Преимущества биотрансформации стероидов перед химическими методами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный

исследовательский университет»

Кафедра фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА ПО БИОТЕХНОЛОГИИ

Вариант № 7.

Выполнил:

студентка группы фармацевтического факультета

заочной формы обучения

Беляковой Елены

Белгород 2014г.

План:

Аэробные процессы с полным и неполным окислением

Преимущества биотрансформации стероидов перед химическими методами

Поверхностное культивирование. Недостатки метода

Поддержание оптимальной температуры в ферментере. Проблемы и способы термостатирования

Каллусная культура. Особенности физиологии каллусных клеток

Направленный мутагенез

Антисмысловые олиглнуклеотиды. Способы защиты препаратов на основе антисмысловых олиглнуклеотидов от разрушения внутриклеточными нуклеазами

Фармакогеномика и фармакотерапия. Новые подходы к клиническим испытаниям лекарств

Задача

Список используемой литературы

Аэробные процессы с полным и неполным окислением

Аэробные процессы - это процессы, протекающие при достаточном поступлении кислорода.

Аэробный процесс состоит из трех этапов:

* Гликолиз

* Цикл Кребса

* Дыхательная цепь 

Гликолиз - сначала один за другим идут этапы распада глюкозы до пировиноградной кислоты, идентичные тем, которые происходят в цитоплазме при анаэробном гликолизе. Если достаточно кислорода, пировиноградная кислота входит в митохондрию и не превращается в молочную кислоту. Митохондрии для начала процесса расщепления пирувата необходимо наличие кислорода, при этом сохраняется высокий уровень молекул АТФ. Пировиноградная кислота превращается внутри митохондрии в вещество ацетил, к которому присоединяются ко-ферменты [1,5].

Цикл Кребса - серия ферментативных реакций (химических реакций), которая расщепляет ацетил и в конечном итоге мы получаем 2 молекулы АТФ. Продукты распада жиров и белков могут также входить в цикл Кребса и загружать АТФ. Результатом процессов цикла Кребса являются 6 молекул СО2 и молекулы рецепторов свободного водорода Н. Эти молекулы переносят атомы водорода в следующий этап - дыхательную цепь.

аэробный культивирование ферментер каллусный



Рис.1 Гликолиз



Рис.2 Цикл Кребпа

Дыхательная цепь - рецепторы водорода переносят молекулы водорода на так называемых электронных перевозчиках. При этом электроны атомов Н перескакивают с одного перевозчика на другой, и таким образом создаваемое действие имеет цепной характер. В моменты переходов образуется большое количество энергии, пригодное для зарядки АТФ [7,14].

Чтобы электроны могли продолжать подобные перемещения с помощью электронных перевозчиков, образуется электронная цепь, и здесь основную роль играет кислород. Кислород забирает последний электрон в цепочке (дыхательной цепи). 32 молекулы АТФ заряжаются в результате этого процесса. Параллельно образуются 6 молекул воды H2O [5,11].

Таким образом, в результате процесса образуется 36 заряженных молекул АТФ, 6 молекул углекислого газа CO2 и 6 молекул воды H2O.



Рис.3 Дыхательная цепь

Все аэробные процессы окисления, протекающие в клетках, можно разделить на две группы:

а) Завершающиеся неполным окислением субстрата

б) Завершающиеся полным окислением (до СО₂ и Н₂О)

Наиболее распространенная схема полного окисления глюкозы и других углеводов включает в себя расщепление глюкозы до 2 молекул ПВК, их окислительное декарбоксилирование до 2 молекул ацетил-КоА и полное их окисление в цикле Кребса (цикле трикарбоновых кислот, ЦТК). Суммарно процесс можно представить следующим уравнением:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ 6CO₂ + 6H₂O + 38 АТФ

По похожей схеме (через образование ацетил-КоА) протекает полное окисление органических кислот, углеводородов, глицерина, ряда аминокислот.

При неполном окислении процесс останавливается на стадии образования какого-нибудь промежуточного соединения (чаще всего кислоты) [4,18].

Для получения целевых продуктов в аэробных процессах используют два основных подхода:

а) Если целевой продукт является конечным продуктом неполного окисления, то стараются создать оптимальные условия для его максимального и быстрого накопления (подбор значений рН, температуры, концентрации питательных веществ, добавление активаторов ферментов, отвечающих за синтез продукта, отвод, удаление избыточных количеств продукта) [3,15].

б) Если целевой продукт является промежуточным метаболитом (кислоты цикла Кребса), то в любой момент времени его концентрация в клетке ничтожно мала. Чтобы обеспечить его сверхсинтез и накопление проводят целенаправленное вмешательство в нормальный процесс метаболизма, заключающееся в избирательном блокировании (ингибировании) одной или нескольких последующих стадий превращения этого целевого продукта. При этом в клетках обязательно должны функционировать альтернативные механизмы ресинтеза некоторых, ключевых жизненно важных промежуточных метаболитов, например щавелевоуксусной кислоты для ЦТК. Часто, для уменьшения эффекта ретроингибирования, целевой продукт стараются вывести из клеток, например, за счет увеличения проницаемости клеточных оболочек или из культуральной жидкости (высаждение в осадок, удаление в виде газа) [3,6].

Процессы с неполным окислением.

Классическими примерами таких процессов, нашедших применение в биотехнологии являются процессы получения уксусной, глюконовой и итаконовой кислот.

1. Получение уксусной кислоты и столового уксуса.

Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в частичном окислении этанола до уксусной кислоты при участии бактерий штаммов Acetobacter и Gluconobacter иммобилизованных (закрепленных) на различных носителях (буковая стружка). Таким способом в настоящее время получаю только пищевой уксус [6].

Техническую уксусную кислоту получают химическим способом по реакции Кучерова или сухой перегонкой древесины [1,5,12].

2. Получение глюконовой кислоты.

3.Получение итаконовой кислоты

Итаконовая кислота является ценным сырьем для для производства химических волокон и пластмасс [6,13].

Процессы с полным окислением

1. Получение лимонной кислоты.

Рассмотрим кратко производство органических кислот на примере получения лимонной кислоты. Эта кислота является интермедиатом в цикле Кребса и поэтому концентрация ее в клетках очень незначительна. Следовательно, чтобы получать лимонную кислоту в больших количествах необходимо нарушить нормальное функционирование цикла Кребса в клетке, блокировав процесс ее превращения в изолимонную кислоту. Тем самым мы предотвращаем полное окисление питательного субстрата до СО₂ и Н₂О и бурный рост биомассы продуцента. Оставшись на "голодном пайке" клетки продуцента для поддержания жизнедеятельности вынуждены интенсивно метаболизировать субстрат, что и приводит к сверхсинтезу лимонной кислоты.

Рассмотрим схему синтеза лимонной кислоты.

Лимонная кислота образуется в цикле Кребса в результате конденсации щавелевоуксусной кислоты и ацетил-КоА, катализируемой ферментом цитрат-синтазой. Для того чтобы обеспечить накопление избыточных количеств лимонной кислоты необходимо заблокировать процесс ее дальнейшего превращения в следующие кислоты цикла Кребса.

Механизм ингибирования превращения лимонной кислоты в этом процессе заключается в подавлении активности ферментов аконитазы и изоцитратдегидрогеназы в специфических условиях культивирования. Аконитаза-фермент-ферропротеид: для ее активации необходим ион Fе^+2. Поэтому процесс культивирования проводят в средах бедных ионом Fе⁺². При этом накапливающаяся в Fe⁺²-дефицитных клетках перекись водорода дополнительно ингибирует этот фермент. В среду культивирования так же добавляют гексацианоферрат калия, который, как было показано, является ингибитором другого фермента изоцитратдегидрогеназы. Кроме того, активность обоих ферментов угнетается при низких значениях рН, т.е. при накоплении кислоты в клетке. Низкое значения рН помимо ингибирования ферментов подавляет так же и развитие посторонней микрофлоры и обеспечивает асептические условия процесса [3,15,19].

Необходимая для синтеза щавелевоуксусная кислота при нормальном функционировании цикла Кребса присутствует в нем и регенерируется в конце каждого цикла. В условиях синтеза лимонной кислоты цикл Кребса блокирован и поэтому наряду с ацетил - КоА необходим постоянный подвод и щавелевоуксусной кислоты. Необходимые для реакции ацетил-КоА и щавелевоуксусная кислота образуются в клетках из двух молекул пирувата: при этом одна молекула пирувата декарбоксилируется с образованием ацетил-КоА, а вторая карбоксилируется, давая щавелевоуксусную кислоту. Пируват образуется по классическому фруктозобисфосфатному пути (гликолиз) [3,7,17].

В качестве продуцента лимонной кислоты чаще всего используют A.niger.

2. Получение кетокислот (пировиноградной и кетоглутаровой).

Как известно тиамин (витамин В₁) в форме пирофосфатного производного является простетической группой ферментов, осуществляющих реакции расщепления и синтеза углерод-углеродных связей, находящихся между карбоксильной и карбонильной группами в молекулах б-кетокислот. Примерами таких процессов являются реакции окислительного декарбоксилирования ПВК и б-кетоглутаровой кислоты в цикле Кребса.

Большинство природных микроорганизмов способны самостоятельно синтезировать всю молекулу тиамина, однако методом мутагенеза и селекции получены виды неспособные к этому - тиамингетеротрофы или более правильно тиаминауксотрофы, нуждающиеся в добавлении тиамина к питательным средам.

При этом в зависимости от субстрата, на котором проводится культивирование, дефицит тиамина по-разному отражается на обмене веществ у тиамингетеротрофов, поскольку может происходить избирательное блокирование тех или иных процессов карбоксилирования и декарбоксилирования [4,12].

Так, при окислении глюкозы тиамингетеротрофными дрожжами рода Candida промежуточным продуктом ее превращения в ацетил-КоА является пировиноградная кислота, окислительное декарбоксилирование которой осуществляется полиферментным комплексом, включающим ТПФ-зависимую Пируватдекарбоксилазу [3].

Дрожжи, выращиваемые на глюкозной среде с дефицитом по тиамину, не могут нормально осуществлять реакцию декарбоксилирования ПВК, что приводит к торможению или блокированию образования ацетил-КоА. Следствием дефицита тиамина является выделение ПВК в культуральную среду, нарушение функционирования цикла Кребса, снижение биосинтетических процессов в клетке, приводящее к прекращению роста культуры.

При росте на среде с н-алканами ацетил - КоА образуется в результате в-окисления алифатических жирных кислот, образующихся из н-алканов, минуя стадию образования ПВК. Если в культуральной среде создается лимит по тиамину, то процессы окисления в цикле Кребса прекращаются на стадии образования б-кетоглутаровой кислоты. Это связано с тем, что блокируется функционирование другого тиаминзависимого ферментного комплекса - б-кетоглутаратдегидрогеназы, катализирующей окислительное декарбоксилиро-вание б-кетоглутаровой кислоты и образование сукцинил-КоА. Следствием дефицита тиамина является накопление б-кетоглутаровой кислоты в клетке, ее выделение в среду и замедление роста клеток. Однако зависимость клеток от тиамина в данном случае гораздо меньше. Даже при глубоком дефиците тиамина в среде - 3-4 ·10^-4 мкг/мл, что соответствует его содержанию в водопроводной воде - дрожжи растут и выделяют в среду б-кетоглутаровую кислоту до полного потребления н-алканов. Это объясняется тем, что в клетках часть молекул ацетил-КоА метаболизируется по глиоксилатному циклу. Глиоксилатный цикл позволяет клетке не только получать энергию (АТФ), и самое главное, обеспечивает расширенный ресинтез (2 молекулы на цикл) щавелевоуксусной кислоты, восполняя ее утечку с б-кетоглутаровой кислотой из ЦТК [5,11].

б-Кетоглутаровая кислота - ценный химический реагент, используемый для производства глутаминовой кислоты и некоторых гетероциклических соединений. Промышленное производство б-кетоглутаровой кислоты микробиологическим путем налажено во многих странах.



Преимущества биотрансформации стероидов перед химическими методами

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них. Процессы биотрансформации это составные части метаболизма.

В последние годы высокая специфичность процессов биотрансформации и эффективность иммобилизованных ферментов нашли широкое применение для крупномасштабного производства аминокислот, антибиотиков, стероидов и других промышленно важных продуктов. В процессе биотрансформации в организме человека образовываются метаболиты, которые в дальнейшем либо используют для медицинских и фармацевтических целей, либо подвергают окончательной биотрансформации. Метаболимты-- продукты метаболизма каких-либо соединений. Метаболиты бывают первичными, вторичными, промежуточными (подвергающимися дальнейшим биотрансформациям) и конечными, не подвергающимися дальнейшей биотрансформации и экскретируемыми из организма с мочой, калом, потом, выдыхаемым воздухом и др [1,6,9].

Первичными метаболитами называют молекулы, присутствующие во всех клетках организма и необходимые для жизнедеятельности. Они делятся на четыре категории:

· Углеводы

· Белки

· Липиды

· Нуклеиновые кислоты

Вторичные метаболиты -- молекулы, встречающиеся не во всех клетках и не у всех видов живых организмов. Стероиды являются вторичными метаболитами.

Принципы получения вторичных метаболитов основаны на особенностях их образования клетками микроорганизмов. Биосинтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их еще называют идиолитами [4].

Прогестерон

Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Использование абсолютной субстратной специфичности и стереоспецифичности биологических катализаторов, присущих целым клеткам микроорганизмов, позволило разработать условия осуществления множества химических реакций для структурных перестроек стероидов [4].

11-а-Гидроксипрогестерон

В результате были получены новые соединения с лучшими фармакологическими свойствами. Биотрансформация стероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-а-гидроксилирование) прогестерона [13,17].

Значимость разработанной микробной трансформации определяется тем, что процессы гидроксилирования кортикостерона и его производных лежат в основе промышленного получения многих ценных продуктов: противовоспалительных и противоопухолевых препаратов, трансквилизаторов, анестезирующих средств, половых гормонов и пр. Так, производство в промышленном масштабе важнейшего противовоспалительного препарата -- преднизолона -- осуществля ется путем микробного гидроксилирования кортикостерона (см. схему ниже).

Правильность преобразования стероидного субстрата контролируют, сочетая химический подход со специфичностью биологической системы. Например, образование уксуснокислого эфира по С-17-субстрата стереохимически препятствует другим побочным реакциям [6].

Важнейший источник стероидных гормонов -- культура клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) корневого происхождения продуцирует фи- тостерин диосгенин и его гликозидные производиые (сапонины). Существенно, что способность к сверхсинтезу фуростаноловых гли- козидов ряда штаммов диоскореи, например штамма ДМ-ОГ, стабильно поддерживалась в течение 27 лет (Р. Г. Бутенко, 1999). Таким образом, культивирование клеток растений in vitro представляет собой новое решение проблемы промышленного получения вторичных метаболитов.

Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток, использованием оптимального сочетания биологических и химических превращений, а также с совершенствованием технологии очистки получаемых соединений. Среды для биотрансформации имеют достаточно сложный состав, а реакция требует строгого контроля за каждым ее параметром (рН, время и т.д.). Так, среда для осуществления реакции окисления кортизола в пред- низолон культурой клеток Arthrobacter simplex включает пептон, глюкозу и кукурузный экстракт. Через сутки к смеси добавляют вещество S Рейхш- тейна. Процесс ведут строго в нейтральной среде при температуре 28 °С в течение 120 ч. Выход преднизолона составляет 93 % [4,18].

Разработка крупномасштабного производства преднизолона путем биотрансформации стероидов позволила снизить стоимость этого препарата в 200 раз [13].

Если говорить о химических преобразованиях стероидов, то большим минусом в данном вопросе является то что химическим путем невозможно преобразование определенных структур стероидов для получения необходимых веществ широкого применения т.е. процесс бесполезен. Так селективность действия микробных ферментов позволяет восстановить определенную кето-группу стероидов (химическим путем это невозможно). В синтезе стероидов эта особенность микроорганизмов используется очень широко, например, для восстановления 14а- или 17 (3-кетогрупп) секостероидов ряда эстрана:

Данным примером подтверждаются преимущества биотрасформации стероидов перед химическими методами, которые либо не применимы для медицины либо имеют не совершенный механизм и конечный результат невозможно применить [3,17].

Поверхностное культивирование. Недостатки метода

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И.Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорганизмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постенном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха [5].

Культивирование микроорганизмов на твердых питательных средах -поверхностное культивирование) приблизительно можно представить в виде следующей последовательности технологических операций. Предварительно простерилизованный и измельченный твердый питательный субстрат засевается выращенной в отделении «чистой культуры» заводской лаборатории культурой соответствующего микроорганизма. Далее среду с посевным материалом направляют в раздаточное устройство где с помощью механических дозаторов осуществляется загрузка кювет (лотков) для выращивания. Перед загрузкой кюветы тщательно моют и стерилизуют острым паром. Загруженные кюветы помещают в специальные растительные камеры, где для нормального роста культур микроорганизмов поддерживаются соответствующие условия [11].

В качестве субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, как правило, нестандартное сырье - различные отходы пищевой промышленности. Среди них наиболее часто используют пшеничные отруби, свекловичный жом, проросшие ячменные зерна (солод), шелуха от некоторых сельско- хозяйственных культур (риса, гречихи, подсолнуха). В качестве разрыхлителя субстрата часто используют древесные опилки. Все эти виды субстратов отличает низкое содержание азотсодержащих веществ, поэтому в качестве добавок к ним добавляют такие азотсодержащие соли, как сульфат аммония и различные добавки микроэлементов и ростовых факторов [11].

Перед использованием готовый субстрат подвергают тщательной стерилизации, чтобы обеспечить максимально возможное подавление посторонней микрофлоры. Микробиологический контроль при этом обычно ведут по наличию спор бактерий, так как именно они наиболее устойчивы к различным методам стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С). Однако это часто приводит к комкованию среды, что резко ухудшает процесс стерилизации таких комков на всю глубину, и кроме того, этот процесс является весьма длительным, энерго- и материалоемким. Поэтому на ряде производств в последнее время стали использовать для стерилизации принципиально другие методы, например уничтожение микроорганизмов г- или рентгеновскими лучами [14].

Выращенный в отделении «чистой» культуры посевной материал перед засевом подвергают микробиологическому и биохимическому контролю на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие его паспортным технологическим данным. Посевной материал считается пригодным для засева основных аппаратов, если он обеспечивает при нормальной длительности культивирования на производственной среде необходимое по паспорту накопление целевого продукта или нужную ферментативную активность.

Поскольку практически все продуценты культивируемые поверхностным способом являются аэробами, то им для дыхания необходим интенсивный подвод воздуха [7].

Очистка используемого воздуха и его стерилизация осуществляется с использованием волокнистых фильтрах. Перед растительными камерами всегда устанавливают кондиционеры для поддержания необходимой температуры и влажности. В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его достигает значительной величины. Поэтому практически любая технологическая схема подготовки и циркуляции воздушного потока предусматривает его рецикл, в котором участвует до 90% воздуха. При этом циркулирующий воздух проходит через воздухоохладитель, а часть отработанного воздуха очищается на фильтрах от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу [3].

Проблема регулирования теплообмена в процессе культивирования имеет не менее важное значение, чем обеспечение подвода воздуха. В ходе своего роста большинство культур выделяют значительное количество тепла. В то же время известно, что уже при температуре 38-40 С наступает угнетение вегетативного развития многих культур, а при 43-45 С может происходить полная инактивация их ферментных систем. Проблема усложняется тем, что выделение тепла в течение всего периода культивирования происходит неравномерно. В начале культивирования выделение тепла обычно в 10-20 раз больше чем в конце процесса. Поэтому необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла.

Решение проблемы теплообмена существенно упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования происходит и потребление кислорода (воздуха), при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения. В конце культивирования потребление кислорода становится минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла [3].

В процессе культивирования наблюдается непрерывное снижение влаги в твердом субстрате. В начале процесса влажность питательной среды достигает 58-60%, к моменту окончания процесса эта величина может снизиться до уровня 30%. Это отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и как следствие на выходе целевого продукта. Поэтому для производственных условий важно в течении всего времени культивирования поддерживать величину влагосодержания на уровне не ниже 55-50%, что достигается предварительным увлажнением (кондиционированием) воздуха, подаваемого в растительные камеры [15].

Способы поверхностного культивирования

В современном производстве используются, в основном, три способа поверхностного культивирования микроорганизмов: кюветный способ выращивания, кассетный способ выращивания и выращивание методом объемной аэрации.

Кюветный способ является наиболее распространенным, особенно в малотоннажных производствах. Лотки-кюветы после загрузки субстрата, засеянного соответствующей культурой микроорганизма, помещаются на стеллажи в специальные растительные камеры в которых поддерживаются все необходимые для культивирования условия. Такой процесс является малопроизводительным и весьма трудоемким, поскольку большинство технологических операций по загрузке и выгрузке выполняются вручную.

С целью интенсификации процессов кюветного выращивания разрабатываются конструкции растительных камер в которых кюветы по бесконечной конвейерной ленте движутся через различные зоны растительной камеры, в которых поддерживаются условия (теплообмен, воздухообмен, влажность и др.) соответствующие тем или иным стадиям роста микроорганизма. После прохождения камеры кюветы проходят отделения сушки, съема готовой культуры, мойки, стерилизации и снова подаются на загрузку [12].

Кассетный способ выращивания продуцента осуществляется в специальных растительных камерах, имеющих форму параллелепипеда. Камера разделена на 23 секции-касcеты перфорированными перегородками с двойными стенками, между которыми подается стерильный воздух. В пространство между перегородками загружают сверху засеянную питательную среду. Днище кассеты состоит из двух жалюзийных пластин. Стерильный воздух подводится к каждой из секций с помощью коллектора [12,16].

По окончании процесса культивирования камеру разгружают путем открытия жалюзийных пластин днища камеры. Полнота разгрузки камеры обеспечивается путем установки ее на специальный вибростол.

Касcетный способ выращивания позволяет вдвое увеличить толщину слоя субстрата, по сравнению с кюветным, благодаря двустороннему обдуву его потоком воздуха, что ведет к повышению эффективности процесса поверхностного культивирования [12,15].

Процесс культивирования методом объемной аэрации проводят в специальных колонных аппаратах, разделенных по высоте на секции перфорированными пластинами, укрепленными на поворотных осях. Воздух с помощью коллектора подают под каждую секцию аппарата, а выделяющееся в ходе ферментации тепло отводят охлаждающей водой, подаваемой в наружную рубашку аппарата. Питательная среда дополни-тельно перемешивается и распределяется по тарелкам с помощью установленных по центру аппарата на общем валу перемешивающих устройств. Загрузка аппарата осуществляется сверху, а выгрузка через днище. При этом перегрузка среды с тарелки на тарелку и выгрузка осуществляется в результате поворота сегментных частей тарелок на угол 90 в автоматическом режиме.

Выделение и очистка целевых продуктов

По окончании процесса культивирования необходимо выделить целевой продукт, отделив его от биомассы микроорганизма и частичек субстрата. Если целевыми продуктами являются простые органические соединения (кислоты. витамины, антибиотики и др.) то для их выделения применимы большинство стандартных методов используемых в химической и фармацевтической промышленности. При этом обычно сначала субстрат с выросшей на нем биомассой измельчают, если надо сушат, и подвергают экстракции соответствующим растворителем. Растворитель упаривают и далее в зависимости от физико-химических свойств продукта его дополнительно очищают тем или иным способом (перегонка, возгонка, перекристаллизация, хроматографическое разделение и др.). Наиболее трудоемкой и экологически вредной является процедура измельчения частиц твердого субстрата, которая требует использования громоздких и энергоемких аппаратов дробилок и сопровождается образованием большого количества алергенной пыли.

Если целевым продуктом являются белковые соединения (ферменты), то выбор методов и режимов выделения более ограничен. Это связано с тем, что ферменты, являясь веществами белковой природы, могут легко подвергаться денатурации под воздействием таких факторов, как высокие (выше 70⁰С) и низкие (ниже 0⁰С) температуры, значения рН среды, не отвечающее оптимуму действия ферментов, наличие реакционно-способных химических соединений, способных вступать в реакции и необратимо инактивировать ферменты. Более подробно технология выделении ферментных препаратов приведена в методическом указании “Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств” [4,12].

Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях. Однако среда, кюветы, подаваемый воздух и все оборудование должны быть надежно стерилизованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь. Перед посеем проводится огромное количество анализов. А так же большой проблемой является обеспечение процесса постоянным потоком воздуха и регулирование теплообмена.

Поддержание оптимальной температуры в ферментере. Проблемы и способы термостатирования

Ферментер (биореактор) - аппарат, ферментационная система, для проведения биотехнологических процессов, основной целью которого является обеспечение оптимальных условий для проведения процесса. Ключевое средство производства в биотехнологической промышленности.

Обеспечение оптимальной температуры процесса культивирования является одной из самых сложных и ответственных технических проблем. На практике теплоотвод связан с большими капиталовложениями и необходимостью строительства сложных систем оборотного водоснабжения, теплообменных устройств в ферментерах, а иногда и дополнительных холодильных установок. Затраты на теплоотвод соизмеримы с затратами на обеспечение клеток кислородом (аэрирование, перемешивание) и поэтому они могут быть решающими при выборе конструкции ферментера [14].

Проблема обусловлена следующими причинами:

а) низким коэффициентом теплопередачи (малой теплопроводностью) клеточной стенки, и как следствие малоинтенсивной теплоотдачей со стороны микробной суспензии, а также с образованием отложений клеток на внешней стороне охлаждающих элементов. Малый коэффициент теплопередачи объясняется так же практически ламинарным обтеканиием вязкой микробной суспензией поверхности охлаждающих элементов [4,19];

б) небольшой величиной движущей силы теплопереноса, т.е. перепада температур между охлаждающей водой (в летнее время 26-28 С) и микробной суспензией (обычно 32-34 С);

в) необходимость отводить не только тепло, выделяющееся при жизне- деятельности микроорганизмов, но и все тепло, которое выделяется при работе перемешивающих устройств за счет трения слоев жидкости друг о друга и о стенки и внутренние узлы аппарата.

В зависимости от тепловой нагрузки для отвода тепла используют поверхность корпуса аппарата (тепловые рубашки) или встроенные внутрь аппарата теплообменники змеевикового типа. Наилучшим решением проблемы является использование выносных теплообменников (кожухотрубных, пластинчатых), располагаемых на внешних циркуляционных трубах, если такие имеются [11].

При использовании встроенных теплообменников очень важно правильно выбрать место их размещения, чтобы можно было обеспечить интенсивный циркуляционный поток жидкости. Всегда необходимо помнить, что встроенные теплообменники повышают вероятность инфицирования ферментеров (дополнительные “слабые” точки), ухудшают гидродинамический режим, уменьшают полезный объем, усложняют их промывку, стерилизацию и ремонт [13].

Каллусная культура. Особенности физиологии каллусных клеток

В биотехнологии каллусом называют недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными (способность клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма) и способными поэтому, дать начало целому растению. Являются объектом генетической инженерии. В биологии растений каллусом называют также клетки, образующиеся на раневой поверхности растения в виде опробковевающей ткани, которая возникает в результате деления пограничных с раной клеток^. Каллусная ткань способствует зарастанию ран, срастанию прививок и т. д. Калуссная культура получается путем культивирования на поверхности твердой агаризированной питательной среды или на поверхности твердых носителей, помещенных в питательную среду [4,13].

Классическая каллусная культура, выращиваемая поверхностным способом, (первичный каллус) представляет собой аморфную, рыхлую массу сильно оводненных дедифференцированных клеток, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. Такая рыхлая каллусная ткань легко распадается на небольшие группы клеток и кластеры и поэтому может быть использована для получения суспензионной культуры. Под влиянием фитогормонов клетки первичного каллуса могут претерпевать процессы вторичной (обратно) дифференцировки и органогенеза, что существенно сказывается на внешнем виде и консистенции (плотности) каллуса. Так каллусная культура средней плотности уже характеризуется хорошо выраженными меристематическими очагами. В ней легко инициируются процессы органогенеза. Наконец, у плотных каллусных тканей различают зоны редуцированного камбия и трахеидоподобных элементов, которые могут дать начало целым растениям [17].

В естественных условиях каллусная ткань может возникнуть у растений в результате механических повреждений. Она функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса [11].

Вообщем физиология каллус клеток не имеет значительных отличий от друх культур клеток. Основной особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрасту. В каллусной ткани одновременно присутствуют клетки молодые в G1-фазе, старые в G2- и S-фазах цикла клеточных делений. Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене каллусных клеток . Они потребляют меньше кислорода [15].

Направленный мутагенез

Мутагенез -- это внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Различают естественный (спонтанный) и искусственный (индуцированный) мутагенез.

В свою очередь вышеуказанные виды мутагенеза делется следующим образом:

1. Естественный мутагенез

· 1.1 Мутационная теория Х. Де Фриза и С. И. Коржинского

· 1.2 Механизм мутагенеза

· 1.3 Точечные мутации

· 1.4 Хромосомные мутации

· 1.5 Геномные мутации

· 1.6 Ядерные и цитоплазматические мутации

2. Искусственный мутагенез

· 2.1 Ненаправленный мутагенез

· 2.2 Направленный мутагенез

o 2.2.1 Мутагенез по Кункелю

o 2.2.2 Мутагенез с помощью ПЦР

Направленный мутагенез (site-directed (directed) mutagenesis) - Индукция in vitro мутации в конкретном сайте клонированной последовательности ДНК. Метод направленного мутагенеза позволяет идентифицировать функционально значимые участки в молекулах белков и нуклеиновых кислот, а также получать белки и ферменты с измененными свойствами (например, повышенной термостабильностью) [14].

Антисмысловые олигонуклеотиды. Способы защиты препаратов на основе антисмысловых олиглнуклеотидов от разрушения внутриклеточными нуклеазами

Нуклеотимды -- фосфорные эфиры нуклеозидов, нуклеозидфосфаты. Свободные нуклеотиды, в частности АТФ, цАМФ, АДФ, играют важную роль в энергетических и информационных внутриклеточных процессах, а также являются составляющими частями нуклеиновых кислот и многих коферментов.

Соединения, состоящие из двух нуклеотидовых молекул, называются динуклеотидами, из трёх -- тринуклеотидами, из небольшого числа -- олигонуклеотидами , а из многих -- полинуклеотидами, или нуклеиновыми кислотами [4].

Морфолино (англ. Morpholino) -- синтетические олигонуклеотиды, применяемые в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Антисмысловые олигомерные морфолино используются для блокировки доступа других молекул к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют небольшие одноцепочечные участки (около 25 нуклеотидов) на поверхности молекул РНК [11].

В большинстве протоколов генной терапии ex vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, которые не синтезируются в организме больного или синтезируются в дефектной форме. Однако многие заболевания человека ( рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические системы с использованием олигонуклеотидов. Небольшой олигонуклеотид может гибридизироватся со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции и трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид который гибридизируется с самим геном и блокирует его транскрипцию называется «антигенным», а тот который гибридизируется с самой м РНК - «антисмысловым» [3].

Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой длинные последовательности нуклеотидов ДНК в хромосомах. Если какой-то ген должен экспрессироваться, то запускается процесс транскрипции этого гена, в результате которого синтезируется мРНК.

Терапевтический эффект синтетических антисмысловых олигонуклеотидов зависит от спецефичности их гибридизации с доступным сайтом м РНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличию системы доставки в клетку [12].

На сегодняшний день наиболее эффективное адресное направленное выключение активности определённых участков генома осуществляется антисмысловыми олигонуклеотидами (АОН). Стратегия использования АОН основана на уотсон-криковском взаимодействии молекул ДНК с М-РНК-мишеныо. Образование гетеродуплекса ДНК-МРНК приводит к инактивации М-РНК и последующей остановке синтеза белка.

Иными словами, под антисмысловым механизмом подразумевается связывание олигонуклеотида с комплементарным участком целевой РНК и подавление внутриклеточной функции данной РНК.

Однако, эта простая и привлекательная теоретическая модель в действительности оказалась значительно сложнее. Известны три типа антисмысловых молекул: относительно короткие синтетические олигонуклеотиды; антисмысловые РНК, экспрессирующиеся в клетке после трансфекции антисмысловым геном рибозимы, обладающие каталитической активностью [16].

Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок. Эта технология дает исследователю возможность направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью. Если какой-то белок способствует росту раковой клетки, то, используя соответствующий антисмысловой олигонуклеотид, можно сделать так, что этот белок больше никогда не будет синтезироваться в клетке. Антисмысловые олигонуклеотиды настолько специфичны, что воздействие на какой-либо другой белок в клетке практически исключено. Такая специфичность обеспечит ослабление побочных эффектов, зачастую наблюдаемых при традиционных способах лечения рака.

Механизм инактивации до сих пор до конца не ясен. Но, возможно, это связано с тем, что двунитевая РНК нехарактерна для нормальных клеток. Так как сигналом для синтеза каждого белка является одна единственная мРНК, то такой сигнал для определенного белка можно выключить или «нокаутировать» с помощью такой комплементарной последовательности [11,19].

Рис.4 Механизм работы антисмыслового олигонуклеотида

Важной проблемой лечения препаратами на основе антисмысловых олигонуклеотидов является разрушение таких лекарственных средств ферментами клеток - нуклеазами. Олигодезоксонуклеотиды разрушаются нуклеазами, поэтому очень важно защитить их от действия последних так, что бы они не утратили способности гибридизации с мишенью. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5'- или З'-конпам мРНК, границам экзонов и интро- нов и даже двухцепочечным областям. Олиго- дезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания и де- зоксирибозу [4].

Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфо- группу, в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК--ДНК-дуплексы, которые активируют ри- бонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов -- лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний [14].

Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями . Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2'-угле- родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.

Фармакогеномика и фармакотерапия. Новые подходы к клиническим испытаниям лекарств

Фармакогеномика -- отрасль фармацевтики и фармакологии, которая исследует влияние генетической вариации каждого человека в его ответе на лекарственное средство. Фармакогеномика связывает экспрессию конкретного гена или однонуклеотидного полиморфизма в геноме человека с эффективностью или токсичностью лекарства, для того, чтобы разработать рациональные средства оптимизации фармакотерапии [11].

Фармакогеномика учитывает генотипы людей для обеспечения максимальной эффективности при минимальных побочных действиях. Подобный подход в будущем может привести к созданию «персонифицированной медицины», в которой лекарственные средства и их сочетания оптимизированы для генетических характеристик конкретного человека. Фармакогеномика -- это прикладное применение всего генома человека, в котором фармакогенетика исследует взаимодействия отдельного гена с лекарствами [1].

Разработки фармакогеномики в настоящее время применяют при лечении рака молочной железы, ВИЧ, лейкемии, для выявления потенциальных побочных реакций в ответ на действие лекарственных препаратов [1].

Фармакотерапия -- лечение лекарственными средствами, или иначе, фармакологическими агентами. Сходное понятие Химиотерапия обозначает фармакотерапию в применении к онкологии. Фармакотерапию относят к консервативным (неинвазивным) методам лечения.

Фармакотерапией также называется раздел фармакологии, изучающий терапию лекарственными препаратами [2].

Перекрест эти двух понятий происходит на уровне человеческого организма. Очень важно знать и понимать зависимость фармакотерапевтического действия лекарственно о средства на организм при индивидуальных генетических вариациях.

Клинические исследования - это один из наиболее важных этапов разработки и внедрения в практику нового лекарства. Они проходят фазы.

Фаза 1: Первые испытания нового активного ингредиента на человеке, часто на здоровых добровольцах, которым обычно платят. Цель -- установить предварительную оценку и «набросок» фармакодинамического/фармакокинетического профиля активного ингредиента у человека.

Фаза 2: На ограниченном числе пациентов (100-300 чел.) из этических соображений. Цель -- показать активность и оценить краткосрочную безопасность активного ингредиента у пациентов с болезнью или состоянием, для которого активный ингредиент предназначен.

Фаза 3: Испытания на больших (и по возможности различных) группах пациентов (1000-3000 человек и более), с целью определить краткосрочный и долгосрочный баланс безопасность/эффективность для лекарственных форм активного ингредиента и для того, чтобы определить его общую и относительную терапевтическую ценность. Должны быть исследованы профиль и разновидности наиболее часто встречающихся побочных реакций и специфические характеристики препаратов. Если результаты положительны, препарат регистрируется и выпускается на рынок.

Фаза 4: «Постмаркетинговые», пострегистрационные испытания. Ознакомление с лекарством врачей и пациентов. Данные продолжают собираться для изучения долгосрочных эффектов, определения новых показаний к использованию. Например, для регистрации нового онкологического препарата, применяемого у безнадежных больных, может быть достаточно данных 2-й фазы, полученных, например, на 150 пациентах. Если хотя бы у половины из них продлилась жизнь, считается, что лекарство эффективно и нужно дать возможность как можно большему числу больных успеть воспользоваться им. Общетерапевтический препарат должен доказать, насколько большему числу пациентов он помогает в отличие от стандартной терапии.

Клинические исследования лекарственного средства являются необходимым этапом разработки любого нового препарата, или расширения показаний для применения лекарственного средства, уже известного врачам. На начальных этапах разработки лекарственных средств проводятся химические, физические, биологические, микробиологические, фармакологические, токсикологические и другие исследования на тканях (in vitro) или на лабораторных животных. Это так называемые доклинические исследования, целью которых является получение научными методами оценок и доказательств эффективности и безопасности лекарственных средств. Однако, эти исследования не могут дать достоверной информации о том, как изучаемые препараты будут действовать у человека, так как организм лабораторных животных отличается от человеческого и по фармакокинетическим характеристикам и по реакции органов и систем на лекарства. Поэтому необходимо проведение клинических испытаний лекарственных средств у человека [1,14,17].

Итак, что такое клиническое исследование (испытание) лекарственного средства? Это системное изучение лекарственного препарата посредством применения его у человека (пациента или здорового добровольца) с целью оценки его безопасности и/или эффективности, а также выявления и/или подтверждения его клинических, фармакологических, фармакодинамических свойств, оценки всасывания, распределения, метаболизма, выведения и/или взаимодействия с другими лекарственными средствами. Решение о начале клинического исследования принимает Спонсор/Заказчик, который несет ответственность за организацию, контроль и/или финансирование исследования. Ответственность за практическое проведение исследования возложена на Исследователя (лицо или группу лиц). Как правило, спонсором являются фармацевтические компании - разработчики лекарственных средств, однако в роли спонсора может выступать и исследователь, если исследование начато по его инициативе и он несет полную ответственность за его проведение.

Клинические исследования должны проводиться в соответствии с основополагающими этическими принципами Хельсинкской Декларации, Правилами GСP (Good Clinical Practice, Надлежащая Клиническая Практика) и действующими нормативными требованиями. До начала клинического исследования должна быть проведена оценка соотношения предвидимого риска с ожидаемой пользой для испытуемого и общества. Во главу угла ставится принцип приоритета прав, безопасности и здоровья испытуемого над интересами науки и общества. Испытуемый может быть включен в исследование только на основании добровольного информированного согласия (ИС), полученного после детального ознакомления с материалами исследования [1,4,11].

Клиническое исследование должно быть научно обосновано, подробно и ясно описано в протоколе исследования. Оценка соотношения рисков и пользы, а также рассмотрение и одобрение протокола исследования и другой документации, связанной с проведением клинических исследований, входят в обязанности Экспертного Совета Организации / Независимого Этического Комитета (ЭСО / НЭК). После получения одобрения от ЭСО/НЭК можно приступать к проведению клинического исследования.

Виды клинических исследований

Пилотное исследование предназначено для получения предварительных данных, важных для планирования дальнейших этапов исследования (определение возможности проведения исследования у большего числа испытуемых, размера выборки в будущем исследовании, необходимой мощности исследования и т.д.).

...