х.н. Кнірель Ю.О., д.х.н. Шашковим О.О. та к.х.н. Кочаровою Н.О. (Інститут органічної хімії ім. Зелинського, РАН, Москва), досліди по вивченню інтерфероногенної активності ЛПЦ здійснено спільно з д.м.н. Рибалко С.Л. (Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Громашевського, Київ), одержання модифікованих ліпідів А досліджуваних ЛПЦ здійснено спільно з д.х.н. Сейфулліною І.Й. (Одеський національний університет) та к.б.н. Васильєвим В.М. (Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ), які є співавторами публікацій дисертанта. Спільно з к.б.н. Мурас В.О., пров. інж. Житкевич Н.В. (відділ фітопатогенних бактерій ІМВ НАНУ) проведено дослідження по вивченню фітотоксичності позаклітинних глікополімерів. Автор висловлює подяку пров. інж. Житкевич Н.В. за допомогу у підтримці мікробіологічно чистих культур досліджуваних штамів R. solanacearum.

Автор висловлює особливу подяку науковому керівнику д.б.н., проф. Л.Д. Варбанець за всебічну допомогу при інтерпретації та формулюванні основних положень і висновків, підготовці публікацій за результатами досліджень та представленні їх на наукових конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень та положення дисертації доповідались та обговорювались на конференціях фундаментальних досліджень Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАНУ (Київ, 1994, 1996, 2005, 2006 рр.); 9-th International Congress “Molecular plant-microbe Interactions” (Amsterdam 1999); XVI International Symposium on Glycoconjugates “GLYCO XVI” (Hague, 2001); на засіданні Х з'їзду Мікробіологічного товариства України (Одеса, 2004); на Міжнародній науковій конференції по фітопатогенним бактеріям (Київ 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт в провідних вітчизняних та закордонних виданнях: 11 статей у фахових виданнях та тези доповідей - 5.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 153 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати експериментальних досліджень”, “Узагальнення результатів досліджень”, “Висновки”, “Список використаних джерел”, який включає 181 найменування (74 вітчизняних і країн СНД та 107 - іноземних авторів). Робота містить 27 таблиць та 22 рисунки.

Розділ 1. Огляд літератури

Огляд літератури представлений трьома підрозділами. Перший містить аналіз біологічних властивостей представників фітопатогенного виду R. solanacearum, а також питань таксономії і підходів щодо їх розв'язання. Другий підрозділ присвячений ЛПЦ грамнегативних бактерій, їх складу, будові та біологічній активності. Висвітлено роль ЛПЦ, як ендотоксинів і детермінант патогенності. Третій підрозділ стосується позаклітинних глікополімерів фітопатогенних бактерій і їх ролі в патогенезі.

Розділ 2. Матеріали і методи

Об'єктами дослідження були 7 штамів Ralstonia solanacearum, які люб'язно надані куратором ICMP доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія), за що ми висловлюємо йому щиру подяку. Досліджувані штами є представниками різних біоварів та виділені з різних рослин-хазяїнів і різних географічних зон світу (табл.1).

Таблиця 1

Походження досліджуваних штамів R. solanacearum

Вирощування бактерій здійснювали методом періодичного культивування на кругових качалках з використанням синтетичного середовища N (Vidaver, 1967).

Виділення та очищення ЛПЦ із сухої бактеріальної маси проводили за водно-фенольним методом Вестфаля і Янна. ЛПЦ очищали від нуклеїнових кислот осадженням 50% розчином трихлороцтової кислоти. Деградацію молекули ЛПЦ здійснювали м'яким кислотним гідролізом в 1 % оцтовій кислоті (100 0С, 2-4 год в залежності від штаму). Гідрофільну та гідрофобну частини деградованого ЛПЦ відділяли центрифугуванням (25000 g, 40 хв). Вуглеводні компоненти деградованої молекули ЛПЦ фракціонували на колонці (70,0 Ч 3,0 см) з сефадексом G-50, використовуючи 0,025 N піридин-ацетатний буфер pH 4,5. Фракціонування позаклітинних глікополімерів проводили на колонці (90,0 2,0 см) з ДЕАЕ-ТСК 650 М гелем в системі ступінчастого градієнта натрій-фосфатного буферу.

Визначення кількості вуглеводів здійснювали за Dubois (1956), нуклеїнових кислот - за Спіріним (1958), білку - за Lowry et al. (1951), 2-кето-3-дезоксиоктонову кислоту (КДО) - реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Droge, 1970).

Ідентифікацію нейтральних моноцукридів (ЛПЦ і його структурних компонентів) у вигляді ацетатів поліолів проводили на хромато-мас-спектрометричній системі Agilent 6890N/5973 inert з використанням комп'ютерної бази даних ChemStation. Моноцукридний склад позаклітинних глікополімерів ідентифікували на газорідинному хроматогріфі “Chrom-5” з полум'яно-іонізаційним детектором. Жирнокислотний склад ліпіду А визначали, аналізуючи препарати у вигляді метилових ефірів жирних кислот на хромато-мас-спектрометричній системі Аgilent 6890N/5973 inert з використанням персонального комп'ютера та стандартної суміші метилових ефірів жирних кислот.

Структури О-ПЦ встановлювали, застосовуючи методи 1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопії, ком'ютерного аналізу (Lipkind et al., 1988), розпад за Смітом, метилювання.

Модифіковані форми ЛПЦ отримували методами: дезацилювання (гідроліз в безводному гідразині при 1000С, 40 год), дефосфорилювання (гідроліз в 40% плавіковій кислоті при 40С, 24 год), сукцинилювання (гідроліз в суміші янтарного ангідриду з піридином при 56 0С, 3 год), комплексоутворення з 0,05 М водним розчином діоксиду германія (кімнатна температура, перемішування, 1 год).

Антисироватку отримували до грітих культур R. solanacearum (при 1000С, 2,5 год) шляхом чотирьох внутрим'язових з ад'ювантом Фрейнда і однієї внутривенної ін'єкції із зростаючими дозами суспензії мікробних тіл з інтервалом між ін'єкціями 5 діб. Кров відбирали на 7 добу після останньої ін'єкції. Вивчення антигенної активності ЛПЦ проводили методами кільцепреципітації, аглютинації, подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні.

Пірогенну дію вивчали на кролях шляхом внутрішньовенного введення встановленої мінімальної пірогенної дози ЛПЦ з подальшою термометрією тварин протягом 3 год. Токсичність (ЛД50) досліджували при внутричеревинному введенні ЛПЦ мишам, сенсибілізованих D-галактозамінгідрохлоридом.

Фітотоксичність культуральних рідин визначали по їх впливу на схожість зерна і оцінювали по ростовому ефекту пророслих насінин.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили з використанням t критерію Ст'юдента.

Розділ 3. Дослідження ліпополіцукридів Ralstonia solanacearum

Дослідження ЛПЦ, виділених водно-фенольним методом, показало, що їх вихід з клітин R. solanacearum складав від 4,0 до 8,7% в залежності від досліджуваного штаму, що порівняно вище, ніж у інших грамнегативних бактерій, у яких вміст ЛПЦ коливається від 1 до 5%. Хоча у деяких видів Pseudomonas - P. cepacia, а також таких представників Enterobacteriaceae, як Rahnella aquatilis, вихід ЛПЦ може складати 10,0-30,0%.

ЛПЦ, ізольовані з R. solanacearum, характеризувались доволі високим вмістом нуклеїнових кислот (до 35,0%), що можна пояснити особливостями методу виділення. В очищених від нуклеїнових кислот ЛПЦ виявлено вуглеводи (від 35,0% до 45,0%), білок (від слідових кількостей до 5,9%) та нуклеїнові кислоти (від 0,5% до 2,5%). Доволі незначний вміст вуглеводів, можливо обумовлений присутністю гексозамінів, які не дають забарвлення в реакції з фенолом і сірчаною кислотою. Аналіз моноцукридного складу (табл. 2) показав, що домінуючими моноцукридами ЛПЦ 6 досліджуваних штамів R. solanacearum була рамноза (60,0-76,7 %), яка часто зустрічається в складі представників Pseudomonas, Burkholderia (Jansson P-E, 1999). Характерною виявилась глюкоза (5,5-17,1 %). Деякі штами містили ксилозу (2,4-12,2%), рибозу (1,8-20,1%), галактозу (3,0%) (в залежності від штаму). Оскільки після очистки вміст нуклеїнових кислот в препаратах ЛПЦ складав 0,5-2,4 %, виключається можливість забруднення їх рибозою нуклеїнових кислот. Більш ймовірно, що вона дійсно входить до складу ЛПЦ. Рибоза була виявлена в складі ЛПЦ E.coli (Ratnayake S. et al., 1994). Вміст гептоз в ЛПЦ коливався від 5,3 до 7,7 %, в залежності від штаму. Характерним компонентом ЛПЦ є КДО. В недеградованих ЛПЦ вона присутня в незначній кількості (0,3-0,7%) або взагалі не виявлена. Це обумовлено особливим типом і ступенем заміщення молекули КДО. Відрізнявся від досліджуваних штамів ЛПЦ R. solanacearum 6189, домінуючими моноцукридами якого були галактоза (58,7%), глюкоза (18,8%) та фукоза (12,8%). КДО і гептоза в недеградованому ЛПЦ були відсутні. Вміст глюкозаміну складав від 0,4 до 16,4% (в залежності від штаму).

Таким чином, ізольовані з R. solanacearum ЛПЦ містять всі характерні для цих біополімерів компоненти.

До недавнього часу вважали, що амінокислоти, які ідентифікують в ЛПЦ, є наслідком забруднення білком при їх виділенні. Але в останні роки встановлено, що вони можуть входити до складу ЛПЦ і виконувати певну роль в прояві їх біологічної активності. Що стосується ЛПЦ R. solanacearum, то в їх складі виявлено незначну кількість амінокислот: від 0,1 до 1,9 %. Домінуючою був аланін (1,9 %).

ЛПЦ - це унікальний біополімер, який побудований з трьох структурно та функціонально високоспецифічних компонентів, які мають різну ступінь консервативності. Для їх виділення був використаний м'ягкий кислотний гідроліз, внаслідок якого розщеплюється кетозидний зв'язок між залишком КДО і гідроксильною групою при С6 залишка глюкозаміна II - компонента ліпіду А.

Осад ліпіду А відділяли від вуглеводної частини ультрацентифугуванням. Як відомо, ліпід А є найбільш консервативною в процесі еволюції частиною макромолекули ЛПЦ і тому вивчення його жирнокислотного складу може надати інформацію щодо філогенетичних взаємозв'язків між досліджуваними бактеріями. Що стосується R. solanacearum, то жирнокислотний склад ліпідів А їх ЛПЦ досліджений вкрай обмежено. Роботи, в основному, проводились на клітинних гідролізатах, а не на ліпідах А. Аналіз жирнокислотного складу ліпідів А ЛПЦ досліджених штамів R. solanacearum (табл. 3) показав наявність жирних кислот з числом атомів вуглецю в ланцюзі від 12 до 19.

Таблиця 2

Моноцукридний склад ЛПЦ R. solanacearum і його структурних компонентів

Примітка.“-” моноцукрид не виявлений

Диференцюючими оксикислотами ліпідів А шести досліджених штамів, а також типового штаму 5712, були: 3-ОН-С14:0 від 34,6 до 73,1% та 2-ОН-С16:0 від 3,5 до 17,2% (в залежності від штаму). В ліпідах А всіх досліджених штамів характерними компонентами також були С14:0 від 7,6 до 46,0 %, та С16:0 від 2,4 до 7,4 % (в залежності від штаму). Слід зазначити, що присутність 3-ОН-С14:0 є характерною для представників Burkholderia cepacia (Солдаткіна, 1989) - типового виду роду Burkholderia, до якого нещодавно відносили R. solanacearum. В ряді штамів R. solanacearum (7859 і 7864) було ідентифіковано незначну кількість 2-окситетрадеканової кислоти (0,8 %). Деякі штами містили також інші кислоти - від 1,2 до 19,7% (в залежності від штаму).

Таким чином, за складом типових для ліпідів А жирних кислот, 6 досліджуваних штамів разом з типовим можна віднести до одного хемотипу. Відрізнявся від них R. solanacearum шт. 6189, в ліпіді А якого домінуючою була ізо-пентадеканова кислота (іС15:0, 67,2%), а з оксикислот визначена тільки 2-оксигексадеканова (2-ОН-С16:0, 4,9%), в той час як 3-ОН-С14:0 - відсутня.

Цікаво, що в ліпіді А Flavobacterium meningosepticum, який викликає менінгіт і септицемію у новонароджених, присутні амідозв'язана 3-окси-ізогептадеканова та ефірнозв'язана 3-окси-ізопентадеканова кислоти. Не виключено, що ідентифікована в ліпіді А R. solanacearum шт. 6189 ізо-пентадеканова кислота може бути гідроксильованою, але за відсутністю стандарта цієї кислоти, вона остаточно нами не ідентифікована.

Відомо, що препарати ЛПЦ завжди гетерогенні, що в першу чергу пов'язано з наявністю в S-формах бактерій молекул з різною довжиною поліцукридного ланцюга, а також молекул R-форм, які не містять поліцукридних ланцюгів. Про існування такої гетерогенності свідчить наявність високомолекулярної фракції О-ПЦ (I) і фракцій олігоцукриду кору (ОГ-кору) (II і III), які були одержані при гель-фільтрації на сефадексі G-50 водорозчинних продуктів деградованої молекули ЛПЦ (рис. 1).

Таблиця 3

Жирнокислотний склад ліпідів А R. solanacearum

Примітка. “-“ кислота відсутня

Рис. 1. Профілі елюції на сефадексі G-50 вуглеводної частини деградованого ЛПЦ R. solanacearum штамів: 6524 (а); 7859 (б); 8115 (в); 750, 8169 (г); 7864 (д); 6189 (е); I, I' - фракції О-ПЦ, II і III - фракції ОГ-кору

Характер кривих елюції дає можливість стверджувати про незначний вміст R-форм ЛПЦ в комплексному препараті, а також про присутність у ЛПЦ R. solanacearum шт. 7859 (рис. 1, б) двох високомолекулярних фракцій I і I.

ОГ-кору більш варіабельна в порівнянні з ліпідом А частина молекули ЛПЦ до недавнього часу була досліджена вкрай обмежено. І тільки в останні декілька років був досягнутий значний прогрес в структурній оцінці цього компоненту ЛПЦ.

Встановлено, що єдиним структурним елементом, який присутній в ОГ-кору всіх вивчених бактерій є КДО, від 1 до 3 молекул, одна з яких приймає участь в приєднанні ОГ-кору до ліпід А частини. Більшість ОГ-кору, але не всі, як було встановлено в останні роки, характеризуються присутністю L- або D-гліцеро-D-маногептози. В ОГ-кору досліджуваних штамів R. solanacearum (крім 6189) виявлені гептози (5,9-24,3%) і КДО (від слідових кількостей до 3,2%) (в залежності від штаму) (табл.2). Щодо вмісту інших моноцукридів, то спостерігаються значні штамові варіації. Характерними моноцукридами ОГ-корів всіх досліджуваних штамів R. solanacearum є рамноза, глюкоза і глюкозамін. Такі моноцукриди, як ксилоза, маноза, галактоза, рибоза і фукоза присутні лише в окремих штамах. За якісним моноцукридним складом ОГ-корів досліджувані штами відрізняються між собою і можуть бути віднесені до 4 хемотипів. Лише у деяких штамів в складі ОГ-кору присутні амінокислоти від 0,11 до 0,7 %.

Домінуючим моноцукридом О-ПЦ 6 досліджуваних штамів була рамноза (76,1-92,6%) і глюкозамін (10,0-19,7% від сухої маси препарату), відрізнявся шт. 6189, О-ПЦ якого містив 72,0 % галактози. Для штаму 8169 характерний високий вміст ксилози (19,6%), О-ПЦ інших штамів містили незначну її кількість - від 1,3 до 4,5 %, в залежності від штаму (табл.2).

Таким чином, дослідження складу ЛПЦ і його структурних компонентів свідчить, що в ліпіді А і О-ПЦ виявлено по два хемотипи, а в ОГ-кору - чотири хемотипи.

Розділ 4. Встановлення структури О-специфічних поліцукридних ланцюгів

Встановлення структури О-ПЦ включає, крім ідентифікації моноцукридних компонентів, визначення розмірів циклів моноцукридних залишків, їх послідовність, положення заміщення, конфігурацію глікозидних зв'язків, а також визначення положення невуглеводних замісників (якщо вони присутні). У своїй більшості досліджувані О-ПЦ були вільні від амінокислот і лише О-ПЦ окремих штамів містили від однієї до двох амінокислот в дуже низьких концентраціях.

Виходячи з аналізу даних ЯМР-спектроскопії (рис. 2) з залученням комп'ютерного аналізу було встановлено структури О-ПЦ, які були підтверджені результатами метилювання та розпаду за Смітом. Показано, що О-ПЦ двох штамів R. solanacearum 7859 і 6524 характеризувались лінійною структурою (1) з тетрацукридними ланцюгами, що повторювалися, які включали три залишки -L-рамнози та один залишок N-ацетилглюкозаміна.

Особливістю ЛПЦ R. solanacearum шт. 7859 є присутність в деградованому ЛПЦ двох високомолекулярних фракцій О-ПЦ (рис.1, б). Вивчення їх структури методом 13С-ЯМР-спектроскопії свідчить про їх ідентичність, тобто два О-ПЦ різнились тільки молекулярною масою, тобто кількістю ланцюгів, які повторюються. О-ПЦ шт. 750 (структура 1), шт. 7864 (структура 2) і шт. 8169 (структура 3) (раніше встановлені Варбанець Л.Д. із співавторами) відрізнялися від О-ПЦ досліджуваних штамів тільки варіацією у типі конфігурації глікозидного зв'язку залишку N-ацетилглюкозаміну: - в структурі 1 і - в структурі 2, а також положенням його прикріплення до залишку рамнози: 12 в структурі 1 та 13 в структурі 2 (табл. 4). Основу структури 3 складала лінійна тетрацукридна структура 2, в якій до одного з залишків рамнози була приєднана -L-ксилоза, як бічний замісник. Ксилоза є рідкісним компонентом бактеріальних поліцукридів і, крім R. solanacearum, виявлена в складі О-ПЦ Pseudomonas maltophіlia. На відміну від R. solanacearum шт. 750, 6524, 7859, 8115 і 7864, О-ПЦ яких був представлений тільки одним типом структури, О-ПЦ шт. 8169 характеризувався наявністю двох типів структур 2 і 3 (табл. 4).

Таблиця 4

Розподілення типів структур ланцюга, що повторюється, в О-специфічному поліцукриді штамів R. solanacearum

Примітка. “*” - структури, встановлені Варбанець з співавторами

В О-ПЦ R. solanacearum розгалужені структури, ймовірно, є результатом нестехіометричного ксилозування лінійних структур. Але не зрозуміло, лінійна та розгалужена одиниці входять в один і той же поліцукридний ланцюг, або кожна з них утворює окремий поліцукридний ланцюг. Кореляції між стуктурою О-ПЦ і належністю штаму до певного біовару чи рослини, з якої цей штам було виділено, чи за географічним походженням нами не виявлено.

Розділ 5. Імунохімічні дослідження ліпополіцукридів

Відомо, що тонкі варіації в структурі О-ПЦ є молекулярною основою створення внутрішньовидових серологічних класифікаційних схем мікроорганізмів. Для виду R. solanacearum така схема на сьогодні відсутня. Раніше Варбанець Л.Д. з співавторами були проведені імунохімічні дослідження деяких штамів R. solanacearum, в яких, на основі О-антигенності ЛПЦ, була показана його імунохімічна гетерогенність.

Серологічну активність досліджуваних ЛПЦ визначали за допомогою антисироватки, отриманої до грітої бактеріальної суспензії R. solanacearum шт. 8115, ЛПЦ якого характеризувався наявністю тільки одного типу структури О-ПЦ (1), а також до типового штаму 5712, який аналогічно шт. 8169, характеризувався наявністю двох типів структур О-ПЦ (2 і 3). В дослідах подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні ЛПЦ R. solanacearum штамів 8115 і 5712 в гомологічних системах проявили активність антигену (рис. 3).

В перехресних реакціях О-антисироватка до R. solanacearum шт. 8115 взаємодіяла з гетерологічними ЛПЦ, структури О-ПЦ яких, як аналогічні (750, 6524, 7859), так і відрізнялись (7864, 8169, 5712). Це свідчить про наявність в них загальних антигенних детермінант. Оскільки О-ПЦ ЛПЦ шт. 8169 містить залишок ксилози в бічному ланцюзі, а в О-ПЦ 750, 6524 і 7859 - він відсутній, можна припустити, що взаємодія цих ЛПЦ з сироваткою до R. solanacearum шт. 8115 здійснюється за рахунок антигенних детермінант, які знаходяться в лінійній структурі.

Дуже цікавий факт, який поки що не можна з'ясувати, є здатність ЛПЦ R. solanacearum шт. 6524 взаємодіяти з антисироваткою до типового штаму, в той час як ЛПЦ штамів 8115 і 7859, хоча і мають структуру О-ПЦ, аналогічну шт. 6524, не взаємодіють з О-антисироваткою до типового штаму R. solanacearum 5712. Це свідчить про відсутність в антитілах детермінант, комплементарних детермінантам в О-ПЦ R. solanacearum штамів 8115 і 7859.

Виявлені нами розбіжності в серологічній активності ЛПЦ, які характеризуються однаковою структурою, ймовірно свідчить про те, що активність може бути обумовлена присутністю в О-ПЦ мінорних компонентів вуглеводної або невуглеводної природи, які або були втрачені при деградації ЛПЦ, або які не вдається встановити методами ЯМР-спектроскопії. Відомо, що імунізація ЛПЦ або бактеріями із диких форм індукує утворення антитіл до О-специфічного ланцюга, але не до детермінант ОГ-кору чи ліпіду А. Разом з тим, дослідники припускають, що при оральному введенні ЛПЦ тваринам О-специфічні поліцукридні ланцюги звільнюються від молекули одночасно з вивільненням R-ЛПЦ, які здатні індукувати утворення антитіл до ОГ-кору і ліпіду А, відповідно, і які при імунній відповіді індукуються раніше, ніж антитіла до О-ланцюга. Тому ми припускаємо, що олігоцукрид кору і ліпід А також відіграють певну роль в загальній серологічній активності молекули ЛПЦ.

Порівняльне вивчення серологічної активності нативного і модифікованих форм ЛПЦ засвідчує, що дефосфорилювання і дезацилювання не впливає на серологічну активність, у той час як сукцинилювання призводить до її повної втрати.

Розділ 6. Вивчення біологічної активності нативних і модифікованих ліпополіцукридів R. solanacearum

Завдяки широкому розповсюдженню фітопатогенів в навколишньому середовищі, в тому числі на рослинах, що культивуються, людина і тварини можуть контактувати з ЛПЦ цих бактерій. Потрапляючи в організм людини або тварини, вони проявляють як надзвичайно корисні (імуномодулюючі, антиметастатичні, антилейкозні), так і шкідливі (токсичність, пірогенність) ефекти. Задача дослідників запобігти шкідливому впливу ендотоксинів. При дослідженні пірогенності була встановлена мінімальна пірогенна доза (7,5Ч10-3 мкг/мл непірогенного ізотонічного розчину). Результати термометрії показали, що підвищення температури у експериментальних тварин викликали розчини ЛПЦ R. solanacearum штамів 8115 і 6524. За своєю пірогенністю вони були більш ефективні, ніж “Пірогенал” - фармацевтичний препарат (табл. 5). При внутрішньовенному введенні мінімальної пірогенної дози розчинів ЛПЦ штамів R. solanacearum 7859 і 6189 спостерігалось зниження (-0,060С) або незначне підвищення (+0,170С) (відповідно) температури у дослідних тварин, що може свідчити про відсутність у цих ЛПЦ пірогенної дії. ЛПЦ шт. 8169 спочатку викликав підвищення температури у дослідних тварин, а на протязі другої і третьої години температура знизилась в порівнянні з початковою на -1,20С.

В дослідах на безпородних мишах встановлено, що досліджувані ЛПЦ характеризуються токсичною дією, але вона була на два порядки меншою, ніж токсичність ЛПЦ E. coli O55:B5 (табл. 5). Оскільки впровадження ЛПЦ в медичну практику гальмується наявністю токсичної дії необхідно розробити підходи до її зменшення. Одним із шляхів зниження токсичності ЛПЦ є їх модифікація. Нами були одержані ЛПЦ, в яких гідроксильні групи моноцукридів піддавались сукцинилюванню, а фосфатні і ацильні групи відщеплювались. Порівняльне вивчення нативних і модифікованих форм ЛПЦ засвідчує втрату останніми токсичності і пірогенності (рис. 4). Відомо, що модифікація призводить не лише до зміни складу ЛПЦ, але й до зміни його конформації, яка відповідає за ендотоксичну активність ЛПЦ.

Таблиця 5

Біологічна активність ЛПЦ R. solanacearum

Рис. 4. Пірогенна дія нативного і модифікованих ЛПЦ

Детоксикацію ЛПЦ здійснювали також за допомогою їх комплесоутворення з діоксидом германію . Внаслідок модифікації було одержано координаційну сполуку ЛПЦ з германієм. Встановлено, що модифікований ЛПЦ характеризувався меншою токсичністю, але його інтерфероногенна активність була аналогічна нативному ЛПЦ. Координаційна сполука ліпіду А з германієм не проявляє інтерфероногенної активності. Можна припустити, що ділянка в ліпіді А, яка відповідає за інтерфероногенну активність, змінюється при модифікації діоксидом германію.

Розділ 7. Позаклітинні глікополімери R. solanacearum

Одним із факторів, які викликають вілт у рослин за рахунок підвищення в'язкості їх судинної системи, є позаклітинні глікополімери.

Порівняльне вивчення фітотоксичної дії культуральних рідин (позбавлених клітин) R. solanacearum штамів 7859, 6524, 6189 і 5712 (типового) на проростання і розвиток насіння показало, що найбільшу активність проявляють штами 6524 і 6189.

Для очистки позаклітинних глікополімерів використовували іонообмінну хроматографію на ДЕАЕ-TSK 650 М гелі, внаслідок якої були одержані нейтральні (ГП 1) і заряджені (ГП 2, ГП 3) глікополімери, в складі яких ідентифіковані як білки, так і вуглеводи. Встановлено, що нейтральні глікополімери не проявли фітотоксичної дії. В складі глікополімерів, які проявляли фітотоксичну дію, домінуючими були рамноза (47,0, 20,0%) і глюкоза (21,7, 60,0%) (ГП2 R. solanacearum штамів 5712 і 6524, відповідно); маноза (42,3%) і глюкоза (46,8%) (ГП2 R. solanacearum шт. 6189); рамноза (31,8%), маноза (20,3%) і глюкоза (14,3%) (ГП3 R. solanacearum шт. 5712) або тільки одна глюкоза (70,8%) (ГП3 R. solanacearum шт. 6189). Наявність галактози (65,3%) як домінуючого моноцукриду (ГП3 R. solanacearum шт. 6524) ні в якій мірі не пов'язана з фітотоксичною дією.

Показано, що в глікополімерах, які проявляють фітотоксичну дію, співвідношення вуглеводів і білків складає 3,4:1 (для ГП 2 R. solanacearum шт. 6524) і 8,2:1 (для ГП 2 R. solanacearum шт. 6189), в той час як у глікополімерах, які не викликають фітотоксичну активність співвідношення вуглевод:білок складає 0,1:1.

Вивчення молекулярних мас свідчить, що досліджувані нами позаклітинні ГП характеризуються широким діапазоном їх величин - від 31900 до 716100 дальтон. Кореляції між фітотоксичною дією і величиною молекулярної маси не встановлено.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішено актуальну наукову задачу щодо вивчення закономірностей складу, будови, імунохімічної і біологічної ативності ЛПЦ і позаклітинних глікополімерів у представників фітопатогенного виду R. solanacearum. Обґрунтовано застосування методів хімічної модифікації ЛПЦ для зміни ендотоксичних властивостей, зокрема втрати токсичності і пірогенності. Головні наукові результати роботи викладено у наступних висновках:

1. Вперше виділено і хімічно охарактеризовано ЛПЦ семи досліджуваних штамів R. solanacearum. Показано, що архітектоніка їх макромолекули є типовою для даного класу біополімерів і включає ліпід А, олігоцукрид кору і О-специфічний поліцукрид.

2. Вивчення складу і будови ЛПЦ R. solanacearum і його структурних компонентів свідчить, що дивергенція властивостей відбувається в наступному порядку: ліпід А / О-ПЦ - олігоцукрид кору. В ліпіді А виявлено два хемотипи: шість штамів R. solanacearum характеризуються однаковим набором жирних кислот, зокрема 3-ОН-С14:0 і 2-ОН-С16:0, в той час як ліпід А R. solanacearum шт. 6189 характеризувався відсутністю 3-ОН-С14:0. По моноцукридному складу до двох хемотипів відносяться також О-ПЦ: домінуючими моноцукридами першого хемотипу є рамноза, глюкозамін, ксилоза і глюкоза, в той час як другого - галактоза, глюкоза, рамноза і фукоза. На рівні складу ОГ-кору досліджувані штами R. solanacearum складають більш гетерогенну групу - виявлено чотири хемотипи, які відрізняються вмістом окремих компонентів.

3. Встановлено, що О-ПЦ R. solanacearum шт. 7859 і 6524 характеризуються регулярною структурою і побудовані з лінійних тетрацукридних ланцюгів, які включають три залишки б-L-рамнози і один залишок N-ацетилглюкозаміну.

4. Не виявлено залежності між структурою О-специфічних поліцукридів ЛПЦ і належністю штаму до певного біовару, рослини-хазяїна, з якої він був виділений, чи географічної зони, з якої він походить.

5. Показано, що ЛПЦ деяких штамів R. solanacearum містять загальні антигенні детермінанти: виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів R. solanacearum, які характеризуються як однаковими структурами О-ПЦ (штами 8115, 750, 6524, 7859), так і такими, що відрізняються (штами 7864, 8169, 5712).

6. Встановлено, що ЛПЦ R. solanacearum проявляють токсичність на два порядки нижчу, ніж ЛПЦ E.coli O55:B5, і пірогенність, нижчу (штами 7859, 8169, 6189) або вищу (штами 8115, 6524) в порівнянні з “Пірогеналом” - фармацевтичним препаратом.

7. Вперше одержано модифікований внаслідок утворення координаційної сполуки з діоксидом германію ЛПЦ, який в значній мірі втрачає токсичність, але зберігає інтерфероногенну активність. Показано, що модифікація ЛПЦ шляхом сукцинилювання, дефосфорилювання і дезацилювання призводить до повної втрати таких ендотоксичних властивостей, як токсичність і пірогенність.

8. Вперше встановлено, що ацетилювання, дефосфорилювання і дезацилювання не впливає на серологічну активність ЛПЦ, в той час як сукцинилювання призводить до її втрати.

9. Вперше показано, що позаклітинні глікополімери R. solanacearum, домінуючими моноцукридами яких є рамноза, глюкоза і маноза проявляють фітотоксичну дію.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Варбанец Л.Д., Кочарова Н. А., Книрель Ю.А., Мурас В.А., Броварская О.С., Москаленко Н.В. Липополисахариды Pseudomonas solanacearum и Pseudomonas cichorii // Микробиол. журн. - 1990. - Т.52, №4. - С.27-30. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваних штамів, виділені ЛПЦ, проведені аналізи по вивченню їх хімічного складу).

2. Kocharova N.A., Knirel Y.A., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Kochetchov N.K., Varbanets L.D., Moskalenko N.V., Brovarskaya O.S., Muras V.A., Young J.M. Studies of O-specific polysaccaride chains of Pseudomonas solanacearum lipopolysaccharides consisting of structurally different repeating units // Carbohydr. Res. - 1993. - Vol.250. - P.275-287. (Мета роботи авторами сформульована спільно, здобувачем деградовані ЛПЦ та отримані їх структурні компоненти).

3. Варбанец Л.Д., Мурас В.А., Москаленко Н.В., Броварская О.С., Житкевич Н.В. Внеклеточные гликополимеры Burkholderia solanacearum (Yabuuchi et al., 1992) // Микробиол. журн. - 1996. - Т.58, №1. - С.30-36. (Здобувачем одержані позаклітинні глікополімери, отримані фракції нейтральних і заряджених глікополімерів, проаналізовано хімічний склад).

4. Varbanets L.D., Gvozdyak R.І., Brovarskaya O.S., Zhitkevich N.V. Bacterial glycopolymers: chemical characterization and phytotoxic activity //International regional seminar. Environment protection: modern studies in ecology and microbiology. Uzgorod. May 13-16, 1997. P.136-139 (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид, вивчений його моноцукридний і амінокислотний склад).

5. Варбанец Л.Д., Гвоздяк Р.И., Мурас В.А., Броварская О.С., Житкевич Н.В. Химический состав и биологическая активность гликополимеров Ralstonia solanacearum (Yabuuchi et al. 1995) // Микробиол. журн. - 1997. - Т.59, №5. - С.13-21. (Здобувачем одержані позаклітинні глікополімери, отримано окремі їх фракції, проведена хімічна ідентифікація і визначена молекулярна маса).

6. Варбанец Л.Д., Сейфуллина И.И., Рыбалко С.Л., Дядюн С.Т., Броварская О.С. Биологическая активность липополисахарида Ralstonia solanacearum ICMP 7859 и его модифицированного производного // Микробиол. журн. - 1998. - Т.60, №4. - С.80-87. (Авторами спільно сформульовано мету, здобувачем виділений ліпополіцукрид, отримані структурні компоненти, вивчений хімічний склад, досліджено токсичність нативного і модифікованого ліпополіцукридів).

7. Варбанец Л.Д., Гвоздяк Р.И., Мурас В.А. Броварская О.С., Житкевич Н.В. Характеристика липополисахарида Ralstonia solanacearum ICMP 6189 // Микробиол. журн. - 1998. - Т.60, №4. - С.15-24. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид, вивчений його хімічний склад).

8. Варбанец Л.Д., Васильев В.Н., Броварская О.С. Характеристика липополисахаридов Ralstonia solanaceatum // Микробиология. - 2003. - Т.72, №1. - С.19-25. (Здобувачем деградовані ліпополіцукриди та отримані їх структурні компоненти, вивчений хімічний склад О-специфічного поліцукриду, олігоцукриду кору та визначений жирнокислотний склад ліпіду А).

9. Броварська О.С., Варбанець Л.Д. Характеристика ліпополіцукриду Ralstonia solanacearum ICMP 8115 // Зб. статей учасників Міжнародної наукової конференції по фітопатогенним бактеріям. Київ. 2005. - С.107-112. (Здобувачем накопичена біомаса досліджуваного штаму, виділений ліпополіцукрид його структурні компоненти, вивчений жирнокислотний склад).

10. Броварская О.С., Варбанец Л.Д. Липополисахарид Ralstonia solanacearum ICMP 8115: характеристика и эндотоксическая активность //Современные проблемы токсикологии. 2006. - №.4. - С.56-59. (Здобувачем сформульовано завдання роботи, проведені експ...