Ліпополіцукриди та позаклітинні глікополімери Ralstonia solanacearum: склад, структура і біологічна активність

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню ліпополіцукридів (ЛПЦ) Ralstonia solanacearum. З семи штамів R. solanacearum ІСМР 750, 6524, 7859, 8115, 7864, 8169, 6189 виділені ЛПЦ, проведена хімічна ідентифікація, яка свідчить, що вони містять всі характерні для цих біополімерів компоненти. За складом диференцюючих для ліпідів А жирних кислот, 6 досліджуваних штамів можна віднести до одного хемотипу: вони містять 3-OH-C14:0 і 2-OH-C16:0. Відрізнявся від них R. solanacearum шт. 6189, в ліпіді А якого домінуючою була ізо-пентадеканова (іС15:0), а з оксикислот присутня лише 2-ОН-С16:0. Встановлено, що структури О-специфічного поліцукриду (О-ПЦ) штамів 6524 і 7859 характеризувались лінійними тетрацукридними ланцюгами, що повторювалися, і включали три залишки -L-рамнози та один залишкок N-ацетилглюкозаміна. В деградованому ЛПЦ шт. 7859 виявлено наявність двох високомолекулярних фракцій О-ПЦ. Вивчення їх структури методом ЯМР-спектроскопії свідчить про їх ідентичність, тобто два О-ПЦ різнились молекулярною масою, тобто кількістю ланцюгів, які повторюються. Досліджувані ЛПЦ були токсичними і пірогенними. При модифікації ЛПЦ відбулася втрата ендотоксичної активності, зокрема токсичності і пірогенності. В дослідах подвійної імунодифузії в агарі за Оухтерлоні ЛПЦ R. solanacearum в гомологічних системах проявили активність антигену, а в гетерологічній - виявлена наявність перехресних серологічних реакцій у штамів R. solanacearum, які характеризуються як однаковими структурами О-ПЦ (8115, 750, 6524, 7859), так і такими, що відрізняються (7864, 8169, 5712). Встановлено, що дефосфорилювання, дезацилювання не впливає на серологічну активність ЛПЦ, в той час як сукцинилювання приводить до її втрати.

Порівняльне вивчення фітотоксичної дії культуральних рідин (позбавлених клітин) R. solanacearum на проростання і розвиток насіння показало, що найбільшу активність проявляють штами 6524 і 6189. Позаклітинні глікополімери (ГП) містили як білок, так і вуглеводи. Фітотоксична дія спостерігалась у заряджених ГП, домінуючими моноцукридами яких були рамноза, глюкоза і маноза.

Ключоів слова: Ralstonia solanacearum, ліпополіцукрид, О-специфічний поліцукрид, олігоцукрид кору, ліпід А, токсичність, пірогенність, модифікований ЛПЦ, позаклітинні глікополімери.

АННОТАЦИЯ

Броварская О.С. Липополисахариды и внеклеточные гликополимеры Ralstonia solanacearum: состав, структура и биологическая активность. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, г. Киев, 2007.

Диссертация посвящена исследованию липополисахаридов (ЛПС) Ralstonia solanacearum. Из семи штаммов R. solanacearum ІСМР 750, 6524, 7859, 8115, 7864, 8169, 6189 выделены и химически охарактеризованы ЛПС. Выход ЛПС составлял от 4,0 до 8,7%, что отличает их от других представителей фитопатогенных бактерий. Анализ моносахаридного состава ЛПС показал, что доминирующим моносахаридом была рамноза (60,0-76,7%), которая часто встречается в составе видов Pseudomonas. ЛПС содержал в своем составе глюкозу (5,5-18,8%), ксилозу (2,4-12,2%), а в шт. 6189 доминировала галактоза (58,7%). Кроме указанных моносахаридов, в ЛПС R. solanacearum выявлены менее распространенные для данного вида остатки моносахаридов - ксилоза, фукоза и рибоза. Поскольку после очистки содержание нуклеиновых кислот в препаратах ЛПС составляло от 0,5 до 2,4 %, исключается возможность загрязнения рибозой нуклеиновых кислот. Вероятно, что она действительно входит в состав ЛПС указанных штаммов. Характерным компонентом ЛПС исследуемых штаммов R. solanacearum является гептоза (5,3-7,7%) и КДО, которая в недеградированных ЛПС присутствует в незначительных количествах (от следовых количеств до 0,7%). Установлено, что изолированные из R. solanacearum ЛПС содержали все характерные для этих биополимеров компоненты.

В результате мягкого кислотного гидролиза получены структурные компоненты молекулы ЛПС: липид А, олигосахарид кора (ОГ-кора) и О-специфический полисахарид (О-ПС). По составу дифференцирующих для липидов А жирных кислот, 6 исследуемых штаммов можно отнести к одному хемотипу: они содержат 3-OH-C14:0 и 2-OH-C16:0 кислоты. Отличался R. solanacearum шт. 6189, в липиде А которого доминирующей была изо-пентадекановая кислота (іС15:0), а из оксикислот присутствовала только 2-ОН-С16:0.

При изучении ОГ-коров показано, что гептозы (5,9-24,3%) и КДО (от следовых количеств до 3,2%) присутствовали во всех исследуемых штаммах. Что касается других моносахаридов, то наблюдались значительные штаммовые вариации. Характерными моносахаридами ОГ-коров всех исследуемых штаммов была рамноза, глюкоза и глюкозамин. Такие моносахариды как ксилоза, манноза, галактоза, рибоза и фукоза присутствовали в отдельных штаммах. По моносахаридному составу ОГ-коров можно отнести к 4 хемотипам.

Доминирующими моносахаридами О-ПС являются рамноза, галактоза, ксилоза и глюкозамин. По моносахаридному составу О-ПС всех исследованных штаммов можно разделить на два хемотипа.

Установлено, что структуры О-ПС штаммов 6524 и 7859 представлены линейными тетрасахаридными повторяющимися звеньями, состоящими из трех остатков -L-рамнозы и одного остатка N-ацетилглюкозамина. В деградированном ЛПС шт.7859 выявлено наличие двух высокомолекулярных фракций О-ПС. Изучение структуры О-ПС методом ЯМР-спектроскопии свидетельствует об ее идентичности, оба О-ПС различались между собой молекулярной массой, то есть количеством повторяющихся звеньев. Исследуемые ЛПС были токсичны и пирогенны. Модификация ЛПС путем дезацилирования, дефосфорилирования, сукцинилирования приводит к полной потере их токсичности и пирогенности. В опытах двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони ЛПС R. solanacearum в гомологичных системах проявляли активность антигена, а в гетерологичних системах выявлены перекресные серологические реакции у штаммов R. solanacearum, которые характеризовались как одинаковыми структурами О-ПС (8115, 750, 6524, 7859), так и такими, что отличались (7864, 8169, 5712). Показано, что дефосфорилирование, дезацилирование не оказывает влияния на серологическую активность ЛПС, в то время как сукцинилирование приводит к полной потере.

Сравнительное изучение фитококсического действия культуральных жидкостей (свободных от клеток) R. solanacearum на проростание и развитие семян показано, что наибольшую активность проявляли штаммы 6524 и 6189. Внеклеточные гликополимеры (ГП) содержали как белок, так и углеводы. Фитотоксическая активность наблюдалась у заряженных ГП, доминирующими моносахаридами которых были рамноза, глюкоза и манноза.

Ключевые слова: Ralstonia solanacearum, липополисахарид, О-специфический полисахарид, олигосахарид кора, липид А, токсичность, пирогенность, модифицированный ЛПС, внеклеточный гликополимер.

SUMMARY

Brovarskaya O.S. Lipopolysaccharides and extracellular glycopolymers of Ralstonia solanacearum: composion, structure and biological activity. - Manuscript.

The thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of microbiology and virology named D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2007.

The dissertation is devoted to investigations of Ralstonia solanacearum lipopolyssaccharides (LPS). LPS have been isolated from 7 strains of R. solanacearum ICMP 750, 6524, 7859, 8115, 7864, 8169, 6189. Their chemical idenfication showed that LPS tested contain all components which are characteristic for this type of polymers. Accordingly to composition of diagnostic fatty acids of lipid A, six strains investigated may be attributed to one chemotype which was characterized by presence of two hydroxylated acids 3-OH-C14:0 and 2-OH-C16:0. Unlike in lipid A of R. solanacearum 6189 the presence of iso-pentadecanoic acid as predominant and insignificant amount of 2-OH-C16:0 have been shown. The structures of O-specific polysaccharides (O-PS) of R. solanacearum 6524 and 7859 have been established. They characterized by linear tetrasaccharide units, including three residues of -L-rhamnose and one residue of N-acetylglucosamine. Two high molecular fractions of O-PS have been shown in R. solanacearum 7859 LPS. The studies of their structures by using nmr-spectroscopy showed their identity. These data indicate the O-PS tested are differed by molecular masses that is to say the numbers of repeating units. The LPS tested were toxic and pyrogenic. Modifications of LPS lead to the loss of their endotoxic activity, in particular toxicity and pyrogenicity. Using method of double immunodiffusion in agar by Ouchterlony it was shown that LPS of R .solanacearum in homological systems displayed activity of antigen, and in heterological systems it was demonstated the presence of cross serological reactivity of R. solanacearum strains which characterized both similar O-PS structures (8115, 750, 6524,7859) and varying ones (7864, 8169, 5712). It was settled, that dephosphorylation and deacylation don't influence the LPS serological activity while succinylation leads to its loss.

The comparative studies of phytotoxic activity of R. solanacearum culture liquids (without cells) on germination and growth of seeds showed that R. solanacearum strains 6524 and 6189 displayed the highest activity. Extracellular glycopolymers (GP) contained both proteins and carbohydrates. It was shown that charged glycopolymers exerted phytotoxic activity.

Key words: Ralstonia solanacearum, lipopolyssaccharide, O-specific polysaccharide, core oligosaccharide, lipid A, toxicity, pyrogenicity, modified LPS, extracellular glycopolymers.

Размещено на Allbest.ru