Преимущества биотрансформации стероидов перед химическими методами

Рандомизированное клиническое исследование, в котором пациенты распределяются по группам лечения случайным образом (процедура рандомизации) и имеют одинаковую возможность получить исследуемый или контрольный препарат (препарат сравнения или плацебо). В нерандомизированном исследовании процедура рандомизации не проводится.

Контролируемое (иногда используется синоним «сравнительное») клиническое исследование, в котором исследуемое лекарственное средство, эффективность и безопасность которого до конца еще не изучены, сравнивают с препаратом, эффективность и безопасность которого хорошо известны (препарат сравнения). Это может быть плацебо, стандартная терапия или отсутствие лечения вообще. В неконтролируемом (несравнительном) исследовании группа контроля / сравнения (группа испытуемых, принимающих препарат сравнения) не используется. В более широком смысле под контролируемым исследованием имеется в виду всякое исследование, в котором контролируются (по возможности минимизируются или исключаются) потенциальные источники систематических ошибок (т. е. оно проводится в строгом соответствии с протоколом, мониторируется и т.д.) [3,15].

При проведении параллельных исследований испытуемые в различных группах получают либо только изучаемое лекарственное средство, либо только препарат сравнения / плацебо. В перекрестных исследованиях каждый пациент получает оба сравниваемых препарата, как правило, в случайной последовательности.

Исследование может быть открытым, когда все участники исследования знают, какой препарат получает пациент, и слепым (замаскированным), когда одна (простое слепое исследование) или несколько сторон, принимающих участие в исследовании (двойное слепое, тройное слепое или полное слепое исследование) держатся в неведении относительно распределения пациентов по группам лечения [2,3,15].

Проспективное исследование проводится с делением участников на группы, которые будут или не будут получать исследуемое лекарственное средство, до того, как наступили исходы. В отличие от него, в ретроспективном (историческом) исследовании изучаются исходы проведенных ранее клинических исследований, т.е. исходы наступают до того, как начато исследование.

В зависимости от количества исследовательских центров, в которых проводится исследование в соответствии с единым протоколом, исследования бывают одноцентровыми и многоцентровыми. Если исследование проводится в нескольких странах, его называют международным.

В параллельном исследовании сравниваются две или более группы испытуемых, одна или более из которых получают исследуемый препарат, а одна группа является контрольной. В некоторых параллельных исследованиях сравнивают различные виды лечения, без включения контрольной группы. (Такой дизайн называют дизайном независимых групп).

Когортное исследование - это обсервационное исследование, в котором выделенную группу людей (когорту) наблюдают в течение некоторого времени. Исходы у испытуемых в разных подгруппах данной когорты, тех кто подвергался или не подвергался (или подвергался в разной степени) лечению исследуемым препаратом сравниваются. В проспективном когортном исследовании когорты составляют в настоящем и наблюдают их в будущем. В ретроспективном (или историческом) когортном исследовании когорту подбирают по архивным записям и прослеживают их исходы с того момента по настоящее время.

В исследовании случай-контроль (синоним: исследование сходных случаев) сравнивают людей с определенным заболеванием или исходами («случай») с людьми из этой же популяции, не страдающими данным заболеванием, или у которых не наблюдался данный исход («контроль»), с целью выявления связи между исходом и предшествующему воздействию определенных риск-факторов. В исследовании серии случаев наблюдают несколько индивидуумов, обычно получающих одинаковое лечение, без использования контрольной группы. В описании случая (синонимы: случай из практики, история заболевания, описание единичного случая) ведется исследование лечения и исхода у одного человека.

В настоящее время предпочтение отдается такому дизайну клинического исследования лекарственных средств, при котором обеспечивается получение наиболее достоверных данных, к примеру, при проведении проспективных контролируемых сравнительных рандомизированных и, желательно, двойных слепых исследований [11,15,19].

В последнее время роль клинических исследований лекарственных средств возросла в связи с внедрением в практическое здравоохранение принципов доказательной медицины. И главным среди них является принятие конкретных клинических решений для лечения пациента на основе строго доказанных научных данных, которые могут быть получены в ходе хорошо спланированных, контролируемых клинических исследований.

Задача

Получение субстанции аскорбиновой кислоты является многостадийным процессом, в котором сочетаются методы органического и биологического синтеза.

· Какой предшественник аскорбиновой кислоты получают с использованием биотехнологии и каково значение этого для всего процесса в целом?

Ответ:

Аскорбимновая кислотам -- органическое соединение, родственное глюкозе, является одним из основных питательных веществ в человеческом рационе, которое необходимо для нормального функционирования соединительной и костной ткани. Выполняет биологические функции восстановителя и кофермента некоторых метаболических процессов, является антиоксидантом. Биологически активен только один из изомеров -- L-аскорбиновая кислота, который называют витамином C.

Методов синтеза АС очень много. Аскорбиновая кислота может быть получена из моносахаридов D- или L-ряда.

1. Бензоиновый метод. В основе лежит конденсация-- треозы и этилглиокислота в присутствии KCN. Метод неперспективен из-за дефицитности сырья, низкого выхода.

2. Циангидриновый метод. Аскорбиновую кислоту получают, исходя из L-ликсозы или L-ксилозы. Практического применения не имеет из-за отсутствия сырья, синтез которого из D-глюкозы очень сложен.

3. Получение аскорбиновой кислоты из свекловичного «жома» (отходы производства сахара из свеклы). Метод предложен американцами в 1904 г. Метод нуждается в значительном усовершенствовании: из 100 кг жома получают всего 2,5 кг аскорбиновой кислоты.

4. Частично микробиологический метод получения аскорбиновой кислоты из D-глюкозы. Включает 5 стадий, в т. ч. 3 химических. В основе метода лежит окисление D-глюкозы уксуснокислыми бактериями до кальциевой соли 5-кето-0-глюконовой кислоты, которую превращают в L-аскорбиновую кислоту. Метод привлекает внимание ограниченным применением химических реагентов. Однако выход продукта низок, а процессы микробиологического синтеза трудно управляемы.

Набольшее значение при производстве субстанции АС в крупных размерах имеет Метод Рейхштейиа

5. Метод Рейхштейиа. Синтез L-аскорбиновой кислоты из 2-кето-L-гексоновой кислоты. Основное сырье (D-глюкоза) и вспомогательные реагенты, применяемые для синтеза, используются в пищевой и химической промышленности. Метод нашел применение во многих странах, в т. ч. СССР.

Метод Рейхштейна состоит из 6 стадий, включая 1 стадию микробного синтеза:

1 стадия. Получение D-сорбbта из D-глюкозы методом каталитического восстановления водородом.

2 стадия. Получение L-сорбозы из D-сорбита путем его глубинного аэробного окисления уксуснокислыми бактериями.

3 стадия. Получение диацетон-L-сорбозы из L-сорбозы путем ее ацетонирования.

4 стадия. Получение гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты путем окисления диацетон-L-сорбозы.

5 стадия. Получение L-аскорбиновой кислоты из гидрата диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты (деацетонирование --> этерификация --> «енолизация» --> «лактонизация»).

6 стадия. Получение медицинской аскорбиновой кислоты. Перекристаллизация технической аскорбиновой кислоты.

Выход продукта в пересчете па глюкозу составляет в целом до 54%.

Во 2 стадии синтеза для получения предшественника аскорбиновой кислоты - L-сорбозы, используется биотехологический процесс глубинного аэробного окисления уксуснокислыми бактериями. Данный процесс очень важен для всего синтеза в целом.

Химическая схема производства аскорбиновой кислоты

Химическая схема производства аскорбиновой кислоты

Стадия 2. Производство L-сорбозы из D-сорбита

L-сорбоза является кетогексозсй, в кристаллическом виде имеет р-форму пиранозы. Хорошо растворима в воде, плохо в спирте, Тпл= 165°С. Строение L-сорбозы можно представить различными структурами-

L-сорбоза чувствительна к нагреванию, особенно в растворах. Наиболее устойчива при рН 3,0. При рН<3 идет процесс распада до оксиметилфурфурола и далее муравьиной и левулиновой кислот.

Возможны два метода получения L-сорбозы из сорбита:

химический и микробиологический. Химический метод включает до 6 стадий, выход L-сорбозы составляет всего 0,75% от теоретически возможного, поэтому промышленного применения он не нашел.

Микробиологическое аэробное окисление можно представить следующей схемой:

Процесс окисления D-сорбита в L-сорбозу осуществляется биохимическим методом и является результатом жизнедеятельности аэробных кетогенных уксуснокислых бактерий, культивируемых на питательной среде, состоящей из D-cop" бита и дрожжевого автолизата или экстракта.

Изучено окислительное действие различных микроорганизмов: Ac. xylinum, Ac.xylinoides, Ac.suboxydans. Наиболее эффективно использование иммобилизованных клеток Gluconobacter Oxydans.

Окисление осуществляется в присутствии биостимуляторов--аминокислот, витаминов группы В, ускоряющих процесс на 40%. Биостимулятор должен отвечать определенным требованиям: обеспечивать высокую скорость процесса, применяться в возможно меньших количествах, быть недорогим и простым в приготовлении, содержать мало балластных веществ, которые затрудняют выделение L-сорбозы и ухудшают ее качество. Биостимуляторы приготавливают, как правило, из дрожжей, подвергая их различным видам обработки. В настоящее время разработан способ приготовления ферментативного гндролизата дрожжей -- нового биостимулятора для получения L-сорбозы. Испытания его показали, что окисление сорбита в этих случаях происходит с более высокой скоростью, чем на используемом в производстве кислотном гидролизате дрожжей с кукурузным экстрактом.

Основные факторы, влияющие на процесс окисления:

а) Состав и качество питательной среды. Качество зависит от степени очистки раствора D-сорбита. Так, при наличии в сорбите примесей могут протекать побочные процессы: образование D-глюконовой к-ты, б-кетп-О-глюконовой к-ты, D-фруктозы из манинита, а в кислой среде--5-оксиметилфурфу-рола. Сама L-сорбоза способна гидролизоваться, легко превращаясь в муравьиную и левулиновую кислоты.

б) Количество и качество воздуха. Процесс окисления является аэробным, поэтому интенсивность его зависит от количества и качества воздуха, подаваемого для аэрации питательной среды.

в) Герметичность и высокая стерильность аппаратуры, недопустимость заражения среды посторонней микрофлорой.

Технологический процесс окисления D-сорбнта в L-сорбозу состоит из следующих вспомогательных и основных операций:

1. Приготовление дрожжевого биостимулятора, дрожжевого автолизата и разбавленной серной кислоты.

2. Приготовление рабочей культуры.

3. Приготовление и выращивание посевного материала.

4. Проведение процесса биохимического окисления в производственном ферментаторе.

5. Выделение кристаллической L-сорбозы из окисленного раствора.

6. Выделение L-сорбозы из маточных растворов.

Биостимулятор готовят, как уже указывалось, из дрожжей, извлекая необходимые компоненты из дрожжевых клеток с помощью водной экстракции, автолиза, плазмолиза, кислотного гидролиза.

Наиболее эффективно процесс ферментации осуществляется в колонном ферментаторе с сетчатыми тарелками (установка типа УНФ-100). Ферментатор (рис. 2) представляет собой колонну высотой 8,3 м, диаметром -- 1,1 м, состоящую из 6 царг с 32 ситчатыми тарелками (рис. 2). Объем рабочей зоны--3,8 м³. В аппарат с определенной скоростью, обеспечивающей необходимую степень превращения D-сорбита в L-сорбозу, непрерывно подается рабочая культура, стерильная среда (водный раствор сорбита с концентрацией D-сорбита 22%), а также сжатый воздух. Процесс проводится при температуре 30--36°С, давлении 0,2--0,5 атм, рН==4--4,5 в течение 28--39 ч. Обогрев осуществляется горячей водой через секционные рубашки. Окисленный раствор непрерывно отводится из верхней части колонного ферментатора в сборник, а затем поступает на доокисление в периодически действующие ферментаторы, где глубина окисления повышается с 70--80% до 95%. Окисленный раствор сорбита с содержанием сухих веществ 20--25% направляют на очистку.

Очистку проводят с помощью активированного угля, который отфильтровывают на фильтр-прессе. Затем проводят процессы упаривання при t=45--50°С под вакуумом и кристаллизации, фуговки и сушки сорбозы в сушилках кипящего слоя при t=60--100°С до содержания влаги не более 0,7%. С целью повышения качества, снижения потерь при упаривании раствора сорбозы разработан метод непрерывного упаривания и кристаллизации сорбозы в вакуум-кристаллизаторе при пониженной температуре (35 °С) и температуре теплопередающей поверхности не выше 70--92 °С с последующей фуговкой сорбозы и возвратом маточного раствора сорбозы в вакуум-кристаллизатор. Потери сорбозы уменьшаются, а выход сорбозы возрастает до 90%. Производительность непрерывного способа выделения сорбозы на 10% выше, чем периодического. Непрерывное выделение кристаллической сорбозы может также осуществляться следующим образом. Окисленный раствор непрерывно отводится из колонного аппарата в сборник и далее поступает в сепаратор для очистки от белковых частиц, затем направляется в колонну с катпоиптом, и далее-- в колонну с анионитом. Очищенный раствор насосом подают в распылительную сушилку, где сушат при /=70°С, Окончательная сушка производится в шнековой сушилке до влажности не более 0,1%. Последний метод особенно перспективен в крупнотоннажных производствах.

Значимость данного этапа промышленного синтеза аскорбиновой кислоты заключается в наибольшей совершенности ее по сравнению с другими химическими стадиями. Трансформация D-сорбита в L-copбозу, осуществляемая микробиологическим окислением. При этом используется уникальное свойство бактерий -- выполнять направленный процесс окисления многоатомных спиртов в сахаре.

В исследованиях, направленных на усовершенствование синтеза витамина С, четко прослеживается тенденция к сокращению числа химических стадий за счет привлечения биотехнологических методов.

Список используемой литературы:

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика, т. 1-2, пер. с англ. - М.: 2000.

2. Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. - М.: "Мир", 2002.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. - М.: "Агропромиздат", 1990.

4. Бочков Н.П., Захаров А.Ф., Иванов В.И. Медицинская генетика. - М.: 2001.

5. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: биотехнологические агенты, технология, аппаратура. - Рига: "Зинатне", 2005.

6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. - М.: «Мир», 2002.

7. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: 1999.

8. Гриневич А.Г., Босенко А.М. Техническая микробиология. - СПб.: 2001.

9. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. - СПБ: "Наука", 2005.

10. Маниатис Г., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование (методы генетической инженерии), пер. с англ. - М.: 2001.

11. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: "Просвещение", 2000.

12. Синклер М., Берг П. Гены и геномы. - М.: «Мир», т.1, 2, 2001.

13. Уотсон Дж., Туз Дж., Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ. - М.: 1999.

14. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - М.: 2004.

Размещено на Allbest.ru