Генетично змінені штами мікроорганізмів у системі етапної оцінки мутагенної активності косметичних засобів і їхніх інгредієнтів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

УДК 575.224.4:579.253.4:613.49

ГЕНЕТИЧНО ЗМІНЕНІ ШТАМИ МІКРООРГАНІЗМІВ У СИСТЕМІ ЕТАПНОЇ ОЦІНКИ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ КОСМЕТИЧНИХ ЗАСОБІВ І ЇХНІХ ІНГРЕДІЄНТІВ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Яловенко Олена Ігорівна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі промислової біотехнології Національного технічного університету України „КПІ” Міністерства освіти і науки України (м. Київ)

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Дуган Олексій Мартем'янович, Національний технічний університет України „КПІ”, завідувач кафедри промислової біотехнології, декан факультету біотехнології і біотехніки (м. Київ)

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАНУ Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології і вірусології НАНУ, завідувач відділу генетики мікроорганізмів (м. Київ)

доктор біологічних наук, професор, Горова Алла Іванівна, Національний гірничій університет МОН України, завідувач кафедри екології (м. Дніпропетровськ)

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка

Захист дисертації відбудеться „_26_”_жовтня_2006 р. о _10⁰⁰__годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Наукового центру радіаційної медицини АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий „_23_” _вересня__2006 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради А.В. Стефанович

індукція генний мутація косметичний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Наприкінці ХХ сторіччя почали розроблятись складні косметичні препарати і системи косметичних препаратів, здатні активно впливати на фізіологічні процеси шкіри, і тому значно поліпшувати її зовнішній вигляд. Ретельний аналіз рецептур багатокомпонентних композицій косметичних засобів показує, що вміст в них речовин з потенційними мутагенними або канцерогенними властивостями не виключається, і це підтверджується чисельними експериментальними дослідженнями, у результаті яких була встановлена мутагенна/канцерогенна дії деяких інгредієнтів (лаурилсульфату натрію, триетаноламіну, барвників та модифікаторів кольору, консервантів та ін.) на тест-системах різного рівня організації (Alan R., Liss К., 1994; Марголина А.А, Эрнандес Е.И., 2005; Chang K., Murdock C.A., Stevens S.E. et al, 1995; Connor T.H., Tee, M., 1996; Byford J.R., Shaw L.E., Drew M.G.B., 2002). Крім того, при аналізі результатів моніторингу онкологічних захворювань встановлено істотний доза-залежний зв'язок між фарбуванням волосся та ризиком виникнення раку яєчнику, неходжкінських лімфом, множинної мієломи і раку сечового міхура (Gago-Dominguez M., Castelao J.E., 2001; Correa A., Mohan F., Jackson L. et al., 2000; J. Сho, E. On, E. Lee, 2003). Однак наукові експериментальні підтвердження генетичної небезпеки для здоров'я людини саме складних композицій - косметичних засобів - практично відсутні. Більш того, намічається тенденція випередження доклінічних досліджень епідеміологічними. Тому з огляду на можливу мутагенну і канцерогенну дії деяких інгредієнтів косметичних засобів, Європейська асоціація з косметики, засобів особистої гігієни та парфумерії (COLIPA) та Науковий комітет з косметичних та непродовольчих продуктів, призначених для споживача, (SCCNFP) вважають за обов'язкове вивчення потенційних мутагенних ефектів як самих інгредієнтів, так і їхніх композицій, та пропонують стратегію їхньої поетапної оцінки на мутагенність/канцерогенність (SCCNFP/0755/03).

У 2003 році Європарламентом та Єврокомісією була прийнята Директива 2003/15/ЄС про повну заборону з 2009 року проведення тестів на тваринах при оцінці ефективності і безпечності косметичних засобів. Враховуючи вимоги цієї директиви, для виявлення потенційної мутагенності компонентів косметичних засобів і самих композицій COLIPA та SCCNFP у якості обов'язкової альтернативної тест-системи пропонують використовувати генетично змінені штами мікроорганізмів роду Salmonella - тест Еймса Salmonella/microsome, який вважається одним з основних методів у скринінгових програмах різних країн у тих випадках, коли необхідно порівняно швидко і економічно вивчити потенційну генетичну і канцерогенну активність великої кількості сполук і комплексів хімічних сполук і відібрати серед них ті, які можуть бути мутагенами для людини (Maurici D., Aardema M., Corvi R. еt al., 2005).

Ці положення були покладені в основу досліджень в межах даної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках НДР “Розробка технологій нових пробіотиків, імунокоректорів, ад'ювантів” (шифр теми М/454, № державної реєстрації 0103U007799), “Наукове обґрунтування комплексу альтернативних та традиційних методів з метою гігієнічної регламентації нових хімічних матеріалів та препаратів для населення” (шифр теми АМН.Ф.10.05, № державної реєстрації 0105U002737)

Мета дослідження - встановити особливості і закономірності індукції генних мутацій деякими косметичними засобами й їхніми інгредієнтами в системі етапної оцінки їхньої безпечності в альтернативних тест-системах (генетично змінені штами Salmonella typhimurium).

Завдання дослідження:

1. Встановити можливість індукції генних мутацій відтінковими бальзамами.

2. Проаналізувати спектр генних мутацій, індукованих стійкими фарбами для волосся, барвниками та модифікаторами кольору, що входять до їхнього складу.

3. Здійснити порівняльний аналіз мутагенної активності у системі “фарбувальні компоненти стійких фарб для волосся - стійкі фарби для волосся”

4. Виявити особливості індукції генних мутацій шампунями і поверхнево-активними речовинами, що входять до їхнього складу.

5. Встановити потенційну генетичну небезпеку деяких косметичних засобів у залежності від наявності у їх складі мутагенно-активних речовин.

6. Зіставити результати статистичного аналізу первинних експериментальних даних, отриманих різними методами, для запобігання псевдопозитивних відповідей на бактеріальних тест-системах.

Об'єкт дослідження - генетична дія косметичних засобів і їхніх інгредієнтів на альтернативні біологічні системи.

Предмет дослідження - кількість мутацій заміни пар нуклеотидних основ і зсуву рамки зчитування генетичного коду.

Методи дослідження: мікробіологічні, генетичні, статистичні, фізико-хімічні.

Матеріали дослідження. У роботі досліджено: бальзами відтінкові - 17 найменувань, стійкі крем-фарби для волосся (суміш фарбувального та окислювального компонентів) і їхні фарбувальні компоненти - по 23 найменування, барвники та модифікатори кольору (інгредієнти фарб для волосся) - 10, шампуні - 13, поверхнево-активні речовини (ПАР) - інгредієнти шампунів та фарбувальних косметичних засобів для догляду за волоссям - 7, туалетні води - 2, креми косметичні “З”, “Ф”, “Ц” (умовні назви) (“З” - дитячої групи, “Ф”, “Ц” - лікувально-профілактичні) і їхні інгредієнти - 4. Всі досліджувані зразки отримані в лабораторії гігієни нових хімічних матеріалів, препаратів та біомоніторингу Інституту гігієни та медичної екології ім. А.М. Марзеєва. В якості розчинників, у залежності від фізико-хімічних властивостей сполук і особливостей методики тестування, використовували стерильну дистильовану воду, диметилсульфоксид (ДМСО), етиловий спирт.

Методи дослідження. У роботі використовували напівкількісний метод обліку генних мутацій на Salmonella. Експерименти проводили згідно Методичних рекомендацій Л.М. Фонштейна і співавторів у модифікації О.М. Дугана і співавторів. Математичну обробку первинних даних проводили згідно з Методичними рекомендаціями Лазутка і співав. і за критерієм Стьюдента за допомогою програми Microsoft Excel та пакету програм SPSS 14 зі статистики. Оцінку мутагенних ефектів здійснювали згідно рекомендацій О.М. Дугана і співав. В роботі використовувались наступні генетично змінені тест-організми: штам ТА 98 (виявляє мутагенні сполуки, які індукують генні мутації зсуву рамки зчитування генетичного коду) і штам ТА 100 (виявляє мутагенні сполуки, які індукують генні мутації заміни пар нуклеотидних основ). Для виявлення мутагенності ймовірних метаболітів досліджуваних речовин використовували систему метаболічної активації in vitro - супернатант гомогенату печінки щурів (S-9 фракцію). Усі тверді хімічні сполуки були тестовані в класичних для “мікробного мутагенезу” дозах: від 0,1 до 1000,0 мкг/чашку з кроком в один порядок; рідкі хімічні сполуки - у розведенні 1:0 (нативна речовина); 1:1; 1:4 і 1:9.

Результати досліджень

Відтінкові бальзами. Результати досліджень мутагенної дії відтінкових бальзамів представлені в табл. 1.

Дані таблиці свідчать про: а) наявність мутагенної активності в майже всіх досліджуваних бальзамів, б) більш виразні мутагенні ефекти виявлені на тест-штамі ТА 98. Найбільш активними індукторами генних мутацій за різними механізмами дії і в різних варіантах експерименту виявилися три засоби - “Червоне дерево”, “Каштановий”, і “Чорний”, які показали ефект „середньої”

Таблиця 1 Потенційна мутагенна активність відтінкових бальзамів

Примітки: ¹ - мутагенна активність “слабкої” сили; ² - граничний мутагенний ефект; ³ - відсутність мутагенного ефекту; ⁴ - мутагенний ефект „середньої” сили; ⁵ МС+ - варіант досліду з метаболічною активацією; ⁶ МС- - варіант досліду без активації (наведені у примітці пункти розповсюджуються на всі таблиці автореферату).

сили, що можна пояснити вмістом у складі цих композицій мутагенних інгредієнтів у досить високих відсоткових відношеннях: для бальзамів “Червоне дерево” і “Каштановий” - це, крім більш слабких мутагенів, міститься барвник 2-нітро-1,4-фенілендіамін: масова частка - 0,8% і 0,4% відповідно, що відповідає майже максимальній дозі 800 і 400 мкг у пробі в класичних експериментах з використанням мікробних тест-систем; для бальзаму “Чорний” - це наявність двох барвників: основний синій і дисперсний чорний (масова частка 1 і 0,8% відповідно). Максимальний мутагенний ефект на тест-штамі ТА 98 показав бальзам “Червоне дерево” (рис. 1), для якого було виявлено достовірне перевищення кількості ревертантів у досліді відносно контролю в 17,6 разів у варіантах МС+, що вказує на наявність у цій композиції „непрямих” мутагенів (наприклад, 2-нітро-1,4-фенілендіамін). Крім того, рецептура бальзаму “Червоне дерево” містить технічний формалін, мутагенна активність якого показана у попередніх дослідженнях, чим і пояснюється ефект тону “Червоне дерево”, отриманий на тест-штамі ТА 100 в обох варіантах досліду. Максимальна відповідь на цьому штамі спостерігалася для бальзаму тону “Чорний” (рис. 2) у варіанті МС+ (перевищення контрольних значень у 10 разів). Бальзами тонів “Чорний” і “Каштановий” на ТА 98 також виявилися досить активними (достовірне перевищення кількості ревертантів у дослідних варіантах більш ніж у 13 і 11 разів відповідно), причому, ефект метаболічної активації в незначній мірі спостерігався для тону “Каштановий”. Відмічено стійкість отриманих ефектів (чітка залежність ефекту від дози).

Типовими мутагенами „слабкої” сили є бальзами тонів “Вишневий”, “Гранат”, “Вогняний танок” і “Бордо”, ефекти яких знаходяться в межах 6,5 - 8 кратного перевищення контрольних значень. Для решти із цієї групи препаратів характерно суттєве зниження (або відсутність взагалі) ефектів на тест-штамі ТА 100, а також недостовірні ефекти метаболічної активації, мутагенні ефекти “слабкої” сили з кратністю перевищення контрольних

значень, в основному, від 2 до 5 разів у різних варіантах досліду. Один з відтінкових бальзамів - тон “Бургунд” - виявився генетично інертним.

Таким чином, дослідження відтінкових бальзамів виявили неоднозначну їхню мутагенну відповідь, яка обумовлена декількома складовими, які впливають на загальний мутагенний пул незалежно одна від одної та в комплексі. Незалежність дії обумовлена наявністю в складі 4-5 інгредієнтів з відомими мутагенними властивостями в різних відсоткових відношеннях. Комплексна дія обумовлена взаємодією складових частин бальзамів з утворенням проміжних продуктів, мутагенна активність яких може бути виявлена тільки експериментальним шляхом і тільки за допомогою експрес-методів (у переважній більшості за допомогою методики Еймса й обов'язково з метаболічною активацією).

Стійкі крем-фарби для волосся. Експериментальні дані наведені в табл. 2 (графах А).

Існують принаймні дві причини мутагенності стійких фарб для волосся: наявність у рецептурах фарб інгредієнтів з мутагенними властивостями і змішування (перед застосуванням) фарбувального компоненту з пероксидом водню. Комплекс хімічних речовин, що утворився, володіє невідомими біологічними властивостями і не вивчався взагалі. Саме він може викликати різні негативні наслідки в споживачів - алергенні, мутагенні, канцерогенні. Як виявилося, майже усі фарби, що досліджуються, здатні індукувати генні мутації, причому, більш ніж половина з них показали мутагенну активність середньої сили; тільки одна фарба виявилась інертною в генетичному відношенні, решта дев'ять - слабкі мутагени.

Характерним є те, що фарби які виявилися мутагенами „середньої” сили, проявили ці властивості тільки на ТА 98 і в обох варіантах МС+ МС-. Останнє можна пояснити двома обставинами. По-перше, у процесі метаболізму in vitro створюються мутагенні метаболіти досліджуваних фарб, таким чином, можна виявити мутагенні властивості метаболітів суміші фарбувального і окислювального компонентів у варіантах досліду з метаболічною активацією. По друге, якщо в результаті додавання пероксиду водню створюються комплекси, які є “прямими” мутагенами, то у цьому випадку ефект спостерігається у варіантах досліду без метаболічної активації. Той факт, що мутагенна активність фарб виявлена в обох варіантах свідчить про те, що задіяні обидва механізми утворення мутагенів і ці косметичні засоби є генетично досить небезпечними.

Таблиця 2 Мутагенна активність стійких крем-фарб для волосся/фарбувальних компонентів стійких крем-фарб у тесті Еймса

Примітки: ⁷ - ступінь проявлення мутагенного ефекту; ⁸ - Хд./Х.к - співвідношення середньої кількості колоній-ревертантів у досліді відносно контролю.

На рис. 3 представлені дані з мутагенної дії трьох найбільш сильних у генетичному відношенні стійких фарб. Така висока кратність перевищення кількості ревертантів у дослідних варіантах (від 22,7 для тону “Коричневий” до 19,4 для тону “Темно-каштановий”) пояснюється двома причинами: а) наявністю в їхніх складах у досить високих концентраціях таких мутагенів, як параамінофенол, парафенілендіамін і -нафтол; б) появою нових мутагенних сполук у результаті, з одного боку, окислювання інгредієнтів фарб пероксидом водню перед застосуванням фарби, з другого - метаболізмом in vitro нових сполук, створених у результаті дії пероксиду водню.

Доказом того, що виявлені ефекти є стійкими, являється залежність мутагенного ефекту від концентрації фарби. Як видно з рис. 3, зі зменшенням концентрації фарб у пробі, що досліджується, зменшується і мутагенний ефект. На максимальних концентраціях мутагенність залишалась майже на однакових рівнях. Розведення фарб у 10 разів повністю знімало їхню мутагенну дію.

Значно менші ефекти в цієї групи фарб були отримані на штамі ТА 100 (рис. 4), але ці ефекти також є стабільними. Тільки розведені в 10 разів зразки не індукували мутацій.

Другу групу фарб складали засоби, які також показали статистично значимі ефекти „середньої” сили на ТА 98 з кратністю перевищення контрольних значень від 16,6 ("Божоле”) до 14,7 (“Баклажан”), із чіткою зворотною залежністю мутагенної відповіді від кратності розведення. Мутагенність тону “Божоле” може бути обумовлена вмістом трьох мутагенів: 2,4-толуілендіаміном (200 мкг у пробі), параамінофенолом (750 мкг у пробі) і -нафтолом (500 мкг у пробі). Ефект зразка тону “Синьо-чорний” обумовив парафенілендіамін (600 мкг/чашку), тону “Баклажан” - 2,4-толуілендіамін і -нафтол (150 і 200 мкг/чашку відповідно). Ці ефекти мало чим відрізняються від ефектів, індукованих тоном “Божоле”, що підтверджує тезу про достатньо високі концентрації у фарбах мутагенних інгредієнтів, здатних індукувати генні frameshift-мутації. Аналогічні ефекти фарб цієї групи (тільки “слабкої” сили) були виявлені на ТА 100.

Ні за особливостями індукції генних мутацій, ні за ступенем проявлення ефектів, фарби з мутагенним ефектом „середньої” сили: “Синій оксамит”, “Рожеве дерево” та “Вишневий” майже не відрізнялися одна від одної. Характерною рисою наступної групи фарб (за табл. 2 № 10, 11, 12) є наявність у них на ТА 98 мутагенних властивостей „середньої” сили у варіантах МС+ і “слабкої” сили у варіантах МС-, за винятком тону “Червоне золото” (у варіанті МС- також виявлена “середня” ступінь мутагенності).

Тони “Каштановий”, “Червоне дерево”, “Темно-русявий” показали граничну (між “середньою” і “слабкою”) мутагенну активність. Кратності перевищення ревертантів у дослідних варіантах у всіх трьох випадках виявилися приблизно однаковими (10,5 для тону “Каштановий” і 9,8 для інших). Ефект метаболічної активації найбільш істотним виявився для тонів “Каштановий” і “Темно-русявий”. Активність цих фарб обумовлюють: для тону “Каштановий” - параамінофенол, парафенілендіамін, -нафтол; для тону “Червоне дерево” - парафенілендіамін, 2-нітро-1,4-фенілендіамін; для тону “Темно-русявий” - 2,5-діамінотолуілен сульфат, метаамінофенол, парафенілендіамін, -нафтол.

Решта фарб виявилися класичними мутагенами „слабкої” сили. Тон “Світло-русявий” - інертним по відношенню до індукції генних мутацій.

Таким чином, дані вивчення мутагенної активності стійких фарб для волосся свідчать про те, що косметичні засоби, що масово використовуються споживачами (в основному жіночої статі), становлять потенційну небезпеку не тільки як алергени, але і як потенційні канцерогени і мутагени.

Фарбувальні компоненти стійких крем-фарб для волосся. Дані з наявності мутагенності фарбувального компоненту стійких крем-фарб для волосся представлені в табл. 2 (графах Б). Аналіз даних показав значно більш різноманітну картину особливостей прояву їхньої здатності індукувати генні мутації в Salmonella typhimurium.

По-перше, жодна з вивчених фарб не виявила ефектів “середньої” сили на відміну від аналогічних властивостей відповідних композицій після їхнього змішування з окислювачем; по-друге, три фарби виявилися інертними у відношенні індукції мутацій (після змішування з пероксидом водню - тільки одна); по-третє, ступінь проявлення ефектів фарбувальних компонентів стійких крем-фарб набагато нижче їхньої суміші з окислювачем; по-четверте, практично усі виявлені ефекти були встановлені або тільки на нативних зразках, або на нативних зразках і розведених у два рази.

Максимальні значення ступенів проявлення ефектів стійких крем-фарб та їхніх фарбувальних компонентів представлені в табл. 2. Аналіз даних показує, що загальна тенденція особливостей прояву мутагенних ефектів зразків істотно не змінилась, тобто ТА 98 практично в усіх випадках виявився більш чутливим, ефект метаболічної активації був аналогічним стійким фарбам. Разом з тим, добавка Н₂О₂ майже на 50 % збільшувала мутагенну силу практично будь-якої фарби, незважаючи на розведення фарбувального компоненту пероксидом водню вдвічі, причому ця тенденція зберігалася для усіх варіантів досліду і навіть у тих випадках, коли мав місце ефект метаболічної активації, тобто в досліджуваних пробах з'являлися мутагенно-активні сполуки як за рахунок мікросомального окислювання, так і за рахунок подальшого окислювання пероксидом водню продуктів, що утворилися.

Барвники та модифікатори кольору. Дані про мутагенну активність барвників та модифікаторів кольору, що входять у рецептури стійких крем-фарб, представлені в табл. 3.

Таблиця 3 Потенційна мутагенна активність барвників та модифікаторів кольору - інгредієнтів стійких фарб для волосся

В основному індукція генних мутацій цими речовинами мала місце саме в діапазоні доз, які відповідають процентній частці в рецептурах вивчених фарб, що може служити тривожним сигналом у плані безпеки використання цих засобів.

Фактичні максимальні значення ступеню проявлення мутагенної активності перших трьох інгредієнтів на штамі ТА 98 наступні: 1,4-фенілендіаміну (співвідношення середньої кількості колоній-ревертантів у досліді відносно контролю (Хд./Хк)., МС+ - 20,3), метаамінофенолу (Хд./Хк., МС+ - 15) і 2-нітро-1,4-фенілендіаміну (Хд./Хк., МС+ - 9,8). Спостерігався ефект метаболічної активації із чіткою залежністю ефектів від дози речовин, що є свідченням стійкої здатності цих інгредієнтів індукувати генні мутації. На ТА 100 ефект був виявлений тільки для метаамінофенолу і тільки в присутності метаболізуючої системи. Не менш потенційно небезпечними в генетичному відношенні є також 2,5-діамінотолуілен сульфат (2,5-д-АТ), 4-метил-метафенілендіамін (4-МФ-д-А) і б-нафтол, що показали на ТА 98 “середню” (б-нафтол і 2,5-д-АТ -Хд./Хк., МС+ - 19,3 і 11,6 відповідно) і “слабку” (4-МФ-д-А -Хд./Хк., МС+ - 7,7) ступінь проявлення ефектів. Особливості прояву мутагенності в цій групі речовин типові для стійких мутагенів: зростання ефектів зі збільшенням дози речовини і відсутність бактерицидної дії на тест-організм. Очевидно, збільшення дози до 1250-1500 мкг/чашку до деякої міри збільшило б мутагенну відповідь, однак ми виходили з реального змісту інгредієнтів у рецептурах фарб.

На тест-штамі ТА 100 тільки б-нафтол і фуксин лужний виявилися як мутагени “середньої” сили у варіанті МС+. Фуксин показав здатність індукувати мутації “середньої” сили і на штамі ТА 98 у варіантах МС+. Хд./Хк. була на рівні 17,0 із чіткою залежністю ефекту від дози. Інші - класичні слабкі мутагени. Практично інертним виявився резорцин.

Поверхнево-активні речовини. З 7 вивчених ПАР (Emulgin PEG-40, Antyl 141 Liquid, Tego Betain, лаурилмірістилполігліколь (Arlypon F), Euperlan PK 3000 AM, Синтанол АЛМ 10, лаурилсульфат Na) 2 виявили здатність індукувати мутації. Ступінь проявлення ефектів цих двох сполук не виходила за межу “слабких” мутагенів з максимальним перевищенням контрольних значень у 5 разів і чіткою залежністю ефекту від дози при дії лаурилсульфату натрію, і в 3,5 рази - при дії лаурилмірістилполігліколю. Ефект метаболічної активації не спостерігали, тобто обидві ПАР є “прямими” мутагенами. Інші ПАР не індукували генні мутації. Виявлені перевищення контрольних значень у всіх випадках були недостовірні.

Засоби косметичні для очищення шкіри та волосся (шампуні). Аналіз даних свідчить про повну відсутність потенційної здатності представлених шампунів індукувати мутації. Система метаболічної активації також виявилася неефективною, тобто можливі проміжні і кінцеві метаболіти цих шампунів також були інертними. Практично у всіх дослідах із шампунями мало місце невелике перевищення кількості ревертантів (від 1,1 до 1,4 рази). Статистичний аналіз первинних даних за Даннетом у жодному випадку не виявив статистично значимих розходжень між дослідними і контрольними значеннями. Незважаючи на досить велику масову частку вмісту лаурилмірістилполігліколю в шампунях: “Блиск кольору” - 300 мкг/чашку, “Aroma”, “Сила і об'єм” - 500 мкг/чашку, “Оксамитовий шовк” - 1000 мкг/чашку, мутагенність їхня виявлена не була. Інший загальновизнаний мутаген - лаурисульфат натрію - міститься в рецептурах всіх вивчених нами шампунів у процентних частках (у перерахунку на мкг/чашку) від 9000 (“Aroma”) до 11690 мкг/чашку (“Оксамитовий шовк”). Виходячи із чисельних даних про мутагенність лаурилсульфату натрію на тест-системах різного рівня організації, мутагенність шампунів цілком була б виправдана. Однак, всі тестовані композиції були інертними щодо індукції генних мутацій. Це можна пояснити наступним: взаємодією речовин між собою з утворенням комплексу хімічних сполук, не здатних проникнути у середину тест-організму і вступити в реакцію з ДНК мікробної клітини, нейтралізацією мутагенів у процесі утворення кінцевого продукту, активністю екстрактів з різних трав, овочів, фруктів з антимутагенною дією, що входять до складу шампунів.

Креми косметичні і їхні інгредієнти. Нами було зроблено спробу вивчити мутагенну активність декількох багатокомпонентних косметичних засобів інших асортиментних груп, що належать до препаратів, які не змиваються з поверхні шкіри і застосовуються споживачами щоденно (креми косметичні, туалетні води), та деяких інгредієнтів крему “З”: поліметилсилоксанову рідину, вітамін А, пропилпарабен, триетаноламін.

З цієї групи речовин генетично активними були тільки крем “З”, пропилпарабен та триетаноламін, причому, враховуючи літературні дані (О.Е. Беліков, Т.В. Пучкова, 2003; G. Eisenbrand, 1991), генетична активність крему може бути пояснена не тільки мутагенною активністю триетаноламіну та пропилпарабену, а й утворенням нітрозоамінів при взаємодії триетаноламіну та бронополу, які входять до складу рецептури засобу.

Крем “З” за результатами попередніх випробувань з оцінки безпечності (у тому числі і на мутагенну активність) не відповідав вимогам щодо даної продукції і не був рекомендований до виробництва та використання населенням. При оцінці нової зміненої рецептури цього крему (а саме, заміна триетаноламіну на інший неіонний структуроутворювач та виключення бронополу зі складу консервантів за рахунок зміни концентрацій тих, що залишились) було встановлено відсутність мутагенної активності в даній тест-системі. Крем “З” зі зміненою рецептурою отримав позитивну оцінку за показниками токсикометрії відповідно до ДСанПін 2.2.9.027-99 і був рекомендований для виробництва і застосування споживачами.

Отже, за результатами проведених досліджень цієї групи косметичних засобів можна відмітити, що саме наявність у їхніх складах мутагенно-активних компонентів обумовлює генетичну активність засобу.

Порівняльний аналіз результатів математичної обробки первинних експериментальних даних у тесті Еймса. Однієї з не до кінця розроблених проблем мікробного мутагенезу є оцінка ефектів. На сьогоднішній день, при вивченні мутагенної активності хімічних сполук у мікробних тест-системах, зокрема, на Salmonella typhimurium, можуть виникнути три кінцевих ситуації: а) кількість ревертантних колоній у дослідних варіантах істотно не відрізняється від контрольних; б) кількість ревертантних колоній у дослідних варіантах більше, ніж у контролі в 1,1-2,5 рази; в) кількість ревертантних колоній у дослідних варіантах істотно (на порядок і більше) відрізняється від контрольних і має місце зростання їхньої кількості зі збільшенням дози речовини, що випробовується.

Основна складність виникає при обліку граничних ефектів. Виходячи з цього, нами було проведено порівняльний статистичний аналіз власних первинних експериментальних даних двома методами - за Даннетом і за критерієм Стьюдента з наступним виявленням розбіжностей статистично значимих розходжень між дослідними і контрольними значеннями.

Першим етапом цього аналізу було зіставлення перевищення кількості ревертантів у досліді щодо контролю зі статистично значимими розходженнями дослідних і контрольних значень за Даннетом, тобто, ми спробували установити відсоток псевдопозитивних відповідей, що могли б мати місце, якщо вважати мутагенний ефект установленим тільки за умови статистичних розходжень.

Усього проаналізовано по 352 варіанти відповідей по кожному тест-організму з метаболічною активацією і без активації. Для ТА 98 у варіантах МС+ і МС- виявлено 17,4 % псевдопозитивних результатів. Система метаболічної активації суттєво не впливала на процент псевдопозитивних результатів. Для ТА 100 відсоток псевдопозитивних відповідей склав 32 % без суттєвої різниці для варіантів МС+ і МС- - 30 % і 29 % відповідно. У такий спосіб зрозуміло, що введені обмеження (у вигляді кратності перевищення кількості ревертантів у досліді щодо контролю для ТА 98 у 2 рази, для ТА 100 - у 1,8 рази) при встановленні мутагенних ефектів для мікробної тест-системи є виправданою.

Другим етапом статистичного аналізу було зіставлення статистично значимих мутагенних відповідей за t-критерієм Стьюдента і критерієм Даннета, маючи на увазі, що має місце 100 відсоткова впевненість у тім, що мутагенний ефект для речовини, при відповідній концентрації, установлений, виходячи з вищенаведених перевищень кількості ревертантів у досліді щодо контролю. При аналізі результатів статистичної обробки цими двома методами ми керувалися Методичними рекомендаціями з оцінки мутагенних ефектів у тесті Еймса.

Співставлення результатів математичного аналізу первинних даних за двома методами дає змогу зробити висновок, що метод Даннета дає на 5-10 % менше псевдопозитивних результатів, що є істотним у скринінгу великої кількості хімічних агентів (і їхніх сумішей) на мутагенну активність. Складність розрахунків, що передбачається при статистичному аналізі за Даннетом, окупається більш точним кінцевим результатом і дозволяє уникнути непотрібних (і, найчастіше, досить дорогих) експериментальних досліджень.

ВИСНОВКИ

Проведений в дисертаційній роботі аналіз і узагальнення отриманих експериментальних даних трьох груп косметичних засобів і їхніх найпоширеніших інгредієнтів дозволив встановити потенційну мутагенну/канцерогенну небезпеку переважної більшості відтінкових бальзамів і стійких крем-фарб для волосся, а також барвників та модифікаторів кольору - компонентів перманентних фарб.

1. Мутагенна активність стійких фарб для волосся обумовлена чотирма причинами: а) наявністю в їхніх рецептурах інгредієнтів, здатних індукувати генні мутації (барвників/модифікаторів кольору); б) утворенням (у процесі заводського виробництва) хімічних сполук з невідомими біологічними властивостями (фарбувальні компоненти фарб); в) утворенням у процесі підготовки фарби (додавання у фарбу пероксиду водню безпосередньо перед застосуванням) складного комплексу хімічних сполук з невідомими біологічними властивостями (стійкі крем-фарби); г) метаболізмом in vitro перерахованих у п.п. а), б) і в) варіантів.

2. Генетична активність усіх тестованих косметичних засобів здійснювалась за двома механізмами дії: заміна пар нуклеотидних основ і зсув рамки зчитування генетичного коду.

3. 16 з 17 відтінкових бальзамів індукували frameshift-мутації; 11 з 17 - заміни пар нуклеотидних основ; найбільший мутагенний ефект “середньої” сили був виявлений для бальзамів трьох тонів - “Червоне дерево”, “Чорний” і “Каштановий” із кратністю перевищення кількості ревертантів у досліді щодо контролю від 11,8 (“Каштановий”) до 17,7 (“Червоне дерево”) з явно вираженим ефектом метаболічної активації; бальзами двох тонів (“Русявий” і “Коричневий”) показали граничний між “середнім” і “слабким” ефекти (кратність перевищення кількості колоній у досліді щодо контролю склала 9,9); бальзам тону “Бургунд” виявився генетично інертним, інші - класичні “слабкі” мутагени (кратність перевищення кількості колоній у досліді склала від 2,5 до 7,7).

4. Генетична активність стійких крем-фарб розподілилася в такий спосіб: а) тон “Світло-русявий” не виявив здатності індукувати генні мутації; б) 9 - “слабкі” мутагени відносно обох тест-штамів (кратність перевищення контрольних значень - від 4,1 (тон “Русявий”) до 9,8 (тон “Червоне дерево”) з достовірним ефектом метаболічної активації; в) 13 - мутагени “середньої” сили на тест-штамі ТА 98 (перевищення кількості ревертантів у досліді від 22,7 до 10,5 для тонів “Коричневий” і “Каштановий” відповідно) з достовірним ефектом метаболічної активації.

5. Генетична активність барвників та модифікаторів кольору розподілилась наступнім чином: а) парафенілендіамін і б-нафтол - ярко-виражені frameshift-мутагени “середньої сили” (Хд./Хк., МС+ - 20,3 і 19,3 відповідно); б) фуксин - мутаген “середньої” сили за двома механізмами дії (кратність перевищення контрольних значень складала 17,0 для ТА 98 і 13,2 для ТА 100 відповідно) з ефектом метаболічної активації); в) метаамінофенол і 2,5-діамінотолуілен сульфат “середні” непрямі frameshift мутагени (Хд./Хк.=15,0 і 11,6 відповідно) і “слабкі” непрямі мутагени для ТА 100 (Хд./Хк. = 7,2 і 4,9 відповідно); д) резорцин не виявив здатності індукувати генні мутації; інші інгредієнти: 2-нітро-1,4-фенілендіамін, 2,4-толуілендіамін і метафенілендіамін - “cлабкі” мутагени зі статистично значимим ефектом метаболічної активації.

6. З 7 ПАР тільки лаурилсульфат натрію і лаурилмірістилполігліколь виявилися “слабкими” мутагенами. Всі тестовані шампуні інертні відносно індукції генних мутацій у Salmonella typhimurium.

7. Крем “З” - слабкий мутаген, ефект якого обумовлений вмістом мутагенних інгредієнтів.

8. Використання в якості альтернативних тест-систем методів з застосуванням мікроорганізмів як найбільш інформативних, економічних і чутливих доцільне при скринінгових дослідженнях багатокомпонентних композицій. Застосування методу Даннета при статистичному аналізі первинних експериментальних даних дає змогу уникнути до 10 % псевдопозитивних результатів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Генетично змінені мікроорганізми - альтернативна тест-система виявлення потенційної мутагенності косметичних засобів і їх компонентів / О.Г. Волощенко, О.В. Раєцька, О.І. Яловенко, О.М. Дуган // Зб. наук. пр. “Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології”. - 2004. -Вип. 5. (58). - С. 19-24 (внесок здобувача: збір і аналіз літератури, написання статті).

2. Яловенко О.І., Дуган О.М. Використання генетично змінених штамів мікроорганізмів при виявленні і оцінці мутагенності продуктів біотехнології /Тези доп. Х конгресу світової федерації Українських лікарських товариств, 26-28 серпня 2004. - Чернівці-Київ-Чікаго, 2004. - С. 72 (внесок здобувача: участь у написанні тез).

3. Альтернативні біологічні системи у токсикологічній оцінці сировини косметичної / О.І. Яловенко, О.І. Волощенко, О.В. Раєцька , О.М. Дуган // В зб. тез ІІ Всеукраїнської науково-практичної конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука”, 6-8 жовтня 2004. - Львів, 2004.- С. 84 (внесок здобувача: участь у написанні тез).

4. Яловенко О.І. Мутагенна активність деяких косметичних засобів у системі гігієнічної оцінки їх небезпеки при альтернативному тестуванні // Зб. тез доп. Науково-практичної конференції “Актуальні питання гігієни та екологічної безпеки України (Перші марзеєвські читання)”, 21-22 квітня 2005. - Київ, 2005. - С. 108-109.

5. Оцінка мутагенної активності окремих інгредієнтів та готових засобів (парфумерних, косметичних, мийних) в альтернативних біологічних тест-системах / О.І. Яловенко, О.В. Раєцька, З.Ю. Майстренко, О.М. Дуган // Довкілля та здоров'я. - 2005. -№ 2 (33). - С. 63-64 (внесок здобувача: проведення експерименту, математична обробка первинних даних, участь у аналізі літератури з даної проблеми, участь у написання статті).

6. Яловенко О.І., Дуган О.М., Бариляк І.Р. Потенційні мутагенні властивості консервантів косметичних засобів // Зб. наук. пр. “Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології”. - 2005. - Вип. 1 (60). - С. 28 - 41 (внесок здобувача: збір літератури, участь у аналізі літератури, написання статті).

7. Потенційна мутагенна дія відтінкових бальзамів на генетично змінені мікроорганізми / О.І. Яловенко, О.М. Жорнік, Л.Б. Орябінська, Л.М. Шинкаренко, О.М. Дуган // Мат. VI національного з'їзду фармацевтів України “Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України”, 28-30 вересня 2005. - 2005, Харків. - С. 384 - 385 (внесок здобувача: участь у написанні тез).

8. Яловенко О.І., Дуган О.М. Деякі аспекти безпечності косметичних засобів // Вісник українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2005. - Т. 3, № 1-2. - С. 187 - 193 (внесок здобувача: збір літературних даних, аналіз, участь у написанні статті).

9. Яловенко О.І., Дуган О.М. Потенційна мутагенна активність барвників для волосся // Зб. наук. пр. “Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології”. - 2005. - Вип. 4 (67). - С. 41-52 (внесок здобувача: збір та аналіз літературних даних, участь у написанні статті).

10. Яловенко О.І., Останіна Н.В., Дуган О.М. Відтінкові бальзами в системі етапного тестування їх потенціальної мутагенної дії на генетично змінених мікроорганізмах // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 6 (39). - С. 60-65. (внесок здобувача: проведення експерименту, математична обробка даних, написання статті).

11. Яловенко О.І., Дуган О.М. Потенційна мутагенна дія інгредієнтів фарб для волосся в альтернативних тест-системах // Зб. наук. пр. “Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології”. - 2006. - Вип. 1. (64). - С. 34-47 (внесок здобувача: проведення експерименту, математична обробка первинних даних, участь у написанні статті).

12. Яловенко О.І. Оцінка біологічної дії стійких фарб для волосся альтернативними тест-системами // Довкілля та здоров'я. - 2006. - № 1 (36). - С. 58-63.

13. Волощенко О.И., Раецкая Е.В., Яловенко Е.И. Специфические биологические свойства шампуней // Мат. Междунар. Симп. “Дни ПАВ и косметики - 2006”, 29-31 мая 2006. - Бахчисарай, 2006 (внесок здобувача: проведення експерименту, аналіз та статистична обробка даних, написання статті).

АНОТАЦІЯ

Яловенко О.І. Генетично змінені штами мікроорганізмів у системі етапної оцінки мутагенної активності косметичних засобів і їхніх інгредієнтів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика (біологічні науки). - Науковий центр радіаційної медицини АМН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено вивченню особливостей індукції генних мутацій у генетично змінених за допомогою генно-інженерних методів мікроорганізмах у системі етапної оцінки мутагенної активності косметичних засобів і їхніх інгредієнтів. Досліджено закономірності прояву здатності відтінкових бальзамів, стійких крем-фарб для волосся і їхніх інгредієнтів, шампунів і їхніх інгредієнтів індукувати генні мутації за різними механізмами мутагенної дії. Встановлено, що деякі з досліджуваних відтінкових бальзамів виявилися як мутагени „середнього” ступеню активності (“Червоне дерево”, “Чорний” і “Каштановий”), властивості яких обумовлені наявністю в їхніх рецептурах речовин, здатних індукувати мутації у тест-систем різного рівня організації. Стійкі крем-фарби (містять фарбувальний і окислювальний компоненти), порівняно з відтінковими бальзами, є більш сильними мутагенами: 13 з 23 вивчених фарб проявили генетичну активність „середньої” сили (“Коричневий”, “Рубін”, “Темно-каштановий”, “Божоле”, “Синьо-чорний”, “Баклажан”, “Синій оксамит”, “Рожеве дерево”, “Вишневий”, “Попелястий”, “Махагон”, “Червоне золото”, “Каштановий”). Система метаболічної активації в деяких випадках була ефективною, що свідчить про наявність у фарбах, що окислюються, як „прямих”, так і „непрямих” мутагенно-активних речовин. У всіх випадках тест-штам ТА 98 був більш чутливим до дії хімічних речовин.

Встановлено, що генетична активність стійких фарб залежить від двох складових: від наявності у складах фарб мутагенів (це в основному барвники та модифікатори кольору) і від створення комплексу хімічних речовин, що утворюються у процесі додавання пероксиду водню перед їх застосуванням.

Показано, що шампуні не володіють мутагенними властивостями, незважаючи на наявність у їхніх рецептурах лаурилсульфату натрію - відомого мутагену.

Ключові слова: відтінкові бальзами, стійкі фарби, барвники, шампуні. поверхнево-активні речовини, мутагенна активність, генні мутації.

АНОТАЦИЯ

Яловенко Е.И. Генетически измененные штаммы микроорганизмов в системе этапной оценки мутагенной активности косметических средств и их ингредиентов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению особенностей индукции генных мутаций генетически измененных с помощью генно-инженерных методов микроорганизмах в системе этапной оценки мутагенной активности косметических средств и их ингредиентов. Исследованы закономерности проявления способности оттеночных бальзамов, стойких крем-красок для волос, шампуней, кремов и их ингредиентов, индуцировать генные мутации по разным механизмам мутагенного действия. Установлено, что 16 из 17 оттеночных бальзамов индуцировали frameshift-мутации; 11 из 17 - мутации замены пар нуклеотидных оснований. Мутагенный эффект “средней” силы был выявлен для бальзамов трех тонов: “Красное дерево”, “Чорный” і “Каштановый”, бальзамы двух тонов (“Русый” и “Коричневый”) показали пограничный между “средним” и “слабым”, остальные 11 - “слабый”. Мутагенная активность бальзамов обусловлена наличием в их рецептурах веществ, способных индуцировать мутации у тест-систем разного уровня организации. Стойкие крем-краски (содержат красящий и окисляющий компоненты) сравнительно с оттеночными бальзамами показали себя более сильными мутагенами: 13 из 23 изученных красок проявили генетическую активность „средней” силы (“Коричневый”, “Рубин”, “Темно-каштановый”, “Божоле”, “Сине-черный”, “Баклажан”, “Синий бархат”, “Розовое дерево”, “Вишневый”, “Пепельный”, “Махагон”, “Красное золото”, “Каштановый”). Система метаболической активации в некоторых случаях была эффективной, что свидетельствует о наличии в перманентных красках, как „прямых”, так и „непрямых” мутагенно-активных веществ. Во всех случаях тест-штамм ТА 98 был более чувствительным к действию химических веществ. Генетическая активность стойких красок обусловлена: а) наличием в их рецептурах ингре...