"Мішеневі" та "немішеневі" цитогенетичні ефекти в соматичних клітинах осіб, які зазнали впливу іонізуючої радіації внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

„НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

„Мішеневі” та „немішеневі” цитогенетичні ефекти в соматичних клітинах осіб, які зазнали впливу іонізуючої радіації внаслідок аварії на чорнобильській АЕС

ДИБСЬКИЙ СЕРГІЙ СЕРГІЙОВИЧ

УДК: 575.001.8:616-053.7/8:616-001.28

03.00.15 - генетика

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН

України”, м.Київ.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор Пілінська Марія Андріївна, ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”, завідувач лабораторії цитогенетики, відділу медичної генетики, м. Київ.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Багацька Наталія Василівна, ДУ „Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України”, завідувач лабораторії медичної генетики, м. Харків;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дьоміна Емілія Анатоліївна, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу радіобіології і екології, м. Київ;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Лукаш Любов Леонідівна, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу генетики людини, м. Київ.

Захист відбудеться „ 16 ” вересня 2010 року о 10-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 в ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України„ (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України” (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53).

Автореферат розісланий „ ___” липня 2010 р.

Вчений секретар спецiалiзованої вченої ради Д 26.562.02

Г.В. Стефанович

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

соматичний клітина випромінювання цитогенетичний

Актуальність теми. Аварія на Чорнобильській АЕС значно ускладнила екологічну ситуацію в Україні та на тлі вже існуючого техногенного забруднення сприяла розширенню контакту населення з одним із найпотужніших універсальних мутагенів - іонізуючим випромінюванням (ІВ), яке індукує пошкодження геному в усіх живих організмів, включаючи людину [Д. М. Гродзинський, 2000; В. Г. Бебешко та ін., 2007].

Наукові дослідження та клінічні спостереження, що проводилися протягом післяаварійного періоду, свідчать про погіршення стану здоров`я осіб, постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС [В. Г. Бебешко та ін., 2005, 2007, 2009; Д. А. Базика 2007; А. Ю. Романенко, 2007; В. О. Бузунов, 2007; Є. І. Степанова та ін., 2007]. Не виключено, що цей феномен може бути наслідком радіоіндукованої дестабілізації геному людини, яка на цитогенетичному рівні проявлялася підвищеною частотою аберацій хромосом в лімфоцитах периферичної крові опромінених осіб [Н. П. Бочков, 2002; М. А. Пілінська та ін., 2007; Є. І. Степанова та ін., 2002], а також посиленням чутливості геному соматичних клітин до дії інших мутагенів фізичної та хімічної природи [И. И. Пелевина, 2000; Л. Р.Педан, М. А. Пілінська, 2004].

Науковим дослідженням, присвяченим вивченню частоти та спектру хромосомних аберацій у осіб, які брали участь в ліквідації аварії на Чорнобильській АЕС (особливо в 1986 р.), або мешкали на радіаційно забруднених територіях, присвячено достатньо робіт [Pilinskaya, 1996;

М. А. Пилинская и др., 1995; Э. А. Дёмина и др., 2000, 2003; А. В. Севанькаев и др., 2000, 2003; Н. П. Бочков, 1996, 2002]. Результати більшості з них вказують на вірогідне зростання цитогенетичного ефекту в клітинах-мішенях обстежених осіб у найближчі строки після аварії. Разом з тим, майже не проводилось динамічне цитогенетичне обстеження осіб, які зазнали впливу іонізуючої радіації внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, що є необхідним для оцінки кількісних та якісних змін стану хромосомного апарату людини з плином часу.

У віддалені строки після Чорнобильської аварії на перший план виступають дослідження не стільки прямих (мішеневих) мутагенних ефектів іонізуючої радіації в опромінених клітинах, як так званих дисгеномних (не- мішеневих) ефектів, серед яких провідне значення для реалізації променевого ураження людини мають різні форми радіаційно-індукованої нестабільності геному [Smith et al., 2003; Wright, 2006; Wu et al., 2002].

На цитогенетичному рівні важливу роль в дестабілізації геному людини відіграє прихована, затримана та трансмісивна хромосомна нестабільність. Тому у віддалені строки після променевого ураження людини особливої актуальності набуває не тільки дослідження закономірностей зберігання та елімінації мішеневих цитогенетичних ефектів, але й розробка нових методичних підходів до виявлення та оцінки немішеневих цитогенетичних ефектів, провідним компонентом яких є саме різні форми хромосомної нестабільності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана дисертація є фрагментом науково-дослідних робіт Інституту експериментальної радіології ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”: „Використання генетичних методів досліджень для оцінки доз опромінення осіб, які зазнали впливу радіації в зв'язку з аварією на ЧАЕС ” (1993-1995 рр.), № держреєстрації 0193V032306 (виконавець теми); „Вивчення структури і стабільності генетичного апарату соматичних клiтин людини в зв'язку з дією факторiв Чорнобильської аварії” (1993 - 1995рр.), № держреєстрації VА01002905Р (виконавець теми); „Цитогенетичне обстеження осіб, перехворівших на гостру променеву хворобу, за допомогою нового перспективного методу дослiдження геному людини - FISH. Вивчення реакцiї хромосомного апарату на додаткове мутагенне навантаження in vitro; оцiнка мiжiндивiдуальної чутливостi до дiї мутагенних факторiв” (1997-2000 рр.),

№ держреєстрації 0198U004902 (відповідальний виконавець теми); „Особливостi пошкодження лiмфоцитiв периферичної кровi людини на клiтинному та хромосомному рiвнях у вiддаленi строки пiсля Чорнобильської аварiї” (2000-2002 рр.), № держреєстрації 0100U002771 (відповідальний виконавець теми); „Дослідити стабільність хромосомного апарату та функціональні резерви тиреоїдної системи у нащадків батьків, опромінених внаслідок Чорнобильської катастрофи” (2003-2005 рр.), № держреєстрації 0103U001414 (відповідальний виконавець теми); „Дослідження прихованої хромосомної нестабільності, індукованої факторами Чорнобильської аварії, за чутливістю лімфоцитів периферичної крові постраждалих осіб до тестуючої мутагенної дії блеоміцину” (2006-2008 рр.), № держреєстрації 0106U002356 (відповідальний виконавець теми).

Мета дослідження. Визначення закономірностей реалізації впливу іонізуючого випромінювання на спадкові структури соматичних клітин людини в різні строки після аварії на Чорнобильській АЕС та обґрунтування цитогенетичних критеріїв оцінки нестабільності геному для формування «груп ризику» серед осіб з хромосомною нестабільністю.

Поставлена мета досягалась шляхом послідовного вирішення таких завдань:

1. Визначити частоту нестабільних хромосомних аберацій у осіб, які зазнали дії іонізуючого випромінювання в діапазоні доз від 460 до 5000 мГр внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС та перенесли гостру променеву хворобу (ГПХ) різного ступеня тяжкості.

2. Дослідити частоту нестабільних хромосомних аберацій у учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС (УЛНА), які, згідно з офіційними даними, зазнали впливу іонізуючого випромінювання в діапазоні доз від 40 до 1800 мГр.

3. Визначити частоту нестабільних хромосомних аберацій у дітей, які мешкали на радіоактивно забруднених територіях, де щільність забруднення грунту радіонуклідом 137Cs коливалася в межах від 350,0 до 960,0 кБк/м2.

4. Дослідити динаміку частот нестабільних хромосомних аберацій з плином часу у осіб, які перенесли ГПХ внаслідок аварії на ЧАЕС, та дітей, які мешкали на радіоактивно забруднених територіях.

5. Дослідити рівень стабільних хромосомних аберацій в осіб, які перенесли ГПХ, та у учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС за допомогою методу “FISH-WCP”.

6. Провести розрахунки доз опромінення в учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС та осіб, які перенесли ГПХ, за результатами цитогенетичного аналізу з використанням методу “FISH-WCP” та порівняти їх з офіційними дозами.

7. Розробити та апробувати модельну систему для вивчення затриманої та трансмісивної хромосомної нестабільності в соматичних клітинах людини.

8. Розробити та апробувати модельну систему для виявлення прихованої хромосомної нестабільності в соматичних клітинах людини.

9. Оцінити за цитогенетичними критеріями стабільність геному соматичних клітин людини в різні строки після дії іонізуючого випромінювання в широкому діапазоні доз.

Об'єкт дослідження: лімфоцити периферичної крові осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання внаслідок аварії на ЧАЕС.

Предмет дослідження: стабільність геному соматичних клітин людини в різні строки після дії іонізуючого випромінювання.

Методи дослідження: цитогенетичні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні в порівняльному аспекті встановлено індивідуальні та середньогрупові частоти інтегральних та специфічних для дії ІВ цитогенетичних показників в пріоритетних групах осіб, постраждалих від дії факторів Чорнобильської аварії - у реконвалесцентів ГПХ різного ступеня тяжкості; учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС; дітей, які мешкали на радіоактивно забруднених територіях; працівників із зони відчуження та зони безумовного (обов'язкового) відселення в різні строки після опромінення.

Вперше розроблено, опрацьовано та апробовано модельні тест-системи для виявлення затриманої, трансмісивної та прихованої хромосомної нестабільності в соматичних клітинах осіб, які зазнали дії іонізуючого випромінювання внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС.

Вперше за цитогенетичними критеріями визначено різні форми нестабільності геному в соматичних клітинах осіб, які зазнали радіаційного впливу в діапазоні доз від 40 до 3400 мГр внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддалені строки після опромінення.

Вперше вивчено модифікуючий вплив іонізуючого випромінювання в широкому діапазоні доз на генетично детерміновану індивідуальну чутливість спадкового апарату соматичних клітин людини до мутагенної дії.

Вперше в Україні адаптовано та використано сучасний молекулярно-генетичний метод FISH-WCP для розрахунку поглинутих індивідуальних доз опромінення людини та формування критичних груп осіб з можливою радіаційно індукованою патологією.

Вперше при динамічному цитогенетичному обстеженні осіб, які перенесли ГПХ внаслідок аварії на ЧАЕС, та дітей, які мешкали на радіаційно забруднених територіях, встановлено особливості перебігу радіаційно-індукованого мутаційного процесу в соматичних клітинах людини з плином часу.

Виконані дослідження захищені патентом, який впроваджено в роботу лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики Інституту експериментальної радіології ДУ «Науковий центр радіаційної медицини АМН України», „Спосіб виявлення хромосомної нестабільності в лімфоцитах крові нащадків опромінених людей” (Пат. № 15062, Україна, МПК G01N33/48/С12Q 1/68 опубл. 15.06.06., Бюл. № 4, 2006). Зазначені науково-практичні результати дисертаційної роботи відображено у методичних рекомендаціях: „Цитогенетичний спосіб визначення прихованої хромосомної нестабільності в соматичних клітинах людини за допомогою тесту "G2-bleomycin sensitivity assay” (Київ, 2008).

Практичне значення одержаних результатів. Адаптовано та впроваджено в практику роботи лабораторії цитогенетики метод FISH-WCP, який використовувався для ретроспективного визначення індивідуальних поглинутих доз іонізуючої радіації у осіб, опромінених внаслідок аварії на ЧАЕС.

Розроблено модельні системи для визначення різних форм хромосомної нестабільності, що пропонуються для виявлення осіб, гіперчутливих до мутагенної дії іонізуючого випромінювання, при здійсненні попередніх та поточних медичних оглядів професійних контингентів, які можуть мати виробничий контакт із мутагенними чинниками, для формування „груп ризику” з підвищеною схильністю до розвитку віддалених медичних наслідків радіаційного впливу та повинні підлягати диспансерному спостереженню.

Впровадження в практику. Розроблені підходи до визначення затриманої та прихованої хромосомної нестабільності у осіб, які постраждали внаслідок Чорнобильської катастрофи, впроваджені в практичну діяльність лабораторій генетичного моніторингу відділу медичної генетики ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України” та медичної генетики ДУ „Інститут охорони здоров'я дітей та підлітків АМН України”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу виконано в лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики (керівник - д. мед. н., проф. М. А. Пілінська) Інституту експериментальної радіології ДУ ”Науковий центр радіаційної медицини АМН України”. Здобувачу належить ідея дисертаційної роботи. Автором самостійно здійснено пошук та аналіз наукових літературних даних; обгрунтовано актуальність та необхідність роботи, її мету і завдання; сформовано групи спостереження; опрацьовано методики дослідження; виконано всі етапи цитогенетичного обстеження людини (культивування лімфоцитів периферичної крові, приготування та обробка препаратів метафазних хромосом, хромосомний аналіз); створено комп'ютерну базу даних; написано всі розділи дисертації; сформульовано висновки та розроблено концепцію щодо закономірностей індукції „мішеневих” та „немішеневих” цитогенетичних ефектів в соматичних клітинах людини внаслідок дії іонізуючого випромінювання.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на Республіканській науковій конференції „Актуальні питання екогенетики та імунології” (Полтава, 1994); II з'їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), а також були включені в доповіді, представлені на Щорічній конференції Health Physics Society USA (Сан-Франциско, США, 1994), Першому з'їзді медичних генетиків Росії (Москва, 1995), Українському Конгресі радіобіологів (Київ, 1995), Другій Міжнародній конференції „Мутагени довкілля в популяціях людини” (Прага, 1995), Науково-практичному семінарі „Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи” (Київ, 1996); П'ятій міжнародній науково-технічній конференції „Чорнобиль-96. Підсумки 10 років робіт з ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС ” (Зелений мис, 1996); III з'їзді з радіаційних досліджень (Пущино, 1997); IY Міжнародній науково-практичній конференції „Об'єкт „Укриття” 15 років. Минуле.Сучасне. Майбутнє” (Київ, 2001); III з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2002); III з'їзді з радіаційних досліджень (радіобіологія і радіоекологія) (Київ, 2003); IY Конференції Європейської асоціації цитогенетиків (Болонья, Італія, 2003); Міжнародній конференції „Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005); Міжнародній конференції Європейського товариства генетиків людини (Прага, 2005; Амстердам, 2006; Ніцца, 2007; Барселона, 2008); Міжнародній конференції „Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє” (Київ, 2006 р.); Y Міжнародній конференції „Мутагени навколишнього середовища у популяціях людини” (Анталія, Туреччина, 2007); XIII міжнародному конгресі з радіаційних досліджень (Сан Франциско, США, 2007); ІV з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2008); Екофорумі „Проблеми радіаційної екології та безпеки людини” (Санкт-Петербург, 2008); V Міжнародній науковій конференції „Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2009); Y з'їзді радіобіологічного товариства України (Ужгород, 2009); 7-й Конференції Європейської асоціації цитогенетиків (Стокгольм, Швеція, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 44 наукові праці: розділів монографій - 3, статей у журналах - 31, статей у збірках наукових праць - 8, методичних рекомендацій - 1, отримано 1 патент на корисну модель. З цієї кількості у фахових виданнях, які відповідають вимогам ВАК України, опубліковано 36 наукових праць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Матеріалом для проведення цитогенетичних досліджень слугували лімфоцити периферичної крові людини. Згідно із завданнями роботи, було проведено добровільне цитогенетичне обстеження 485 осіб з радіаційним впливом різної інтенсивності в анамнезі (експоновані групи дітей та дорослих) та відповідні контрольні групи з неекспонованих індивідів, які проходили диспансеризацію та лікування в Інституті клінічної радіології ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”, з яких сформували наступні групи спостереження :

Експоновані групи дорослих:

- особи, які перенесли ГПХ-I в 1986 р. (20 осіб, всі чоловіки віком від 43 до 64 років, середній вік - 49 років; коливання офіційних доз опромінення від 460 до 1870 мГр);

- особи, які перенесли ГПХ-II в 1986 р. (25 осіб, всі чоловіки віком від 43 до 67 років, середній вік - 51 рік; коливання офіційних доз опромінення від 600 до 3400 мГр);

- особи, які перенесли ГПХ-III в 1986 р. (8 осіб, всі чоловіки віком від 33 до 58 років, середній вік - 50 років; коливання офіційних доз опромінення від 2300 до 5000 мГр);

- учасники ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, відібрані з Державного реєстру України (83 особи, всі чоловіки віком від 37 до 58 років, середній вік - 52 роки; коливання офіційних доз опромінення від 80 до 1800 мГр);

- учасники ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, відібрані з реєстру Міністерства оборони України (62 особи, всі чоловіки віком від 41 до 73 років, середній вік - 53 роки; коливання офіційних доз опромінення від 40 до 1750 мГр);

- особи, які працювали у зоні відчуження та зоні безумовного (обов'язкового) відселення в 2005-2009 рр. (12 осіб, всі чоловіки віком від 29 до 56 років, середній вік - 48 років; коливання офіційних доз опромінення від 30 до 160 мГр );

- відповідна вікова контрольна група порівняння - практично здорові індивіди, які заперечували свідомий контакт з іонізуючим випромінюванням та іншими відомими чи потенційними мутагенами та в останні три місяці не хворіли на вірусні захворювання (29 осіб, всі чоловіки віком від 57 до 23 років, середній вік - 49 років).

Експоновані групи дітей:

- діти, які мешкали в смт Народичі Народицького району Житомирської області, де щільність забруднення грунту 137Cs становила 350,0 кБк/м2 (57 осіб - 37 дівчат, 20 хлопців віком від 8 до 16 років, середній вік - 12,2 року);

- діти, які мешкали смт Виступовичі Овруцького району Житомирської області, де щільність забруднення груну 137Cs становила 556,0 кБк/м2(49 осіб - 30 дівчат, 19 хлопців віком від 8 до 15 років, середній вік - 11,8 року);

- діти, які мешкали в смт Поліське Поліського району Київської області, де щільність забруднення грунту 137Cs становила 960,0 кБк/м2 (68 осіб - 39 дівчат, 29 хлопців віком від 8 до 16 років, середній вік - 12,1 року);

- діти, народжені від учасників ліквідації аварії на ЧАЕС (коливання офіційних доз опромінення від 40 до 670 мГр), які мешкали в м. Києві, де щільність забруднення грунту 137Cs дорівнювала фоновим значенням (17 осіб - 11 дівчат, 6 хлопців віком від 10 до 16 років, середній вік - 12,4 року);

- діти, народжені від батьків, які мешкали в с. Старе Рокитнівського району Рівненської області, де щільність забруднення грунту 137Cs становила 50,0 кБк/м2 (16 осіб - 10 дівчат, 6 хлопців віком від 8 до 16 років, середній вік - 12,2 року).

Контрольні групи дітей:

- діти, які мешкали в смт Яготин Яготинського району Київської області, де щільність забруднення грунту 137Cs дорівнювала фоновим значенням (20 осіб - 11 дівчат, 9 хлопців віком від 8 до 16 років, середній вік - 11,8 року);

- діти, народжені від батьків, які мешкали в м. Львів, де щільність забруднення грунту 137Cs дорівнювала фоновим значенням (21 особа - 14 дівчат, 7 хлопців віком від 12 до 16 років, середній вік - 12,3 року).

Всього в ході виконання докторської дисертації проведено цитогенетичне обстеження 485 осіб та проаналізовано більш ніж 360 500 метафаз.

Для тест-системи культури лімфоцитів периферичної крові людини, стимульованих фітогемаглютиніном (ФГА), використовували венозну кров обстежуваних осіб в кількості 2,0 - 5,0 мл. До активації поділу лімфоцитів кров зберігали і транспортували в стерильних флаконах з напиленим гепарином в охолодженому вигляді, протягом 1 - 2 діб.

Згідно з модифікованим нами напівмікрометодом, в культуральну суміш вносили цільну кров із розрахунку 0,5 мл гепаринізованої крові на 5,0 мл живильного середовища RPMI 1640 з глютаміном (Sigma, USA) та 0,2 мл розчину ФГА (Sigma-P, USA). Флакони з культурою інкубували в термостаті при 37 °С протягом 48 год, що дозволяло аналізувати клітини, які знаходилися переважно в першому мітозі. За 2 - 3 год до кінця інкубації культуру обробляли розчином колцеміду (Sigma, USA) із розрахунку 0,5 мг/мл культуральної суміші.

Після закінчення інкубації культуральну суміш центрифугували (1000 об/хв) впродовж 5 хв, видаляли надосадову рідину і проводили гіпотонічну обробку обережно ресуспендованого осаду клітин. Для цього додавали по 4,5 - 5,0 мл приготованого ex tempore та підігрітого до 37 °С 0,075 М розчину KCl, в якому інкубували клітини протягом 20 хв при 37 °С. Після цього суміш центрифугували (1000 об/хв) впродовж 5 хв, надосадову рідину видаляли, осад обережно ресуспендували та здійснювали фіксацію клітин приготованою ex tempore охолодженою (4 °С) сумішшю: 3 частини етанолу (чи метанолу) + 1 частина льодяної оцтової кислоти. Для цього 6 мл фіксатора додавали в пробірку, струшуючи її, потім залишали на 1 год при 4 °С. Після триразової зміни фіксатора одержували фіксовані клітинні осади, які зберігали у морозильній камері при температурі -20 °С до моменту приготування препаратів метафазних хромосом.

Від кожного обстеженого з однієї частини лімфоцитарних осадів готували препарати, які фарбували барвником Гімза (Giemsa stain, Merk, Germany) для проведення традиційного цитогенетичного аналізу рівномірно забарвлених хромосом, а другу частину осадів залишали для обробки за методом FISH-WCP та проведення аналізу флуоресцентно забарвлених хромосом.

Для виготовлення препаратів метафазних хромосом суміш клітин центрифугували (1000 об/хв) впродовж 5 хв, надосадову рідину видаляли, додавали 0,5 мл приготованого ex tempore охолодженого (4 °С) фіксатора. Отриману суспензію клітин розкапували на знежирені, охолоджені, вологі предметні скельця і висушували на термостолику при 50 °С. Для підвищення якості метафазних пластинок їх обробляли протягом 30 сек 50 % розчином льодяної оцтової кислоти, після чого швидко висушували на термостолику та фарбували.

Фарбування препаратів здійснювали 4 % розчином барвника Гімза протягом 5-10 хв. Одержані препарати шифрували та аналізували „сліпим методом”.

Класичний цитогенетичний аналiз проводили „всліпу”, на зашифрованих препаратах, під мікроскопом Axioscope (Germany) зi збiльшенням х 1000. Для кожного випадку аналiзували по 200 - 500 метафаз, які містили 46 + 2 хромосом, що вiдповiдали наступним необхiдним вимогам:

- всі хромосоми повинні бути чітко пофарбовані і рівномірно розподілені у метафазній пластинці так, щоб кожну з них можна було добре розгледіти та ідентифікувати за груповою приналежністю;

- бажано не аналізувати метафазні пластинки з перехрещенням хромосом, але у разі накладання двох хромосом їх форми та центромери повинні бути добре виражені;

- ступінь спіралізації хромосом має забезпечувати чітке виявлення хроматид і центромер усіх без винятку хромосом; оптимальний рівень спіралізації хромосом має бути в таких межах: максимум - малі акроцентрики чітко видно у вигляді хромосом, мінімум - хромосоми розділені на дві хроматиди і знаходяться окремо одна від одної.

Наш багаторічний досвід виконання цитогенетичних досліджень показує, що дотримання вказаних вимог при виборі метафазних пластинок дозволяє підвищити точність реєстрації структурних порушень хромосом і зменшити суб'єктивний фактор при їх ідентифікації.

При проведенні цитогенетичного аналізу враховували всi аберацiї хроматидного та хромосомного типiв (за винятком пробiлiв), якi можна розпізнати при груповому карiотипуванні на рівномірно пофарбованих препаратах метафазних хромосом.

На підставі одержаних при цитогенетичному аналізі даних розраховували такі відносні показники - частота аберантних метафаз (%), загальна частота хромосомних аберацій (на 100 проаналізованих метафаз), частоти окремих типів хромосомних аберацій (на 100 проаналізованих метафаз).

Маркерами радiацiйної дiї вважали нестабiльнi та стабiльнi аберацiї тільки хромосомного типу - поліцентрики, центричнi кiльця, ацентрики ( парні

фрагменти та ацентричні кільця), аномальнi моноцентрики (сформовані в результаті транслокацій, інверсій, інсерцій); маркерами хромосомної нестабільності - аберації хроматидного типу (одиночні фрагменти, хроматидні обміни).

Метод флуоресцентної in situ гібридизації метафазних хромосом людини з ДНК-зондами до цілих хромосом (метод FISH-WCP) було вперше в Україні впроваджено нами після стажування в Ліверморській та Оак-Ріджській Національних лабораторіях (США) в рамках спільного Міжнародного проекту „Українсько-Американське дослідження лейкемії та споріднених гематологічних захворювань у ліквідаторів Чорнобильської аварії”.

Препарати для FISH-аналізу готували ~ за 15 діб до проведення флуоресцентної in situ гібридизації. Для гібридизації використовували набір безпосередньо мічених флуорохромом „Spectrum orange” ДНК-зондів до цілих хромосом # 1, 2 и 4 (Vysis, USA), які становлять ~22 % диплоїдного генома та дозволяють виявляти ~35 % всіх транслокацій.

Обробку препаратів проводили згідно з протоколом фірми Vysis (США), успішно адаптованим нами для роботи в умовах України, який включає наступні стадії: специфічну попередню обробку препаратів; гібридизацію (24 години при температурі 37 °С); промивку; контрфарбування хромосом флуоресцентним барвником DAPI-1 (4,6-діамідіно-2-феніліндолоїл) в спеціальному розчині (antifade solution), який запобігає швидкому вицвітанню препарату при мікроскопуванні в УФ-світлі.

Препарати аналізували під люмінесцентним мікроскопом Axioscope (Germany), який мав люмінесцентну 10-ватну лампу (USHIO, Japan) та набір спеціальних фільтрів (DAPI/ORANGE dual pass filter set, Zeiss, Germany), що дають змогу окремо та одночасно візуалізувати обидва флуорохроми, завдяки чому хромосоми-мішені, фарбовані Spectrum Оrange (painted), та контрфарбовані DAPI хромосоми (unpainted), мають різний колір (рожево-оранжевий та голубий відповідно), який залежить від використаного фільтра Панцентромерні зонди не вживали, оскільки при використанні флуорохрому DAPI структура хромосом та положення центромери виявляються досить чітко.

Обміни частинами між „painted” та „unpainted” хромосомами призводили до виникнення двоколірних cтруктур, які містили одну або декілька центромер - повних (реципрокних, збалансованих, two-way) та неповних (one-way) транслокацій, інверсій, інсерцій, поліцентриків, складних обмінів (complex exchanges), які вважали маркерами радіаційного впливу. Двоколірні безцентромерні структури приймали за ацентрики.

Ідентифікацію та облік хромосомних аберацій проводили згідно з PAINT номенклатурою.

Від кожного обстеженого, як правило, аналізували по ~1000 метафаз.

Загальну частоту транслокацій на геном розраховували за формулою J.

Lucas: Fg = Fp/2.05fp(1 - fp), де

Fg - частота транслокацій на геном;

Fp - виявлена частота транслокацій з участю "painted" хромосом;

fp - частка генома, яку складають хромосоми-мішені (для використаного

нами хромосомного коктейля - 22 %).

Для реконструкції поглинутої дози опромінення в учасників ліквідації аварії на ЧАЕС використовували частоту тільки повних транслокацій, які вважали за одну подію. Враховуючи сценарій радіаційної дії на обстежену групу УЛНА, розрахунок дози радіації проводили за алгоритмом, розробленим J. Lucas для гострого рівномірного гамма-опромінення 137Cs .

Для дослідження затриманої та трансмісивної хромосомної нестабільності використовували двотермінове культивування лімфоцитів периферичної крові людини (короткотривале - 48 год, та довгострокове - 144 год), що дозволило аналізувати соматичні клітини, які знаходилися у першому та п'ятому мітозах відповідно.

Для вивчення прихованої хромосомної нестабільності використовували додаткове мутагенне навантаження на культуру лімфоцитів людини мутагеном-провокатором - протипухлинним антибіотиком блеоміцином (C50H73N17O21S2; синоніми - Вlanoxan, Вlenoxane, Вleocin, Вleocamicina, Бланоксан, Бленоксан, Блеоцин, Блеокамицина), який належить до радіоміметиків та індукує потужний цитогенетичний ефект (фрагментацію хромосом різного ступеня внаслідок гальмування синтезу ДНК та порушення її структури) в лімфоцитах периферичної крові людини. При виконанні роботи було опрацьовано та вдосконалено модельну систему для дослідження прихованої хромосомної нестабільності в лімфоцитах периферичної крові за допомогою тестуючого мутагенного навантаження, для чого було визначено оптимальні строки обробки культури лімфоцитів блеоміцином (через 48 год від початку культивування, в пізній постсинтетичній G2 стадії першого мітотичного циклу) та відповідні концентрації препарату (0,05 та 5,0 мкг/мл), придатні для оцінки чутливості хромосом соматичних клітин людини in vitro до мутагенного навантаження.

Статистичну обробку результатів проводили стандартними методами варіаційної статистики, порівняння емпіричних сукупностей проводили за критерієм Стьюдента. Для обробки отриманих результатів було створено базу даних всіх клітин з хромосомними абераціями в програмі Excel та використано пакети аналізу програм STATISTICA i MATLAB.

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження „мішеневих” цитогенетичних ефектів у осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. В усіх обстежених групах опромінених внаслідок Чорнобильської аварії осіб визначали частоту всіх типів хромосомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові. Хромосомні аберації виявляли переважно традиційним методом аналізу рівномірно забарвлених метафазних хромосом і вибірково - за допомогою методу флуоресцентної in situ гібридизації метафазних хромосом з ДНК-зондами (FISH-WCP техніка).

Цитогенетичними індикаторами радіаційного впливу вважали обмінні аберації хромосомного типу - нестабільні, що елімінуються з часом (дицентричні та кільцеві хромосоми), і стабільні (аномальні моноцентрики - при рівномірному забарвленні; повні та неповні хромосомні транслокації - при флуоресцентному забарвленні), які не лише майже повністю зберігаються після гострого радіаційного впливу, але й акумулюються при хронічному опроміненні.

Отримані результати дозволяють зробити наступні узагальнення щодо „мішеневих” цитогенетичних ефектів, індукованих іонізуючим випромінюванням у людини, в найближчі та віддалені строки після Чорнобильської катастрофи.

У осіб, які перенесли ГПХ у 1986 р. (всі діагнози верифіковані), навіть через 11 років після гострого променевого ураження (табл. 1) спостерігалося вірогідне підвищення середньогрупових частот як інтегральних цитогенетичних показників (хромосомних аберацій та аберантних клітин), так і специфічних цитогенетичних маркерів радіаційної дії (стабільних та нестабільних аберацій хромосомного типу), яке залежало від ступеня тяжкості гострої променевої хвороби та середньогрупової офіційної дози опромінення, що, відповідно до літературних даних [М. А. Пілінська, 1994; Evans et. al., 1991], свідчить про можливе ураження стовбурових клітин та частково узгоджується з результатами А. В. Севанькаева (1994) та Е. К. Пяткина (1987).

Таблиця 1

Результати цитогенетичного обстеження осіб, які перенесли ГПХ у 1986 р.

Ступінь ГПХ	Середня доза, мГр	Традиційний цитогенетичний аналіз з груповим каріотипуванням
		Частота аберацій хромосомного типу (на 100 клітин)	Дицентрики та центричні кільця (на 100 клітин)	Аномальні моноцентрики (на 100 клітин)
		Мін.	Макс.	Серед.	Мін.	Макс.	Серед.	Мін.	Макс.	Серед.
ГПХ-I	1210	0,60	8,57	2,78	0,00	0,75	0,32	0,00	7,63	1,42
ГПХ-II	2030	1,50	10,02	5,54	0,00	4,00	0,97	0,25	5,47	2,33
ГПХ-III	3925	6,00	17,50	9,23	0,50	5,50	2,70	0,00	7,50	3,85

На підставі цитогенетичного обстеження тих самих осіб в динаміці встановили, що з плином часу доля нестабільних та стабільних маркерів радіаційної дії у осіб, які перенесли ГПХ у 1986 р., суттєво відрізнялась: так, сумарна частота дицентриків та центричних кілець в усіх випадках поступово зменшувалась (незалежно від ступеня ГПХ та середньої дози опромінення), тоді як частота аномальних моноцентриків не тільки практично не змінювалась, але й навіть поступово зростала в залежності від середньої дози опромінення та ступеня ГПХ.

Ступінь виразності сумарного цитогенетичного ефекту в групі учасників ліквідації аварії на ЧАЕС залежала від середньогрупової дози опромінення

Рівень нестабільних маркерів радіаційної дії в учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, відібраних з реєстру Міністерства оборони України, практично відповідав аналогічним показникам в учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, відібраних з Державного реєстру України, тоді як частота зустрічальності стабільних радіаційних маркерів у осіб з останньої групи більше ніж у три рази перевищувала рівень аномальних моноцентриків у військових УЛНА.

Використання методу FISH-WCP дозволило суттєво (р < 0,01) підвищити (в порівнянні з традиційним цитогенетичним аналізом) виявлення стабільних маркерів радіаційної дії в осіб, які перенесли ГПХ у 1986 р., та учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС (в середньому, у 10 та 6 разів відповідно).

Виявлений у віддалені строки після опромінення цитогенетичний ефект не завжди корелював з документованими офіційними дозами радіації, що може бути пов'язано як з індивідуальними особливостями елімінації нестабільних і, можливо, деякої частини стабільних аберацій, так і, в ряді випадків, з некоректністю офіційних доз. Останнє було підтверджено нами в рамках Міжнародного проекту „Українсько-Американське дослідження лейкемії та споріднених гематологічних захворювань у ліквідаторів Чорнобильської аварії” за допомогою методу FISH-WCP при реконструкції та верифікації офіційних доз опромінення в групі УЛНА із дозовим навантаженням вище припустимих 250 мГр. Всього було обстежено 169 осіб, які працювали на ліквідації наслідків Чорнобильської аварії у 1986 р., - 73 особи з Державного реєстру України, 62 особи - з реєстру Міністерства оборони України та 34 особи, які перенесли ГПХ у 1986 р. Результати флуоресцентного цитогенетичного аналізу, згідно з якими було реконструйовано біологічні дози опромінення, показали (табл. 2), що у цивільних УЛНА індивідуальні офіційні дози опромінення коливались від 80 до 1750 мГр, середньогрупова доза складала 630 мГр.

Таблиця 2

Порівняння індивідуальних офіційних доз опромінення та FISH-доз у ліквідаторів аварії на ЧАЕС

Групи	Кількість обстежених	Кількість проана-лізованих метафаз	Кількість повних транслокацій на клітину	Офіційна доза, мГр	FISH-доза, мГр
				мін.	макс.	серед.	мін.	макс.	серед.
УЛНА з Державного реєстру України	73	70765	0,024	80	1750	630	130	1400	460
УЛНА з реєстру Міністерства оборони України	62	62188	0,017	40	1750	369	163	1106	385
Особи , які перенесли ГПХ у 1987 р.	34	26685	0,190	600	5500	2180	160	4050	1320

Біологічні дози варіювали від 130 до 1400 мГр, тобто за результатами FISH-аналізу майже всю групу цивільних УЛНА можна вважати за “високодозну” із середньогруповою дозою 460 мГр. У 20 випадках індивідуальні офіційні та біологічні дози опромінення практично не відрізнялись; у 38 - офіційні дози були вищими за біологічні; у 15 - офіційні дози були дещо нижчими за FISH-дози.

Аналогічні дані (тільки при значно більш високих дозових навантаженнях) були виявлені в групі осіб з діагнозом ГПХ. Так, індивідуальні офіційні та біологічні дози опромінення коливались від 600 до 5500 мГр та від 160 до 4040 мГр відповідно, завдяки чому аналогічні середньогрупові показники склали 2180 і 1320 мГр відповідно. У цій групі також переважали випадки з більш високими (у порівнянні з FISH-дозиметрією) значеннями офіційних доз опромінення, які були виявлені у 28 з 34 обстежених. Тільки у 3 осіб офіційні дози опромінення були нижчими за біологічні дози, у 3 осіб біологічні та офіційні дози практично не відрізнялись.

У групі військових УЛНА індивідуальні офіційні дози опромінення коливались від 40 до 1750 мГр, біологічні дози - від 163 до 1106 мГр. Тільки у 8 випадках офіційні дози були дещо вищі за біологічні. У 28 учасників ліквідації наслідків на ЧАЕС FISH-дози перевищували офіційні дози. У 26 осіб офіційні дози відповідали біологічним. За результатами FISH-аналізу групу військових УЛНА також можна віднести до “високодозної” із середньогруповою біологічною дозою 385 мГр, що дещо перевищувало середню офіційну дозу (369 мГр).

Таким чином, за результатами нашого дослідження встановлено, що у цивільних УЛНА та осіб з діагнозом ГПХ домінували випадки з перевищенням індивідуальних офіційних доз опромінення над FISH-дозами, завдяки чому середньогрупова FISH-доза була нижча за офіційну. В той же час, у осіб з реєстру Міністерства оборони переважали випадки з деякою недооцінкою індивідуальних офіційних доз в порівнянні з біологічними дозами опромінення, тому середньогрупова FISH-доза була дещо вища за офіційну. За середньогруповими значеннями біологічних доз опромінення можна вважати, що обидві групи, які можна віднести до “високодозних”, одержали майже ідентичне радіаційне навантаження (460 та 385 мГр, відповідно).

Порівняння біологічних FISH-доз та офіційних доз опромінення в учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС та осіб, які перенесли ГПХ у 1986 р., виявило їх найбільший збіг у діапазоні доз від 250 до 500 мГр.

В усіх групах дітей, обстежених за період 1991-2000 рр., які мешкали на радіоактивно забруднених територіях України (Київська та

Житомирська області), виявили не лише вірогідне в порівнянні з доаварійними показниками підвищення середньогрупової частоти хромосомних аберацій різного типу (включаючи більш ніж десятикратне зростання рівня специфічних маркерів опромінення по групах в середньому з суттєвими міжіндивідуальними коливаннями), але й тенденцію до збільшення цитогенетичного ефекту з часом (- переважно, за рахунок накопичення стабільних пошкоджень хромосом при збереженні відносно постійного підвищеного рівня нестабільних аберацій, що, зокрема, було підтверджено результатами повторного цитогенетичного обстеження дітей із смт Народичі, Виступовичі та Поліське.

Беручи до уваги, що, згідно з дозиметричною паспортизацією, середня накопичена доза опромінення людини в смт Народичі, смт Виступовичі та смт Поліське за 15 років складала приблизно 25, 96 та 90 мГр відповідно, можна припустити, що цей феномен, обумовлений не лише дією факторів Чорнобильської аварії, але й зростанням чутливості хромосомного апарату обстежених дітей до впливу деяких природних чи антропогенних мутагенів невідомого походження, характерних для екологічного стану даного регіону, тобто, є проявом радіаційно-індукованої віддаленої та/або прихованої хромосомної нестабільності.

У 11 дітей, які мешкали в смт Поліське і Народичі, виявили 19 мультиаберантних клітин, що містили від трьох до 11 різних радіозалежних аберацій. Поява так званих навантажених клітин (включаючи специфічні «rogue» клітини, що містять інтерстиціальні делеції), незалежно від причини, яка їх викликала, вважається несприятливою прогностичною ознакою через їх можливу етіологічну роль в індукції канцерогенезу, зумовлену активацією протоонкогенів [В. А. Шевченко та ін., 1995, А. В. Севанькаев та ін., 1995].

При обстеженні експонованих груп дітей не виявили позитивної кореляції між інтенсивністю цитогенетичного ефекту та щільністю забруднення грунту радіоізотопами цезію.

Результати цитогенетичного обстеження дитячих контингентів підтвердили високу чутливість хромосомного апарату соматичних клітин дітей до мутагенної дії так званих „малих доз” іонізуючого випромінювання і свідчать як про продовження мутагенного пресингу на обстежені дитячі контингенти, ймовірно, за рахунок дії комплексу мутагенів довкілля, так і про радіаційно-індуковане порушення хромосомної стабільності соматичних клітин. Останнє підтверджується зростанням частоти аберацій не тільки хромосомного, але й хроматидного типу практично в усіх експонованих групах дітей, що не характерно для мутагенної дії іонізуючого опромінення, однак може бути результатом радіоіндукованої хромосомної нестабільності в потомстві первинно опромінених (у тому числі, стовбурових) клітин і, отже, до модифікації чутливості геному до дії інших генотоксичних факторів забруднення навколишнього середовища [Е. А. Дьоміна та ін., 2004, 2008; Ryabchenko, 2005; Н. А. Мазник, 2004].

Таким чином, за допомогою використання традиційних підходів до оцінки цитогенетичних наслідків опромінення людини, які використовувались для моніторингу за Чорнобильськими контингентами пріоритетного спостереження в перші 10-15 років після аварії, доведено зростання інтенсивності соматичного хромосомного мутагенезу у людини на тлі загального екологічного та соціального неблагополуччя, що дозволяє вважати аварію на ЧАЕС новим екогенетичним фактором для населення України.

Отримані результати, що є показниками загального мутагенного навантаження, добре узгоджуються з даними колег з України, ближнього і далекого зарубіжжя та свідчать про дестабілізацію хромосомного апарату в деяких критичних групах осіб, які зазнали дії факторів Чорнобильської аварії [А. В. Севанькаев и др., 1994, 1995, 2000; Н. П. Бочков и др., 1992, 1993, 1996, 2002; Padovani et al., 1991; Stephan, 1993].

Міжіндивідуальна варіабельність частоти хромосомних аберацій, яка спостерігається при ідентичних умовах опромінення, може слугувати показником адаптаційних можливостей та індивідуальної реактивності організму на дію мутагенних факторів, що належить враховувати при професійному відборі осіб для роботи в умовах хронічного опромінення навіть при дотриманні гігієнічних регламентів.

Дослідження „немішеневих” цитогенетичних ефектів у осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС. Результати ряду експериментальних досліджень останнього десятиріччя показали, що рівень радіоіндукованого мутагенного ефекту може не тільки знижуватися з часом в результаті елімінації нестабільних хромосомних аберацій завдяки загибелі аберантних клітин в процесі мітозу. Виявлено, що нестабільність геному може передаватися у вигляді потенційних пошкоджень генетичного матеріалу через декілька клітинних поколінь і реалізуватися з затримкою in vivo чи in vitro у віддалені строки після мутагенного впливу [Marder, 1999; Holmberg, 1995; Bortoletto, 2001; Н. А. Мазник, 2004]. Крім того, встановлено, що частина нерепарованих чи помилково репарованих пошкоджень геному статевих клітин опромінених батьків може передаватися в соматичні клітини їх нащадків у вигляді різних типів хромосомних аберацій [С. И. Заичкина, 2002; И. Е. Воробцова, 2005; В. Г. Безлепкин, 2004]. Саме ці два явища ми спробували використати для оцінки можливого впливу факторів Чорнобильської аварії на хромосомну стабільність у нащадків опромінених батьків - за допомогою двотермінового (короткотривалого та довгострокового) культивування лімфоцитів периферичної крові та встановлення частоти хромосомних аберацій в декількох мітозах.

Для дослідження „немішеневих” ефектів іонізуючого випромінювання у осіб, постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, нами були використані такі методичні підходи:

– розробка та апробація модельної тест-системи для дослідження «затриманої» хромосомної нестабільності: двотермінове культивування лімфоцитів периферичної крові людини (не тільки стандартна короткотривала 48-годинна інкубація, але й довгострокове 144-годинне культивування), що давало змогу аналізувати клітини першої та п'ятої клітинних генерацій, відповідно;

– розробка та апробація модельної системи для дослідження прихованої хромосомної нестабільності із застосуванням в якості мутагена-провокатора in vitro протипухлинного антибіотика-радіоміметика блеоміцину (в кінцевих концентраціях 0,05 та 5,00 мкг/мл, на стадії G2 мітотичного циклу) - “G2-bleomycin sensitivity assay”.

Двотермінове культивування лімфоцитів було використано при цитогенетичному обстеженні двох груп дітей, народжених від батьків, в яких іонізуюче випромінювання виступало, як виробничий (учасники ліквідації аварії на ЧАЕС) чи екологічний (мешканці забрудненої радіонуклідами Cs місцевості, які одержали так званий „йодний удар” у 1986 р.) фактори шкідливості. Групою порівняння слугували діти, народжені від неопромінених батьків, які мешкали у сприятливих за радіаційною ситуацією екологічних умовах.

Для визначення фонової частоти та спектру хромосомних аберацій використовували традиційне короткотривале (48-годинне) культивування лімфоцитів, що дозволяло аналізувати клітини переважно першого мітотичного поділу. Для виявлення прихованих потенційних змін ДНК, які можуть проявитися через декілька клітинних поколінь у вигляді затриманої хромосомної нестабільності, використовували нестандартне довгострокове (144-годинне) культивування лімфоцитів, що дозволило аналізувати клітини переважно п'ятого мітотичного циклу.

Узагальнені результати цих досліджень підсумовані в табл. 3.

При аналізі одержаних даних ми намагалися оцінити внесок радіаційної компоненти (опромінення батьків) в цитогенетичний ефект, який спостерігався у їх дітей, а також визначити значення термінів культивування лімфоцитів для експресії цього ефекту. Порівняння результатів цитогенетичного обстеження дітей в залежності від специфіки опромінення батьків показало (табл. 3), що по відношенню до групи порівняння як при стандартному короткотривалому, так і при довгостроковому культивуванні лімфоцитів спостерігали вірогідне (р < 0,01) прискорення темпів спонтанного хромосомного мутагенезу тільки в групі дітей, які народилися від опромінених батьків і проживають на контамінованій радіонуклідами території. Не виключено, що проживання в місцевості, забрудненій радіонуклідами цезію, може сприяти дестабілізації геному як модифікуючий фактор, що підвищує чутливість хромосом соматичних клітин до інших мутагенних чинників, оскільки дози опромінення цих батьків могли бути значно меншими, ніж дози опромінення УЛНА.

Таблиця 3

Порівняння результатів цитогенетичного обстеження дітей, які народилися від експонованих та неекспонованих батьків

Обстежені групи дітей	Частота хромосомних аберацій на 100 клітин	Р
	строки культивування лімфоцитів
	48 годин	144години
Діти, народжені від неопромінених батьків (група порівняння)	1,25±0,11	1,69 ± 0,16	>0,05
Діти, народжені від учасників ліквідації аварії на ЧАЕС	1,46 ± 0,15	2,04 ± 0,20	<0,05
Р	> 0,05	> 0,05
Діти, народжені від неопромінених батьків (група порівняння)	1,25±0,11	1,69 ± 0,16	>0,05
Діти, народжені від батьків, які мешкають на радіаційно забрудненій території (с. Старе, де щільність забруднення грунту 137Cs складає 50,0 кБк/м2 ),	2,09±0,17	3,24 ± 0,23	<0,01
Р	< 0,01	< 0,01

Звертає на себе увагу, що 144-годинне культивування лімфоцитів, при якому аналізувалися клітини переважно 5-го мітотичного циклу, дозволило виявити приховані пошкодження геному у дітей, народжених від опромінених батьків, - цитогенетичний ефект в обох експонованих групах дітей був вірогідно підвищений в порівнянні з результатами, одержаними при короткотривалому культивуванні (р < 0,05; р < 0,01 відповідно), що може свідчити про реалізацію затриманої хромосомної нестабільності в довгострокових культурах лімфоцитів.

Зростання частоти хромосомних аберацій у 5-й клітинній генерації в групі дітей, народжених від батьків з контамінованої радіонуклідами території, як і у відповідній групі дітей, народжених від учасників ліквідації аварії на ЧАЕС, в яких дозове навантаження становило від 40 до 670 мГр, підтверджують можливість експресії віддаленої хромосомної нестабільності в послідовних мітозах. Підвищення рівня обмінних аберацій хромосомного типу - стабільних (аномальні моноцентрики) та нестабільних (центричні кільця) свідчить як про реальність трансгенераційного феномену хромосомної нестабільності у нащадків другої групи, так і про дестабілізацію їх геному через несприятливу екологічну ситуацію в місці проживання - у нащадків першої групи.

У дітей, народжених від учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС, у більшості випадків (88 %) цитогенетичний ефект при обох строках культивування лімфоцитів був ідентичним; у 12 % обстежених частота хромосомних аберацій була вірогідно вища при 144-годинному культивуванні.

У нащадків опромінених радіойодом батьків з контамінованих радіоцезієм територій зросла частка випадків з вірогідним підвищенням хромосомної нестабільності у 5-му мітозі, яка досягла значення 25 %, що у два рази більше, ніж у дітей, народжених від ліквідаторів наслідків аварії на ЧАЕС.

Такий ефект через 18 років після аварії може бути зумовлений характерною особливістю зони Полісся - високим коефіцієнтом переходу радіоцезію з грунту в рослини і акумуляцією його в продуктах харчування (особливо в молоці та картоплі, де його вміст більше ніж в 5 разів перевищував дозволену норму), тобто продовженням внутрішнього опромінення. Не можна виключити також і трансмісивну (трансгенераційну) хромосомну нестабільність, що експресується у нащадків батьків, опромінених радіоізотопами йоду. Саме ефект передачі через опромінені статеві клітини батьків стану нестабільності геному першому поколінню їх нащадків вважається на сьогодні однією з найбільш актуальних проблем радіаційної генетики, для вирішення якої розробляються різні методичні підходи, як на хромосомному, так і на молекулярному рівнях [И. Е. Воробцова, 1991, 1992, 2002; Dubrova, 1996].

...