Структурні зміни органів нервової системи за умов мікромеркуріалізму

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний медичний університет

імені О.О. Богомольця

УДК 616.8 - 018: 615.9:546.49:57.08

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Структурні зміни органів нервової системи за умов мікромеркуріалізму

Сокуренко Людмила Михайлівна

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України.

Наукові консультанти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАМН України Чайковський Юрій Богданович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри гістології та ембріології;

доктор медичних наук, професор, академік НАМН України, член-кореспондент НАН України Трахтенберг Ісаак Михайлович, ДУ "Інститут медицини праці НАМН України", завідувач лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Скибо Галина Григорівна, Інститут фізіології імені О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу цитології;

доктор медичних наук Закордонець Володимир Антонович, Інститут екогігієни і токсикології імені Л.І. Медведя МОЗ України, провідний науковий співробітник відділу екозалежної патології та клінічної токсикології;

доктор медичних наук, професор Геращенко Сергій Борисович, ДВНЗ "Івано-Франківський національний медичний університет", завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології.

Захист відбудеться 21.10.2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, пр-т Перемоги, 34, морфологічний корпус). З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06, доцент В. ДзевульськаАнотації

Сокуренко Л.М. Структурні зміни органів нервової системи за умов мікромеркуріалізму. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія.

- Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, Київ, 2010. мікромеркуріалізм ртуть нервовий

Розроблена нова експериментальна модель мікромеркуріалізму. Експериментально досліджено вплив ртуті на нервову систему та застосування антиоксидантів на основі комплексу морфологічних, морфометричних методів, визначення мікро- та макроелементів і вивчення in vitro. Виявлені морфологічні та морфометричні зміни нейронів і нейроглії є проявами неврологічних розладів, що підтверджується даними щодо цитотоксичної дії сулеми на клітини людини. Найбільшу протекцію при впливі сулеми проявили унітіол та тіотриазолін, а магне-В 6 та мілдронат найменш токсичні в дослідах in vitro. При комбінації препаратів підсилюється їх дія, яка має різні напрями, що дозволяє рекомендувати їх до вивчення на людях при різних клінічних симптомах нейропатії.

Ключові слова: ртуть, нейротоксична дія, спинний мозок, чутливий вузол, тіотриазолін, мілдронат, магне-В 6, унітіол, культура клітин, лектини.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Кардинальні зміни у суспільному житті України докорінно змінюють ситуацію в системі впливу довкілля на здоров'я людини, зумовлюючи необхідність динамічного розвитку якості життя людини, напрями якого визначено в Конституції України, Міжгалузевій комплексній програмі "Здоров'я нації", Законі України "Основи законодавства України про охорону здоров'я". Конституція України гарантує громадянам безпечне навколишнє середовище, тому питання його впливу на організм людини та розробка протекторних заходів є пріоритетними напрямками розвитку галузі охорони здоров'я України. Актуальність цього питання визначена високим рівнем шкідливих факторів довкілля різного походження в Україні (Сердюк А.М., 1998) та у всьому світі (United Nations Environment Programme; 2001), причому найчастіше домінує хімічне забруднення (Омельчук С.Т., 2001). Промислові підприємства та транспорт сьогодні інтенсивно забруднюють навколишнє середовище, що супроводжується викидами токсичних металів та їх сполук, які проникають в організм людини (Кундиев Ю.И., 1996; Abelsohn A., 2002; Barbier O., 2005; Трахтенберг И.М., 2008; Трахтенберг І.М., 2009).

Серед важких металів одне з важливих місць посідають ртуть та її сполуки (Трахтенберг И.М., 1990). Цей хімічний фактор є небезпечним для здоров'я не лише осіб, експонованих на виробництві, а й населення, яке мешкає поблизу підприємств або у великих промислових містах (Ларионова Т.К., 2000; Falandysz J., 2001; Global mercury assessment, 2002; Паранько Н.М., 2002; Clifton J.C., 2007). Провідними напрямами наукових досліджень і практичної діяльності вчених щодо ртутної безпеки стає боротьба з мікромеркуріалізмом (Трахтенберг И.М., 2004), який насамперед позначається на нервовій системі, що знаходить своє відображення в численних нервових розладах та найчастіше маскуються під інші захворювання. Дані про фармакологічні ефекти нейротропних препаратів за умов мікромеркуріалізму в наявній вітчизняній та іноземній літературі представлені недостатньо (Длин В.В., 1998;

Flora G.J.S., Kumar P., 1998). Отже, актуальними є подальші нейроморфологічні дослідження, метою яких є пошук лікарських засобів для підвищення ефективності профілактики нейроінтоксикації, спричиненої малими дозами ртуті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано на кафедрі гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця у відповідності до основного плану науково-дослідних робіт кафедри "Вивчити морфологічні зміни нервової системи за умов дії фізичних та хімічних чинників та можливостей їх корекції", № держреєстрації 0106U002345, та "Вивчення нервової, імунної систем та серця за умов дії екзогенних та ендогенних факторів", № держреєстрації 0109U000091.

Мета дослідження - розробити концепцію морфогенезу токсичних нейропатій, що виникають під впливом малих доз сполук ртуті в хронічному експерименті та їх фармакологічної корекції на підставі виявлення визначальних особливостей змін структур спинного мозку та чутливих вузлів, а також значення тканинних культур при експериментальному вивченні нейротоксикантів.

Завдання дослідження:

1. Розробити концепцію нейротоксичної дії ртуті на основі особливостей морфологічних змін у чутливих вузлах та спинному мозку в процесі формування токсичних периферійних нейропатій, викликаних введенням малих доз сполук ртуті.

2. Виявити закономірності та характеристики основних етапів (хронічна, субхронічна експозиція) розвитку токсичних нейропатій, викликаних введенням експериментальним тваринам малих доз сполук ртуті.

3. Провести аналіз взаємозв'язків між змінами в органах нервової системи у експериментальних тварин та дослідами на клітинних лініях людини.

4. Встановити гістологічні та цитологічні критерії токсичної дії хлориду ртуті in vivo та in vitro.

5. Вивчити особливості морфологічних змін у чутливих вузлах та спинному мозку за умов дії малих доз сполук ртуті та з наступним введенням унітіолу, тіотриазоліну, магне-В 6, мілдронату.

6. Провести порівняльний аналіз між впливом антиоксидантів: унітіол, тіотриазолін, магне-В 6 та мілдронат.

7. З'ясувати дію комбінацій мілдронату з унітіолом, тіотриазоліном та магне-В 6 та запропонувати рекомендації щодо умов їх застосування.

Об'єктом дослідження є експериментальні токсичні нейропатії на прикладі моделі мікромеркуріалізму на білих щурах та клітинних культурах людини ліній IMR-32 та U-373-MG.

Предмет дослідження - морфологічні зміни за умов мікромеркуріалізму в чутливих вузлах та спинному мозку щурів, клітинних культурах людини ліній IMR-32 та U-373-MG та їх фармакологічна корекція.

Методи дослідження. У роботі використано системний підхід, який передбачає застосування комплексу нейрогістологічних, лектино-гістохімічних та електронномікроскопічних методів, а також досліди in vitro, які дають змогу визначити особливості структурних змін нейронів, глії, мікрогемосудин спинного мозку та чутливих вузлів при токсичному ураженні. Визначався вміст макро- та мікроелементів в органах нервової системи, застосовувався комп'ютерний морфометричний аналіз із використанням аналізатора зображень та адаптованого програмного забезпечення, що дало можливість виявити закономірності виникнення і розвитку токсичних процесів і виявити їх морфологічні характеристики.

Наукова новизна і теоретичне значення роботи. Уперше обґрунтовано і розроблено нові методичні підходи щодо визначення ступеня та еколого-гігієнічної значущості впливу ртуті на організм із застосуванням сучасних методів, а також більш чітких і раціональних способів інтерпретації одержаних результатів. Пріоритетним аспектом дослідження є одночасне застосування кількісного і якісного аналізу. Вперше виявлено закономірності та особливості впливу ртуті на структуру клітин спинного мозку та спинномозкових гангліїв у системі in vitro та in vivo. Розроблено концепцію щодо коригуючого впливу фармакологічних препаратів на основі патогенезу ртутної інтоксикації. Уперше оцінено зміни мікро- та макроелементного складу спинного мозку щурів за дії хлориду ртуті. Доведено ефективність дії різних антиоксидантів для протекції токсичного впливу на організм.

За допомогою експериментального дослідження вперше отримано оптимальні умови застосування препаратів "Тіотриазолін", "Мілдронат" та "Магне-В 6" з метою нівелювання токсичної дії хлориду ртуті у щурів та отримано три Державних патенти України на корисну модель.

Уперше систематизовано та оформлено експериментальну модель ртутної інтоксикації при різних термінах дослідження та отримано Державний патент України на корисну модель.

Практичне значення одержаних результатів і впровадження результатів роботи. Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що дані вивчення реактивних змін тіл нейронів, нейроглії та нервових волокон й отримання оптимальних умов прискорення відновлювальних процесів у нервовій тканині за умов токсичного впливу ртуті можуть бути враховані в клінічній практиці медичних закладів, що займаються проблемами нейропатології, гігієни, токсикології та професійних хвороб.

Проведення всебічних досліджень токсичного впливу хлориду ртуті дає можливість розширити коло знань щодо патогенетичних механізмів, що повинно забезпечити осмислене і науково обґрунтоване застосування антиоксидантів, а також пошук нових типів детоксикантів.

Використання препаратів тіотриазолін, мілдронат та магне-В 6 у щурів із мікромеркуріалізмом має практичне значення для впровадження їх у клінічну практику з метою профілактики та лікування (отримано Державні патенти України на корисну модель).

Обґрунтовано доцільність застосування методу культури клітин для оцінки нейротоксичної дії ртуті, що може бути використано як для отримання більш чітких токсикологічних та морфологічних даних для клітин людини, так і для зменшення кількості експериментальних тварин.

Визначення змін рівня мікро- та макроелементів у спинному мозку щурів за умов моделювання мікромеркуріалізму має суттєве значення для розуміння патогенезу ртутної інтоксикації та розробки стратегії лікування, зокрема, для використання різних антиоксидантів.

Результати досліджень можуть застосовуватись при вирішенні прикладних задач гістології, цитології, неврології, патоморфології, гігієни, токсикології та біологічних досліджень. Отримані результати дослідження впроваджені в навчальний процес на кафедрі гістології та ембріології НМУ, Дніпропетровської державної медичної академії, лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин ДУ "Інститут медицини праці АМН України", Інституті експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Е. Кавецького НАН України.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведено наукову розробку всіх отриманих результатів роботи. Дисертація є особистою роботою, в якій автором було визначено мету і завдання дослідження, проаналізовано понад 500 джерел літератури та патентну інформацію за темою. Здобувач була ініціатором нового наукового напряму в галузях токсикоморфології та нейрофармакології. Автор самостійно моделювала токсичну нейропатію у щурів, проводила забір матеріалу, фіксацію та наступне ущільнення матеріалу, отримання гістологічних зрізів, їх забарвлення з використанням нейрогістологічних методів дослідження. Автором особисто було застосовано морфометричні та статистичні дослідження. Автор самостійно провела фотографування гістологічних препаратів на світловому та електронному мікроскопах.

Аналіз отриманих результатів, формулювання висновків із визначенням практичних рекомендацій, що відображено в запропонованих деклараційних патентах на корисну модель, виконано автором самостійно. Автор підготувала статті, оформила дисертаційну роботу та провела апробацію результатів досліджень самостійно. У наукових публікаціях результатів дисертації за участю співавторів дисертанту належить основна частина внеску.

Апробація роботи. Основні положення дисертації було оприлюднено на засіданнях кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, на

II науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (Київ, 2005), міжнародній науково-практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів "Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини", присвяченій Дню науки в Україні (Суми, 2006); на "Колосовських читаннях" (Санкт-Петербург, 2006); III Національному з'їзді фармакологів України "Фармакологія - крок у майбутнє" (Одеса, 2006); науково-практичній конференції молодих вчених з міжнародною участю "Вчені майбутнього" (Одеса, 2006); міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми екології - 2007" (Гродно, 2007); I міжнародному конгресі студентів та молодих вчених "Актуальні проблеми сучасної медицини" (Київ, 2008); 3-му з'їзді токсикологів Росії (Москва, 2008); Науково-практичній конференції "Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології. Прикладні аспекти морфології" (Вінниця, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Довкілля та здоров'я" (Тернопіль, 2009), Науковій конференції з міжнародною участю "Медицина труда. Здоровье работающего населения: достижения и перспективы.

- Актуальные вопросы профпатологии" (Санкт-Петербург, 2009); Міжнародній науково-практичній конференції "Здоровье и

окружающая среда" (Мінськ, 2009); Міжнародній науково-практичній конференції "Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии" (Гродно, 2009).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 48 наукових праць, у тому числі 28 статей у наукових фахових журналах за переліком ВАК України та інших країн (9 - особисто опубліковані здобувачем), 3 - у збірниках наукових праць, 11 - у тезах конгресів, з'їздів і конференцій. За результатами дисертаційної роботи автор має чотири деклараційних патенти на корисну модель та видано п'ять інформаційних листків.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 354 сторінках I тому (основного тексту - 281 сторінка) та складається зі змісту, переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, розділу, в якому охарактеризовано матеріал і методи дослідження, дев'яти розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків, списку використаної літератури. Том 2 містить 174 сторінки з 13 додатками.

Дисертацію проілюстровано 63 рисунками та 7 таблицями, а також 30 таблиць та 199 рисунків у додатках. Список літератури складається з 510 джерел - вітчизняних (278) та зарубіжних авторів (232).

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводились на 180 білих щурах лінії Вістар вагою 160-180 г (на початку експерименту). Експериментальні тварини були розподілені на 18 груп, розбитих на 9 серій. Тварини знаходилися на стандартному раціоні віварію при природній зміні дня і ночі з вільним доступом до питної води. Обсяг проведених досліджень та їх розподіл по групах наведено в таблиці 1.

Вивчали аферентні нейрони та їх оточення у спинномозкових вузлах, поперекові та крижові сегменти мотонейронів спинного мозку, які формують еферентний компонент сідничного нерва і належать до всіх шести нейронних популяцій IX пластини (за Рекседом) сірої речовини попереково-крижового відділу спинного мозку на рівні L2-S1.

Світлова мікроскопія. Зрізи спинного мозку отримували за загальноприйнятими методиками, забарвлювали за Нісслем та імпрегнували нітратом срібла за Більшовським - Грос, із подальшим вивченням на світлооптичному рівні.

Для вивчення реактивних змін мотонейронів спинного мозку на світлооптичному рівні були обрані наступні показники: довгий (великий) та короткий (малий) діаметр, периметр, площа та об'єм тіла й ядра нейронів, об'єм цитоплазми, і, відповідно, показники співвідношення довгого та короткого діаметрів (коефіцієнт елонгації), об'ємів ядерця та ядра, ядерно-цитоплазматичне співвідношення (індекс Гертвіга), а також визначали кількість гліоцитів, які безпосередньо межують із тілами нейронів та показник гліального забезпечення нейрона.

Для вивчення реактивних змін нейронів, нейроглії та нервових волокон чутливих вузлів на світлооптичному рівні вивчали наступні показники: діаметр, периметр, площу та об'єм тіла та ядра світлих і темних нейронів, діаметр, периметр, площу та об'єми їх ядерця та ядра, ядерно-цитоплазматичне співвідношення (індекс Гертвіга) і співвідношення об'ємів їх ядерця та ядра. Також визначали кількість і відсоткове співвідношення світлих і темних нейронів, кількість та відсоткове співвідношення гліоцитів, які безпосередньо межують із тілами світлих і темних нейронів та мієлінових незмінених та патологічно змінених нервових волокон.

Морфометричне дослідження. Морфометричне дослідження було проведено за допомогою аналізатора зображень: мікроскопа

Olympus BX51 з цифровою камерою C-4040zoom та персонального комп'ютера. Вимірювались метричні характеристики на базі програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool ® for Windows ® (version 2.00) в інтерактивному режимі з використанням об'єктива х 40 і окуляра х 10.

Таблиця 1 Обсяг проведених досліджень на щурах

Рис. 1. Схема дослідження.

Лектиногістохімічне дослідження. Препарати спинного мозку обробляли з застосуванням стандартних наборів НПК "Лектинотест" (м. Львів) у розведенні лектину (Л) 1:50 за рекомендованою методикою (Луцик А.Д., 1989). Використані: лектин рицини (RCA), специфічний до D-галактози, екранованої сіаловою кислотою; лектин бобчука анагиролистного (LABA), специфічний до L-фукози, лектин конвалії (ConA), специфічний до манози. Експресію рецепторів визначали напівкількісним методом: - відсутність зв'язування, + слабке зв'язування, ++ помірне зв'язування, +++ сильне зв'язування.

Ультрамікроскопічне дослідження. Ультратонкі зрізи одержували за загальноприйнятою методикою з невеликих фрагментів спинномозкових вузлів та спинного мозку на ультратомі LKB-8800 (Швеція) в їхніх повздовжній та поперечній проекціях, контрастували 2% розчином уранілацетату в 70-50% етанолі протягом 15 хвилин і азотнокислим свинцем стільки ж часу. Зрізи вивчали та фотографували в електронному мікроскопі ПЭМ 125К та ЭМВ 100Б. Досліджували моторні нейрони передніх рогів сірої речовини спинного мозку та нейрони спинномозкових вузлів.

Визначення вмісту хімічних елементів. Визначення вмісту хімічних елементів у біосубстратах проводили методом атомно-емісійної спектроскопії АЕС-ІЗП на приладі Optima 2100 DV виробництва фірми Perkin-Elmer (США), який є багатоелементним. Визначали вміст Mg, Cu, К, Zn, Se, Li у відсоткових співвідношеннях до загальної кількості прорахованих мікро- та макроелементів у групі.

Дослідження на клітинних культурах (in vitro). Цитотоксична дія хлориду ртуті вивчалася методом двократних серійних розведень на постійних лініях клітин IMR-32 (нейробластома людини) та U-373 MG (гліобластома людини). Досліджувані клітини культивували в повному поживному середовищі за стандартних умов при утворенні клітинами на субстраті суцільного моношару (4-а доба росту), заміщали середовищем, яке містило хлорид ртуті (ІІ) у концентраціях 1000, 100, 10, 1,0, 0,1 мкМоль/мл. Кожне розведення хімічного агенту досліджувалось у чотирьох паралельних серіях. За контроль взяли клітини без додавання хімічних сполук. Чутливість клітин до дії хлориду ртуті в присутності досліджуваних антидотів вивчали за інгібіцією цитотоксичного ефекту ртуті при фарбуванні клітин трипановим синім, підрахунок клітин здійснювали за допомогою гемоцитометра. Забарвлені клітини рахували за допомогою світлового мікроскопу. Препарати, забарвлені за Романовським, аналізували під світловим мікроскопом (AxioStarPlus (Сarl Zeiss, Німеччина).

Дослідження ефективності застосування лікарських засобів проводили в два етапи: перевіряли відсутність цитотоксичної та вивчали їх цитопротекторну дію. При цьому живильне середовище, в якому за стандартних умов культивувались культури клітин, заміщали середовищем, що містило в 1 мл різні дози (1, 01, 0,01, 0,001 мг/мл - для тіотриазоліну та магне-В 6 та 10, 1, 0,1, 0,01 мг/мл - для унітіолу та мілдронату) певного препарату та концентрації хлориду ртуті (ІІ) 20 мкМ/мл для U-373 і 10,9 мкМ/мл для IMR-32, які були визначені як ІС 50. Контролем була культура клітин із відповідною концентрацією хлориду ртуті. Визначали IC50 (концентрація 50%), як концентрацію препарату, при якій кількість забарвлених клітин у лунці зменшується на 50%. Розрахунок IC50 був проведений із використанням програми Statistica+ 3.5.0 beta методом пробіт-аналіза (http://www.statplus.nm.ru). Для підвищення об'єктивної оцінки отриманих результатів розроблено такі показники, як відсотковий вміст клітин, індекси цитопатичних змін та індекси проліферації. У зв'язку з тим, що відбувався поділ живих та руйнування мертвих клітин, визначали такі середні показники: відсотки живих (нейробластів та нейрогліобластів) (L, %), індекси цитопатичних змін за мертвими клітинами (ICCD) та за живими клітинами (ICCL), індекси проліферації за мертвими (IPd), за живими клітинами (IPl) та за загальною кількістю клітин (IPg).

Статистичну обробку результатів вимірів структур спинного мозку та чутливих вузлів, а також даних досліджень in vitro проводили з використанням пакету статистичних програм Statistica 4.0 (Statistica Inc. США), Biostat і MS Excell. Відмінності між групами встановлювали, використовуючи параметричний критерій t-Стьюдента та непараметричний критерій Манна-Утні-Вілкоксона. Достовірними вважали відмінності з рівнем значущості більше 95% (p<0,05) (Мінцер О.П., 2003; Антомонов М.Ю., 2006).

Результати дослідження та їх обговорення. Дослідження змін у нервовій тканині під впливом малих доз ртуті. Дослідження змін у нервовій тканині під впливом малих доз ртуті на світлооптичному рівні в спинному мозку та спинномозкових вузлах щурів свідчать про порушення синтетичних процесів у нервових клітинах (ексцентричне розташування ядерця та хроматоліз). При довготривалій експозиції ці явища прогресують. Визначається збільшення кількості світлих нейронів чутливих вузлів і нервових волокон з явищами демієлінізації та деградації, що свідчить про переважне ураження солями ртуті нервових відростків та клітин Шванна, які утворюють мієлінову оболонку.

Зміни морфометричних показників у спинному мозку при короткотривалій експозиції хлориду ртуті відзначаються зростанням коефіцієнтів елонгації ядра і тіла клітини та коефіцієнта ексцентричності, що свідчить про реактивні зміни нейронів, але збільшується показник гліального забезпечення нейронів (97,9 ±11,4 у.о., де контроль 62,5±5,6 у.о., р0,05) за рахунок реактивного збільшення об'єму нейроглії. При довготривалій експозиції відбувається зменшення коефіцієнтів елонгації ядра і тіла клітини та зростання коефіцієнта ексцентричності, а також зменшення показника гліального забезпечення нейронів та нейрон-гліального співвідношення (12,3±1,7, де контроль 62,5±5,6, р0,05), що свідчить про декомпенсаційні зміни реактивності нейроглії та нейронів.

Морфологічні зміни в чутливих вузлах проявляються збільшенням розмірів перикаріонів, ядер та ядерець світлих і темних нейронів та супроводжується зменшенням співвідношення ядер та ядерець світлих нейронів (0,02±0,002 у.о., де контроль 0,11±0,02 у.о., р0,05). При короткотривалій експозиції реактивні зміни відбуваються в світлих і темних нейронах, а при довготривалій морфологічна картина свідчить про вищу, порівняно з темними нейронами, реактивність світлих клітин, активність яких при пошкодженнях чутливих вузлів підтверджують інші дослідники (Андріїшин О.П., 2001).

Лектиногістохімічна оцінка виявила при короткотривалій та довготривалій експозиціях ртуттю слабкий зв'язок із манозоспецифічним лектином конвалії (ConA) та рицини (RCA) на відміну від контрастного забарвлення компонентів інтактної нервової тканини, реакцію якої підтверджують інші дослідники (Луцик Д.О., 2005). Із фукозоспецифічним лектином LABA - зв'язок середньої інтенсивності, що відрізняється від сильного зв'язку в контролі.

За короткотривалої експозиції в нейронах спинного мозку відбуваються процеси компенсаційних змін, спрямованих на залучення внутрішніх резервів для відновлення функціонального стану (вивільнення продуктів синтезу з білоксинтезуючих органел), а при довготривалій - процеси декомпенсації (деструктуризація канальців ендоплазматичної сітки, практично відсутні зв'язані рибосоми та полісоми, але з'являється велика кількість вторинних лізосом, відбувається руйнування структури мітохондрій, в яких накопичуються, за даними літератури, іони ртуті) (Курляндский Б.А., 2001). Подібну реакцію моторних ядер спинного мозку на токсичну дію протипухлинних лікарських засобів описував С.Б. Геращенко (2003). На всіх термінах дослідження простежується така закономірність: чим більша виразність змін у капілярній стінці, тим значніше пошкодження астроглії, що оточує капіляр, чим більший прояв змін у гліальних клітинах, тим значніше пошкодження в нейронах. Можна припустити, що ультраструктурні зміни в ендотеліальних і перицитарних клітинах відбивають послідовні стадії одного й того ж патологічного процесу, який характеризується стадіями компенсації, виражених змін та декомпенсації. Взаємозв'язок між реакцією на пошкодження судин гемомікроциркуляторного русла та клітин нервової тканини підкреслювали інші автори (Чурілін О.О., 2005). Було з'ясовано відмінність між змінами в спинному мозку щурів хронічного та субхронічного експериментів, яка полягає в активації синтетичних процесів при субхронічному впливі та превалюванні декомпенсацій у них - при хронічній експозиції.

В умовах моделювання мікромеркуріалізму в спинномозкових вузлах піддослідних тварин виникають деструктивні порушення в нейроцитах та нейроглії, судинах мікроциркуляторного русла та нервових волокнах чутливих вузлів. Слід зазначити, що після короткотривалої експозиції відбуваються процеси компенсаційних змін, спрямованих на залучення внутрішніх резервів для відновлення функціонального стану. Відбувається вивільнення продуктів синтезу з білоксинтезуючих органел у нейронах і гліоцитах, виявляється багато функціонально активних ендотеліоцитів із великою кількістю цитоплазматичних виростів. При довготривалій експозиції спостерігаються прояви декомпенсації. Це проявляється деструктуризацією канальців ендоплазматичної сітки, відсутністю зв'язаних рибосом та полісом, появою великої кількості вторинних лізосом, а також руйнуванням структури мітохондрій. Схожі зміни виявлено при ендогенній інтоксикації за тяжкої термічної травми (Андріїшин О.П., 2001).

У спинному мозку щурів під впливом малих концентрацій ртуті визначається зниження вмісту таких важливих для функціонування нервової тканини елементів як магній, цинк та мідь. Концентрація антагоніста ртуті - селену - практично дорівнює нулю, що свідчить про високу конкурентну здатність ртуті за місця зв'язування в сірковмісних ферментах та білках. Вміст літію (0,01 (0,01;0,01)%) зростає при короткотривалій експозиції хлоридом ртуті, але суттєво зменшується (0,001 (0,001;0,001)%, де 0,006 (0,01;0,01)% контроль, р0,05) при довгостроковій, що вірогідно обумовлено нейропротекторною дією на нейрони.

Дослідження альтернативним методом in vitro, який усе більше набуває поширення серед науковців, з'ясовано, що клітини лінії

U-373 MG виявилися менш чутливими до хлориду ртуті, ніж IMR-32. Так ІС 50 для клітин лінії U-373 MG складає - 20,5 мкМоль/мл, для IMR-32 - 10,95 мкМоль/мл (табл. 2).

Таблиця 2 Оцінка чутливості клітин ліній до впливу хлориду ртуті (визначення IС 50)

В експерименті з клітинною лінією IMR-32 визначаються щільно розміщені клітини фібробластичного та нейробластичного рядів, які мають веретеноподібну або мультиполярну форми та містять відростки, а також незначну кількість клітин зі зруйнованою структурою, а в досліді з лінією U-373 MG визначено клітини округлої, веретеноподібної та зірчатої фори з двома чи декількома відростками, а також незначною кількістю клітин з ознаками деструкції при концентраціях хлориду ртуті 1,0 та 0,1 мкМоль/мл. Щільність клітинних культур та відсутність зруйнованих клітин залежить від дозування сулеми. Ці явища інтенсивніше виражені на ранніх стадіях дослідів, ніж на другу добу (рис. 2).

Рис. 2. Життєздатність клітин IMR-32 за дії різних концентрацій хлориду ртуті після 24 год та 48 год експозиції. По осі абсцис - концентрації хлориду ртуті (мкМоль/мл), по осі ординат - кількість живих клітин (%).

При цитологічному дослідженні клітинних культур помітні переважно великі округлі клітини та в меншій кількості - дрібні базофільні клітини округлої форми з крупними ядерцями. Спостерігаються нейробласти та гліобласти з мітотичними ядрами, а також зруйновані клітини. При більших дозах сулеми відбулась масова загибель усіх клітин. Зі зменшенням концентрації ртуті кількість клітин у стадії мітозу зростає, а рештки зруйнованих клітин трапляються все рідше. Дослідження цитотоксичної активності хлориду ртуті щодо впливу на культури U-373 MG та IMR-32 визначило, що його різні концентрації впливають на життєздатність та проліферацію клітин лінії IMR-32 різною мірою: у дозах 1000 та 100 мкМ/мл більш проявляється цитотоксичний ефект, а при дозах 1,0 та 0,1 мкМ/мл - пригнічення проліферації, обидва патологічних механізми спостерігаються при дозі 10 мкМ/мл (рис. 3).

Рис. 3. Життєздатність клітин U-373 MG за дії різних концентрацій хлориду ртуті після 24 год та 48 год експозиції. По осі абсцис - концентрації хлориду ртуті (мкМоль/мл), по осі ординат - кількість живих клітин (%).

На підставі викладеного вище, а також враховуючи безперечну участь нейронів ядер передніх рогів спинного мозку та чутливих вузлів у функціонуванні рефлекторних дуг, можна передбачити, що виявлені морфофункціональні перетворення нейронів і нейроглії (зміни площі нейронів і їх ядер, щільність розташування сателітної глії, гліального та перинейронального індексів, інтенсивність лектиногістохімичних реакцій у поєднанні зі зміною ультраструктурної будови, дисбалансу вмісту металів) є однією з причин неврологічних розладів рухових функцій, які при екстраполяції на людину проявляються при тривалому надходженні ртутних сполук, що підтверджується даними щодо цитотоксичної дії на клітини IMR-32 та U-373-MG ліній.

Отже, виходячи з отриманих результатів комплексного аналізу вищезгаданих моделей можна запропонувати концепцію розвитку ртутної токсичної нейропатії, яка включає такі механізми змін структур: вплив солей ртуті через кров і шляхом порушення структури капілярів; вплив через нейрогліальні клітини; вплив на міжклітинні контакти; безпосередній вплив на нейроцити; аутоімунні реакції та наслідки впливу всіх вищезгаданих механізмів. Отже, отримані в результаті проведеного дослідження дані можуть бути використані в клініці для більш глибокого вивчення патогенезу та методів лікування захворювань, пов'язаних із тривалим надходженням малих доз ртуті. Таким чином, концепція вивчення дії ксенобіотиків полягає в моделюванні токсичних нейропатій із максимально можливим наближенням до реальних рівнів впливу та вивчення протекторних властивостей фармакологічних засобів із дотриманням принципів їх безпечності та ефективності. Це включає таку послідовність: скринінг на культурах клітин нейрогенного походження > застосування комплексу нейрогістологічних та лектиногістохімічних методів на лабораторних тваринах, з'ясування більш глибоких змін електронномікроскопічним методом, визначення рівня мікро- та макроелементів для розуміння їх підгрунтя, застосування методів аналізу для отримання доказової бази.

Дослідження ефективності впливу монопротекції лікарськими засобами. Протекція лікарськими засобами токсичного впливу малих концентрацій ртуті призводить до посилення репаративних процесів у чутливих вузлах тварин при короткотривалій експозиції, а при довготривалій експозиції відбувається різні ступені корекції процесів декомпенсації.

За умов застосування препаратів "Унітіол" (У), "Тіотриазолін" (Т), "Магне-В 6" (Мг) та "Мілдронат" (М) при короткотривалій експозиції відбувається активація синтетичних процесів, яка проявляється в зміщенні ядерця до ядерної оболонки та збільшення його в розмірах, більш упорядковане концентричне розміщення гранул хроматофільної субстанції навколо ядра, а при довготривалій відбувається стабілізація синтетичних процесів, яка проявляється впорядкованістю хроматофільної речовини та централізацією ядерця. Ці зміни мають різні ступені виразності при дії різних лікарських засобів. Так, найінтенсивніші зміни відбуваються при застосування У та Т, менш виражені при - Мг та М.

Морфометричні дані на ранніх термінах дослідження впливу лікарських засобів свідчать про зменшення токсичних проявів, нівелювання адаптаційних та компенсаторних змін у нейронах: зменшення розмірів тіл, ядер та ядерець нейроцитів і гліоцитів, нейро-гліального співвідношення, кількості гліоцитів на один нейрон та показника гліального забезпечення нейронів на відміну від експозиції, збільшенням співвідношення середніх об'ємів ядра та ядерця, коефіцієнтів елонгації перикаріонів та ядер. Індекс Гертвіга за умови застосування У (0,6±0,17) та Мг (0,73±0,46) значно перевищує показники контролю (0,4±0,05, р0,05) та групи з інтоксикацією (0,4±0,13, р0,05), під впливом Т та М майже досягає норми. За умов застосування Т зростають розміри ядерець мотонейронів.

Структурні зміни спинного мозку при довготривалій експозиції за умов використання корекції фармакологічними препаратами можна розцінити як прояв інтенсивних відновлювальних процесів, які полягають у збільшенні морфометричних показників перикаріонів і гліоцитів. При цьому співвідношення ядерця та ядра також зростають, але меншою мірою, ніж при короткотривалій експозиції. Це пов'язано з компенсаторною реакцією нейрона, яка направлена на збільшення площі поверхні ядра в зв'язку з активацією синтетичних процесів, необхідних для синтезу групи білків, які беруть участь у відновленні пошкоджених структур нейрона. За умови застосування Т (0,05±0,01), Мг (0,05±0,002) та М (0,04±0,01) коефіцієнт співвідношення ядерця та ядра суттєво менше, ніж при короткотривалій експозиції (відповідно 0,17±0,02; 0,2±0,05; 0,1±0,01, р0,05). Морфометрична картина змін мотонейронів спинного мозку та гліоцитів, що їх оточують, свідчить про більший ступінь їх виразності за умов мікромеркуріалізму під впливом Т, Мг та М, що проявляється зменшенням коефіцієнтів елонгації перикаріонів та ядер. Показник гліального забезпечення нейронів збільшується і перевищує значення контролю та груп із субхронічним дослідом за умови застосування фармакологічної протекції, при цьому найбільші значення характерні для Т (233,0±25,0 у.о.) та Мг (236,1±19,3 у.о.), менші - У (120,0±26,8 у.о.) та М (187,0±18,0 у.о., де контроль 62,5±5,6 у.о., р0,05). Це свідчить про активну роль глії в процесах фармакологічної корекції мікромеркуріалізму.

Зміни в чутливих вузлах демонструють достовірне зростання кількості світлих нейронів та нейроглії навколо них на ранніх стадіях при фармакологічній корекції мікромеркуріалізму У (26,1±3,9; 65,7±2,8%), Т (26,5±1,2; 61,0±1,3%) та Мг (41,2±2,3%; 64,1±2,8%, де контроль 21,9±3,5%, 58,4±2,7%, р0,05), що свідчить про їхню активну синтетичну діяльність. Меншою мірою такі тенденції проявляються на пізніх стадіях. Протекторна дія М на нейротоксичність сулеми визначається зниженням коефіцієнту співвідношення світлих нейронів чутливих вузлів щурів до груп без фармакологічного впливу (0,9) та при короткотривалій експозиції - достовірним зростанням коефіцієнту співвідношення нейроглії навколо світлих нейронів (1,2).

Коефіцієнт співвідношення нормальних мієлінових нервових волокон спинномозкових гангліїв до груп без дії лікарського засобу достовірно зростає за умови застосування У в 1,2 і 1,4 рази, Т - 1,3 та 1,5 рази, в Мг - 1,4 та 1,3 рази, М - 1,2 та 1,3 рази. Зазначені зміни свідчать про стримування токсичних проявів металу на нервові волокна чутливих вузлів за умови застосування лікарських засобів на фоні розвитку ртутної експозиції, особливо Т та Мг.

Лектиногістохімічні дослідження спинного мозку щурів експонованих хлоридом ртуті за умов застосування У демонструють сильний зв'язок нейронів та нейроглії з лектинами LABA та ConA на ранніх термінах дослідження і середній - на пізніх. Лектини LABA мають високу спорідненість до судин гемомікроциркуляторного русла. Для рецепторів RCA характерний низький рівень зв'язування при обох строках експозиції. Це можна розглядати як зростання синтетичних процесів при субхронічній дії хлориду ртуті та відновних процесів при хронічній його дії, а також свідчить про високу активність судин. Т має схожий ефект дії, однак демонструє середній зв'язок із нейроглією після короткотривалої експозиції, що можна трактувати як переважання синтетичної активності в нейронах. За умов випливу Мг інтенсивні відновні процеси проявляються сильним зв'язком лектинів кліщовини та конковаліну А з нейронами та нейроглією після короткотермінової експозиції. Середньої інтенсивності зв'язок характерний для лектину золотого дощу. При довготривалій експозиції характерна середня інтенсивність зв'язування нейронів та сильна для нейроглії, що свідчить про переважання синтетичних процесів у гліоцитах. При субхронічному дослідженні за умов застосування М визначається сильна інтенсивна реакція нейронів та нейроглії з рецепторами всіх лектинів, а у хронічному експерименті проявляється середня за інтенсивністю реакція, що свідчить про залучення до відновних процесів усіх видів вуглеводних рецепторів.

Під впливом монопротекції лікарськими засобами в тканині спинного мозку тварин відбуваються ознаки зворотних компенсаторних реакцій на ранніх термінах дослідження, які є більш інтенсивними за дії У та Т. При довготривалій експозиції на фоні деструктивних та дистрофічних змін у спинному мозку спостерігаються явища регенерації. Явища активації синтетичних процесів за умови застосування одного лікарського засобу характерні для довгих термінів дослідження, а за умови застосування комбінованого впливу - проявляються на обох етапах дослідження. За умови застосування М активуються достатньо інтенсивні синтетичні процеси, виявляються ядерні пори та хроматин.

Протекція лікарськими засобами токсичного впливу малих концентрацій ртуті веде до посилення репаративних процесів у тканині чутливих вузлів тварин після короткотривалої експозиції, а після довготривалої експозиції відбувається корекція процесів декомпенсації, однак із різним ступенем виразності. Вплив У та Т протягом експерименту, а також Мг на ранніх стадіях характеризуються появою новоутворених мієлінових волокон. Дії Мг та М відрізняються більш інтенсивним стимулюванням білоксинтезуючих процесів, що полягає в превалюванні еухроматину та активації ядерних пор.

В експонованих хлоридом ртуті піддослідних тварин у короткі терміни при застосуванні антиоксидантів для корекції мікромеркуріалізму спостерігаються тенденції до відновлення вмісту мікроелементів. Довготривалі терміни експозиції супроводжуються зростанням вмісту мікроелементів. Так, у багатьох серіях дослідження виявляється зростання антагоністів ртуті - селену та літію. Вплив Мг сприяє біосинтезу нейромедіаторів, що, вірогідно, є одним із чинників кращого збереження синаптичних контактів. Зростання цинку відбувається в групах, де застосували У (34,0 (33,1;33,4)%), Т (29,7 (29,2;30,2)%), Мг (11,1 (10,4; 12,0)%) та М (6,7 (6,6; 7,3)%, де контроль 5,3 (4,1;6,5)%, р0,05), що суттєво відрізняється від показників при моделюванні мікромеркуріалізму.

Оскільки при дослідженні фармакологічних препаратів керуються принципами ефективності, безпечності та доступності, то перші два пункти лягли в основу вивчення їх дії на культури клітин нейрогенного походження, у той час, як останнім ми керувались при їх відборі. При вивченні клітин лінії U-373-MG за умов застосування препарату "У" спостерігається достатньо широкий діапазон безпечності від 1,0 до 0,01 мг/мл, Т та Мг у концентрації 0,1-0,01 мг/мл являють собою золоту середину. Найбільший відсоток живих клітин (100,0 (100;100)%), що дорівнює контролю (100,0 (100;100)%), спостерігається за дії концентрації У 0,01 мг/мл, однак найбільший індекс проліферації визначається при концентрації 0,1 мг/мл, причому індекс проліферації для живих клітин однаковий для обох доз (1,14 (1,12; 1,16) та 1,14 (1,09; 1,19) у.о., де контроль 1,36 (1,32; 1,40) у.о. та 1,26 (1,21; 1,32) у.о., р0,05). Найкращі значення проявів безпечності дії М на культуру клітин ліній U-373-MG виявляються в діапазоні концентрацій від 10,0 до 0,01 мг/мл.

При експозиції хлоридом ртуті та монопротекції повного захисту клітин за умов застосування лікарських засобів не відбувалося. За дії У в концентрації 0,1 мг/мл для корекції дії ртуті виявляються найкращі значення індексів цитопатичних змін та індексів проліферації клітин лінії U-373-MG. Найбільший відсоток живих клітин (84,6 (82,05; 87,18)%), де контроль 96,8 (95,7; 97,9)%, р0,05) та індексів цитопатичних змін спостерігається при 0,1 мг/мл Т. Однак найбільші індекси проліферації визначаються в концентраціях 1,0 та 0,1 мг/мл, причому при останній концентрації суттєво менший індекс проліферації за мертвими клітинами. Найбільший відсоток живих клітин та індексів цитопатичних змін клітин лінії U-373-MG з моделюванням токсичного впливу хлориду ртуті спостерігається при концентраціях Мг 0,1 та 0,001 мг/мл. Найбільші індекси проліферації живих клітин визначаються при 0,1 мг/мл Мг, а при концентрації 0,001 мг/мл, суттєво менший індекс проліферації за мертвими клітинами (0,07 (0,05; 0,08) у.о.), де контроль 0,04 (0,02; 0,05) у.о., р0,05). Під впливом М за умов експозиції хлоридом ртуті клітин лінії U-373-MG виявляються цитопротекторні властивості препарату в дозах 10-0,01 мг/мл. Найбільші значення процентного співвідношення живих клітин та індексів цитопатичних змін за живими та мертвими клітинам спостерігаються при концентрації М 0,1-10 мг/мл. Найбільші індекси проліферації за живими клітинами та менший індекс проліферації за мертвими клітинами виявлено при концентрації 10,0 мг/мл.