Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені В. Н. КАРАЗІНА

03.00.15 - генетика

УДК: 576.312.332+575.224.2]:616.697

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВНЕСОК ГЕНЕТИЧНИХ ЧИННИКІВ У СТРУКТУРУ ІДІОПАТИЧНОГО НЕПЛІДДЯ ЧОЛОВІКІВ

ЗАХІДНОГО РЕГІОНУ УКРАЇНИ

Тиркус Марта Ярославівна

Харків - 2010

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділенні діагностики спадкової патології ДУ «Інститут спадкової патології АМН України» (м. Львів)

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Заставна Данута Володимирівна,

ДУ «Інститут спадкової патології АМН України» (м. Львів), завідувач відділення діагностики спадкової патології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Багацька Наталія Василівна ДУ «Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України» (м. Харків), завідувач лабораторії медичної генетики кандидат біологічних наук, Тижненко Тетяна Василівна.

ДУ «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України» (м. Харків), науковий співробітник лабораторії патофізіології та медичної генетики.

Захист дисертації відбудеться «01» лютого 2011 р. о 15.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21. Харківського національного університету iм. В.Н. Каразiна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077 м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету iм. В.Н. Каразiна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077 м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розіслано «31» грудня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради К 64.051.21. О. М. Федота

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

генетичний сперматогенез непліддя

Актуальність теми. Приблизно у п?яти відсотків чоловіків репродуктивного віку спостерігаються різноманітні відхилення кількісних або якісних показників сперми, які призводять до непліддя. Близько третини таких випадків відносять до ідіопатичного непліддя, причини виникнення якого до кінця не з'ясовані. Згідно з сучасними даними, ідіопатичне непліддя у чоловіків значною мірою (на 30-50%) зумовлене генетичними чинниками, серед яких виділяють кількісні та структурні порушення хромосом, мікроделеції Y хромосоми [Simoni M. et al., 2008], а також функціональні дефекти білків, що виникають внаслідок мутацій цілої низки генів, серед яких провідне місце займають мутації гена трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу [Лівшиць Л.А., 2001, Горовенко Н.Г., 2000]. До цього слід додати потребу врахування особливостей генетичної структури окремих популяцій, яка передбачає певні відмінності в розподілі генетичних маркерів схильності до чоловічого непліддя [Tьtitman F. et al., 2007].

Мікроделеції Y хромосоми, які не виявляються за допомогою стандартних цитогенетичних методів, є однією з найвагоміших генетичних причин чоловічого непліддя. Більшість пошкоджень Y хромосоми виникає de novo та призводить до порушення процесів сперматогенезу в чоловіків. Відносно висока частота Y-делецій може свідчити про схильність до спонтанних втрат генетичного матеріалу в цій хромосомі. Природа такого явища залишається предметом дискусії, в межах якої вважаємо актуальним вивчення часткових делецій AZFc регіону Y хромосоми як можливого тригерного механізму чоловічого непліддя.

Маніфестація муковісцидозу має багато форм завдяки великій кількості мутацій [www.genet.sickkids.on.ca/cftr] та найрізноманітнішим порушенням у межах гена ТРБМ. Мутації гена ТРБМ виявляють як при типовому перебігу муковісцидозу, так і при інших фенотипових проявах, пов'язаних із мутаціями гена ТРБМ (CFTR-related disorders - CFTR-RD). До них, зокрема, належить вроджена аплазія сім'явивідних протоків.

Одним із можливих механізмів чоловічої стерилізації може бути крипторхізм. Порушення екскреції і метаболізму статевих гормонів виявляється у 95% хворих з крипторхізмом. У підлітковому та юнацькому віці у хворих хлопчиків з'являються ознаки гіпогеніталізму із запізненням статевого дозрівання [Багацька Н.В., 2004]. У чоловіків з крипторхізмом в анамнезі фертильний потенціал знижується до 25%-75%. Актуальним залишається пошук генетичних передумов порушення фертильності при крипторхізмі.

Зв'язок роботи з іншими науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному планові науково-дослідницьких робіт відділення діагностики спадкової патології ДУ "Інститут спадкової патології АМН України" і виконувалась в рамках комплексної НДР: "Вивчення ролі генетичних маркерів нестабільності геному у взаємозв'язку із репродукційними втратами у людини" (№ держ. реєстрації 0106U012621, 2007-2009рр.). Робота частково виконувалась у рамках отриманого на конкурсних засадах гранту від Західно-Українського Біо-Медичного Наукового Центру (WUBMRC).

Мета роботи. З'ясувати частоту та спектр генетичних чинників формування порушень процесів сперматогенезу при ідіопатичному неплідді у чоловіків Західного регіону України.

Для досягнення мети поставлені наступні завдання:

1. Сформувати групи пацієнтів та створити банк ДНК чоловіків з ідіопатичним непліддям, пацієнтів з крипторхізмом та фертильних чоловіків Західного регіону України.

2. Провести цитогенетичне дослідження у чоловіків з ідіопатичним непліддям.

3. Провести молекулярно-генетичне дослідження AZFa, AZFb, AZFc регіонів Y хромосоми та гена SRY у групі чоловіків з ідіопатичним непліддям.

4. Вивчити частоту та спектр мутацій гена ТРБМ та поліморфного локусу IVS8-5/7/9T в обстежуваній групі чоловіків з ідіопатичним непліддям.

5. Провести клініко-генеалогічні, цитогенетичні та молекулярно-генетичні дослідження у хлопчиків з крипторхізмом.

6. Визначити інформативні маркери геному людини, які задіяні у формуванні тригерних механізмів порушення процесів сперматогенезу.

7. Запропонувати алгоритм генетичних обстежень чоловіків з ідіопатичним непліддям - як один із заходів попередження репродуктивних втрат у людини.

Об'єкт дослідження: генетичні чинники порушень процесів сперматогенезу у чоловіків.

Предмет дослідження: хромосоми, мутації генів Y хромосоми, мутації та поліморфні варіанти гена ТРБМ.

Методи дослідження: клініко-генеалогічний, молекулярно-генетичні: виділення та очистка ДНК; ПЛР, мультилокусна ПЛР, алель-специфічна ПЛР; гетеродуплексний, делеційний та рестрикційний аналіз продуктів ПЛР; цитогенетичний; статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Створено банк ДНК, який нараховує 400 зразків ДНК чоловіків з порушеннями сперматогенезу та 100 зразків пацієнтів з крипторхізмом. Вперше в Україні вивчено частоту та спектр часткових делецій AZFc регіону Y хромосоми в контингентах неплідних чоловіків і хлопчиків з крипторхізмом. Встановлено, що часткові делеції AZFc регіону Y хромосоми є фактором ризику порушень сперматогенезу у фертильному віці, а також - предиктивним маркером подальшого формування інфертильного фенотипу у випадках крипторхізму, діагностованого в дитячому віці. Вперше для з'ясування генетичних чинників непліддя у чоловіків Західного регіону України проведено комплексне дослідження частоти та спектру кількісних та структурних порушень хромосом, мікроделецій AZF регіону і гена SRY Y хромосоми, а також мутацій та алельних варіантів гена ТРБМ. Дістало подальше розуміння питання вичленення інформативних маркерів геному людини, які задіяні в порушенні процесів сперматогенезу та статевої диференціації у неплідних чоловіків та в осіб з крипторхізмом.

Практичне значення одержаних результатів. Проведено селективний скринінг подружніх пар із репродуктивними втратами скерованих Львівським ММГЦ на наявність хромосомних аномалій, мікроделецій Y хромосоми та мутацій гена ТРБМ. Налагоджено комплекс клініко-генеалогічних, цитогенетичних та молекулярно-генетичних досліджень у інфертильних чоловіків і хлопчиків з крипторхізмом. Встановлено високу результативність комплексу цито- та молекулярно-генетичних досліджень серед чоловіків з ідіопатичним непліддям. У 17,5% неплідних чоловіків з різними формами порушень сперматогенезу з'ясовано генетичну передумову порушення фертильності.

Впровадження запропонованого у роботі алгоритму генетичного обстеження неплідних чоловіків у практику медико-генетичної служби України дозволить своєчасно виявляти сім'ї високого ризику щодо репродуктивних втрат та проводити профілактичні заходи, що вплине на показники покращення генофонду, забезпечить позитивний медико-соціальний та економічний ефекти.

Використаний в роботі метод виділення ДНК шляхом висолювання оформлений та виданий у вигляді патенту на корисну модель «Спосіб виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові» (Макух Г.В., Заставна Д.В., Тиркус М.Я., Третяк Б.І., Чорна Л.Б. - 2008. - Бюл.№8, № 32044), а використані в роботі методи молекулярно-генетичної діагностики склали основу методичних рекомендацій «Методики молекулярно-генетичного аналізу муковісцидозу, фенілкетонурії та синдрому Ніймеген» (Г.В. Макух, О.З. Гнатейко, Д.В. Заставна, М.Я. Тиркус, Г.Р. Акопян. - 2009. - 28с.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконувались усі етапи дисертаційної роботи; планування, пошук та опрацювання літературних джерел, виконання і оформлення тексту дисертаційної роботи. Весь обсяг молекулярно-генетичної експериментальної частини дисертації виконано автором самостійно, апробовано та оптимізовано проведення полімеразної ланцюгової реакції, мультилокусної ПЛР, алель-специфічної ПЛР, гетеродуплексного та рестрикційного аналізу продуктів ПЛР. Автор проаналізував та узагальнив результати клінічних та цитогенетичних досліджень. Співучасть співробітників відділення діагностики спадкової патології, Львівського міжобласного медико-генетичного центру, лікарів-андрологів та лікарів-урологів у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на міжнародних та вітчизняних з міжнародною участю конференціях та з'їздах: III International young scientists conferens «Biodiversity. Ecologi. Adaptation. Evolution.» (Одеса, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання медичної генетики» (Київ, 2007), VIII з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавілова (Алушта, 2007); науково-практичній конференції «Генетичні аспекти порушень репродукційної функції людини» (Львів, 2007); IV міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2008); IV з'їзді медичних генетиків України з міжнародною участю (Львів, 2008); V міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Алушта, 2009); European Society of Human Reproduction and Embryology Annual Meeting (Італія, Рим, 2010).

Публікації. За темою дисертації надруковано 19 праць, зокрема 8 статей у спеціалізованих наукових виданнях, у тому числі 5 статей у виданнях, що рекомендовані ВАК України як фахові з біологічних наук.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація, яка має 3 розділи, складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, додатків та списку використаних джерел. Дисертаційну роботу викладено на 141 сторінці комп'ютерного тексту. Текст дисертації проілюстровано 15 таблицями, 19 рисунками та 1 додатком. Перелік використаних джерел охоплює 261 найменування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження

Матеріалом дослідження слугували зразки крові неплідних чоловіків з порушеними показниками спермограми, хлопчиків з крипторхізмом та фертильних чоловіків,які мають двоє і більше здорових дітей.

Виділення та очищення ДНК проводили методом фенольної екстракції [Маниатис Т. и др.,1984] та методом висолювання [Макух Г.В. та ін., 2008].

Ампліфікацію послідовностей ДНК in vitro проводили, використовуючи метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [Mc.Pherson M.J. et al., 1993]. ПЛР проводили в автоматичному режимі на термоциклері «Терцик». Наявність мікроделеції AZF регіону Y хромосоми, гена SRY та часткових делецій AZFс регіону Y хромосоми визначали за допомогою мультилокусних ПЛР [Simoni M. et al., 2004, Norambuena P. et al., 2008]. Для детекції алелів у триалельній поліморфній послідовності IVS8polyT - 5Т, 7Т, 9Т використовували алель-специфічну ПЛР [Friedman K. et al., 1997].

Для ідентифікації мутацій гена ТРБМ застосовували метод рестрикційного аналізу продуктів ПЛР відповідних послідовностей.

Електрофорез тотальної ДНК та продуктів ПЛР проводили в 2% агарозному гелі в камері для горизонтального електрофорезу «MGU-202T». Для розділення продуктів ПЛР з малою молекулярною вагою проводили електрофорез ДНК у 10% поліакриламідному гелі, приготованому на трис-боратному буфері в камері для вертикального електрофорезу «HELICON».

Електрофореграми сканували на ультрафіолетовому трансілюмінаторі «ECX-15.M». Отримані сигнали порівнювали з маркерами довжин і на основі цього детектували розміри отриманих фрагментів. Результати сканування гелів знімали цифровою камерою «Gel Imager» через червоний світлофільтр на ультрафіолетовому трансілюмінаторі при довжині хвилі 256 нм. Обробку зображень здійснювали на комп'ютері за допомогою програм Adobe Photoshop CS та Gel Explorer 2.0.

Культивування лімфоцитів проводили за стандартною методикою [Зерова-Любимова Т.Е. та ін., 2003] з певними модифікаціями. З метою отримання середньо мітотичних хромосом одночасно з колхіцином вводили бромистий етидій в концентрації 10 мкг/мл. Препарати забарвлювали GTG- або СBG-методами [Зерова-Любимова Т.Е. та ін., 2003]. Стандартно аналізували на мікроскопі «Axiostar Plus» по 20-25 метафаз задовільної якості із кількістю 550 бендів на гаплоїдний набір.

Статистичний аналіз даних проводили за загальнопринятими методами [Атраментова Л. А. та ін., 2008]. Перевірку статистичних гіпотез проводили на рівні значущості р ? 0,05.

Результати дослідження та їх обговорення

Обстежено 400 чоловіків з порушенням процесів сперматогенезу різного ступеня, 100 хлопчиків, прооперованих з приводу крипторхізму, і їхні родини, які звернулися у Львівський міжобласний медико-генетичний центр на консультацію та 100 фертильних чоловіків, які мають не менше двох здорових дітей, без скарг на репродуктивну функцію. Всі обстежувані індивіди є вихідцями із Західної України.

За результатами клінічного аналізу досліджуваної групи неплідних чоловіків встановлено широкий спектр порушень процесів сперматогенезу. Всі обстежувані чоловіки мали багаторічне непліддя незрозумілого генезу, а показники спермограми практично не піддавались корекції. Враховуючи, що ідіопатичне непліддя в переважній більшості зумовлене генетичними чинниками, видавалось необхідним проведення цито- та молекулярно-генетичних досліджень у групі неплідних чоловіків Західного регіону України.

Крипторхізм є одним із найбільш розповсюджених вад чоловічого сечостатевого тракту, але проблеми порушення фертильності в майбутньому залишаються недостатньо вивченими. Хлопчики з крипторхізмом складають групу ризику по чоловічому неплідді при статевому дозріванні навіть при умові вчасного оперативного втручання. Тому вважали за доцільне проведення клініко-генеалогічних, цито- та молекулярно-генетичних досліджень у групі хлопчиків з крипторхізмом.

Результати цитогенетичних обстежень чоловіків з ідопатичним непліддям. Аналіз цитогенетичних досліджень неплідних чоловіків показав, що внесок хромосомних аномалій при ідіопатичному неплідді складає 8,25%.

У спектрі хромосомних аномалій, виявлених серед чоловіків із ідіопатичним непліддям, назагал 33 випадки, суттєво переважала дисомія по Х хромосомі (синдром Кляйнфельтера) із частотою 66,67%. З частотою 6,06% виявляли дисомію по Y хромосомі. На структурні аномалії хромосом (рівною мірою як статевих, так і аутосом) назагал припадало 12,12%. У п'яти випадках у неплідних чоловіків встановлений жіночий 46,XX-каріотип при чоловічому фенотипі (синдром де ля Шапеля), що склало 15,15% в групі пацієнтів з порушенням каріотипу. Наші дані співзвучні з результатами інших цитогенетиків [Etem E.O. et al., 2009] щодо частоти синдрому Кляйнфельтера - як домінуючої аномалії каріотипу у чоловіків з порушеннями процесів сперматогенезу.

Результати досліджень показали, що з високою частотою аномалії каріотипу виявлялися у групі осіб з аспермією/азооспермією - 18,00%, рідше у групі чоловіків з олігозооспермією/олігоастенотератозооспермією IV ст. - 6,00% та жодного випадку аномалій каріотипу не виявлено у групі осіб з кількістю сперматозоїдів в еякуляті >5млн/мл. Отже, порушення каріотипу зазвичай асоціювалися з важкими порушеннями процесів сперматогенезу, які клінічно проявлялися цілковитою відсутністю сперматозоїдів в еякуляті або присутністю їх в концентрації <5млн/мл.

Молекулярно-генетичний аналіз мікроделецій AZF регіону Y хромосоми у неплідних чоловіків з різними формами порушення процесів сперматогенезу. Молекулярно-генетичні дослідження мікроделецій AZFa, AZFb та AZFc регіонів та гена SRY Y хромосоми проводили за допомогою двох мультилокусних ПЛР реакцій в наступних STS локусах: sY14, sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255 (рис.1 та рис.2). У групі неплідних чоловіків Західного регіону України мікроделеції AZF регіону Y хромосоми виявлено у 29 із 400 осіб, що становить 7,25% за їх повної відсутності в контрольній групі фертильних чоловіків (р=0,016).

Проаналізувавши отримані результати щодо кореляції виявлених мікроделецій AZF регіону з характером порушень процесів сперматогенезу, стало очевидним, що найчастіше мікроделеції виявляли у групі осіб з аспермією/азооспермією - 13,33% (p=0,0001). З нижчою частотою мікроделеції виявляли в групі осіб з олігозооспермією/олігоастенотератозооспермією IV ст. - 8,00% (p=0,004) і лише в одного пацієнта з групи осіб, де кількість сперматозоїдів в еякуляті >5млн/мл, виявлено мікроделеції AZFc регіону Y хромосоми, що становить 0,67% (p=0,6). Подібні генофенотипові кореляції, характерні для делецій AZF регіону, описані іншими дослідниками [Simoni M. et al., 2008, Фесай О.А. та ін. 2008, Черных В.Б.и др., 2009].

Спектр мікроделецій у групі неплідних чоловіків (29 випадків) був наступним: мікроделеції субрегіону AZFa виявлено в однієї особи (3,45%), субрегіону AZFb - у трьох осіб (10,34%), субрегіонів AZF(b+c) - у семи осіб (24,14%), мікроделеції субрегіону AZFc виявлено у тринадцяти осіб - (44,83%).

У п'яти осіб встановлено відсутність усієї послідовності AZF(а+в+с) Y хромосоми, що становить 17,24%. Під час проведення цитогенетичного аналізу у цих осіб встановлено каріотип 46,ХХ (синдром де ля Шапеля). Щодо гена SRY, то молекулярно-генетичний аналіз показав його наявність у чотирьох осіб та у одного пацієнта - відсутність. За даними літератури, більшість пацієнтів з синдромом де ля Шапеля є носіями гена SRY на одній з Х хромосом, що і пояснює чоловічий фенотип, однак у 20% обстежених пацієнтів з синдромом де ля Шапеля цей ген не виявляють [Vorona E. et al.,2007].

Щодо частот виявлених мікроделецій AZFa, AZFb та AZFс регіонів, то вони принципово співпадають із даними інших дослідників [Viswambharan N. et al., 2004. Simoni et al.,2004, Singh A. et al.,2006]. Слід відзначити виявлену у роботі вищу частоту протяжної делеції AZF(b+c) регіонів у порівнянні з іншими вибірками, що може бути обумовлено етногеографічною особливістю західноукраїнської популяції.

Переважна більшість описаних вище AZF мікроделецій утворюється de novo. Молекулярно-генетичні дослідження мікроделецій AZF регіону у батьків обстежуваних пацієнтів з мікроделеціями AZFс регіону не засвідчили успадкування таких мікроделецій, що підтверджує їх виникнення de novo. Але разом з тим, вони мають тенденцію до закріплення у подальших поколіннях по чоловічій лінії.

Отже, мікроделеції Y хромосоми є однією з найбільш вагомих генетичних причин ідіопатичного непліддя. Тому видається за необхідне проведення детекції мікроделецій Y хромосоми у всіх чоловіків з кількістю сперматозоїдів в еякуляті <5млн/мл та у чоловіків, які планують ІКСІ.

Молекулярно-генетичні дослідження мутацій гена ТРБМ у чоловіків із ідіопатичним непліддям. Для молекулярно- генетичного дослідження мутацій гена ТРБМ та виявлення серед обстежених чоловіків випадків так званих CFTR-related disorders (фенотипів, пов'язаних з мутаціями гена ТРБМ) сформовано групу у кількості 108 осіб із клінічними ознаками, характерними для цієї нозології (аспермія/ азооспермія, дво- або одностороннє порушення прохідності сім'явивідних протоків, знижений об'єм насінної плазми, патологічна в'язкість еякуляту, знижений рН, підвищений рівень електролітів хлору в поті).

До спектру мутацій, які склали панель молекулярно-генетичного дослідження мутацій гена ТРБМ чоловіків з підозрою на атипову форму муковісцидозу, увійшли мутації, поширені серед хворих на МВ в Західному регіоні України [Макух Г.В., 2001, Makukh H.et al., 2010] та мутації, характерні для CFTR-RD [Dequeker E. et al., 2009, Castellani C. et al., 2008]. Таким чином, нами сформовано наступну панель 29 мутацій гена ТРБМ для генетичного тестування чоловіків із підозрою на генітальну форму муковісцидозу: F508del, I507del, CFTRdele2,3(21kb), 2184insA, 2143delT, G542X, N1303K, W1282X, G551D, R553X, 1717-1G>A, 3849+10kbC>T, 621+1G>T, 1898-1G>A, R117H, D1152H, R347P, R347H, R347L, R347C, R334W, I336K, R560T, G551S, Q552X, Y122X, D1270N, S549I, S549N та 5Т/7Т/9Т алелів поліморфного локусу IVS8polyT.

Результати досліджень показали, що мутацію F508del в гетерозиготному стані виявлено у чотирнадцяти осіб, що становить 12,96%, мутацію G542X в гетерозиготному стані виявлено у однієї особи - 0,93% та у двадцяти двох осіб виявлено 5Т алель поліморфного локусу IVS8polyT, що становить 20,37%.

Комбінація 5Т алеля в одній копії гена з ТРБМ мутацією в іншій копії є найпоширенішою причиною генітальної форми муковісцидозу. Таких випадків у нашій досліджуваній групі було виявлено п'ять: у чотирьох осіб мутація F508del та у однієї особи мутація G542X поєднані з 5Т алелем поліморфного локусу IVS8polyT.

Генофенотиповий аналіз показав наступні клінічні порушення у цих осіб: у двох пацієнтів діагностовано аспермію на фоні непрохідністі сім'явивідних протоків (F508del/5Т та G542X/5Т); у двох пацієнтів аспермія, знижений об'єм насінної плазми, збільшена в'язкість еякуляту та знижений рН (F508del/5Т та F508del/5Т); у одного пацієнта аспермію та рівень хлоридів у поті 79,5 мекв/л (F508del/5Т).

У десяти випадках мутацію F508del гена ТРБМ та сімнадцяти випадках 5Т алель поліморфного локусу IVS8polyT ідентифіковано лише в одному з алелів гена ТРБМ. Серед осіб з ідентифікованою мутацією F508del в одному алелі - у одного пацієнта діагностовано аспермію, непрохідність сім'явивідних протоків та підвищений рівень хлоридів у поті (65,18 мекв/л); у двох осіб - аспермію та непрохідність сім'явивідних протоків; у однієї особи - азооспермію та знижений об'єм насінної плазми, збільшена в'язкість та знижений рН еякуляту. Серед осіб з ідентифікованим лише 5Т алелем - у двох пацієнтів спостерігалась аспермія та непрохідність сім'явивідних протоків.

В одного пацієнта триразове проведення потової проби показало підвищений (90,1 мекв/л) рівень іонів хлору за відсутності вищенаведених мутацій гена ТРБМ та порушень зі сторони травної чи дихальної системи. Порушення прохідності сім'явивідних протоків та достовірно підвищений рівень електролітів у поті дозволив верифікувати у цього пацієнта генітальну форму муковісцидозу.

Отже, в результаті сукупного молекулярно-генетичного та клінічного аналізу у 13 із 108 осіб верифіковано чоловіче непліддя, зумовлене мутаціями гена ТРБМ - генітальну форму муковісцидозу, що становить 12,04%.

Для з'ясування ролі мажорної мутації F508del та 5Т алеля поліморфного локусу IVS8polyT в етіології порушень процесів сперматогенезу, окрiм ВАСП, проведено молекулярно-генетичне дослідження мутації F508del та 5Т алеля серед неплідних чоловіків Західного регіону України, контрольній групі плідних чоловіків з двома і більше здоровими дітьми та в контрольній групі індивідів без обтяженого генетичного анамнезу.

Результати досліджень показали, що частота мажорної мутацiї F508del є вірогідно вищою у загальній групі неплідних чоловiкiв (4,75%) у порівнянні з групою здорових індивідів західноукраїнської популяції (1,67%) (р=0,026; OR=2,94 при ДІ 1,09-7,97). Частота 5Т алеля поліморфного локусу IVS8polyT в обстеженій групі інфертильних чоловіків складає 9,25%, що є дещо вищою у порівнянні із вибіркою фертильних чоловіків, де частота 5Т алеля склала 5,00% (p=0,170; OR=1,94 при ДІ 0,75-5,06).

Отримані результати можуть свідчити на користь того, що зміни структури і/або експресії гена ТРБМ асоційовані з порушенням сперматогенезу, а не лише з вродженою відсутністю сім'явивідних протоків [Фесай О.А. та ін., 2008]. Тому гетерозиготне носійство мутації F508del за певних умов може бути тригером порушення фертильності. Це припущення є цілком імовірним з огляду на досить високий рівень експресії гена ТРБМ у клітинах різних відділів статевої системи чоловіків.

Виходячи з результатів досліджень, діагностичними критеріями для генетичного скринінгу мутацій гена ТРБМ серед неплідних чоловіків є азооспермія/аспермія, знижений об'єм насінної плазми (<2,0мл), pH<7,2, збільшена в'язкість еякуляту, природжене дво- або одностороннє порушення прохідності сім'явивідних протоків чи їх відсутність та планування застосовування допоміжних репродуктивних технологій.

Отже, вагомий внесок кожного з генетичних чинників у порушення процесів сперматогенезу показує високу результативність комплексу цито- та молекулярно-генетичних досліджень серед чоловіків з ідіопатичним непліддям (табл.1.). Назагал, верифіковано генетичну компоненту у 17,50% неплідних чоловіків з різними формами порушення сперматогенезу. Низький відсоток виявлення генетичних чинників порушення сперматогенезу у групі неплідних чоловіків з кількістю сперматозоїдів в еякуляті >5млн/мл свідчить про недоцільність проведення генетичних досліджень у чоловіків при кількісті сперматозоїдів в еякуляті більше 5млн/мл.

Клініко-генеалогічний аналіз у пацієнтів з крипторхізмом. У групі хлопчиків з крипторхізмом у 66 осіб діагностовано однобічний крипторхізм і у 34 осіб -двобічний. Серед пацієнтів з однобічним крипторхізмом правобічну форму мали 60% хлопчиків, лівобічну - 40%. Біля 40% хлопчиків з крипторхізмом мали супутні захворювання, дизморфічні риси та вроджені аномалії. Причому п'яту частину всіх супутніх вад складали аномалії сечостатевих органів: гіпоспадія, фімоз, міхурово-мисковий рефлюкс, гідронефроз, епіспадія, екстрофія сечового міхура, пахова кила, гідрофунікулоцелє. Іншими супутніми соматичними вадами були патології передньої черевної стінки, опорно-рухового апарату та офтальмологічні порушення.

Таблиця 1. Результати комплексних генетичних досліджень у чоловіків порушенням процесів сперматогенезу

Досліджувані підгрупи чоловіків	Частота аномалій каріотипу	Частота мікроделеційY хромосоми	Частота мутацій гена ТРБМ	Генетична компонента
Чоловіки з відсутністю сперматозоїдів в еякуляті	18,00	13,33	12,04	43,37
Чоловіки з кількістю сперматозоїдів в еякуляті <5млн/мл	6,00	8,00	_____	14,00
Чоловіки з кількістю сперматозоїдів в еякуляті >5млн/мл	0	0,67	_____	0,67
Всього	8,25	6,00	3,25	17,50

У 38 родинах хлопчиків з крипторхізмом проведено генеалогічні дослідження. Дані генеалогічного аналізу збирались до прародичів по вертикальній лінії та до двоюрідних сибсів - по горизонтальній шляхом графічного зображення сімейного дерева (родоводу). Обтяжений репродуктивний анамнез виявлено у 17 матерів, у них попередні вагітності закінчувались пренатальними втратами та самовільними викиднями. У процесі збору клініко-генеалогічних даних встановлено чотири випадки крипторхізму серед родичів першого, другого та третього ступенів спорідненості, що складає 10,53% обстежених родин. Окрім того, виявлена родина, де зафіксовані випадки крипторхізму у двох сім'ях. Отже, 13,16% обстежених родин мали сімейну форму крипторхізму.Цитогенетичні та молекулярно-генетичні дослідження у хлопчиків з крипторхізмом. Під час проведення цитогенетичних досліджень у пацієнтів з крипторхізмом у трьох осіб зафіксовано наступні зміни каріотипу: каріотип 46,XYinv(2)(p11q13)[20]/46,XY виявлено у хлопчика з лівобічним крипторхізмом, у хлопчика з двобічним крипторхізмом виявлено каріотип 45,Х/46,Х,і(Хq)/46,ХY та каріотип 46,ХХ у пацієнта з двобічним крипторхізмом. Результати молекулярно-генетичних досліджень показали, що в групі осіб з крипторхізмом мікроделеції Y хромосоми виявлено у трьох осіб, що відповідно склало 3,00%. Слід наголосити, що молекулярно-генетичні дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми в хлопчиків з крипторхізмом вперше проведено в Україні.Cпівставлення AZF-мікроделецій з каріотипом показало, що мікроделецію субрегіону AZFb у ділянці Y127 виявлено у хлопчика, який клінічно мав двобічний крипторхізм при нормальному каріотипі. У хлопчика з двобічним крипторхізмом та каріотипом 45,Х/46,Х,і(Хq)/46,ХY виявили мікроделеції субрегіонів AZFb+c. Відсутність усіх локусів AZF регіону та гена SRY виявлено у пацієнта з двобічним крипторхізмом та каріотипом 46,ХХ.Таким чином, у 3,00% хлопчиків з крипторхізмом діагностовано аномалії каріотипу. У 2/3 випадків аномалії стосувалися Y хромосоми і супроводжувалися мікроделеціями AZF регіону Y хромосоми. Сумарна частота мікроделецій AZF регіону Y хромосоми та аномалій каріотипу при крипторхізмі становить 4,00%, що передбачає порушення процесів сперматогенезу при статевому дозріванні навіть за умови вчасного оперативного втручання з опускання яєчок у калитку. Порівняльний молекулярно-генетичний аналіз часткових делецій AZFс регіону Y хромосоми у хлопчиків з крипторхізмом та неплідних чоловіків. Як зазначалось, у чоловіків з крипторхізмом в анамнезі є значні порушення сперматогенезу і їх репродуктивний потенціал значно знижений, тому ще одним напрямком наших досліджень був пошук спільних генетичних маркерів порушення фертильності у осіб з крипторхізмом та чоловіків з ідіопатичним непліддям. Особливий інтерес під час таких досліджень викликають часткові делеції AZFc регіону Y хромосоми. Вперше в Україні проведено молекулярно-генетичний аналіз часткових делецій b1/b3, b2/b3, b2/b4, gr/gr AZFс регіону Y хромосоми у групі неплідних чоловіків, хлопчиків з крипторхізмом та фертильних чоловіків Західного регіону України (рис.4 та рис.5).Молекулярно-генетичний аналіз часткових делецій AZFс регіону Y хромосоми показав, що у групі фертильних чоловіків часткових делецій не виявлено, у групі неплідних чоловіків виявили наявність часткових делецій різного спектру у шістнадцяти осіб, що становить 8,00% (p=0,004) та у групі хлопчиків з крипторхізмом часткові делеції виявлено у шести осіб, що становить 6,25% (p=0,011). Статистичний аналіз даних показав вірогідне підвищення сумарної частоти детектованих часткових делецій AZFс регіону у досліджуваних групах пацієнтів у порівнянні із фертильними чоловіками. Щодо спектру часткових делецій AZFc регіону у групі неплідних чоловіків, серед 16 виявлених випадків часткову делецію gr/gr знайдено у п'яти осіб (2,50%), делецію b2/b3 знайдено у дев'яти осіб (4,50%) та у двох осіб виявлено відсутність локусу sY1201 (1,00%). Серед хлопчиків з крипторхізмом делецію gr/gr знайдено у трьох осіб (3,13%), делецію b2/b3 знайдено у двох осіб (2,08%) та у однієї особи виявлено відсутність локусу sY1201 (1,05%). Отримані результати вказують на те, що частота виявлення часткових делеції AZFc регіону Y хромосоми у групі чоловіків з різними формами порушення сперматогенезу та хлопчиків з крипторхізмом є суттєвою, оскільки в контрольній групі плідних чоловіків часткових делецій не виявлено. Отримані результати дозволяють припустити, що часткові делеції AZFc регіону можуть бути генетичним маркером порушення сперматогенезу у чоловіків та тригером майбутньої інфертильності у хлопчиків з крипторхізмом.Детекцію часткових делецій було проведено у батьків хлопчиків з частковою делецією gr/gr. Дослідження показали успадкування мікроделеції gr/gr від батька до сина. В іншому випадку у батька хлопчика з двобічним крипторхізмом часткових делецій не виявлено, тобто в цій родині вона виникла de novo. Ми вважали доцільним проведення молекулярно-генетичного аналізу часткових делецій AZFс регіону у групі осіб з детектованими мікроделеціями AZF регіону різного спектру (n=24). У пацієнта з мікроделецією регіону AZFa часткових делецій не виявлено, серед двох пацієнтів з мікроделеціями регіону AZFb виявлено часткові делеції b1/b3 та b2/b3 та у всіх пацієнтів з мікроделеціями регіонів AZF(b+c) та AZFc виявлено делецію b2/b4. З отриманих результатів очевидно що у чоловіків з мікроделеціями AZFс та AZF(b+c) субрегіонів наявність часткових делецій b2/b4 підтверджує повну відсутність AZFс регіону. Детекція часткових делецій b1/b3 та b2/b3 у чоловіків з AZFb мікроделеціями вказує на складність будови Y хромосоми та те, що у сперматогенез залучена велика кількість генів Y хромосоми.Виходячи з результатів роботи, для встановлення можливих генетичних передумов непліддя пропонуємо наступний алгоритм поетапних досліджень для чоловіків з ідіопатичним непліддям при кількості сперматозоїдів у еякуляті менше 5 млн/мл (рис.6.).Запропонований алгоритм поетапних досліджень дозволить поставити коректний діагноз, виключити зайві обстеження, уникнути непотрібного дороговартісного лікування та підібрати коректні підходи під час застосування допоміжних репродуктивних технологій.

Рис. 6. Алгоритм поетапних досліджень чоловіків з ідіопатичним непліддям.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та вирішення наукового завдання, яке полягає в обгрунтуванні доцільності проведення комплексних цито- та молекулярно-генетичних досліджень серед чоловіків з ідіопатичним непліддям.

1. Аномалії каріотипу в обстежуваній групі неплідних чоловіків виявлено у 8,25% випадків. Всі аномалії каріотипу асоціювалися з важкими порушеннями процесів сперматогенезу - цілковитою відсутністю сперматозоїдів в еякуляті або присутністю їх в концентрації менше 5 млн/мл.

2. У групі неплідних чоловіків у 7,25% випадків діагностовано мікроделеції Y хромосоми, за цілковитої відсутності їх в контрольній групі. Найважчі порушення процесів сперматогенезу асоціювалися з мікроделеціями AZFa та AZFb регіонів, хоча найчастіше виявляли мікроделеції AZFc регіону, які асоціювалися з широким спектром порушень процесів сперматогенезу.

3. У групі неплідних чоловіків з підозрою на генітальну форму муковісцидозу в 12,04% верифіковано чоловіче непліддя, зумовлене мутаціями гена ТРБМ, а в загальній групі чоловіків з ідіопатичним непліддям спостерігалося вірогідно значиме (порівняно з групою здорових індивідів західноукраїнської популяції) підвищення частоти мажорної мутації F508del гена ТРБМ.

4. Сумарна частота мікроделецій AZF регіону Y хромосоми та аномалій каріотипу при крипторхізмі становить 4,00%, що передбачає порушення процесів сперматогенезу при статевому дозріванні навіть за умови вчасного оперативного втручання з опускання яєчок в калитку.

5. Часткові делеції AZFc регіону Y хромосоми діагностовані у 8,00% неплідних чоловіків та у 6,25% хлопчиків з крипторхізмом за цілковитої відсутності їх у контрольній групі плідних чоловіків.

6. Отримані результати дозволяють припустити, що часткові делеції AZFc регіону можуть бути генетичним маркером порушення сперматогенезу у чоловіків та тригером майбутньої інфертильності у хлопчиків з крипторхізмом в анамнезі.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Тиркус М. Я. Частота та спектр мікроделеції Y-хромосоми у чоловіків з різними формами порушення сперматогенезу / М.Я. Тиркус // Фактори експериментальної еволюції організмів: зб. наук. пр. - 2009. - Т. 7.- С. 387-392.

2. Нестабільність геному - як передумова репродукційних втрат у людини / Д.В. Заставна, Н.Л. Гулеюк, М. Я. Тиркус, Г.М. Безкоровайна // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: зб. наук. пр. - 2007. - Т. 1. - C. 447-451. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми.

3. Мікроделеції Y-хромосоми як прогностичний маркер неплідь у чоловіків / М.Я. Тиркус, Г.В. Макух, Д.В. Заставна, Н.Л. Гулеюк, А.Й. Наконечний, Б.Р. Стойка // Цитологія і генетика. - 2008. - № 2. - С. 46-50. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних досліджень, молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону, узагальнення одержаних даних.

4. Внесок основних генетичних чинників в етіологію порушень сперматогенезу / М.Я. Тиркус, Г.В. Макух, О.Б. Білевич, Д.В. Заставна // Фактори експериментальної еволюції організмів: зб. наук. пр. - 2008. - Т. 4. - С. 429-433. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних досліджень, молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми та мутацій гена ТРБМ, аналіз цитогенетичних досліджень, узагальнення одержаних даних.

5. Вивчення генетичних аспектів репродуктивних порушень у людини / Д.В. Заставна, О.І. Терпиляк, Н.Л. Гулеюк, М.Я. Тиркус // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, № 2. - С. 201-208. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми.

6. Клініко-генеалогічні дослідження у пацієнтів з крипторхізмом / Н.В. Гельнер, А.Й Наконечний, Д. В. Заставна, МЯ. Тиркус, К.О. Сосніна // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: зб. наук. пр. - Київ-Луганськ-Харків., 2009. - С. 20-32. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, аналіз та узагальнення одержаних даних.

7. САG-полиморфизм гена андрогенового рецептора у мужчин с азооспермией и олигозооспермией из Украины / О.А. Фесай, С.А. Кравченко, М.Я. Тыркус, Г.В. Макух, В.М. Зинченко, Г.В. Стрелко, Л.А. Лившиц // Цитологія і генетика. - 2009. - № 6. - С. 45-51. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних та молекулярно-генетичних досліджень чоловіків з порушенням сперматогенезу, які звернулись у Львівський ММГЦ.

8. Complex cytogenetic and molecular-genetic analysis of males with spermatogenesis failure / N. Huleyuk, D. Zastavna, M. Tyrkus, H. Makukh, S. Gavrylyshyn, M. Kurpish // Cytology and Genetics. - 2010. - Vol. 44, № 6. - P. 370-375. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних досліджень, молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми та мутацій гена ТРБМ.

9. Генетичні чинники в етіології чоловічої неплідності / М.Я. Тиркус, Н.Л. Гулеюк, Г.В. Макух, Г.М. Безкоровайна, С.В. Гаврилишин, Д.В. Заставна // Актуальні питання медичної генетики: наук.-прак. конф. з міжнар. участю, 17-18 квіт. 2007 р.: тези допов. - К., 2007. - С. 115. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ, аналіз цитогенетичних досліджень, узагальнення одержаних даних.

10. The molecular-genetic testing of CFTR gene mutations in infertile males with spermatogenic defects / O. Bilevych, M. Tyrkus // Biodiversity. Ecologi. Adaptation. Evolution.: III International young scientists conferens, 15-18 May, 2007: abstracts. - Odessa, 2007. - Р. 177-178. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мутацій гена ТРБМ та узагальнення одержаних даних.

11. Роль мікроделецій Y-хромосоми в етіології чоловічої неплідності / М.Я. Тиркус, Г.В. Макух, Д.В. Заставна, В.І. Черепанін, А.І. Воробець // Генетичні аспекти порушень репродукційної функції людини: наук.-прак. конф., 18-19 жовт. 2007 р.: тези допов. - Львів, 2007. - С. 31. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних досліджень, молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, узагальнення даних.

12. Молекулярно-генетичні дослідження мутацій гена ТРБМ у чоловіків з різними формами патоспермії / Г.В. Макух, О.З. Гнатейко, М.Я. Тиркус, О.Б. Білевич // Генетичні аспекти порушень репродукційної функції людини: наук.-прак. конф., 18-19 жовт. 2007 р.: тези допов. - Львів, 2007. - С. 22. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мутацій гена ТРБМ, узагальнення одержаних даних.

13. Результати комплексних цито- та молекулярно-генетичних обстежень подружніх пар з репродукційними втратами в анамнезі / Д.В. Заставна, Н.Л. Гулеюк, Г.М. Безкоровайна, М.Я. Тиркус // Генетичні аспекти порушень репродукційної функції людини: наук.-прак. конф., 18-19 жовт. 2007 р.: тези допов. - Львів, 2007. - С. 15. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми.

14. The chromosome abnormalities, Y-chromosome microdeletions and CFTR gene mutations testing of infertility man from Western Ukraine. / M. Tyrkus, N. Huleyuk, O. Bilevych, D. Zastavna, H. Makukh // European Jornal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 16. - P. 361. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ, аналіз цитогенетичних досліджень, узагальнення одержаних даних.

15. Генетичні аспекти непліддя / Д.В. Заставна, Н.Л. Гулеюк, М.Я. Тиркус, О.І. Терпиляк, Г.В. Макух // IV з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю, 9-11 жовт. 2008 р.: тези допов. - Львів, 2008. - С. 18. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ, аналіз цитогенетичних досліджень.

16. Аналіз мутацій гена ТРБМ в асоціації із результатами потового тесту у чоловіків із ідіопатичним непліддям / Г.В. Макух, М.Я. Тиркус, О.Б. Білевич, Л.Б. Чорна, Д.В Заставна // IV з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю, 9-11 жовт. 2008 р.: тези допов. - Львів, 2008. - С. 29. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мутацій гена ТРБМ, аналіз результатів потової проби, узагальнення одержаних даних.

17. Висока інформативність комплексу цито- та молекулярно-генетичних досліджень для діагностики причин порушення сперматогенезу у чоловіків./ М.Я. Тиркус, Н.Л. Гулеюк, М І. Микула, Г.М. Безкоровайна, В.І. Черепанін, Д.З. Воробець, С. В. Гаврилишин // IV з'їзд медичних генетиків України з міжнародною участю, 9-11 жовт. 2008 р.: тези допов. - Львів, 2008. - С. 35. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ, узагальнення одержаних даних.

18. Frequency and spectrum of chromosomal abnormalities, Y-chromosome microdeletions and CFTR gene mutations among Ukrainian infertile men / M. Tyrkus, N. Huleyuk, H. Makukh, S. Gavrylyshyn, M. Kurpish, D. Zastavna // 4th Utah-Florence Symposium on the Genetics of Male Infertility, 4-6 February, 2010: abstracts. - Salt Lake City, 2010. Особистий внесок здобувача - молекулярно-генетині дослідження мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ, аналіз цитогенетичних досліджень, узагальнення одержаних даних.

19. Partial deletions in the AZFc region of the Y chromosome are common among infertile men but not in fertile men from Ukraine / H. Makukh, M. Tyrkus, D. Zastavna, A. Nakonechnuy // Human Reproduction.- 2010. - Vol. 25, № 1.- P. 40. Особистий внесок здобувача - аналіз спермологічних досліджень, молекулярно-генетичні дослідження часткових делецій AZFс регіону Y хромосоми, узагальнення одержаних даних.

20. Пат. 32044 UA, МПК G01N33/49 (2006.01) Спосіб виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові / Г.В. Макух, Д.В.Заставна, М.Я. Тиркус, Б.І. Третяк, Л.Б. Чорна, заявник ДУ «Інститут спадкової патології АМНУ». - № u200801896; заявл. 14.02.2008; опубл. 25.04.2008, Бюл.№8.

АНОТАЦІЯ

Тиркус М.Я. Внесок генетичних чинників у структуру ідіопатичного непліддя чоловіків Західного регіону України - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15. - генетика. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2010.

Дисертаційна робота присвячена вивченню генетичних чинників ідіопатичного непліддя чоловіків - кількісних та структурних порушень хромосом, мікроделецій AZF регіону Y хромосоми, мутацій гена ТРБМ та часткових делецій AZFс регіону Y хромосоми.

Встановлено генетичну компоненту ідопатичного непліддя у 17,5% чоловіків Західного регіону України з порушенням процесів сперматогенезу. Внесок хромосомних аномалій при цьому склав 8,25%, мікроделеції AZF регіону Y хромосоми детектовано у 7,25%, у 12,04% верифіковано чоловіче непліддя, зумовлене мутаціями гена ТРБМ - генітальну форму МВ.

Частота виявлення часткових делеції AZFc регіону Y хромосоми у групі чоловіків з різними формами порушення сперматогенезу та хлопчиків з крипторхізмом є суттєвою, оскільки в контрольній групі фертильних чоловіків часткових делецій AZFc регіону не виявлено. Отримані результати дозволяють припустити, що часткові делеції AZFc регіону можуть бути генетичним маркером порушення сперматогенезу у чоловіків та тригером майбутньої інфертильності у хлопчиків з крипторхізмом.

Запропоновано алгоритм поетапних цито- та молекулярно-генетичних досліджень для чоловіків з ідіопатичним непліддям при кількості сперматозоїдів у еякуляті менше 5 млн/мл.

Ключові слова: чоловіче непліддя, сперматогенез, Y хромосома, AZF регіон, ген ТРБМ, мутація, крипторхізм

АННОТАЦИЯ

Тыркус М.Я. Вклад генетических факторов в структуру идиопатического бесплодия мужчин Западного региона Украины - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15. - генетика. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2010.

Диссертационная работа посвящена изучению генетических маркеров мужского идиопатического бесплодия - количественным и структурным нарушениям хромосом, микроделециям AZF региона Y хромосомы, мутациям гена ТРБМ и частичным делециям AZFс региона Y хромосомы.

В результате комплексных цито- и молекулярно генетических исследований установлена генетическая компонента у 17,5% бесплодных мужчин Западного региона Украины с разными формами нарушения сперматогенеза .

Анализ цитогенетических исследований бесплодных мужчин, показал, что хромосомные аномалии при идиопатическом бесплодии составили 8,25%. В спектре хромосомных аномалий, обнаруженных среди мужчин с идиопатическим бесплодием, существенно преобладала дисомия по Х хромосоме (синдром Кляйнфельтера) с частотой 66,7%. В пяти случаях у бесплодных мужчин установлен женский 46,XX-кариотип при мужском фенотипе (синдром де ля Шапеля). Аномалии кариотипа обычно ассоциировались с тяжелыми нарушениями процессов сперматогенеза, которые клинически проявлялись полным отсутствием сперматозоидов в эякуляте или присутствием их в концентрации менее 5 млн/мл.

В группе бесплодных мужчин микроделеции AZF региона Y хромосомы выявлены в 7,25%. Проанализировав полученные результаты относительно корреляции обнаруженных микроделеций AZF региона с характером нарушений процессов сперматогенеза, установили, что чаще всего микроделеции детектировали в группе лиц с аспермией/азооспермией (13,3%), с частотой 8% микроделеции детектировали в группе лиц с олигозооспермией/ олигоастенотератозооспермией IVст. и только у одного пациента из группы лиц, где количество сперматозоидов в эякуляте >5млн/мл выявлена микроделеция AZFc региона Y хромосомы. Тяжелые нарушения процессов сперматогенеза асоциировались с микроделециями AZFa и AZFb регионов, хотя чаще детектировали микроделеции AZFс региона, которые ассоциировались с широким спектром нарушений процессов сперматогенеза.

С целью выявления среди обследованных мужчин случаев так называемых CFTR-related disorders (фенотипов, связанных с мутациями гена ТРБМ) проводили молекулярно- генетическое исследование мутаций гена ТРБМ в группе лиц с клиническими признаками, характерными для этой нозологии. Нами сформирована панель 29 мутаций и 5Т/7Т/9Т алелей полиморфного локусу IVS8polyT гена ТРБМ для генетического тестирования мужчин с подозрением на генитальную форму муковисцидоза. В спектр мутаций вошли мутации, распространенные среди больных на муковисцидоз в Западном регионе Украины и мутации, характерные для CFTR-RD.

Мутация F508del в гетерозиготном состоянии обнаружена у четырнадцати пациентов (12,96%), мутация G542X в гетерозиготном состоянии обнаружена у одного пациента (0,93%) и у двадцати двух пациентов (20,37%) детектирован 5Т аллель полиморфного локусу IVS8polyT. Итак, в результате комплексного молекулярно-генетического и клинического анализа у 13 из 108 человек верифицировано мужское бесплодие, обусловленное мутациями гена ТРБМ (генитальная форма МВ), что составляет 12,04%.

Анализ клинико-генеалогических данных семей мальчиков прооперированных по поводу крипторхизма, выявили 4 случая крипторхизма среди родственников первой, второй и третьей степени родства, что составляет 10,53% обследованных родоводов. Кроме того, выявлена большая семья, где зафиксированы случаи крипторхизма в двух ядерных семьях. Итак, 13,16% обследованных семей имели семейную форму крипторхизма. У 3,00% мальчиков с крипторхизмом диагностированы аномалии кариотипа. У 2/3 случаев аномалии касались Y хромосомы и сопровождались микроделециями AZF региона. Суммарная частота микроделеций AZF региона Y хромосомы и аномалий кариотипа при крипторхизме составляет 4,00% и предусматривает нарушение процессов сперматогенеза при половом созревании даже при условии своевременного оперативного вмешательства по опусканию яичек в мошонку.

...