-перед проведенням тесту необхідно виключити лікувальні процедури і прийом ліків;

Невірно позитивні результати спостерігаються при гіпоглікемії, дисфункції печінки, ендокринопатіях.

Суть методу заключається в замірі рівня глюкози крої натщесерце, потім протягом 5 хвилин пропонується випити склянку теплої води, в котрій розчинена глюкоза (75 грамів). Через 30 хвилин, 1 годину та через 2 години знову заміряють рівень цукру в крові [19].

Рівень цукру в крові не менше 7,8 ммоль/л (через 2 години після навантаження глюкозою) вважається нормою. При рівні більше 7,8, але не менше 11,0 ммоль/л результат тесту оцінюють як порушення толерантності до глюкози. При рівні глюкози в крові більше 11,0 ммоль/л результат оцінюється як наявність цукрового діабету [11,19].

2.1.2 Визначення рівня цукру в крові за методом Хаггедорна-Йенсена

Рівень цукру за модифікованим методом Хаггедорна-Йенсена визначається за наступною методикою. В мікропіпетку набирають 0,1 мл крові й видувають в пробірку, що містить 5 мл 0,45% розчину сульфату цинку та 1 мл 0,1 н розчину гідроксиду натрію. Для рівномірного перемішування крові з сумішшю вміст кожної пробірки струшують. Далі пробірки поміщають в металевий штатив, який переносять на 3 хвилини на водяну баню з киплячою водою. По закінченні цього строку пробірки вилучають. Вміст кожної пробірки фільтрують в окрему широкогорлу пробірку, куди додають по 2 мл розчину червоної кров'яної солі. Пробірки поміщають в штатив, який поміщають на водяну баню з киплячою водою. Через 15 хвилин штатив з пробірками зняти з бані. В кожну пробірку налити по 3 мл потрійного розчину та 2 мл 3% розчину оцтової кислоти.

Для готування потрійного розчину 1г йоду розчинити в 40 мл подвійного розчину, що являє собою суміш 2г сульфату цинку, 10г хлориду та 40 мл дистильованої води. Вміст пробірки титрують розчином гіпосульфату натрію й по таблиці, яку запропонували С.Д. Балаховський та І.С. Балаховський, на підставі даних титрування встановлювити концентрацію глюкози в крові в ммоль/л [19].

2.2 Методики дослідження панкреатичних острівців

2.2.1 Цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних клітинах В

Для цитохімічного визначення цинку шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин в холодному ацетоні (+4⁰С) та витримували по 15 хвилин в 2-х порціях ксилолу. Потім промивали шматочки протягом 30 хвилин в суміші 50% парафіну та 50% ксилолу при температурі 37⁰С. Із такої суміші (каши) шматочки переносили в один, потім в другий рідкий парафін. Тривалість інфільтрування в кожному парафіні - 1,5 години при 56⁰С. Потім шматочки заливали в парафін [20-25].

Із приготовлених блоків підшлункової залози готували парафінові зрізи товщиною 5-10 мкм. Зрізи фарбували 0,01% ацетоновим розчином 8-ТСХ після попереднього депарафінування. Парафінові зрізи переносили прямо з ножа на предметне скло, яке вкрите шаром яєчного білка. Для цього за допомогою скляної палички на предметне скло наносили тонким шаром яєчний білок. Останній прожигали над полум'ям спиртівки. На шар яєчного білка поміщали парафіновий зріз і прижимали до предметного скла. Така процедура забезпечувала найкращу фіксацію на предметному склі парафінового зрізу. Виключення розплавлення зрізу в теплій воді перед виловлюванням його на предметне скло покращує відтворюваність результатів [22,24,26].

Депарафінування зрізів проводили в такий спосіб: зрізи витримували в двох частинах ксилолу (по 3 хвилини в кожній), двох частинах ацетону (по 3 хвилини в кожній). Зрізи, які вилучають із другого ацетона стають на повітрі білісуватими в результаті того, що ацетон випаровується. На поверхню зрізу наносили за допомогою піпетки 0,01% ацетоновий розчин 8-ТСХ. Через 1 хвилину промивали дистильованою водою, занурювали в гліцерин і розглядали під люмінесцентним мікроскопом. Для збудження люмінесценції застосовували світлофільтр ФС-1, а у якості захисного (окулярного) використали світлофільтр зі скла ЖС-18. На препаратах у цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася зернистість, яка люмінесціювала жовто-зеленим світлом [24-28].

Для доказу специфічності цитохімічної реакції 8-ТСХ із цинком на де парафіновані зрізи наносили 0,1М розчин ЕДТОК і розчин ДЕДТКН або 0,1М розчин ДЕДТКН. При послідовній обробці зрізів 8-ТСХ, у них не виявлялося люмінесцентної реакції [20,24,28].

Пояснюється це тим, що ЕДТОК і ДЕДТКН утворюють із цинком нефлуоресцуючий комплекс. Обробка ЕДТОК і ДЕДТКН зрізів із люмінесцентною реакцією 8-ТСХ призводила до гасіння цієї реакції внаслідок витиснення 8-ТСХ із комплексу з цинком [29].

Після обробки з хлороформом зрізів, позитивною реакцією 8-ТСХ повторне фарбування острівцевих клітин цим реагентом не вийшло. Це явище пов'язано із екстракцією 8-ТСХ-цинкового комплексу, який добре розчиняється у хлороформі, із клітин [30].

2.2.2 Цитохімічна реакція альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В

Для цитохімічного визначення інсуліну в панкреатичних клітинах В шматочки підшлункової залози фіксували в рідині Буена. Рідину Буена готували шляхом змішування 15 мл насиченого розчину пікринової кислоти, 5 мл нейтрального формаліну, 1 мл льодяної оцтової кислоти. Тривалість фіксації - 24 години [20-24].

Потім шматочки підшлункової залози проводили через спирти зростаючої міцності (70⁰, 80⁰, 90⁰, 96⁰, абсолютний спирти) - по 4 години в кожному. Абсолютний спирт отримували перемішуванням 96⁰ спирту з прокаленим мідним купоросом. Після цього шматочки залози витримували у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰ С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰ С). Далі шматочки підшлункової залози заливали в парафін [23].

Із парафінових блоків підшлункової залози готували зрізи товщиною 5-10 мкм. Депарафінування зрізів проводили шляхом їхньої обробки у двох ксилолах (по 3 хвилини в кожному), потім відбувалась обробка в спиртах міцності, що знижується, (абсолютний спирт, 96⁰, 90⁰, 80⁰, 70⁰) - по 3 хвилини в кожному і промивали у водопровідній воді (5 хвилин) [25].

Після цього зрізи поміщали в окислювач (до порудіння) і відновник (до знебарвлення). Окислювач готували безпосередньо перед його застосуванням у такий спосіб: змішували одну частину 2,5% розчину перманганату калію, одну частину 5% розчину сірчаної кислоти та 4 частини дистильованої води. У відновник зрізи поміщали без попереднього їхнього промивання у водопровідній воді після окислювання. Відновником слугував 2,5% розчин щавлевої кислоти або бісульфату натрію до повного знебарвлення [23].

Після відновлення зрізи промивали в дистильованій воді протягом 5 хвилин та фарбували протягом 6 хвилин розчином альдегідфуксину, у герметично зачиненій посудині. Барвник готували таким чином: розчиняли 250 мг альдегідфуксину в 25 мл 70⁰ спирту, потім ще додавали 75 мл 70⁰ спирту і 1 мл льодяної оцтової кислоти. Після закінчення зазначеного строку фарбування зрізи витягали з посудини, на них наносили трохи крапель 96⁰ спирту. Зрізи промивали протягом 5 хвилин у водопровідній воді. Потім зрізи проводили через 96⁰ спирт (1-2 хвилини), абсолютний спирт (1-2 хвилини), два ксилоли (по 1-2 хвилині в кожнім) і занурювали в бальзам [29].

На препаратах в цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася синьо-фіолетова зернистість. ЇЇ кількість слугувала показником вмісту в клітинах гормону інсуліну [30].

2.2.3 Дитизонова реакція у панкреатичних клітинах В

Для дослідження цитохімічного визначає мого цинку, шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин у холодному ацетоні. Потім шматочки залози доводили до парафіну наступним чином: витримували їх у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰С). Далі шматочки підшлункової залози заливали в парафін. Парафінові зрізи підшлункової залози готували товщиною 5-10 мкм. Депарафінування зрізів проводили наступним чином: обробка у двох ксилолах - по 3 хвилини у кожній, обробка у двох ацетон ах - по 3 хвилини у кожному. Промивали у дистильованій воді 5 хвилин [20-23].

У випадку постановки цитохімічної реакції дитизону використовували 0,2% (робочий) його розчин. Тривалість забарвлення - 3 години. Розчин готували таким чином. У колбочку з притертою (яка герметично замикається) пробкою наливали 30 мл дистильованої води, додавали 0,6 мл 25% розчина гідроксиду амонію та 400 мг дитизону. Суміш перемішували на водяній бані впродовж 10 хвилин при 70⁰С. Потім фільтрували через беззольний фільтр. Так як на фільтрі залишалась приблизно чверть наважки реагенту, що не розчинився, фільтрат представляв собою 1% водно-аміачний розчин дитизону. Це основний розчин фарбника. Його робочий розчин готували п'ятикратним розведенням дистильованою водою його основного розчину. По закінченні терміну забарвлювання препаратів, зрізи промивали у двох порціях дистильованої води (по 5 хвилин у кожній) і замикали в гліцерин-желатин. Зрізи розглядали під світловим мікроскопом. На препаратах у цитоплазмі острівцевих клітин тварин виявлялися гранули червоного кольору [22].

Специфічність цитохімічної реакції дитизону перевіряли наступним чином. Обробка де парафінованих зрізів 0,1М, що була проведена заздалегідь розчином ЕДТОК, попереджувала отримання кольорової дитизонової реакції у панкреатичних острівцях. Пояснюється це явище тим, що ЕДТОК утворює з цинком безкольоровий комплекс. Цей реагент має більш високі константи стабільності комплексів із цинком, аніж дитизон. У результаті цього, останній не здатний відокремити цинк від комплексу із ЕДТОК і не здібний внаслідок цього забарвити клітини [23-27].

Якщо ЕДТОК обробляти зрізи, на яких уже вийшла позитивна кольорова реакція дитизона, проходило скоріше (протягом 1 хвилини) знебарвлення зрізів. Пояснюється це явище також конкурентним взаємовідношенням даної речовини із дитизоном. Володіє більш високим константами стабільності комплексів із цинком, він легко витискує дитизон у поєднанні із цим металом.

Нарешті, при обробці зрізів із кольоровою реакцією дитизону хлороформом продукт цитохімічної дитизонової реакції екстрагується зі зрізів, і при повторній обробці дитизоном зрізи не забарвлюються ним. Ці дані говорять на користь селективності цитохімічної дитизонової реакції із цинком. Для підвищення цієї селективності, ми використовували замість дистильованої води 0,2% розчин ДЕДТКН [30].

ЗАКЛЮЧЕННЯ

Ендокринну частину підшлункової залози складають клітини епітеліального походження, які отримали назву острівців Лангерганса і які складають всього 1-2% маси підшлункової залози. В острівцях розрізняють три типа клітин, які продукують гормони: б-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону; в-клітини, які виробляють інсулін; д-клітини, які продукують соматостатин; б-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону; G-клітини, які виробляють гастрин; РР-клітини, які виробляють невелику кількість панкреатичного поліпептиду.

Регуляція секреції гормонів клітин острівців, як і їх ефекти, взаємопов'язані, що дозволяє розглядати остівцевий апарат, як «міні-орган». Основним регулятором секреції інсуліну являється D - глюкоза, яка надходить з кров'ю. Глюкоза активує в в-клітинах специфічну цАМФ. Секрецію інсуліну викликають також гормони ШКТ, іони Са²⁺. В регуляції секреції інсуліну визначену роль грає і вегетативна нервова система. Блукаючий нерв і ацетилхолін стимулюють секрецію інсуліну, а симпатичні нерви і норадреналін гальмує секрецію інсуліну і стимулює викид глюкагону. Специфічним інгібітором продукції інсуліну є гормон д-клітин підшлункової залози - соматостатин.

Секреція глюкогону стимулюється зниженням рівня глюкози в крові, гормонами ШКТ та зменшенням в крові іонів Са²⁺. Клятини ШКТ, які продукують гормони являються своєрідним «пристроєм раннього оповіщення» клітин панкреатичних острівців про надходження поживних речовин в організм.

Інсулін впливає на всі види обміну речовин, він сприяє анаболічним процесам, збільшує синтез глікогену, жирів та білків, гальмуючи ефекти багато численних контрінсулярних гормонів. Глюкагон являється міцним контрінсулярним гормоном і його ефекти реалізуються в тканинах через вторинного посередника цАМФ. На відміну від інсуліну глюкагон підвищує рівень цукру в крові.

Інсулін сприймається спеціальними рецепторами, які реагують на присутість цього гормону в периферичній крові.

Іннервація підшлункової залози реалізується постгангліонарними симпатичними і парасимпатичними нервами, гілками блукаючого і спінальних нервів. Безпосередньо в острівцях закінчуються постгангліонарні симпатичні і парасимпатичні волокна.

ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ

1. Физиология человека: учебник для мед. вузов / [Авдеев С.Н., Айсонов З.Р., Водолажская М.Г., Гурфингель В.С., Дегтярев В.П., Кобрин В.И. и др]; под. ред. В.М. Покровского, Г.Ф. Коротько.- [2-е изд.].- М.: Медицина, 2003.- 656 с.

2. Држевецкая И.А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы: пособие для биологических специальностей университетов и институтов / Држевецкая И.А. - М.: Высшая школа, 1983. - 272 с.

3. Физиология человека / [Е.Б. Бабский, В.Д. Глебовский, А.Б. Когант, Г.Ф. Коротько и др.]; под ред. Г.И. Косицкого. - [3-е изд.].-М.: Медицина, 1985.-544 с.

4. Нормальна фізіологія / [В.І. Філімонов, В.С. Райцев, В.Г. Шевчук, Д.Г. Наливайко]; під ред. В.І. Філімонова.-К.: Здоров'я, 1994.-608 с.

5. Тепермен Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс / Дж. Тепермен, Дж. Тепермен ; пер. с анг. В.И. Кандрора; под ред. Я.И. Ажипы.- М.: Мир, 1989.-656 с.

6. Основы физиологии человека: учебник для высших учебних заведений, в 2-х томах / [В.Б. Брин, И.А. Вартанян, С.Б. Даниярова, Ю.М. Захарова и др.]; под ред. Б.И. Ткаченко.- Санкт-Петербург.: Международный фонд истории наук, 1994. Т.1-567 с..

7. Брин В.Б. Физиология человека в схемах і таблицях / Брин В.Б. - [2-е изд.]. - Ростов н/Д.: Феникс, 1999. -352 с.

8. Рафф. Г. Секреты физиологии / Рафф. Г. - [пер. с анг. Д. Абдурохманов, Г. Азбиль, Ю. Бородина, Д. Газизова, В. Деньгин, В. Ромаив].- М.: «Бином»- «Невский диалект», 2001.-448 с.

9. Губський Ю.І. Біологічна хімія: підручник / Губський Ю.І. - Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - 508 с.

10. Эндокринология / [Айзенберт Д., Близард Р., Блюминг А., Брикман А., Брикс С., Бхасинг Ш., и др. ]; пер с анг., В.И. Кандрор, Э.А. Антух, Т.Г. Горлина; под ред., Н. Лавин. - М.: «Практика», 1999. - 830 с.

11. Комов В.П. Биохимия: учебник для вузов / В.П. Комов, В.Н.Шведов. - М.: Дрофа, 2004. - 638 с.

12. Ефимов А.С. Сахарный диабет: проблемы наших дней / А.С. Ефиров, Ю.В. Щербак - К.: Наукова думка, 1991. - 153 с.

13. Балуш Л.В., Ковалишин В.І., Ященко А.М. Гістохімічні та електронномікроскопічні дослідження підшлункової залози на тлі експериментального цукрового діабету // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. -Т. 8, № 1 - 2009.- С. 37-42.

14. Кот Л. Сучасні уявлення про біохімічні механізми патогенезу інсулінонезалежного цукрового діабету / Л. Кот, О. Богданова, Л. Остапенко // Вісн. НАН України. - 2008.- № 9. - С. 18-26.

15. Міськів І.Ф. Морфофункціональні зміни ендокринної частини підшлункової залози у щурів старечого віку при стрептозотоциновому діабеті / І.Ф. Міськів // Прикл. асп. морфології експер. і клін. досліджень: тези доп. наук.-прак. конф. - Тернопіль, 2008. - С. 85-86.

16. Иннервация поджелудочной железы // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - Т.6. - № 1. - 1996. - С. 35-39.

17. Berger A. What does zinc do ? // BMJ. - 2002. - Vol. 325, № 7372. - P. 1059.

18. Chausmer A.B. Zinc, insulin and diabetes // J.Am.Coll.Nutr. - 1998. - Vol. 17, № 2. - P. 109-115.

19. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / [Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.]; под ред., В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987, - 368 с.

20. Brocardo P.S., Pandolfo P., Taikahashi R.H., Rodrigues A.L., Dafre A.L. Antioxidant defenses and lipid peroxidation in the cerebral cortex and hippocampus following acute exposure to malathion and / or zinc chloride // Toxicology. - 2005. - Vol. 207, N2. - P. 283-291.

21. Григорова Н.В. Стан панкреатичних острівців мишей i щypiв при введені сульфату міді тваринам, отримавшим алоксан // Питання біоіндикації та екології. - Запорiжжя: ЗНУ, 2008. - Вип. 13, № 2. - С. 163-169.

22. Григорова Н.В. Клітинний метаболізм цинку при уведені тваринам солей важких металів на фоні іммобілізованого стресу // Вісник ЗДУ. - 2000. - № 2. - С. 194-196.

23. Миргородська К.П., Григорова Н.В. Вплив фізичного навантаження на вміст цинку та секреторного матеріалу в клітинах Панета та В-інсулоцитах старих мишей // Науковий вісник Ужгородського університету. - 2008. - № 22. - С.114-117.

24. Міськів В.А.,Левицький В.А. Особливості будови панкреатичних острівців на різних етапах онтогенезу // Світ медицини та біології. - 2009.- № 4. - С. 36-40.

25. Вивчення вмісту цинку та інсуліну в острівцевих клітинах при різному функціональному станіінсулярного апарату / Т.В. Берегова, Н.В. Григорова, Ю.В. Єщенко [та ін.] // Фізіологічний журнал. - 2007. - Т.53, №4. - С. 100-104.

26. Діабетогенна активність дитизону у тварин різних видів / Н.В. Григорова, Ю.В. Єщенко, Є. Ю. Гороховський [та ін.] // Вісник Запорізького національного університету. - 2009.- № 2.- С. 85-89.

27. Рівень АКТГ й інсуліну в крові при різному функціональному стані кортикотрофів аденогіпофізу та бета - клітин панкреатичних острівців / Т.В. Берегова , Ю.В. Єщенко, В.Д. Бовт, В.А. Єщенко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохіміяю - 2010.- № 2. - С. 7-11.

28. Mechanisims of stabilization of the insulin hexamer allosteric ligand interactions / S. Rahuel-Clermont, C.A. French, N.C. Kaarsholm [at al.] // Biochemistry. - 1997. - Vol. 36, N 19. - P.5837-5845.

29. Mutation of active site residues of insulin degrading enzyme alters allosteric interactions / E.S. Song, A. Daily, M.G. Fried [at al.] // J. Biol. Chem. - 2005. - №3. - P. 175-179.

30. Rosenfeld L. Insulin: discovery and controversy / L. Rosenfeld // Clin. Chem. - 2002. - Vol.48, №12. -Р. 2270-2288.

Размещено на Allbest.ru