Біотехнологія одержання та використання моноклональних антитіл до IgM людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ОдеськИЙ національнИЙ університет імені І.І. Мечникова

УДК 573.6.083.3+573.6.086.8

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Біотехнологія одержання та використання моноклональних антитіл до IgM людини

03.00.20 - біотехнологія

Галкін Олександр Юрійович

Одеса - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі промислової біотехнології Національного технічного університету України «Київський політехнічний інститут» МОН України. моноклональний антитіло імуноаналіз гібридома

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор Дуган Олексій Мартем'янович, Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут» МОН України, декан факультету біотехнології і біотехніки, завідувач кафедри промислової біотехнології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Чумак Ростислав Максимович, Національний університет біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної діагностики Української лабораторії якості і безпеки продукції АПК;

доктор медичних наук, професор Казмірчук Віра Євстафіївна - Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, директор Інституту імунології та алергології.

Захист відбудеться «19» лютого 2010 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06 при Одеському національному університеті імені І.І. Мечникова МОН України (65058, Україна, м. Одеса, Шампанський пров., 2).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського національного університету імені І.І. Мечникова МОН України (65082, Україна, м. Одеса, вул. Преображенська, 24).

Автореферат розісланий «___» _січня__ 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 41.051.06

доктор біологічних наук, професорТ.О. Філіпова

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Одним з напрямів сучасної біотехнології є імунобіотехнологія, яка має на меті цілеспрямований біосинтез нових біологічно активних речовин, до яких, зокрема, відносяться й моноклональні антитіла (МКАТ), які широко використовується у сучасній діагностиці та терапії, дозволяють проводити високоефективні науково-дослідні розробки. Моноклональні антитіла на відміну від поліклональних сироваток характеризуються виключною специфічністю і гомогенністю, а також можливістю одержання практично необмежених кількостей. Ідентичність ізотипу й ідіотипу МКАТ від партії до партії забезпечує відтворюваність їх якості, а отже й відтворюваність аналітичних методик [Goding, 1996; Johnstone, 1997].

Вирішення багатьох експериментальних задач в імунології пов'язане із використанням антиімуноглобулінових (анти-Ig) моноклональних антитіл. Такі МКАТ знаходять застосування, наприклад, при дослідженні функцій та механізмів дії імунокомпетентних клітин, що сенсибілізовані молекулами імуноглобулінів, а також у різних аналітичних методиках, зокрема в серологічній діагностиці [Климович та ін., 1998; Hermanson, 2000; Якобисяк та ін., 2004].

Одним з методів, який знайшов широке застосування у діагностиці інфекційних захворювань, є імуноферментний аналіз (ІФА). Даний метод може бути застосований як для визначення антигенів збудника, так і визначення антитіл до нього. Розробка та виробництво імуноферментних тест-систем для діагностики цих інфекцій не можливі без використання антивидових моноклональних антитіл, специфічних до певного класу імуноглобулінів [Gosling, 2000].

Завдяки доступності методів гібридомної технології в умовах стандартно оснащеної лабораторії, у даний час можливо отримувати безліч МКАТ заданої специфічності. Проте, навіть не кожна гібридизація дозволяє отримати клони МКАТ, придатні для промислового впровадження. За відсутності науково-методичних підходів до отримання гібридом-продуцентів заздалегідь практично значущих МКАТ науково-дослідні роботи перетворюються на рутинний пошук цінних клонів серед сотень й тисяч отриманих МКАТ [Gosling, 2000; Ніколаєнко та ін., 2003].

Відомо, що гібридомна технологія дозволяє розкласти імунну відповідь на складові, і при цьому з'являється можливість відбирати клони гібридом із такими властивостями (активність, специфічність, афінність, епітопна приналежність, ізотип), які заздалегідь мають практичну цінність, зокрема, дозволяють розробляти високоспецифічні та чутливі методи імуноаналізу. Разом із тим, якщо чітко не встановлені критерії відбору МКАТ, то завдання по розробці методів ідентифікації, очистки та кількісного визначення речовин неминуче призводить до вкрай трудомісткого та тривалого й не завжди успішного підбору клонів антитіл для тих чи інших видів імуноаналізу.

Таким чином, створення науково обґрунтованих підходів до отримання антивидових моноклональних антитіл є актуальною задачею, вирішення якої дозволило б підвищити ефективність цілого ряду імунобіотехнологій, в першу чергу тих, що адресовані до розробки та виробництва засобів для in vitro діагностики.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконувалась у рамках науково-дослідної роботи «Наукова розробка засобів для виявлення серологічних маркерів бактерійних та вірусних інфекцій людини» (№ держреєстрації 0109U005714) кафедри промислової біотехнології Національного технічного університету України «Київський політехнічний інститут», а також науково-технічних програм НВК «Вітротест». У даних комплексних роботах пошукачем виконано окремі фрагменти досліджень.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи - розробити біотехнологію одержання моноклональних антитіл до IgМ людини та створення на їх основі високоспецифічних і чутливих методів імуноаналізу.

Для досягнення поставленої мети в роботі вирішували наступні задачі:

1. Одержати високоочищені препарати IgM, IgA, IgG людини та Fcм-фрагменти антитіл, придатні для використання як антигени при тестуванні гібридом.

2. Одержати набір гібридом-продуцентів МКАТ до IgМ людини за двома схемами імунізації - короткостроковою та довгостроковою.

3. Відібрати гібридоми, що продукують найбільш активні та специфічні антитіла, накопичити МКАТ, синтезувати пероксидазні кон'югати на їх основі.

4. Провести характеристику отриманих МКАТ на основі імунохімічних властивостей (специфічність, афінність, титр, ізотип, здатність до преципітації та епітопне картування).

5. Провести порівняльну характеристику різних схем імунізації для отримання анти-IgM МКАТ.

6. Дослідити діагностичні характеристики одержаних моноклональних антитіл при їх використанні у складі кон'югату та імуносорбенту імуноферментних наборів для виявлення IgM-антитіл до збудників ТORCH-інфекцій, урогенітального хламідіозу та Епштейн-Барр вірусної інфекції.

7. На основі отриманої панелі МКАТ розробити високочутливий ІФА для кількісного визначення сумарного IgM людини та методику імуноафінного виділення та очистки IgM людини.

Об'єкт дослідження - біотехнологічні підходи до отримання антивидових моноклональних антитіл та створення на їх основі високоспецифічних і чутливих методів імуноаналізу.

Предмет дослідження - розробка біотехнології одержання моноклональних антитіл до IgM людини та створення на їх основі імуноферментних діагностикумів й методики імуноафінної хроматографії.

Методи дослідження - методи клітинної інженерії, імунологічні, біохімічні та математичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Одержано оригінальний набір із 21 нового клону гібридом-продуцентів високоактивних та специфічних МКАТ до IgМ людини.

Вперше представлена епітопна структура молекули IgМ людини з точки зору імунодомінантності та наявності обмеженої кількості висококонсервативних епітопних регіонів (ЕР). Виявлено три основні ЕР: А, В і С. ЕР-А та ЕР-В містять по одному домінантному епітопу у відповідності із більшим числом спрямованих до них МКАТ. ЕР-С представлений однією антигенною детермінантою. Встановлені особливості отримання МКАТ до різних ЕР, відносна просторова локалізація, ступінь імуногенності, а також вперше запропонована класифікація епітопів IgМ людини, яка за приналежністю до певного ЕР та відомою афінністю МКАТ дозволяє заздалегідь встановити практичну цінність анти-IgM антитіл для імуноаналізу.

Вперше запропоновано ефективну короткострокову схему імунізації мишей лінії Balb/c для одержання моноклональних антитіл до IgМ людини, придатних для використання в імуноаналізі.

Результати даної роботи заклали науково-методичні основи біотехнології одержання антивидових моноклональних антитіл та їх використання для розробки високоспецифічних та чутливих методів імуноаналізу.

Практичне значення отриманих результатів. На основі отриманих нами імуносорбенетів та пероксидазних кон'югатів МКАТ було розроблено низку імуноферментних наборів для виявлення IgM-антитіл до Toxoplasma gondii, Chlamydia trachomatis, вірусів краснухи, простого герпесу, цитомегалії та Епштейна-Барр. Розроблено технічні умови ТУ У 24.4-33946682-001:2006 «Реагенти імуноферментні для виявлення серологічних маркерів інфекційних захворювань».

Розроблено високочутливий імуноферментний набір для кількісного визначення IgM людини (аналітична чутливість 11 нг/мл) та добре відтворювану і просту у виконанні методику специфічного виділення IgM людини із використанням імуноафінного сорбенту на основі отриманих анти-IgM МКАТ.

З використанням одержаних МКАТ та кон'югатів на їх основі може бути розроблено тест-системи для визначення антитіл класу IgМ до збудників інших інфекційних захворювань, наприклад до вірусу varicella-zoster або збудників пневмонії Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae.

Результати роботи впроваджено також у викладання курсів «Загальна імунологія», «Біотехнологія рослинної та тваринної клітини» та «Медична біотехнологія» на кафедрі промислової біотехнології Національного технічного університету України «Київський політехнічний інститут».

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно здійснено аналіз вітчизняної та зарубіжної літератури за темою дисертації. Пошукач особисто освоїв всі етапи технології одержання та використання МКАТ: одержання препаратів імуноглобулінів та Fcµ-фрагментів, методи імунізації тварин, методику підготовки мієломних клітин до злиття, гібридизацію, клонування та тестування гібридом, накопичення та характеристику МКАТ, а також розробку ІФА із використанням імуносорбентів та пероксидазних кон'югатів МКАТ.

Одержання моноклональних антитіл проводилося разом із к.мед.н. І.В.Ніколаєнко, а отримання високоочищенних препаратів імуноглобулінів - спільно з к.мед.н. І.В. Ніколаєнко та к.біол.н. Н.І. Грабченко, які є співавторами відповідних публікацій. Особисто автором описані результати досліджень та проведено їх обговорення; разом із науковим керівником сформовано висновки.

Апробація результатів роботи. Основні положення роботи доповідались та обговорювались на 58 науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця «Актуальні проблеми сучасної медицини» (2003 р., м. Київ), Установчому з'їзді Українського товариства клітинних біологів (2004 р., м. Львів), VI Національному з'їзді фармацевтів України (2005 р., м. Харків), ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (2006 р., м. Львів) та V Міжнародній конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (2009р., м. Львів).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 11 наукових праць, у тому числі 5 наукових статей у фахових виданнях, тези 6 доповідей. Одержано 1 патент України на корисну модель.

Об'єм та структура роботи. Текст дисертації викладено на 171 сторінці машинопису. Робота складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та основних методів досліджень, п'яти розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків і списку літератури, який містить 201 джерело, у тому числі 151 іноземне. У роботі наведено 24 таблиці та 31 рисунок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Розглянуто основні засади гібридомної технології. Узагальнено літературні дані щодо особливостей технології одержання МКАТ, специфічних до імуноглобулінів людини, та сфер їх застосування. Розглянуто підходи до одержання кон'югатів антитіл з ферментами. Проаналізовано місце і роль техніки біокон'югації в розробці та виробництві сучасних ІФА наборів. Проаналізовано критерії, від яких залежить якість одержуваних імуноферментних кон'югатів, та розглянуто підходи до оцінки їх діагностичної якості.

Матеріали та основні методи досліджень. У дослідах використовували мишей лінії Вalb/с різного віку та статі, в залежності від потреб дослідів. Культури клітин: працювали з мієломною лінією Sр 2/0 мишей Вalb/с.

Поживні середовища: гібридоми культивували на середовищі H-Y, «Sigma», з додаванням 12 % ембріональної телячої сироватки (ЕТС) та гентаміцину; мієломні клітини вирощували на середовищі DМЕМ з тим самим вмістом ЕТС та антибіотику.

Еуглобулінову фракцію сироватки одержували шляхом діалізу, двократного відмивання преципітату, та використовували для виділення IgM людини. Вихідним матеріалом для одержання імуноглобулінової фракції був надосад (без IgM людини), отриманий після діалізу сироватки. Осадження IgG та IgA проводили розчином сульфату амонію до кінцевого насичення 33 %. Гель-фільтрацію на сефакрилі S-300 використовували як один з методів очистки Fcм-фрагментів та імуноглобулінів. Афінну хроматографію на протеїні G «HiTrap Protein G», Pharmacia Biotech, використовували для виділення IgG з сироватки або імуноглобулінового препарату. Розщеплення IgМ папаїном для отримання Fcм-фрагментів проводили при 37 °С у атмосфері азоту; реакцію зупиняли шляхом заморожування. Електрофорез у ПААГ з ДСН використовували для контролю чистоти препаратів імуноглобулінів та Fcм-фрагментів та проводили за U.Laemmli (1970). Імунодифузію за Оухтерлоні проводили для визначення імунологічної чистоти препаратів імуноглобулінів та Fcм-фрагментів.

Імунізацію мишей IgM людини проводили за двома схемами. При короткостроковій схемі імунізацію проводили в подушечки задніх лапок мишей у сумарній дозі 50-60 мкг на тварину. Перші дві ін'єкції здійснювали з повним ад'ювантом Фрейнда, а третю - без ад'юванта. Імунізація продовжувалася 7-8 днів. На третій день після останньої ін'єкції антигену проводили гібридизацію лімфоцитів, отриманих з регіонарних лімфатичних вузлів мишей, із клітинами мієломи Sp 2/0. При довгостроковій схемі перші три ін'єкції були аналогічними короткостроковій схемі. Через три місяці після третьої ін'єкції внутрішньовенно вводили бустер-дозу IgМ людини та на третій день здійснювали гібридизацію спленоцитів селезінки миші із клітинами мієломи Sp 2/0. Сумарна доза імуногену при довгостроковій схемі склала 85-100 мкг на мишу.

Гібридоми отримували за базовою методикою G. Kohler та C. Milstein (1975) у модифікації D. Lane (1986). Одержані клони гібридом тестували у ТІФА на: IgМ людини (для первинного відбору), Fcм-фрагменти (для визначення специфічності), IgA та IgG людини (для відсіву перехреснореагуючих МКАТ). Позитивні клони гібридом накопичували та кріоконсервували. Титр антитіл у культуральних рідинах визначали у непрямому ТІФА, їх афінність встановлювали за методикою B. Friquet (1985) у модифікації B. Kim (1990), їх ізотип за допомогою набору ІSO-2, «Sіgma», а здатність до преципітації за допомогою імунодифузії за Оухтерлоні. Встановлення епітопної специфічності (епітопне картування) отриманих МКАТ проводили у конкурентному ТІФА. Відібрані клони гібридом клонували до повної стабільності за рівнем синтезу антитіл, кріоконсервували та накопичували МКАТ для подальшого вивчення.

Одержання імуноферментних кон'югатів МКАТ з пероксидазою хрону (horseradish peroxidase - HRP) здійснювали у молярному співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 методом періодатного окислення за Р. Tijssen (1985).

Результати досліджень піддавали статистичному аналізу [Урбах, 1963] з використанням t-критерію Ст'юдента та вважали достовірними при рівні значимості р < 0,05. Для розрахунків використовували програму Microsoft Excel.

Результати досліджень та їх обговорення. Одержання високоочищених препаратів IgM, IgA, IgG людини. Джерелом IgМ людини була еуглобулінова фракція сироватки. Наші дослідження показали, що безпосереднє хроматографічне виділення IgМ призводить до забруднення кінцевого препарату б₂-макроглобуліном. Тому, для уникнення такої контамінації, використовували попереднє осадження еуглобулінової фракції поліетиленгліколем 8000 (5 %). Одержаний таким чином цільовий продукт міг містити й слідові кількості IgG, які агрегували із IgМ (рис. 1). Вирішення даної проблеми проводили за рахунок додавання детергенту (1 % тритону Х-100), який запобігав агрегації молекул IgМ та IgG.

Високоочищену фракцію IgG одержували з «Імуноглобуліну людського нормального», Біофарма, афінною хроматографією на колонці з протеїном G. Очистку проводили у декілька циклів: до зменшення висоти піку, який елюювали з колонки, що вказувало на повне видалення IgG з фракції, що не зв'язувалася з колонкою (рис. 2). Концентрація білка в одержаному препараті коливалась від 2 до 4 мг/мл.

При відпрацюванні схеми одержання IgА було встановлено, що чистий препарат даного імуноглобуліну не можливо отримати при використанні іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі та гель-фільтрації на сефакрилі S-300 як самостійних методів. При проведенні іонообмінної хроматографії вихід IgА не перевищував 7-8 % від його теоретичного вмісту у вихідному препараті. Окрім цього, такий IgА був контамінований іншими класами імуноглобулінів через близькість значень їх ізоелектричних точок. При використанні гель-фільтрації, ми також стикнулись із забрудненням цільового продукту антитілами IgG, який характеризується близькою до IgА молекулярною масою.

Спираючись на отримані експериментальні дані, було розроблено оригінальну схему, яка на першому етапі дозволила вирішити основне завдання - розділення IgА та IgG, що мають близькі молекулярні маси та заряди молекул. Відокремлення Ig даних класів стало можливим завдяки їх різній афінності до білку G. На етапі гіль-фільтрації вилучали білки сироватки крові, які контамінували імуноглобулінову фракцію під час її одержання преципітацією (NH₄)₂SO₄.

Одержання Fcм-фрагментів. Папаїновий гідроліз IgМ людини проводили у середовищі азоту, оскільки кисень повітря, за даними J.Goding (1996), помітно інгібує активність ферменту. Ферментативне розщеплення проводили без використання активатора ферменту - цистеїну - задля максимального виходу (Fc)₅м-фрагментів, що є кращим з огляду на наступну процедуру їх виділення та очистки. Був встановлений оптимум часу фрагментації IgМ людини, який склав 30 хв: після 40 хв інкубації папаїну та імуноглобулінів у реакційній суміші не зростає кількість Fcм- та Fabм-фрагментів (рис. 3). Виділення та очистку (Fc)₅м-фрагментів здійснювали послідовним вилученням Fabм-фрагментів та мономерних Fсм-фрагментів за допомогою гель-фільтрації на сефакрилі S-300.

Контроль чистоти одержаних препаратів імуноглобулінів та Fсм-фрагментів здійснювали електрофорезом у ПААГ з ДСН (рис. 4 та 5) й імунодифузією за Оухтерлоні (рис. 6). Використання такої схеми дозволило одержати Fcм-фрагменти високого ступеню чистоти, придатні для тестування клонів гібридом; їх вихід після всіх етапів очистки склав біля 15 % від початкової кількості імуноглобулінів у препараті.

Препарати Ig та Fсм-фрагментів були придатні для імунізації тварин з метою одержання гібридом та тестування останніх у імуноферментному аналізі. Концентрація IgG становила 2,7 мг/мл, IgМ - 0,7 мг/мл та IgА - біля 2 мг/мл.

Одержання та вивчення властивостей МКАТ до IgМ людини. Використання запропонованих схем імунізації та методики злиття клітин дозволило одержати достатньо високий вихід позитивних клонів гібридом: при тестуванні у ТІФА на IgМ людини позитивною виявлялася кожна лунка планшету. Тому було розроблено схему відбору клонів гібридом, продуцентів МКАТ із властивостями, які потенційно забезпечували високі показники аналітичної чутливості та специфічності методів імуноаналізу (табл. 1).

Відбирали ті клони гібридом, які продукують антитіла саме до Fcм-фрагментів. Була запропонована комплексна характеристика антитіл, яка включала встановлення їх ізотипу, титру та константи афінності. З огляду на подальше використання одержаних МКАТ у розробці високоінформативних методів імуноаналізу відбирали лише антитіла з високими титром та афінністю. Оскільки IgM-антитіла характеризуються низькими специфічністю та афінністю, то МКАТ даного ізотипу не залишали для подальшого вивчення. Орієнтуючись на більш ефективну очистку МКАТ на протеїні А, відбирали МКАТ ізотипів IgG_2a, IgG_2b, IgG₃. Встановлено, що існує кореляція між титром антитіл у культуральній рідині та їх константою афінності: всі антитіла з титром 1:500 і більше характеризувалися константою афінності більшою за 10¹⁰ М.

Таблиця 1 Етапи відбору клонів гібридом-продуцентів МКАТ до IgM людини

Короткострокова схема імунізації	Довгострокова схема імунізації
1 етап: Первинний скринінг на IgM людини
Відібрано 82 клони	Відібрано 67 клонів
2 етап: Повторне тестування на IgM людини
Підтвердилася висока активність 34 клонів	Підтвердилася висока активність 38 клонів
3 етап: Тестування на Fc-фрагменти IgM, а також IgG та IgА
Відібрано 25 клонів	Відібрано 25 клонів
4 етап: Аналіз гібридом за титром антитіл, їх афінністю та ізотипом
Залишено 12 клонів	Залишено 9 клонів

Важливо відмітити, що розподіл антитіл за їх ізотипами для різних схем імунізації суттєво відрізнявся. При короткостроковій схемі імунізації переважали МКАТ класу IgG_2b (57 %), а при довгостроковій - класу IgМ (44 %). Такі експериментальні дані можливо пояснити наступним чином. По-перше, важливе значення для виникнення та перебігу імунної відповіді має шлях введення антигену [А.Ройт, 2000]. При введенні деяких антигенів підшкірно та внутрішньо шкірно розвивається напружена імунна відповідь, а при внутрішньовенній ін'єкції, пероральній чи інгаляційній імунізації тих самих антигенів, вони можуть індукувати толерантність або імунне відхилення. В останньому відбувається зміна ролі Т-хелперів різних субпопуляцій у імунній відповіді. Як відомо, вкрай важливу роль у експресії імуноглобулінів різних ізотипів відіграють цитокіни, зокрема інтерлейкіни 4 та 5, г-інтерферон, в-трансформуючий фактор росту. Продуцентами згаданих цитокінів є різні Т-лімфоцити. Беручи до уваги всі наведені дані, можна припустити, що роль різних субпопуляцій Т-клітин у імунній відповіді при підшкірній та внутрішньовенній імунізації є різною. Відтак різними є й цитокінові профілі, що призводить до неоднакової експресії імуноглобулінових ізотипів. По-друге, при різних способах введення та дозах антигену імунодомінантними можуть бути різні епітопи. Тому логічно припустити, що при первинній підшкірній імунізації тварин відповідь була скерована на одну групу епітопів, а при внутрішньовенному бустер-введенні IgМ - на іншу. Тому у випадку довгострокової схеми ми цілком могли спостерігати співвідношення між IgG- та IgM-антитілами, характерне для первинної імунної відповіді. Таке припущення підтверджується результатними встановлення епітопної специфічності одержаних МКАТ. Клони антитіл, одержаних в результаті короткострокової та довгострокової схем, мали різну епітопну специфічність.

Епітопне картування проводили із використанням методики конкурентного ТІФА, яка передбачає використання як самих МКАТ, так і їх кон'югатів. У зв'язку із чим попередньо перйодатним методом були синтезовані пероксидазні кон'югати отриманих антитіл. З метою невілювання впливу різної афінності пар МКАТ, для оцінки використовувалися не абсолютні значення конкурентного зв'язування, а профілі конкурентної реактивності кожного МКАТ по відношенню до інших за допомогою методу кореляційного аналізу. Порівняльну епітопну характеристику проводили для панелі високоактивних та специфічних клонів моноклональних антитіл: 12 МКАТ, отриманих за короткостроковою схемою імунізації, та 9 МКАТ отриманих за довгостроковою схемою імунізації (разом 21 МКАТ). Проведене епітопне картування МКАТ свідчить про наявність 3-х (А, В, С) імунодомінантних епітопних регіонів (ЕР) молекули IgM людини, до яких направлені досліджувані клони МКАТ. До ЕР А відноситься 1 домінуючий епітоп А1, що представлений найбільшим числом високоафінних МКАТ, та 2 суміжних епітопи А2 й А3 із середньою афінністю. ЕР В містить 2 прилеглих епітопи В1 та В2 із МКАТ середнім значенням афінності. До складу ЕР С входить лише 1 епітоп із МКАТ середньої афінності. Встановлено, що епітопна специфічність отриманих анти-IgM МКАТ залежала від схеми імунізації. Короткострокова схема імунізації приводила до моноспецифічності МКАТ проти ЕР-А, а при довгостроковій схемі отримані МКАТ спрямовані на антигенні детермінанти ЕР-В та ЕР-С. Характеристика гібридом та МКАТ до IgМ людини наведена у табл. 2.

Використання МКАТ до IgM людини у ІФА для виявлення антитіл, специфічних до збудників інфекційних захворювань. Подальші дослідження були спрямовані на дослідження різних варіантів імуноферментного аналізу для визначення специфічних IgM-антитіл до збудників інфекційних захворювань. Отримані МКАТ використовувалися або у вигляді імуносорбенту (IgM-«пастка»), або у вигляді пероксидазного кон'югату (непрямий ІФА).

Для характеристики кон'югатів та імуносорбентів у складі тест-систем була використана наступна схема: первинний аналіз здійснювали на внутрішньовиробничих оціночних панелях сироваток, а найкращі кон'югати перевіряли на сероконверсійних та низькотитражних панелях охарактеризованих сироваток. Із використанням даних панелей проводили визначення показників чутливості та специфічності аналізу. Для більш повної характеристики діагностичної якості кон'югатів та імуносорбентів вивчали динаміку зміни їх активності при тривалому зберіганні. В першу чергу у складі діагностичних наборів характеризували пероксидазні кон'югати та імуносорбенти МКАТ, одержаних за короткостроковою схемою. Вивчення моноклональних антитіл, одержаних за довгостроковою схемою, продовжували на основі компонентів тих тест-систем, у яких МКАТ першої групи засвідчили незадовільні результати.

Дослідження іммобілізованих МКАТ починали з набору для виявлення IgM-антитіл до T. gondii. За результатами перевірки 12 іммобілізованих МКАТ у складі набору Toxoplasma-IgM два (112С5.2 й 111С2) з них виявилися значно активнішими (у 1,5-2,0 рази) за референтні антитіла СН2 та МВ11 (рис. 7).

Імуносорбенти МКАТ 112С5.2 та 111С2 виявилися більш стабільними: їх активність при зберіганні упродовж трьох місяців зменшилася до 71% та 66%, відповідно. У той же час, актитвність іммобілізованих МКАТ СН2 через три місяці склала лише 44 % від початкової (рис. 8).

Таблиця 2 Характеристика моноклональних антитіл до IgМ людини

№	Назва МКАТ	Оптична густина у ТІФА*	Ізотип	Титр у культуральній рідині	Константа афінності Ка*, 109 моль/л	Епітопна специфічність	Реакція імуно-преципітації
Короткострокова схема імунізації
1	111A4	2,324	IgG2b	1:800	10,0	А1	-
2	111C2	2,660	IgG2b	1:1000	10,0	А1	-
3	111C9	2,785	IgG2a	1:500	14,0	А1	-
4	112C5.2	3,201	IgG2b	1:1000	5,0	А1	-
5	112G9	2,004	IgG2b	1:1000	5,0	А2	-
6	112H12	2,998	IgG1	1:1000	10,0	А2	+
7	113F8	3,012	IgG2b	1:800	5,0	А1	-
8	114B8	2,825	IgG2b	1:1000	5,0	А2	-
9	114G10	2,431	IgG1	1:1000	5,0	А3	-
10	116A2	3,021	IgG2b	1:800	5,0	А3	-
11	116C4	3,010	IgG1	1:800	5,0	А2	+
12	117B5	3,003	IgG2b	1:800	5,0	А3	-
Довгострокова схема імунізації
13	121В8	3,032	IgG1	1:800	10,0	В2	+
14	124E7	3,058	IgG3	1:500	10,0	В1	-
15	125B5	2,506	IgG2b	1:500	5,0	В1	-
16	125C2	3,012	IgG1	1:1000	5,0	В2	+
17	125C8	2,639	IgG3	1:500	5,0	С	-
18	126B10	2,432	IgG2a	1:500	5,0	С	-
19	126G6	2,603	IgG1	1:1000	5,0	В1	-
20	127E9	2,962	IgG2b	1:500	5,0	С	-
21	127H9	2,622	IgG1	1:500	10,0	В1	-
*Тестування у непрямому ТІФА при сорбції IgM людини 0,5 мкг на лунку. У таблиці наведено середні значення ОГ та константи афінності при тестуванні супернатантів гібридом у чотирьох повторностях (р < 0,05).

З використанням іммобілізованих МКАТ 112С5.2 розроблено діагностичну тест-систему Toxoplasma-IgМ, специфічність та чутливість якої склали 100% (при використанні охарактеризованих панелей сироваток). Аналогічні результати були отримані при розробці та дослідженні ІФА для виявлення антитіл класу IgM специфічних до вірусу краснухи (Rubella-IgM) та збуднику урогенітального хламідіозу (Chlamydia-IgM).

Дослідження властивостей кон'югатів МКАТ, отриманих за короткостроковою схемою імунізації, первинно проводили у непрямому ІФА для виявлення специфічних до цитомегаловірусу людини IgM-антитіл (рис. 8). Найбільшим індексом позитивності характеризувався ІФА із використанням пероксидазного кон'югату 112Н12-HRP (індекс позитивності у 2,7 рази вищий, ніж у випадку референтного кон'югату МВ11-HRP). Подальші дослідження кон'югату 112Н12-HRP засвідчили високі показники специфічності та чутливості ІФА та більшу стабільність (рис. 9) даних МКАТ у порівнянні із референтним кон'югатом МВ11-HRP. У наступних дослідженнях було доведено високі аналітичні властивості кон'югату 112Н12-HRP при визначенні IgM-антитіл до Helicobacter pylori (Helicobacter-IgM).



Рис.7. Результати характеристики МКАТ, одержаних за короткостроковою схемою імунізації (обчислення ІП проводили за результатами тестування 8 негативних та 8 позитивних на специфічні IgM-антитіла сироваток; р < 0,05)

Дослідження діагностичних характеристик МКАТ, отриманих за довгостроковою схемою, проводили за аналогічною методикою. Вивчення властивостей ІФА іммобілізованими одержаними моноклональними антитілами проводили у складі діагностичного набору призначеного для виявлення антитіл класу IgМ до вірусу простого герпесу І та ІІ типів, оскільки при використанні імуносорбентів на основі МКАТ 112С5.2 та 111С2 були одержані низькі результати щодо чутливості аналізу.

За результатами дослідження властивостей 9 іммобілізованих МКАТ у складі набору HSVЅ-IgM два (125В5 та 126G6) з них виявилися значно активнішими (приблизно у 1,4 рази) за референтні антитіла клону МВ11 (рис. 10). Імуносорбенти МКАТ 125В5 та 126G6 виявилися більш стійкими: їх залишкова активність після трьохмісячного зберігання склала близько 70 % (для іммобілізованих МКАТ СН2 цей показник склав 44 %).



Рис.10. Результати характеристики МКАТ, одержаних за довгостроковою схемою імунізації (обчислення ІП проводили за результатами тестування 8 негативних та 8 позитивних на специфічні IgM-антитіла сироваток; р < 0,05)

При дослідженні властивостей кон'югатів МКАТ у ІФА для визначення антитіл класу IgМ до капсидного (VCA) антигену вірусу Епшейна-Барр виявилося, що жоден з трьох найактивніших кон'югатів отриманих нами МКАТ (125С2-HRP, 124Е7-HRP, 125В5-HRP) не забезпечував високі показники аналізу, не забезпечував переваги у порівнянні з кон'югатами референтних МКАТ СН2 та МВ11 (рис. 10). Для покращення показників інформативності ІФА для визначення антитіл класу IgМ до VCA ВЕБ нами було запропоновано сумісне використання кон'югатів МКАТ, що відносяться до ЕР В та ЕР А, та не проявляють перехресної реактивності один із одним (за результатами вивчення епітопної специфічності МКАТ). Дослідження характеристик ІФА при сумісному використанні кон'югатів МКАТ 125С2, 124Е7 (ЕР В) та МКАТ 112Н12, 116С4 (ЕР А) показали, що коефіцієнт позитивності аналізу зростав у 1,5-2,0 рази у порівнянні із монокон'югатами (рис. 11). У наступних дослідженнях було доведено високі специфічність, чутливість та стабільність пари кон'югатів 25С2-HRP + 112Н12-HRP при визначенні IgM-антитіл до VCA ВЕБ.

Використання анти-IgM МКАТ для розробки методики специфічного виділення й очистки IgM людини. Наші дослідження були спрямовані на розробку методики імуноафінної хроматографії для виділення IgM людини, що передбачало: підбір МКАТ й оптимальних умов для синтезу імуноафінного носія, підвищення специфічності зв'язування IgM з імуноафінним сорбентом, підбір умов відмивання колонки й елюції IgM, контроль чистоти препарату.

Для синтезу імуноафінного сорбенту було відібрано 4 клони МКАТ (112C5.2, 111C2, 126G6, 125B5), які виявили високу активність у поєднанні із достатньою специфічністю при використанні їх у складі імуносорбенту в ТІФА для виявлення IgM-антитіл до вірусу простого герпеса та T.gondii. Було визначено оптимальний час іммобілізації МКАТ на сефарозі, який склав 6 годин. Оптимізацію загальної методики очищення IgM людини проводили шляхом порівняльного вивчення властивостей 4 імуноафінних сорбентів (з МКАТ 112C5.2, 111C2, 126G6, 125B5), а також умов елюції.

Рис. 11. Характеристика ТІФА для виявлення IgM-антитіл до капсидного антигену ВЕБ при сумісному використанні кон'югатів МКАТ 125С2, 124Е7, 112Н12, 116С4 (обчислення ІП проводили за результатами тестування 8 негативних та 8 позитивних на специфічні IgM-антитіла сироваток; р < 0,05)

Для досягнення ефективної елюції IgM людини проводили порівняльні дослідження щодо умов дисоціації комплексу «антиген-антитіло» при зниженні показника рН (0,1 М HCl-гліциновий буфер, рН 2,5) та використанні хаотропного агенту (3,5 М MgCl₂). Вивчення умов елюції здійснювали паралельно для 4-х згаданих вище МКАТ. Було встановлено, що МКАТ 125B5 активніше зв'язують IgM сироватки й, головне, чистота елюйованого імуноглобуліну набагато вища, ніж у випадку з іншими антитілами. Серед 2-х варіантів елюції, за допомогою MgCl₂ і гліцин-HCl, перший виявився кращим: при його використанні IgM елюювався із колонки в більшій концентрації й елюція була повною (табл. 3). Нівелювання неспецифічного зв'язування компонентів сироватки із сорбентом досягали за рахунок додаткової хроматографії із застосуванням іммобілізованих мишачих МКАТ, які не проявляли активності до IgM людини (антитіла до вірусу поліомієліту). Із використанням такого прийому попередньо видаляли компоненти сироватки, які взаємодіють із імуносорбентом й елюються разом із IgM, забруднюючи препарат останнього. Отримані результати засвідчили підвищення ефективності процесу очищення IgM при використанні додаткового етапу хроматографії - питомий вихід IgM збільшився у 1,32 рази.

Перевірку чистоти одержаного IgM проводили за допомогою електрофорезу у ПААГ з ДСН. Для препарату IgМ було виявлено дві смуги, що відповідали важким та легким ланцюгам IgM. Такі результати електрофорезу засвідчували високу чистоту одержаного препарату, вміст IgM наближався до 100%.

Використання анти-IgM МКАТ для розробки методики кількісного визначення IgM людини. Ще одним прикладом використання анти-IgM МКАТ є розробка на їх основі високочутливого ІФА для кількісного визначення IgM людини, який можна використовувати для контролю продукції й визначення рівня секреції імуноглобулінів В-клітинами, наприклад, у культурі лімфоцитів з метою диференціального діагнозу первинних імунодефіцитів або оцінки ступеню вторинних імунодефіцитів, обумовлених низьким рівнем антитіл.

Таблиця 3 Порівняльна характеристика різних схем імуноафінної хроматографії

Характеристика	Варіанти елюції
	MgCl2Ч6H2O	гліцин-HCl
	112C5.2	111C2	125B5	126G6	112C5.2	111C2	125B5	126G6
Вихідна концентрація IgM, мг/мл	1,21	1,21	1,21	1,21	1,21	1,21	1,21	1,21
Концентрація IgM у фракції, що не зв'язалася, мг/мл	0,24	0,31	0,13	0,19	0,27	0,32	0,17	0,21
Кількість IgM в елюаті, мг	0,56	0,48	0,72	0,62	0,52	0,49	0,67	0,52
Примітка. Підрахунок концентрації IgM проводили за результатами проведення хроматографічного аналізу у 4 повторностях; р < 0,05.

Для розробки відповідного ІФА нами було прийнято рішення використовувати пари МКАТ із різною епітопною специфічністю. Оскільки на попередніх етапах роботи було вивчено властивості всієї панелі отриманих МКАТ та виявлено антитіла, що забезпечують найкращі аналітичні характеристики у непрямому ІФА (у вигляді імуноферментного кон'югату) та у IgM-«пастці» (у складі імносорбенту), то було можливо сформувати пари МКАТ для розробки ІФА для кількісного визначення IgM людини. За результатами вивчення властивостей МКАТ у ІФА для визначення специфічних IgM антитела епітопу А1 (111С2, 112С5.2) та епітопу В1 (125В5, 126G6) засвідчили кращі результати при використанні у складі імуносорбенту, а епітопу А2 (112Н12, 116С4) та епітопу В2 (125С5) - у складі імуноферментного кон'югату (для детекції). Таким чином, антитіла епітопів А1-В2 та В1-А2 являли собою найбільш вірогідну «сендвіч»-комбінацію для конструювання неконкурентного ІФА. Сорбційно-детекційна здатність різних пар МКАТ корелювала із їх афінністю, й була максимально вираженою для високоафінних МКАТ 125В5 і 112Н12. Дана пара МКАТ використовувалася для подальших досліджень, в рамках яких проводили визначення границі чутливості, динамічного діапазону, варіабельність, специфічність (перехресну реактивність) розробленого ІФА.

Розроблений ІФА характеризувався чутливістю, яка на порядок перевищує методи нефелометрії та турбідіметрії (50 нг/мл). Динамічний діапазон розробленого ІФА склав 2 порядки (11-3200 нг/мл) і передбачав попереднє розведення сироватки/плазми крові та інших біологічних рідин при його постановці. Показники варіабельності, а саме величини коефіцієнтів варіації в рамках однієї постановки (intra-CV = 4,8±2,0 %) й між постановками (inter-CV = 5,3±2,2%), були цілком допустимими для даного методу досліджень. Для визначення перехресної реактивності розробленого «сендвіч»-ІФА проводили дослідження із використанням інших білків крові (IgG, IgA, IgE людини, альбумін). Отримані результати засвідчили, що жоден із досліджуваних білків сироватки не впливав на визначення тест-концентрації (100 нг/мл) IgM людини. Отже, розроблений «сендвіч»-ІФА для кількісного визначення IgM людини характеризувався високою чутливістю та специфічністю, а також задовільною варіабельністю аналізу.

Узагальнення. За результатами проведених досліджень можна запропонувати загальну біотехнологічну схему отримання анти-IgM моноклональних антитіл та їх використання для розробки імуноферментних діагностикумів (рис. 12).

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені теоретичне узагальнення і нові шляхи вирішення наукової задачі, що стосується розробки біотехнології одержання моноклональних антитіл до IgM людини та створення імуноферментних діагностикумів й методики імуноафінної хроматографії на їх основі. Результати досліджень дають змогу зробити наступні висновки.

1. Одержано оригінальний набір із 21 нового клону гібридом, продуцентів моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини класу М. Проведено вивчення біологічних властивостей антитіл: встановлено їх специфічність, константу афінності та титр у культуральній рідині, а також здійснено епітопне картування МКАТ.

2. Встановлено, що епітопна структура молекули IgM людини містить три основні епітопні регіони (ЕР): А, В і С. До ЕР А відноситься один домінуючий епітоп А1, що представлений найбільшим числом високоафінних МКАТ, та два суміжних епітопи А2 й А3 із середньою афінністю. ЕР В містить два прилеглих епітопи В1 та В2 із МКАТ середнім значенням афінності. До складу ЕР С входить лише один епітоп із МКАТ середньої афінності.

3. Доведено, що епітопна специфічність анти-IgM МКАТ залежить від схеми імунізації. Короткострокова схема імунізації приводить до моноспецифічності антитіл проти ЕР-А, а при довгостроковій схемі отримані МКАТ спрямовані на антигенні детермінанти ЕР-В та ЕР-С.

4. Порівняльно вивчена можливість використання двох схем імунізації для одержання моноклональних антитіл до IgМ людини. З огляду на високі імунохімічні характеристики МКАТ, швидкість одержання результатів та відсутність алергічних реакцій у мишей лінії Balb/c більш зручною та адекватною виявилася короткострокова схема імунізації.

5. Досліджені діагностичні характеристики одержаних моноклональних антитіл при їх використанні у складі імуноферментного кон'югату та імуносорбенту. Один кон'югат МКАТ за показниками інформативності переважав відомий аналог СН2 (Сорбент, Росія), а ще три МКАТ у складі сорбенту забезпечували кращі аналітичні показники у порівнянні із моноклональними антитілами МВ11 (Sigma, США).

6. Доведена можливість використання кон'югатів двох МКАТ у складі тест-систем для діагностики цитомегалії (кон'югат 112H12-HRP) й Епштейн-Барр вірусної інфекції (суміш кон'югатів 112H12-HRP і 125С2-HRP), також трьох МКАТ у складі імуносорбенту тест-наборів для діагностики токсоплазмозу, краснухи та урогенітального хламідіозу (антитіла 112С5.2), а також вірусу простого герпеса (антитіла 125В5 та 126G6).

7. Розроблено високочутливий імуноферментний набір для кількісного визначення сумарних IgM-антитіл із аналітичною чутливістю 11 нг/мл. Запропоновано добревідтворювану та просту у виконанні методику специфічного виділення IgM людини із використанням імуноафінного сорбенту на основі отриманих анти-IgM МКАТ.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Nikolayenko I.V. Preparation of highly purified human IgG, IgM, and IgA for immunization and immunoanalysis / I.V.Nikolayenko, O.Yu.Galkin, N.I.Grabchenko, M.Ya.Spivak // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - Vol. 2, 2. - P. 3-11. (Здобувач брав участь у плануванні роботи, аналізі літературних даних, обговоренні результатів. Брав участь у проведенні афінної хроматографії, гель-фільтрації, визначенні чистоти препаратів імуноглобулінів у імунодифузії за Оухтерлоні).

2. Галкін О.Ю. Основні принципи одержання і відбору моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини // Наукові вісті НТУУ «КПІ». - 2007. - №1. - С. 99-106.

3. Галкін О.Ю. Одержання та вивчення властивостей нових моноклональних антитіл до IgM людини / О.Ю.Галкін, І.В.Ніколаєнко, О.М.Дуган // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. - 2009. - Випуск 5 (92). - С.105-118. (Здобувач брав участь у плануванні роботи, аналізі та узагальненні результатів проведених досліджень та літературних даних, підготовці статті до друку. Особисто брав участь у імунізації мишей лінії Balb/c, підготовці мієломних клітин, гібридизації, клонуванні та тестуванні клонів гібридом, проведенні характеристик МКАТ та їх пероксидазних кон'югатів. Особисто проведено порівняльну епітопну специфічність МКАТ).

4. Галкін О.Ю. Порівняння схем імунізації мишей лінії Balb/c для одержання моноклональних антитіл до IgM людини / О.Ю.Галкін, О.М.Дуган // Імунологія та алергологія. - 2009. - №1. - С.68-73. (Здобувач брав участь у плануванні роботи, аналізі та узагальненні результатів проведених досліджень та літературних даних, підготовці статті до друку. Особисто брав участь у імунізації мишей, підготовці мієломних клітин, гібридизації, клонуванні й тестуванні клонів гібридом, проведенні характеристик МКАТ та їх пероксидазних кон'югатів. Особисто проведено порівняльну епітопну специфічність МКАТ).

5. Галкін О.Ю. Одержання імуноаффінного сорбенту та розробка методики специфічного виділення IgM людини // Наукові вісті НТУУ «КПІ». - 2009. - №2. - С.98-102.

6. Патент України на корисну модель 20311 UA, МПК7 С12N5/00. Схема імунізації для отримання моноклональних антитіл проти імуноглобулінів людини / Ніколаєнко І.В., Галкін О.Ю.; Ніколаєнко І.В., Галкін О.Ю. - № u 2006 08421; Заявл. 27.07.2006; Опубл. 15.01.2007. (Здобувач брав участь у плануванні роботи, аналізі та узагальненні результатів проведених досліджень та літературних даних, підготовці заявки на видачу патенту. Особисто брав участь у імунізації мишей лінії Balb/c, підготовці мієломних клітин, гібридизації, клонуванні та тестуванні клонів гібридом, проведенні характеристик МКАТ).

7. Галкін О.Ю. Застосування моноклональних антитіл у сучасній медицині / О.Ю.Галкін, І.В.Ніколаєнко, Л.М.Шинкаренко // Актуальні проблеми сучасної медицини: 58 науково-практичної конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця (28 - 31 жовтня 2003 р., м. Київ) / За ред. В.З.Нетяженка. - К.: НМУ, 2003. - С. 55 - 56. (У написанні тез та підготовці її до друку брали участь всі автори).

8. Ніколаєнко І. Гібридомна технологія: теоретичні основи та практичне застосування / І.Ніколаєнко, О.Галкін, Г.Раєвська, І.Гостенко // Збірник тез доповідей учасників Установчого з'їзду українського товариства клітинної біології (25 - 27 квітня 2004 р., м. Львів). - Львів: Інститут білогії клітини НАН України, 2004. - С. 89. (В узагальненні результатів проведених досліджень та літературних даних, обговоренні отриманих результатів, написанні тез та підготовці її до друку брали участь всі автори).

9. Галкін О.Ю. Основні принципи одержання та використання моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матеріали VI Національного з'їзду фармацевтів України (28 - 30 вересня 2005 р., м. Харків). - Харків: НФаУ, 2005. - С. 336.

10. Галкін О.Ю. Гібридомна технологія як одне з найбільш суттєвих досягнень у галузі імунобіотехнології // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: Матеріали VI Національного з'їзду фармацевтів України (28 - 30 вересня 2005 р., м. Харків). - Харків: НФаУ, 2005. - С. 336-337.

11. Галкін О.Ю. Основні принципи одержання та використання у серодіагностиці моноклональних антитіл до імуноглобулінів людини // Молодь і поступ біології: Тези доповідей учасників ІІ Міжнародної конференції студентів та аспірантів (21 - 24 березня 2006 р., м. Львів). - Львів, 2006. - С. 282-283.

12. Galkin O.Yu. Immunization schemas for obtaining of monoclonal antibodies against human immunoglobulins // Молодь і поступ біології: Тези доповідей учасників V Міжнародної конференції студентів та аспірантів (12-15 травня 2009 р., м. Львів). - Львів, 2009. - С. 282-283.

АНОТАЦІЯ

Галкін О.Ю. Біотехнологія одержання та використання моноклональних антитіл до IgM людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Одеський національний університет імені І.І. Мечникова Міністерства освіти і науки України, м. Одеса, 2010 рік.

У дисертаційній роботі представлені результати досліджень по розробці біотехнологічних основ одержання та використання моноклональних антитіл до IgМ людини. Одержано оригінальний набір із 21 нового клону гібридом, продуцентів МКАТ проти IgM людини. Визначено специфічність МКАТ, їх константу афінності та титр у культуральній рідині. Встановлено, що епітопна структура молекули IgM людини містить три основні епітопні регіони (ЕР): А, В і С. До ЕР А відноситься 1 домінуючий епітоп А1, що представлений найбільшим числом високоафінних МКАТ, та 2 суміжних епітопи А2 й А3 із середньою афінністю. ЕР В містить 2 прилеглих епітопи В1 та В2 із МКАТ середнім значенням афінності. До складу ЕР С входить лише 1 епітоп із МКАТ середньої афінності. Доведено, що епітопна специфічність анти-IgM МКАТ залежить від схеми імунізації. Короткострокова схема імунізації приводить до моноспецифічності антитіл проти ЕР-А, а при довгостроковій схемі отримані МКАТ спрямовані на антигенні детермінанти ЕР-В та ЕР-С.

Доведена можливість використання кон'югатів 2-х МКАТ у складі ІФА тест-систем для діагностики цитомегалії й Епштейн-Барр вірусної інфекції, також 3-х МКАТ у складі імуносорбенту наборів для діагностики токсоплазмозу, краснухи та урогенітального хламідіозу та простого герпесу.

Розроблено високочутливий ІФА набір для кількісного визначення IgM-антитіл із аналітичною чутливістю 11 нг/мл. Запропоновано методику специфічного виділення IgM людини із використанням імуноафінного сорбенту на основі отриманих анти-IgM МКАТ.

Ключові слова: гібридоми, моноклональні антитіла, імуноглобуліни, епітопи, імуноферментний аналіз, імуноафінні сорбенти.

АнНотация

Галкин А.Ю. Биотехнология получения и использования моноклональных антител к IgM человека. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Одесский национальный университет имени И.И. Мечникова Министерства образования и науки Украины, г. Одесса, 2010 год.

В диссертационной работе представлены результаты исследований по разработке биотехнологических основ получения и использования моноклональных антител к IgМ человека. Получен оригинальный набор из 21 нового клона гибридом, продуцентов МКАТ к IgM человека. Определены специфичность МКАТ, их константа аффинности и титр в культуральной жидкости. Установлено, что эпитопная структура молекулы IgM человека содержит три основные эпитопные региона (ЭР): А, В и С. К ЭР А относится один доминирующий эпитоп А1, который представлен наибольшим числом высокоаффинных МКАТ, и два смежных эпитопа А2 и А3 со средней аффинностью. ЭР В содержит 2 прилегающих эпитопа В1 и В2 с МКАТ средним значением аффинности. В состав ЭР С входит лишь 1 эпитоп с МКАТ средней аффинностью. Доказано, что эпитопная специфичность анти-IgM МКАТ зависит от схемы иммунизации. Краткосрочная схема иммунизации приводит к моноспецифичности антител к ЭР-А, а при долгосрочной схеме полученные МКАТ направлены на антигенные детерминанты ЭР-В и ЭР-С.

...