Комплексне лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок із використанням трансплантації мультипотентних стромальних клітин аутоліпоаспірату (експериментально-клінічне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ ХІРУРГІЇ ТА ТРАНСПЛАНТОЛОГІЇ

імені О.О.Шалімова

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

14.01.03 - хірургія

14.01.08 - трансплантологія та штучні органи

Комплексне лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок із використанням трансплантації мультипотентних стромальних клітин аутоліпоаспірату (експериментально-клінічне дослідження)

ДОМБРОВСЬКИЙ ДМИТРО БОРИСОВИЧ

Київ - 2011

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

лікування хворий облітеруючий захворювання

Актуальність теми. У загальній структурі серцево-судинних захворювань оклюзійно-стенотичні ураження артеріального русла кінцівок займають третє місце, поступаючись першістю ішемічній хворобі серця та цереброваскулярним порушенням (В. Г. Мішалов та співавт., 2003). За даними Трансатлантичного консенсусу 2000 р. їх частота складає 600 випадків на 1 млн. населення в рік. Якщо взяти до уваги той факт, що 90% ампутацій виконується з приводу судинної патології, то частота розвитку ішемії, яка перейшла в критичну стадію рівна від 500 до 1000 випадків на 1 млн. населення в рік, тобто можна передбачити, що в одного з 100 пацієнтів з переміжною кульгавістю протягом року розвинеться ішемія III або IV ступеню (П. И. Никульников та співавт., 2007; В. Г. Мішалов та співавт., 2008). Крім того, експерти ВОЗ вважають, що найближчими роками очікується зростання цієї патології на 5-7%. В Україні хронічні облітеруючі захворювання артерій кінцівок займають більше 20% від усіх уражень серцево-судинної системи (І. І. Кобза та співавт., 2001).

Незалежні дослідження з Швеції, Данії і Фінляндії показали, що частота великих ампутацій варіює від 120 до 500 на 1 млн. жителів за рік (T. S. Lim та співавт., 2006). Ампутація на рівні стегна приводить хворого до глибокої інвалідності. Лише 30,3% хворих після подібної операції успішно користуються протезом, після ампутації на рівні гомілки це число складає 69,4% (С. М. Геник та співавт., 2002).

Фізіологічні зміни в організмі інваліда приводять до того, що пацієнти часто назавжди випадають з повсякденного ритму життя, втрачають роботу, коло спілкування, що, разом з фізичним стражданням, доповнюється моральним аспектом втрати зв'язку з їх колишнім повноцінним світом і життям (П. І. Нікульніков та співавт., 2005). Висока частота захворювань судин з їх тяжкими ускладненнями, величезна вартість лікування, що проводиться, визначають значну медико-соціальну значущість даної проблеми (П. И. Никульников та співавт., 2004; В. Г. Мишалов та співавт., 2009).

Судинні реконструктивні операції, що проводяться при даній патології, не завжди приводять до відновлення кровотоку, в 6-15% випадків не вдається усунути явища критичної ішемії, і хірурги вимушені виконувати ампутацію кінцівки за вторинними показами (А. С. Никоненко та співавт., 2005; І. М. Гудз та співавт., 2008). До 40% хворих із тромбооблітеруючими ураженнями артерій дистальніше пахової зв'язки мають стенози і оклюзії артерій гомілки, що не дозволяє вирішити питання про пряму реваскуляризацію. Близько 25% післяопераційних ускладнень пов'язані з неправильним вибором методу та об'єму хірургічного лікування, причому, консервативна терапія і первинна ампутація іноді рекомендується, як альтернатива реваскуляризації (В. І. Русин та співавт., 2008). Відсутність адекватного дистального русла є причиною тромбозу при дистальних реконструкціях у 23,7% хворих.

За останні 5 років в експерименті та 3 роки в клініці розробляються новітні методи лікування розповсюджених ушкоджень дистальних відділів судинного русла з використанням методів стимуляції ангіогенезу. В реальних клінічних умовах ендогенна ангіогенна відповідь частіше недостатня або ушкоджена внаслідок різних факторів, таких як старіння, діабет або вплив медикаментів. Так використання в комплексному лікуванні пацієнтів статинів, нестероїдних протизапальних препаратів значно сповільнює процеси ангіогенезу. Враховуючи, що ангіогенез є складним та багатокомпонентним процесом розробляються різні методи його стимуляції (О. А. Штутін та співавт., 2008). Проте, ці методики не завжди ефективні, оскільки досить часто недостатня кількість клітинного матеріалу і досить коштовні.

Отже, питання лікування хронічної ішемії кінцівок далеке від кінцевого вирішення, серед ангіохірургів немає єдиної думки про покази до вибору методу реваскуляризації при даній патології. Традиційні медикаментозні і хірургічні методи лікування хворих з хронічною ішемією кінцівок малоефективні з точки зору їх впливу на мікрогемодинаміку у випадку неможливості виконання прямої реконструктивної операції.

Недостатня ефективність існуючих методів непрямої реваскуляризації з метою стимуляції процесів ангіогенезу в ішемізованій кінцівці спонукають до пошуку і розробки нових методів стимуляції ангіогенезу у хворих на хронічну ішемію кінцівок.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно із планом науково-дослідних робіт Національного інституту хірургії та трансплантології імені О. О. Шалімова НАМН України і є фрагментом науково-дослідних робіт: ИН.14.01.03.19.06 “Вивчити можливості ліпоаспірації та аутотрансплантації аспірата кісткового мозку та жирової тканини, як основних джерел стовбурових клітин, в комплексному лікуванні захворювань судин кінцівок” (номер держреєстрації 0105U008897) та ИН.14.01.03.19.09 “Клініко-експериментальне обґрунтування і розробка методів стимуляції ангіогенезу і репаративних процесів аутологічними і ембріональними клітинними культурами” (номер держреєстрації 0108U011015).

Мета і задачі дослідження. Покращити результати хірургічного лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок шляхом застосування аутологічної трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини.

Для досягнення поставленої мети сформульовані наступні завдання:

1. Вивчити можливість отримання популяції мультипотентних стромальних клітин із жирової тканини та дослідити її властивості під час культивування та консервації.

2. Визначити потенціал стромальних клітин жирової тканини утворювати сітчасту структуру у матригелі після культивування в ендотеліальному середовищі.

3. Дослідити зміни, що відбуваються у культурі мультипотентних стромальних клітин жирової тканини після культивування їх у ендотеліальному середовищі та рівень експресії ендотеліальних маркерів цими клітинами.

4. Розробити методику трансплантації стромальних клітин жирової тканини в експериментальних умовах.

5. Провести оцінку ефективності трансплантації стромальної фракції жирової тканини за умов ішемії кінцівки в експерименті за даними фізичних тестів.

6. Визначити основні чинники, що визначають напрямок диференціації стромальних клітин жирової тканини в експерименті на лабораторних тваринах.

7. Провести гістологічні та імуногістохімічні дослідження м'язової тканини ішемізованої кінцівки на різних стадіях патологічного процесу із застосуванням методів клітинної трансплантації в експерименті.

8. На основі ультраструктурних досліджень ендотеліальних клітин капілярного русла м'язів кінцівок дослідити ефективність трансплантації стромальної фракції жирової тканини на процеси експериментальної ішемії кінцівок.

9. На основі проведених доклінічних досліджень розробити технологію хірургічного лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок на основі застосування методики аутологічної клітинної трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини.

10. Оцінити значення допоміжних методів (ультразвукової допплерографії, лазерної флуометрії та рентгеноконтрастної артеріографії) в оцінці реґіонарної гемодинаміки при хронічній ішемії кінцівок за умов клітинної стимуляції процесів ангіогенезу.

11. На основі гістологічних, імуногістохімічних та ультраструктурних досліджень м'язової тканини кінцівки на різних етапах клітинної трансплантації визначити ефективність застосування мультипотентних стромальних клітин жирової тканини в лікуванні ішемії кінцівок.

12. Провести оцінку ефективності застосування аутологічної трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини у хворих з хронічною ішемією кінцівок за допомогою визначення індексу якості життя хворих.

Об'єкт дослідження: аспірат жирової тканини людини, хронічна ішемія кінцівок.

Предмет дослідження: комплексне хірургічне лікування хронічної ішемії кінцівок із використанням аутологічної трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини.

Методи дослідження - експериментальні, загальноклінічні, гістологічні, імуногістохімічні, електронномікроскопічні, біохімічні, інструментальні (ультразвукова допплерографія, рентгеноконтрастна ангіографія, лазерна флуометрія), методи статистичної обробки.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в стендовому експерименті за допомогою визначення наявності ранніх рецепторів ендотеліобластів під час культивації проведено вивчення можливості диференціювання мультипотентних стромальних клітин жирової тканини людини по ангіобластному типу. В роботі вперше на експериментальній моделі ішемії кінцівок проведено вивчення впливу на процеси ангіогенезу трансплантації стромально-васкулярної фракції жирової тканини. Проведені ультраструктурні та імуногістохімічні дослідження процесів, що відбуваються в м'язовій тканині ішемізованої кінцівки після трансплантації стромально-васкулярної фракції жирової тканини в різні терміни дослідження. Вперше, базуючись на даних доклінічних досліджень, розроблена методика забору аспірату жирової тканини, виділення з нього популяції мультипотентних стромальних клітин з наступною їх підготовкою до трансплантації в ішемізовану кінцівку. Досліджено гістологічні, імуногістохімічні та ультраструктурні зміни в м'язах кінцівок після трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини у хворих на хронічну ішемію кінцівок. Вперше проведено аналіз різних методів інструментальної діагностики (ультразвукової допплерографії, лазерної флуометрії та рентгеноконтрастної артеріографії), як методів діагностики стану магістрального та мікроциркуляторного русла при застосуванні непрямих методів реваскуляризації кінцівок.

Практичне значення отриманих результатів. Наукові положення та висновки дисертаційної роботи адаптовані для впровадження та застосування в практичній охороні здоров'я. Вперше запропоновано оригінальну технологію отримання культури мультипотентних стромальних клітин із аспірату жирової тканини та розроблена методика виконання трансплантації цих клітин хворим на хронічну ішемію кінцівок, як методу непрямої реваскуляризації кінцівки. Розроблені покази до застосування методики трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини у хворих на хронічну ішемію кінцівок. Проведене дослідження методу лазерної флуометрії в комплексній діагностиці хворих на ішемію кінцівок конкретизує доцільність та покази її застосування у даної категорії хворих. Проведене дослідження дозволяє продовжити пошук нових методів лікування хворих на ішемію кінцівок із застосуванням трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини та застосування цього методу в широкій клінічній практиці.

Теоретичні положення дисертації по вивченню процесів ангіогенезу в ішемізованих тканинах та методів його стимуляції можуть використовуватись в учбовому процесі вищих медичних навчальних закладів.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто визначено мету і задачі дослідження, самостійно проведено інформаційний пошук, аналітичний огляд літератури, підготовлено матеріали до патентування. Автором самостійно проведено планування, організація експериментальних, діагностичних і клініко-лабораторних методів дослідження. Всі експериментальні дослідження на лабораторних тваринах та подальше спостереження за тваринами виконані здобувачем самостійно у повному обсязі. Автор приймав участь в інтерпретації отриманих гістологічних, імуногістохімічних та ультраструктурних досліджень отриманого експериментального та клінічного матеріалу. Дисертант особисто проводив отримання біопсійного матеріалу на різних етапах лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок, приймав участь у всіх оперативних втручаннях по трансплантації клітинного матеріалу.

Самостійно проведено статистичну обробку даних із застосуванням комп'ютерних програм та узагальнення отриманих результатів.

Апробація результатів дослідження. Основні положення дисертації були представлені на: І з'їзді судинних та ендоваскулярних хірургів україни (Київ, 2006); науково-практичній конференції “Актуальні питання ангіології” (Трускавець, 2007); Всеукраїнській хірургічній науково-практичній конференції “Інноваційні технології в хірургії” (Полтава, 2008); науково-практичній конференції за участю міжнародних спеціалістів “Актуальні питання клінічної хірургії” (Київ, 2008); Всеукраїнській хірургічній науково-практичній конференції “Інноваційні технології в хірургії” (Полтава, 2009); ІІ Всеукраїнській конференції з міжнародною участю “Сухарєвські читання - ангіологія і судинна хірургія сьогодні” (Київ, 2009); науково-практичній конференції “Достижения интервенционной радиологии” (Севастополь, 2009); науково-практичній конференція “Інтервенційна радіологія на сучасному етапі: досягнення та перспективи” (Мигово, 2010); ІІІ Всеукраїнській конференції з міжнародною участю “Сухарєвські читання - ангіологія і судинна хірургія сьогодні” (Київ, 2010); 22 з'їзді хірургів України (Вінниця, 2010); ІІІ з'їзді судинних хірургів України (Донецьк, 2010).

Публікації за темою дисертації. За матеріалами дисертації опубліковано 26 наукових робіт, з них 23 статті - у наукових журналах, включених до переліку видань, рекомендованих ВАК України, 3 - у вигляді тез доповідей у матеріалах конференцій, отримано 5 патентів України на винахід і корисні моделі.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, п'яти розділів основної частини, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, переліку використаних джерел.

Робота викладена на 376 сторінках з них власне текст займає 332 сторінки. Робота ілюстрована 25 таблицями, 156 рисунками. Список використаних літературних джерел включає 411 джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження на мультипотентних стромальних клітинах (МСК) жирової тканини проводили згідно нормам біомедичної етики з письмової згоди проінформованих донорів на базі кафедри біохімії Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків), завідувач кафедри - професор А. Ю. Петренко. Жирову тканину, яка отримана в результаті хірургічного видалення жирових відкладень (ліпоаспірації), подрібнювали і піддавали ферментативній обробці колагеназою. Стромальні клітини виділяли за загальноприйнятою методикою.

Клітини культивували в живильному середовищі альфа-МЕМ, що була доповнена ембріональною сироваткою великої рогатої худоби (ЕС), 2 мМ L-глутаміну, 50 од./мл пеніциліну і 50 мг/мл стрептоміцину при 37°С, 5% СО₂ і більше 90% вологості. Заміну живильного середовища проводили через 24 год. Клітини культивували протягом трьох-чотирьох пасажів із зміною середовища 2 рази на тиждень.

Імунофенотипічний аналіз субкультури проводили на 4 пасажі. Для цього суспензію культивованих клітин трипсинізували за стандартною методикою, забарвлювали моноклональними антитілами CD29-РЕ, CD45-PE, CD105-FITC (Serotec), CD34 Class II-FITC, CD38-RPE (DAKO, Голландія), CD44-FITC, CD73-PE (BD Biosciences) згідно інструкціям виробників, двічі відмивали центрифугуванням при 200g протягом 10 хв в розчині Хенкса і аналізували на проточному цитометрі FACS Calibur (BD Biosciences, США).

Ендотеліальне диференціювання проводили при моношаровому культивуванні клітинної субкультури, взятої на 4-му пасажі, в середовищі EGM-2 (Endothelial Growth Medium - 2, Lonza, Бельгія) протягом 14 діб.

Здатність культивованих клітин утворювати капіляроподібні структури оцінювали на 7-му і 14-ту добу культивування в індукуючому середовищі з використанням екстраклітинного матриксу матригель (BD Biosciences, UK). Для цього заздалегідь охолоджений матригель вносили по 100 мкл в 96-лунковий планшет і залишали на 30-40 хв при 37°С. Потім на поверхню матриксу наносили 100 мкл суспензії клітин в концентрації 10⁵ клітин/мл і культивували протягом 24 год в середовищі EGM-2. Аналіз проводили під світловим інвертованим мікроскопом Сетi (Бельгія).

Для оцінки експресії клітинами FLK-1, клітинні культури фіксували 4% параформальдегідом протягом 30 хв при 4°С. Після трикратного відмивання клітин фосфатним буфером, проводили блокування неспецифічного зв'язування 5% розчином бичачого сироваткового альбуміну, приготованого на фосфатному буфері протягом 30 хв. Клітини інкубували з первинними поліклональними антитілами rabbit-anti-human FLK-1 (1:75) протягом 60 хв при кімнатній температурі. Після трикратного відмивання фосфатним буфером, клітини інкубували з вторинними goat-anti-rabbit антитілами, кон?югованими AlexaFluor 488 nm протягом 40 хв при кімнатній температурі в темноті. Після трикратного відмивання фосфатним буфером, проводили дофарбовування клітин 4',6 - diamidino-2-phenylindole (DAPI, 100 ng/ml) протягом 5 хв. Забарвлені культури клітин досліджували з використанням флуоресцентної мікроскопії під інвертованим флуоресцентним мікроскопом Ceti Inverso EPIFluor, UK. Для оцінки кількості позитивних по FLK-1 клітин, підраховували кількість позитивно забарвлених клітин в різних полях зору, після чого співвідносили ці дані із загальною кількістю ядер в цих полях зору, забарвлених DAPI.

Для порівняння динаміки росту клітин при культивуванні в середовищі експансії мезенхімальних стромальних клітин (alfa-MEM) або в середовищі росту і диференціювання ендотеліальних клітин (EGM-2), проводили трипсинізацію і підрахунок кількості клітин на 6, 9-ту і 12-ту добу культивування.

Для оцінки морфології клітин, клітинні культури фіксували 70% етанолом протягом 30 хв, після чого забарвлювали розчином азур-еозину, розведеного 1:10 дистильованою водою протягом 10 хв. Після трикратного відмивання дистильованою водою, препарати досліджували під світловим інвертованим мікроскопом Сетi (Бельгія).

Експериментальні оперативні втручання на щурах проводились під кетаміновим наркозом. Середня маса щурів складала (374,23 ± 7,56) г, вік (6 ± 1,2) міс. Тварини знаходились при кімнатній температурі, на звичайному лабораторному раціоні. При проведені експериментальних оперативних втручань зберігались всі умови асептики та антисептики. У тварин всіх груп проводилось визначення функціонального стану м'язової системи кінцівок шляхом проведення спеціальних тестів за загальноприйнятими методиками - визначення відстані одномоментного пробігу та тест примусового плавання. По закінченню експериментальних дослідів та забору матеріалу на дослідження тварини виводились із експерименту шляхом передозування наркозу. У всіх дослідних та контрольних груп тварин по закінченню терміну дослідження була взята м'язова тканина медіальної та латеральної поверхонь стегна на стороні проведення експерименту, після чого були проведені гістологічні, імуногістохімічні та електонномікроскопічні методи дослідження отриманої м'язової тканини.

Всі тварини були поділені на 5 груп (табл. 1).

Моделювання ішемії тканини кінцівки у щура проводилось за методом Т. А. Князевої (1976), згідно якої навкруги судинної ніжки, що кровопостачає тканини кінцівки проводили дві лігатури на відстані 0,01 м одна від одної і перев'язували артерію разом з веною. Рану пошарово ушивали. За даними авторів ішемічні прояви виражені вже на 2-3 добу після моделювання.

Таблиця 1. Розподіл дослідних тварин по групам дослідження

Моделювання аутомієлотрансплантації проводили у тварин за методикою, що розроблена Ю. М. Захаровым, И. Ю. Мельниковым і А. Г. Рассохиным (1984). Згідно даної методики, кістковий мозок отримується у тварин внаслідок промивання та продувки трубчастих кісток (стегнова кістка) після відсічення діафізів з обох сторін. Промивають за цією методикою або розчином, що містить білкове середовище для культивації клітинних культур, або розчином гепарину. Враховуючи відсутність потреби в культивації стовбурових клітин кісткового мозку, ми використовували розчин гепарину, який згідно методики містив в 10 мл 5000 Од гепарину. Після отримання суміші розчину з кістковим мозком ця суміш центрифугувалася при 2500 об./хв протягом 10 хв. Кістковий мозок, який знаходився на дні пробірки виділявся і вводився тваринам в ішемізовані кінцівки.

Для отримання стромально-васкулярної фракції (СВФ) збагаченої мультипотентними стромальними клітинами жирову тканину щура, яка була отримана з передньої черевної стінки - передочеревинний жир, після значного подрібнення обробляли жирову тканину колагеназою (фрагменти жирової тканини інкубували при 37°С у 0,075% розчині колагенази I тип протягом 30 хв), потім отриману суміш розводили втричі фосфатним буфером Дульбеко і інтенсивно струшували протягом 2-3 хв. Після центрифугування (10 хв при 600g) жирове кільце і супернатант видаляли, а осад, який містив мультипотентні клітини строми, судин, лейкоцити, еритроцити ресуспендивували в фізіологічний розчин, після чого дану суміш вводили в ішемізовані кінцівки.

У випадках моделювання аутомієлотрансплантації та трансплантації СВФ жирової тканини клітини вводили в ішемізовані кінцівки на 3-тю добу після моделювання ішемії підфасціально тонкою смужкою на медіальній поверхні стегна. Клінічні дані в групах оцінювали по довжині одномоментного пробігу до появи болю в задній кінцівці, показником чого слугувало щадіння кінцівки при бігу, поява писку та покусування ішемізованої кінцівки, а також по терміну тесту примусового плавання - до моменту повної відсутності рухів в кінцівці, де змодельована ішемія. Дослідження функціонального стану м'язів кінцівок проводилось за загальноприйнятою методикою.

На етапі забору матеріалу на дослідження тварини виводились із експериментального дослідження шляхом передозування наркозу. У тварин всіх груп дослідний матеріал (м'язи стегна) отримували з медіальної та латеральної поверхні дослідної кінцівки. В ІІ групі тварин дослідний матеріал забирали на 3-тю, 5, 7, 14, 21 та 25-ту добу після моделювання ішемії на кінцівці, в ІІІ групі - на 7, 12, 22-гу добу після введення СВФ жирової тканини, а в IV та V групах на 5, 7, 14, 21 та 25-ту доби після моделювання ішемії. Після отримання дослідного матеріалу проводили гістологічні, імуногістохімічні та електронно-мікроскопічні дослідження.

Для оцінки процесу ангіогенезу були проведені в експериментальних та клінічних спостереженнях гістологічні, імуногістохімічні та електронно-мікроскопічні дослідження. Гістологічні та імуногістохімічні дослідження проводились на базі гістологічної лабораторії Інституту педіатрії, акушерства та гінекології НАМН України (завідуюча лабораторією - професор Т. Д. Задорожня). Були застосовані наступні методи.

Загальногістологічний - проводили за стандартною схемою. Після фіксації в формаліні і спиртах матеріал обробляли в парафіновій заливці, зрізи фарбували гематоксилін-еозином та пікрофуксином за ван-Гізон.

Одним з найважливіших біологічних матеріалів потрібних для будівництва та нормального функціонування не лише клітинного апарату, а й фактично усієї з'єднувальної тканини є колаген. Колаген це специфічний білок, структура якого обумовлює пластичність та еластичність з'єднувальної тканини. На сьогоднішній день відомо близько 20 типів колагенів, які входять до складу кісток, хрящів, сухожилків, органів та тканин (Н. И. Соловьева, 2001).

Колаген IV типу є обов'язковим компонентом базальних мембран, в тому числі мембран судинного ендотелію. Імуногістохімічним методом було встановлено що вже на ранніх стадіях ембріонального розвитку базальна мембрана містить значну кількість колагену IV, та супутні ламантин, гепарансульфат-проглікакани. Завдяки формуванню базальної мембрани, яка містить екстрацелюлярний генетичний фактор відбувається диференціювання клітин судинної стінки, в тому числі ендотеліоцитів. Окрім того базальні мембрани відіграють роль орієнтувального матриксу при проліферації та розгалуженні мікросудин, що розвиваються. Необхідно відмітити, що в пренатальному періоді морфогенезу вміст колагену IV, як основного матеріалу базальної мембрани зростає, однак після формування мікросудини його концентрація значно зменшується.

Таким чином, колаген IV типу є вірогідним маркером морфологічного формування базальних мембран первинного ендотелію (A. Katsuno, 2009).

Фактор Віллебранда - складний мультимерний адгезивний глікопротеїн, що синтезується ендотеліальними клітинами і мегакаріоцитами. Утворення фактору Віллебранда в судинах різних областей істотно розрізняється: у легенях, серці, скелетних м'язах виявлений високий рівень Т-РНК фактору Віллебранда, а в нирках і печінці - низький.

В організмі людини фактор Віллебранда виконує декілька функцій. По-перше, він утворює нековалентний комплекс з VIII фактором згортання в плазмі крові. Цей комплекс необхідний для стабілізації VIII фактору кровотоку і для його участі як кофактора в утворенні тромбу. По-друге, він виконує роль своєрідного містка між субендотеліальними структурами пошкодженої стінки судини і тромбоцитами, а також між окремими тромбоцитами на етапах адгезії, розпластування і агрегації тромбоцитів (M. L. Alvarez Gonzalez, 2009).

Фактор Віллебранда забезпечує адгезію тромбоцитів через рецептори GP Ib, а при активації тромбоцитів бере участь в утворенні містків через рецептори GP IIb/IIIa. Фактор Віллебранда має дві групи активних центрів: перші - для з'єднання з колагеном і глікозаміногліканами субендотеліального матриксу, інші - для зв'язку із специфічними тромбоцитарними рецепторами. Таким чином, фактор Віллебранда стає своєрідним містком між тромбоцитом і оголеним субендотеліальним шаром. Таке його з'єднання з тромбоцитарними рецепторами призводить до подальшої активації тромбоцитарних комплексів IIb/IIIa. При цьому останні набувають здатності приєднувати як фібриноген, так і фактор Віллебранда. Синтез фактору Віллебранда здійснюється з деяким “надлишком” - що не бере участі у виконанні фізіологічних функцій молекули фактору Віллебранда накопичуються у внутріклітинних органелах клітин ендотелію - тільцях Вейбеля - Палладе (Weibel - Palade).

Підвищені рівні антигена фактору Віллебранда в крові є індикатором пошкодження ендотелію при судинних захворюваннях. При багатьох захворюваннях, що супроводжуються гострим і хронічним пошкодженням ендотелію (цукровий діабет, атеросклероз, пухлини різної локалізації, гестоз і так далі), рівень фактору Віллебранда в крові значно підвищується. Проте, коротке підвищення фактору Віллебранда після фізичного навантаження, введення адреналіну або вазопресину, а також під час вагітності є достовірним показником активації або стимуляції ендотеліальних клітин, збільшення цього показника в тканині в ендотеліальних клітинах є характерною ознакою активного функціонування ендотеліоцитів і активації процесів ангіогенезу (P. K. Goon, 2009).

Таким чином, дані, представлені в літературі, свідчать про те, що рівень фактору Віллебранда в крові і тканинах є патофізіологічно, експериментально і клінічно верифікованим маркером функції ендотелію, що дозволяє оцінювати наявність і міру вираженості функціонального стану ендотелію при різних захворюваннях серцево-судинної системи.

Одним з трьох основних компонентів цитоскелету в еукаріотичних клітинах є проміжні філаменти. На різних етапах ембріонального розвитку, на стадіях клітинного диференціювання в різних типах клітин експресуються проміжні філаменти, які складаються з різних білків. Білок віментин відноситься до складової частини проміжних філаментів III типу, які експресуються переважно в фібробластах, ендотеліальних клітинах та деяких мезенхімальних клітинах. Головною функцією проміжних філаментів, що ґрунтується на їх механічних властивостях та здатності до самозбирання, є забезпечення клітинної та тканинної цілісності. Механічна функція забезпечується шляхом зв'язування філаментами інших компонентів цитоскелету, таких як мікротрубочки, мікрофіламенти та плазматичною мембраною. Взаємодія з останньою відбувається в особливих ділянках прикріплення - в десмосомах и полудесмосомах ендотеліальних клітин та місцях локальних контактів фібробластів (A. Pierre, 2001).

Окрім цього проміжні філаменти III типу відіграють важливу роль в розподіленні органел та білків, що в свою чергу впливає на їх функціонування. Результати експериментальних досліджень свідчать про те, що функціонування мітохондріального апарату особливо в молодих клітинах залежить від віментинових проміжних філаментів.

Проміжні філаменти III типу в склад яких входить віментін, тісно взаємодіють та активно впливають на роботу апарату Гольджі, рибосом, ендосом та ядерної оболонки. Немеханічна функція проміжних філаментів полягає у внутрішньоклітинному розподілі органел та транспорті ліпідів (I. Walter, 2006).

Було встановлено що віментин в поєднанні з білком АР-3 приймає участь в транспорті везикул між ендосомальними та лізосомальними складовими та регулює надходження білків в лізосоми та тканинноспецифічні органели - меланосоми, гематопоетичні гранули та синаптичні везикули.

В останні роки в зв'язку з підвищеним інтересом до проблеми стовбурових клітин, проміжні філаменти звернули на себе увагу, як зручні маркери клітинної диференціації, дослідивши який з білків філаментів експресується в клітинах можливо достатньо швидко визначити їх тип (H. Mцllmann, 2006).

Отже, оскільки вищезазначені фактори є характерними показниками процесів новоутворення судин були проведені в експерименті та клініці імуногістохімічні дослідження експресії антигенів саме до цих факторів.

Для імуногістохімічного виявлення чинників ангіогенезу проводили непрямий стрептавидін-пероксидазний метод виявлення рівня експресії антигенів колагену ІV типу. Також проводили непрямий стрептавидін-пероксидазний метод виявлення рівня експресії антигенів до фактору Віллебранда. Використовували непрямий стрептавидін-пероксидазний метод виявлення рівня експресії антигенів віментину.

Розповсюдженість того чи іншого прояву процесу, що відбувається в тканині, а саме: порушення кровообігу, дистрофія м'язових волокон, набряк перимізію, лімфоцитарна інфільтрація, прояви ангіогенезу в гістологічних зрізах вираховували у відсотках від загальної кількості зрізів. Якщо певний гістологічний прояв проявлявся у всіх досліджуваних зрізах однієї групи і терміну дослідження то визначали його прояв за 100%, якщо він не спостерігався в жодному гістологічному дослідженні то відповідно морфометрично визначалося у 0%. Розповсюдженість імуногістохімічних реакцій оцінювали напівкількісним методом в балах, від 0 до 3 балів.

Для проведення електронно-мікроскопічного дослідження шматочки м'язової тканини фіксували в 2,5% розчині глутаральдегіду на фосфатному буфері (рН - 7,2-7,4) і дофіксовували в 1% розчині Os0₄. Матеріал зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації і укладали в аралдит. Морфологічні структури контрастували в процесі зневоднення матеріалу насиченим розчином уранілацетату, а на зрізах - цитратом свинцю. Зрізи завтовшки 40-60 нм, одержані на ультратомі УМТП-3, вивчали в електронному мікроскопі ТЕСЛА БС-500.

Нормативно-правова база клінічного випробування та клінічної частини дисертаційної роботи відповідає закону України «Про трансплантацію органів та інших анатомічних матеріалів людей» від 16 липня 1999 року, ґрунтується на постанові Кабінету міністрів України від 5 вересня 2007 року №1100 “Про заходи щодо організації діяльності закладів охорон здоров'я та наукових установ пов'язаної з трансплантацією органів, тканин і клітин” та порядку проведення клінічних випробувань, що визначається наказом МОЗ України від 10.10.2007 року, №630 “Про затвердження порядку проведення клінічних випробувань тканинних та клітинних трансплантатів та експертизи матеріалів клінічних випробувань”, який передбачає проведення доклінічних досліджень ефективності та безпеки клітинних трансплантатів.

Клінічну частину дослідження склали 26 хворих на облітеруючі захворювання артерій кінцівок з проявами хронічної ішемії кінцівок. За нозологічними формами хворі розподілилися наступним чином: хворі на облітеруючий ендартеріїт - 14, облітеруючий атеросклероз - 9, постемболічна оклюзія артерій кінцівок - 3 пацієнтів. За статтю розподіл був наступним: чоловіків - 22, жінок - 4.

За ступенем хронічної ішемії кінцівки із використанням класифікації Покровського - Фонтейна хворі були розподілені наступним чином: ІІБ ступеню - 11 хворих, ІІІ ступеню - 5 хворих і ІV ступеню - 10 хворих.

У всіх хворих було ангіографічно констатовано неможливість виконання реконструктивних оперативних втручань на артеріальному руслі кінцівки.

Методика трансплантації стромальних клітин жирової тканини була наступною. Отриману жирову тканину у розмірі 100 мл розташовували у стерильній ємності, з додаванням розчину антибіотику (цефазолін в дозі 1 г антибіотику на 5 мл фізіологічного розчину). Ємність з жировою тканиною та антибіотиком закривали та розташовували у контейнері для транспортування при температурі 0^оС.

У пацієнта перед проведенням аспірації жирової тканини проводився забор крові в об'ємі 10 мл, з якої отримували, шляхом центрифугування плазму. Отримана плазма крові у стерильній ємності та консервована жирова тканина при температурі 0^оС транспортувались в Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (м. Харків), де проводилось виділення клітин СВФ жирової тканини згідно розробленої оригінальної методики.

Методика виділення клітин СВФ жирової тканини складається в обробці ліпоаспірату колагеназою (жирову тканину інкубували при 37°С у 0,075% розчині колагенази I тип протягом 30 хв). Після чого центрифугували первинну суспензію, що призводило до її розділення на дві фракції. У верхньому світлому шарі розташовувалися адіпоцити, а в осаді - клітини СВФ жирової тканини з домішками гемопоетичних клітин. Еритроцити видаляли за допомогою інкубації в розчині хлориду амонію, який лізував їх, а інші гемопоетичні клітини, що володіють слабкою адгезивною здатністю, виводилися при пасивуванні.

Частину з отриманих клітин (як правило це було 4/5 отриманих клітин) у плазмі крові пацієнта в транспортувальному контейнері при температурі 0^оС транспортували для введення хворому. Кожен отриманий препарат клітин СВФ жирової тканини супроводжувався відповідним сертифікатом препарату, який містить вказівки про загальну кількість клітин в препараті, кількість ядерних клітин в препараті, життєздатність клітин. Кількість ядерних клітин в препаратах варіювала від 15 до 40 млн. клітин, життєздатність складала від 89 до 95%. Крім того кожен сертифікат містив імунофенотипічний аналіз клітин СВФ жирової тканини.

Отримані адгезивні клітини СВФ вводили внутрішньом'язово в кінцівку. Введення проводилось під місцевою анестезією розчином лідокаїну. Місце введення клітин СВФ жирової тканини та кількість вводимого препарату визначалась для кожного хворого індивідуально. Основним критерієм місця введення клітин СВФ жирової тканини були дані ангіографічного дослідження. Трансплантація клітин проводилась в зонах оклюзованих артерій, де кровопостачання страждає найбільше.

Препарат клітин розводився на 100 мл фізіологічного розчину і вводився через доступ на шкірі довгою канюлею під апоневроз в м'язи, розповсюджуючи клітини невеликими порціями вздовж ішемізованої ділянки.

Після проведення трансплантації клітин рани ушивались, накладались асептичні пов'язки, на кінцівку накладали еластичний бинт, досягаючи таким чином більш щільного контакту тканин з трансплантованими клітинами.

Другий етап трансплантації клітин починався з того, що інша частина виділених клітин СВФ жирової тканини (1/5 частина отриманих клітин) залишалась для подальшого культивування та експансії на питомому середовищі. Первинна культура адгезивних клітин жирової тканини складається з клітин, що морфологічно розрізняються, що пов'язано з різноманітністю вихідного спектру клітин у складі СВФ. В ході моношарового культивування відбувається поступове очищення культур від слабо адгезивних клітин, і на 5-ту добу культивування спостерігається рівномірне зростання клітин по всій поверхні культурального пластику. До 10-12 доби культивування адгезивні клітини СВФ жирової тканини формують 70-80% конфлуентного моношару. В процесі субкультивування гетерогенність вихідної суспензії поступово знижується і вже після 3 - 4 пасажів культура стромальних клітин жирової тканини (СКЖТ) представлена популяцією переважно фібробластоподібних клітин. В ході кожного пасажу кількість клітин збільшується в середньому в 2 рази.

Після проведення 4 пасажів клітини знімали з питомого середовища, консервували та транспортували у відповідних транспортних контейнерах при температурі 0^оС для повторної пересадки хворому в ішемізовану кінцівку. Отримані мультипотентні стромальні клітини (МСК) жирової тканини також супроводжувались відповідним сертифікатом, в якому вказувалась кількість клітин в препараті, їх життєздатність та кількість препарату. Згідно сертифікатів кількість МСК жирової тканини в одному препараті варіювала від 5 до 10 млн. клітин. Життєздатність у всіх препаратах була 98 - 99%. Методика трансплантації клітин хворому на другому етапі була подібною першому етапу трансплантації.

У дослідженні для визначення оцінки якості життя хворих використовувався запитальник “Індекс якості життя” (“Quality of Life Index”). Проводилася оцінка якості життя протягом півроку, при цьому порівнювалася якість життя при первинному зверненні і після шести місяців після проведення клітинної трансплантації. Крім того хворий відповідав на запитання, що вказували на дистанцію появи переміжної кульгавості у пацієнтів та функціональний стан кінцівок, про що вказувала швидкість з якою пацієнт міг пройти певну відстань, які загалом складають уніфікований опитувальник - Walking Impairment Questionnaire.

Гістологічні, імуногістохімічні та ультраструктурні дослідження м'язової тканини хворих в до- та післяопераційному періоді проводили за методиками, що описані вище.

Дослідження стану мікроциркуляції у хворих з хронічною ішемією нижніх кінцівок за допомогою лазерної допплерівської флоуметрії (ЛДФ) проводилось на апаратному комплексі «ЛАКК-02» ПП «Лазма» Москва РФ.

Для вивчення і подальшої оцінки стану периферичного кровотоку використовувалась ділянка задньої (зовнішньої) поверхні лівого передпліччя у місці, розташованому по серединній лінії на 0,04 м вище основи шилоподібних відростків ліктьової і променевої кісток, де визначався фоновий показник мікроциркуляції перед початком лікування - Мф (умови дослідження проведено згідно рекомендацій групи по стандартизації ЛДФ (European Contact Dermatitis Society, 1994). Ця ділянка поверхні передпліччя є узагальнюючою для оцінки стану мікроциркуляції, тому завжди рекомендується для дослідження. Запис кровотоку пацієнта здійснювався в стані спокою протягом 8 хв після 15-хвилинного періоду адаптації при температурі повітря в приміщенні 18 - 22^о С. В процесі дослідження проводилась функціональна проба з оклюзією плечової артерії (аналог проби на ендотелій залежну вазодилатацію): манжета одягалась вище зони дослідження, оклюзію здійснювали протягом 3 хв шляхом створення тиску в манжеті до 26,7 кПа (200 мм рт. ст.). Запис після проби проводився до повного відновлення кровотоку.

Крім того, через 15 хв після оклюзійної проби, проводили електрофоретичну пробу з нітрогліцерином для визначення релаксації мікросудин, що викликається безпосереднім впливом оксиду азоту на гладкі міоцити (аналог тесту на ендотелій незалежну вазодилатацію). Проба проводилась в горизонтальному положенні пацієнта, натще, зранку за загальноприйнятими вимогами після стандартного запису ЛДФ. Електрод (металевий з білим дротом) для йонофорезу фіксувався на 3 см вище зап'ястка на зовнішній частині лівого передпліччя на резиновому фіксаторі таким чином, щоб в його центр можна було вставити оптоволоконний зонд для постійного запису ЛДФ-грами, окрім того під ним розташовувався інший чорний електрод іншої полярності (негативний). Запис проводився при реєстрації сигналу на червоному каналі, таймер встановлювали на 10 хв. Фоновий запис проводився 1 хв, потім після натискання кнопки “пауза” в програмі для запису ЛДФ, під “позитивний” електрод розміщувалась спеціальна біла паперова прокладка, змащена рідким спиртовим розчином нітрогліцерину (в 1 ампулі 10 мг нітрогліцерину на 1 мл розчинника). Прокладку суху можна розміщувати і перед проведенням тесту під активний електрод, але потім через отвір для оптоволоконного зонду її треба змочувати розчином нітрогліцерину зверху з шприца на 2 мл. Після того, як волога прокладка перебуває під активним електродом і подача сигналу відновлена на моніторі і на приладі (про що свідчить зміни показника мікроциркуляції на індикаторній панелі приладу ЛАКК-02), відпускалася кнопка „пауза” і вмикалась зелена клавіша „пуск” на ЛАКК-ТЕСТІ, при цьому перевіряється, щоб ручка регулятора подачі струму була повернута на постійну подачу струму, а сила струму була не вище 50 мкА (оптимально - 25 мкА). Експозиція триває 3 хв, у цей період йонофорезу триває реєстрація рівня показника мікроциркуляції на комп'ютері, після закінчення терміну експозиції натискалась червона клавіша “стоп” на ЛАКК-ТЕСТІ, але запис при цьому триває ще 6 хв. Потім оцінювали запис після розрахунків, проведених програмним забезпеченням “LDF 2.20”, визначається показник РККн - резерв капілярного кровотоку після йонофорезу нітрогліцерину - відсоток приросту показника мікроциркуляції на піку йонофорезу нітрогліцерину від його висхідного значення. РККн має нормативні значення 200-450%.

Отримані результати реєструвалися у формі кривої, яка є суперпозицією нейро-, міогенних, метаболічних, дихальних, серцевих впливів на мікроциркуляцію. Крім того, в капілярах проходять обмінні та синтетичні процеси, які характеризуються власними ритмами коливань кровотоку, також відображених на кривій. Потім крива аналізувалася шляхом амплітудно-частотного перетворення коливань кровотоку за допомогою програмного забезпечення ”ЛАКК-02”. Застосування математичного апарату вейвлет-перетворення дозволяє визначити внесок окремих механізмів регуляції, які модулюють кровоток, оцінити рівень мікроциркуляції, виявити дисфункцію ендотелію.

Статистичне обчислення результатів досліджень проводилось з використанням електронних таблиць Microsoft® Office Excel (build 11.5612.5703) та програми для статистичного обчислення Statgraphics Plus 5.1 Enterprise edition (®Statistical Graphics corp. 2001).

Результати досліджень та їх обговорення. Доклінічний етап роботи складався з експериментальних досліджень in vitro та експериментів на лабораторних тваринах. Загалом спрощено схему всього дослідження із МСК жирової тканини можна уявити собі наступним чином: доведення можливості ендотеліального диференціювання МСК на питомому середовищі “в пробірці” - визначення процесів стимуляції ангіогенезу при трансплантації МСК жирової тканини в живий організм - власне клінічні випробування трансплантації МСК жирової тканини у хворих із хронічною ішемією кінцівок.

На першому етапі проведені дослідження по визначенню можливості диференціації МСК жирової тканини в ендотеліальному напрямку. Фібробластоподібні клітини з жирової тканини людини протягом 4 пасажів характеризувалися наступним імунофенотипом: CD29+, CD44+, CD73+, CD105+. В той же час, не спостерігалася експресія гемопоетичних маркерів CD34-, CD45-.

Ортодоксальними напрямами диференціювання МСК жирової тканини вважаються остеогенез, адіпогенез і хондрогенез. Характерним морфо-функціональним показником ефективності ендотеліального диференціювання є здатність ендотеліальних клітин-попередників утворювати капіляроподібні структури на екстраклітинному матриксі в культурі. Функціональною ознакою вступу МСК в ендотеліальне диференціювання вважають здібність до утворення капіляроподібних структур при культивуванні на матригелі - матриксі базальних мембран, екстрагованим із саркоми миші і запропонованого рядом авторів для оцінки ендотеліального потенціалу МСК.

Доведений потенціал МСК жирової тканини людини до формування капіляроподібних структур in vitro у відповідь на чинники, що індукують ендотеліальне диференціювання. Доведено, що не індуковані клітини 4-го пасажу володіють надзвичайно низькою капіляроутворюючою здатністю. Крім того, ці дані підтверджують відсутність в досліджуваній суспензії диференційованих ендотеліальних клітин. Індукція клітин в ендотеліальному напрямку протягом 14 діб у середовищі EGM-2, що містить ростові чинники FGF, EGF, VEGF, призводить до вибудовування клітинних елементів в сітчасту тривимірну структуру в товщі матригелю, що свідчить про наявність у клітин ендотеліальних властивостей.

Відомо, що клітини різні за своїм фенотипом мають на своїй поверхні різні рецепторні білки. Стовбурова клітина в процесі диференціації в той чи інший бік отримує різні властивості, відповідно направленню диференціації на поверхні клітинної мембрани розташовуються різні рецептори. Одні поверхневі білки з'являються на початкових стадіях диференціації, коли клітина ще володіє бластними властивостями, інші рецептори визначаються вже на зрілих клітинах. Визначення таких рецепторів на поверхні клітини, що вступила в процес диференціації і дозволяє визначити в якій бік відбувається розвиток клітини.

Для ідентифікації і оцінки ендотеліальних клітин, в даний час використовується ряд маркерів, серед яких найбільш демонстративними є flt-1 і flk-1, CD31, фактор Віллебрандта. FLK-1 є тирозин-кіназним рецептором фактору росту судинного ендотелію (VEGF), що відповідає за проліферацію і диференціювання ендотеліальних клітин. FLK-1 використовується як найбільш ранній маркер ендотеліальних клітин-попередників.

Підрахунок в первинній культурі кількості FLK-1 позитивних клітин відносно загальної кількості клітин, виявлених по фарбуванню ядерним фарбником DAPI, показав, що в різних полях зору ця кількість варіювалася від 5,6 до 16,3%. Наші дослідження показали, що клітини, які культивуються протягом 2-х тижнів в середовищі експансії мезенхімальних стромальних клітин вже не експресували маркер ендотеліальних клітин FLK-1 в жодному випадку. В той же час, після культивування клітин в ендотеліальному середовищі більше 50% клітин експресували ранній маркер ендотеліальних клітин FLK-1. Ці дані свідчать про те, що культивування МСК жирової тканини людини в середовищі, яке спричиняє направлену ендотеліальну культивацію клітин дозволяє отримати фракцію клітин ендотеліальних попередників і значно підвищити їх кількість при культивуванні in vitro.

Таким чином, видно, що МСК жирової тканини, які отримуються з СВФ жирової тканини після культивування у відповідному ендотеліальному середовищі міняють свої фенотипічні властивості і отримують характерні для ендотеліальних клітин рецептори на своїй поверхні, а також здатні утворювати між собою, у відповідних умовах, ендотеліальні трубочки. Можна чітко сказати, що до ортодоксальних напрямків диференціювання МСК жирової тканини, якими вважаються остеогенез, адіпогенез і хондрогенез додається і ендотеліальне диференціювання стромальних клітин жирової тканини. Отримані дані експериментів in vitro дозволили продовжити дослідження МСК жирової тканини на моделях in vivo.

Наступним етапом доклінічного дослідження було проведення серії експериментів на лабораторних тваринах - щурах. В експерименті були змодельовані на тваринах різноманітні ситуації з трансплантацією СВФ жирової тканини за різних умов, також в якості однієї з контрольних груп було виконано трансплантацію кісткового мозку на фоні ішемії кінцівки щура.

Для визначення клінічного ефекту трансплантації клітин у тварин застосовано визначення відстані одномоментного пробігу та тест примусового плавання. Було встановлено, що у тварин ІІ групи показники тесту одномоментного пробігу складали від (0,81 ± 0,11) м на 3-тю добу до (1,90 ± 0,11) м на 25 добу. У тварин V групи, яким була виконана трансплантація стромально-васкулярної фракції жирової тканини цей показник складав на 3 добу (0,88 ± 0,19) м і зберігався досить низьким до 7 доби експерименту. Починаючи з 7 доби показник одномоментного пробігу збільшувався і становив (1,97 ± 0,13) м, вірогідно відрізняючись від показників ІІ групи тварин в цей же термін дослідження (р < 0,001). Наприкінці дослідження показник тесту складав вже (2,69 ± 0,11) м, також вірогідно відрізняючись від даних ІІ групи тварин (р < 0,001). Також мало місце підвищення дистанції пробігу і в ІV групі тварин, яким була проведена трансплантація кісткового мозку на тлі ішемії кінцівки, проте, на відміну від тварин V групи це спостерігалось лише на 14 добу експерименту, складаючи (1,63 ± 0,12) м, в цей же термін у тварин дослідної групи дистанція була (2,25 ± 0,15) м.

Визначення тесту примусового плавання показало суттєве зниження цього показника у ІІ групі тварин і на 3-тю добу складало (3,36 ± 0,58) хв, вірогідно відрізняючись від показників інтактних тварин (р < 0,001). Суттєве зниження показника тесту примусового плавання зберігалось в ІІ групі тварин до 21-ї доби експерименту - (4,91 ± 0,78) хв (р < 0,01). В V групі тварин збільшення терміну примусового плавання почалось вже на 7-му добу експерименту, а на 14-ту добу вже складало (7,53 ± 0,28) хв, вірогідно відрізняючись від показників цього ж терміну дослідження тварин ІІ групи (р < 0,001).

Результати проведення тестів засвідчили про клінічне покращання кровотоку в ішемізованих кінцівках після проведення трансплантації кісткового мозку та СВФ жирової тканини в порівнянні з тими тваринами, яким не проводилась трансплантація стромальних клітин в ішемізовані тканини. Застосування СВФ жирової тканини в порівнянні з клітинами кісткового мозку в експерименті на фоні ішемії дало більш швидке відновлення нормальної функції м'язів кінцівки. Проведення тестів підтверджує припущення про активацію процесів ангіогенезу в ішемізованих кінцівках на тлі трансплантації стромальних клітин жирової тканини, але для визначення безпосередніх процесів, що відбуваються в ділянці ураження та визначення механізмів впливу МСК жирової тканини проведені гістологічні, імуногістохімічні та ультраструктурні дослідження в усіх групах тварин.