Комплексне лікування хворих на хронічну ішемію кінцівок із використанням трансплантації мультипотентних стромальних клітин аутоліпоаспірату (експериментально-клінічне дослідження)

Характер і ступінь виявлених змін в тканинах кінцівки залежав від характеру змодельованих в досліджуваній групі тварин різних експериментальних процесів. Так, в І контрольній групі тварин, яким було виконано введення фізіологічного розчину в м'язи задньої кінцівки, спостерігається абсолютно нормальна структура м'язової тканини з фізіологічним розташуванням експресії віментину у мезенхімальних структурах та ендотеліальних клітинах судин, де також експресується активно фактор Віллебранда, колаген IV типу розташований в базальній мембрані судин. М'язова тканина була без ушкоджень з чітко вираженими поперечно-счерченими волокнами та судинними пучками.

Проведення електронно-мікроскопічного дослідження в цій групі тварин засвідчило, що введення фізіологічного розчину у м'язи кінцівки жодним чином не вплинуло на структуру ендотеліальних клітин та капілярів загалом. Всі ендотеліоцити мали збережену характерну для цих клітин структури. Органели та компоненти цитоскелету були збережені. Стан клітинної мембрани, міжклітинних з'єднань та транспортних органел свідчили про активну життєдіяльність клітин та проведення активного та пасивного транспорту речовин крізь ендотеліоцити. Структура мітохондрій та пластинчатого комплексу вказували на активність процесів енергообміну та синтезу компонентів клітинних структур. Загалом спостерігались ендотеліоцити на різних етапах свого розвитку, що свідчить про процес активного росту та фізіологічної регенерації капіляру.

Моделювання ішемії кінцівки у дослідних тварин приводить до появи виражених гістологічних та імуногістохімічних змін в м'язах кінцівки на 2 - 14 добу, що відображаються в ознаках порушення кровообігу, які спостерігались в 90% випадків, зникненні поперечної счерченості м'язових волокон та розвитком повної деструкції міосімпласту (60% всіх дослідних препаратів), ліпідної дистрофії, вакуолізації і набряку, який спостерігався у 40% випадків. В артеріальних і венозних судинах спостерігається повнокров'я, частина ендотеліальних клітин судин некротизована, злущена. Стінка судин нерівномірно інфільтрована макрофагами, лімфоцитами - до 20% гістологічних зрізів. Спостерігаються вогнища фрагментації мезенхімальних структур на тлі дистрофії і деструкції міопласту, які зменшуються і зникають до 21 - 25 доби. Фактор Віллебранда експресується в ендотеліальних структурах судин, особливо виражена реакція в повнокровних судинах, в ендомізії перимізії на 2-гу і 7-му добу ішемії. Розповсюдженість цього фактору складала на початкових етапах 3 бали, що свідчить про активацію первинного тромбоцитарно-судинного гемостазу, як реакція ендотелію на пошкоджуючу дію ішемії. В останніх термінах дослідження розповсюдженість експресії фактору Віллебранда складала 1-2 бали. Наприкінці дослідження в багатьох спостереженнях зустрічаються вогнища периваскулярного склерозу, фіброзу, що є реакцією тканини на ішемічне ураження і заміщення м'язової тканини фіброзною.

Зменшення мікропіноцитозу та згладжування ворсинок на поверхні ендотеліоциту на 1-шу добу моделювання ішемії свідчить про порушення транспорту речовин із просвіту капіляру через клітину. Зникнення щільних контактів між клітинами та руйнування люмінальної поверхні вказує на руйнування моношару ендотеліоцитів в капілярах. Зменшення кількості органел та майже повна відсутність комплексу Гольджі вказує на припинення функціонування цих клітин.

Продовжуються процеси деструкції клітин і на 7 добу. Поряд із капілярами в яких відсутній просвіт спостерігаються ендотеліоцити, в яких продовжується хаотичний мікропіноцитоз і порушується водно-електролітний баланс, що є першою ознакою гибелі клітини. В інших клітинах явні ознаки порушеного енергетичного обміну - деструкція мітохондрій. На 21-шу добу характер ультраструктурних змін дещо змінюється. Менше спостерігається порушень в структурі самих ендотеліальних клітин, за виключенням зменшення кількості рибосом та порушеного білкового обміну в клітинах. Основні ушкодження торкаються базальної мембрани, яка розшарована та потоншена. Наприкінці дослідження в цій групі тварин з'являються поодинокі молоді ендотеліоцити, які свідчать про слабку активацію процесів фізіологічного ангіогенезу.

В групі тварин, яким СВФ жирової тканини була введена в інтактні м'язи кінцівки гістологічно і імуногістохімічно виявлено, що структура м'язових волокон і судин без особливостей. Лише у поодиноких спостереженнях (біля 20%) були виявлені вогнища лімфо-макрофагальних інфільтратів на 7-му добу після введення стромальної фракції жирової тканини. В експресії моноклональних антитіл до віментіну, колагену ІV типу, а також до фактору Віллебранда не спостерігається патологічних змін.

Не змінювалась і ультраструктурна організація ендотеліоцитів капілярів. Мало місце на початку спостереження незначне збільшення запальної реакції, яка на 7-му добу майже зникала. Характерною ознакою даної групи є надлишкова кількість макрофагів у зоні трансплантації, які спостерігались у 40% досліджень. Диференціація макрофагів починається на 12-ту добу, в цей період спостерігаються не зрілі клітини з дезорганізованими органелами та елементами цитоскелету. Вже на 22-гу добу після трансплантації макрофаги добре розвинуті з ознаками активних процесів життєдіяльності. Вищезазначене вказує, що макрофаги не мігрують з інших тканин у ділянку трансплантації, а розвиваються з клітин-попередників безпосередньо на місці. Такими клітинами-попередниками можуть бути трансплантовані МСК жирової тканини.

Результати отримані в цій групі вказують, по-перше, на досить широкий спектр диференціації стромальних клітин жирової тканини, по-друге, на те, що основою в направленому диференціюванні стовбурових клітин є середовище, куди вони потрапляють. Неішемізовані тканини не містять факторів і біологічно активних речовин характерних для ішемії, відповідно диференціація стромальних клітин жирової тканини відбулась у нейтральному напрямку - тканинні макрофаги.

Сьогодні у клінічній практиці в якості методу непрямої реваскуляризації кінцівки застосовується метод трансплантації кісткового мозку в м'язи ішемізованої кінцівки. Лікувальний ефект цього методу пов'язаний із мезенхімальними клітинами, що розташовані у кістковому мозку. В експерименті змодельована саме ця клінічна ситуація для проведення порівняльного аналізу. Встановлено, що гістологічно, в досліджуваних тканинах м'язового сімпласту і судин, розташованих в проміжній тканині, у тварин IV групи на 5-7 і 14-21 добу спостерігається переважання деструктивно-дистрофічних змін в м'язових волокнах (60% випадків), проміжній тканині і частково в м'язових пучках, що супроводжують їх в перимізії в 100% спостережень даної групи. Набряк перимізію носить нерівномірний характер, вогнищевий або дифузний. Слід зазначити дистрофію м'язових волокон із зникненням поперечної счерченості, місцями їх гомогенізацію. Також, в 20% спостережень, були виявлені поодинокі вогнища лімфо-макрофагальної інфільтрації в перимізії на тлі ліпідної дистрофії м'язових волокон. На 21 - 25 добу експерименту починається дуже повільний ріст ендотеліальних кіст (10-20% дослідного матеріалу), які прослідковуються при вивченні експресії фактору Віллебранда.

Слід зазначити, що в групі де виконувалась мієлотрансплантація на фоні ішемії кінцівки, в динаміці експерименту, не виявлено “підвищення” фіброзних змін в структурах міосімпласту, що підтверджується даними дослідження імуногістохімічних реакцій на віментин і колаген IV типу, експресія яких була аналогічною групам контролю (групи І і ІІІ) і складала від 0 до 1 балу.

Ультраструктурні дослідження трансплантації кісткового мозку в ішемізовані м'язи показали виражені деструктивні процеси протягом майже всього періоду спостереження. На 11-ту добу після трансплантації кісткового мозку в зоні ішемії не спостерігається виражених проявів ангіогенезу, мають місце лише локуси бластних клітин, цитоплазматичні відростки які проникають в базальний шар капіляру. На 18-ту добу після трансплантації, дані ультраструктурного дослідження свідчать про значні порушення міжклітинних взаємодій цього терміну спостереження. З іншого боку із-за підвищеної в деяких клітинах активності синтетичних і секреторних процесів, в цитоплазмі визначається значне збільшення компонентів ендоплазматичної мережі, пластинчастого комплексу, мітохондрій, проте, має місце значна кількість деструктивних процесів в клітинах, до 30% випадків. Вперше в цей термін спостерігаються молоді ендотеліоцити, але органели в них дезорганізовані, мікрофіламенти не мають чіткого напрямку, зрозуміло, що такі клітини функціонально не повноцінні. Лише на 22-гу добу після трансплантації спостерігаються зрілі, активно функціонуючі ендотеліоцити. Протягом всього періоду спостереження не видно ознак фібродистрофічних процесів, що суттєво відрізняє цю групу від ІІ групи тварин з моделюванням ішемії.

У тварин основної дослідної групи, яким на фоні моделювання ішемії проводилась трансплантація СВФ жирової тканини, на початку дослідження виявлені зміни, які, в основному представлені розладом кровообігу і дистрофією з нерівномірним повнокров'ям і стазами в судинах венозного типу, ці зміни носять вогнищевий характер - 20% випадків і протікають на тлі дистрофії м'язових волокон, втрати поперечної счерченості. На 7 - 14 добу структурні зміни, характерні для гіпоксії поступово зникають і в більшості досліджень вже не виявляються. При морфометричному дослідженні на 7-му добу ці явища мають місце у 10% випадків, а на 14-ту добу моделювання ішемії їх взагалі не спостерігається. В цей же термін в ділянках перимізію в мезенхімальних структурах спостерігається наявність новоутворених капілярів і судинних тяжів, при цьому, імуногістохімічно спостерігається виражена експресія фактору Віллебранда в ендотеліальних клітинах, що вказує на активний ангіогенез на 21-шу добу після моделювання ішемії і подальший термін. Морфометрично вже з 14-ї доби розвитку ішемії, що відповідає 11-й добі трансплантації СВФ, і до кінця дослідження експресія фактору Віллебранда складала 3 бали. Подібна ситуація спостерігалась і з експресією антитіл до мезенхімального фактору віментину та колагену IV типу - експресія цих факторів з 14-ї по 25-ту добу складала 3 бали. Новоутворені капілярні структури виявлені зрідка на 7-му добу (5% спостережень), систематично на 21-шу добу, сягаючи 70% зрізів наприкінці дослідження. Капіляри, які були розташовані в ендоперемізіальних структурах, були повнокровні, або з поодинокими еритроцитами, тобто, в них здійснюється кровоток. Такі структури не виявляються в інших групах в жодному випадку.

При проведені ультраструктурних досліджень на 4-ту добу після трансплантації СВФ жирової тканини має місце активація пластичних і енергетичних процесів. У великій кількості з'являються малодиференційовані клітини, що нагадують ендотеліоцити. В процесі зсуву ендотеліальних клітин або їх відособлення формуються міжклітинні просвіти. Надалі такі тяжі клітин завдяки подальшій каналізації перетворюються на своєрідні клітинні трубки. У складі стінки капіляру видно фрагменти базальної мембрани, що формуються.

На 4 добу після трансплантації з боку базальної мембрани виявляються малодиференційовані ендотеліоцитоподібні клітини з вираженими піноцитозними везикулами. Про посилення білкового обміну в ендотеліоцитах свідчить розширений гранулярний ретикулум, гіперосмований матрикс мітохондрій, а також поява досить значної кількості полісом, окремих везикулярних структур в цитоплазмі і великих мікроворсинок. На 11-ту добу вже спостерігається активний процес новоутворення капілярів. Мають місце різні стадії цього процесу від утворення на ендотеліоцитах “бруньок росту” (рис. 1) до чіткої верифікації утворених капілярів, що вистлані молодими ендотеліоцитами. В подальшому неопластичні процеси, що почались раніше, продовжуються. В клітинах спостерігається активація пластичних процесів, про що свідчать гіпертрофія і гіперплазія елементів ендоплазматичного ретикулуму і пластинчастого комплексу.

Новоутворені ендотеліоцитоподібні клітини на 18-ту добу після трансплантації СВФ жирової тканини мають великі ядра, чітко виражені структури матриксу цитоплазми, наявність вільних рибосом і поодиноких піноцитозних везикул. У цитоплазмі ендотеліоцитів спостерігаються мітохондрії із звичайною щільністю матриксу; профілі зернистої ендоплазматичної мережі, мікротрубочки, множинні рибосоми і тільця Вейбеля - Палладе. Досить показовим є поява в ендотеліоцитах тілець Вейбеля - Палладе, оскільки їх поява чітко корелювала з посиленням експресії фактору Віллебранда при імуногістохімічному досліджені (3 бали). Таким чином ми прослідковуємо на різному рівні клітинному і субклітинному синтез молодими ендотеліоцитами компоненту системи вторинного коагуляційного гемостазу - фактору Віллебранда. Цей фактор необхідний для стабілізації VIII фактору в кровоток і для його участі як кофактора в утворенні тромбу. Він синтезується виключно молодими ендотеліоцитами і в клітині ми бачимо його накопичення у вигляді тілець Вейбеля - Палладе, а при необхідності він потрапляє у кровоток і там вже відбувається посилення імуногістохімічної експресії антитіл до цього фактору.

Наприкінці дослідження після трансплантації СВФ жирової тканини новоутворені судини починають анастомозувати і утворюють судинну мережу за допомогою злиття капілярів, що ростуть. Бічні межі клітин звиті і в розширених ділянках міжклітинного простору спостерігається електроннощільний матеріал. Тонка базальна мембрана переважно в найдрібніших капілярах характеризується шаруватістю. Зовнішня оболонка представлена адвентиціальними клітинами. Має місце утворення сформованих функціонуючих капілярів, які анастомозовані з іншою судинною сіткою і утворені молодими активно функціонуючими ендотеліоцитами. Про безумовне функціонування новоутворених капілярів свідчить наявність в їх просвіті еритроцитів (рис. 2).

Морфологічний аналіз отриманих загальнопатологічних даних експериментального дослідження виявив, що порушення кровообігу найбільш виразне в ІІ групі на 2-3 та 5-7 добу після моделювання ішемії, що пов'язано з гіпоксією, носить вогнищевий характер, виражено в венозних судинах, венулах, артеріолах і капілярах і поступово зменшується до 14 доби експерименту. В ІV та V групах ці розлади мають місце на 5 - 7 добу експерименту і повністю зникають на 21 - 25 добу спостереження. Виходячи з даних морфометричного дослідження показників ангіогенезу в досліджуваних групах тварин на зрізах забарвлених гематоксилін-еозином та пікрофуксином за ван-Гізон, у тварин ІV групи перші прояви ангіогенезу з'являються на 7 добу експерименту, збільшуються протягом подальшого спостереження, досягаючи лише 20% на 25 добу експерименту. Нові кровоносні капілярні та венулярні структури з'являються в V групі тварин вже на 5 добу (маленькі осередки) після моделювання ішемії, що відповідає 2 добі після трансплантації СВФ жирової тканини. На 14 - 21 добу експерименту прояви ангіогенних процесів у м'язах кінцівки прогресивно збільшуються, досягаючи 50% всіх досліджуваних зрізів тканини (р < 0,001). Спостерігаючи на 25 добу дослідження, кількість гістологічних препаратів, в яких мала місце стимуляція ангіогенезу, сягала вже 70% випадків (р < 0,001), що вказує на більш ранню та потужну активацію ангіогенних процесів в V групі дослідних тварин внаслідок трансплантації в ішемізовану кінцівку СВФ жирової тканини.

Отже, застосування стромальних клітин, як кісткового мозку, так і жирової тканини на тлі ішемії сприяло найбільш швидкій адаптації, клітинній перебудові і відновленню ендотеліоцитів, що збереглися. Не можна виключити, що разом із звичайною проліферацією клітин ендотелію материнського ложа відбувалася трансформація і ендотеліальна спрямованість диференціювання трансплантованих клітин.

Слід зазначити, що у всіх випадках застосування СВФ жирової тканини виявлялися клітинні локуси активно проліферуючих малодиференційованих мезенхімних елементів. Крім того, знижений рівень деструктивних змін при поєднаних видах експерименту (ішемія + трансплантація), скоріш за все, пов'язаний з тим, що дія МСК, як кісткового мозку, так і жирової тканини, відбувалася на тлі вже активованих ішемією ендотеліоцитів, що збереглися. Іншими словами, при застосуванні методів клітинної трансплантації клітини ендотелію демонстрували особливу стійкість до пошкодження і високу активність внутрішньоклітинних репаративних процесів.

Активація процесів ангіогенезу, як показало наше експериментальне дослідження, характеризується сукупністю таких ознак, як розширення міжклітинних контактів з утворенням міжендотеліальних щілин і втратою єдності моношару ендотелію; локальний лізис базальної мембрани з просвітленням, фрагментацією її і вростанням в цих ділянках відростків цитоплазми ендотелію; різке просвітлення міжклітинного матриксу в периваскулярній зоні; збільшення розмірів ядра і ядерець, численні інвагінації ядерної оболонки; відсутність зональності в розподілі органел, збільшення кількості рибосом і полісом; численні великі і дрібні вирости, відростки, мікроворсинки на люмінальній і базальній поверхнях цитоплазми.

Зрештою відбувається локальний лізис базальної мембрани ендотелію стінки передіснуючої судини і з'являються цитоплазматичні відростки на поверхні ендотеліоцитів - бруньки росту. Утворення бруньок росту є одним з механізмів утворення нового судинного русла.

Іншим механізмом неоангіогенезу є активація механізмів внаслідок яких формуються неканалізовані тяжі ендотеліоцитів. Потім відбувається їх каналізація. Крім того, не можна виключити формування просвіту судини шляхом злиття численних вакуолей, розташованих в цитоплазмі ендотеліоцитів ростових бруньок.

Аналіз результатів проведеного експериментального дослідження із моделюванням ішемії кінцівки у тварин підтверджує дані, які з'явились останніми роками, щодо зміни уявлення про механізми регуляції процесів ангіогенезу. Раніше твердо встановлене принципове положення проблеми ангіогенезу - “ендотелій від ендотелію” вказувало, що в дорослому організмі у будь-якому випадку включаються процеси реплікації ендотеліоцитів з подальшим ремоделюванням “бруньок росту”. Проте, в даний час потрібне істотне переосмислення цього положення у зв'язку з можливою трансформацією трансплантованих або місцевих тканинних мультипотентних клітин в ендотеліальні.

Отже, проведені гістологічні, імуногістохімічні та ультраструктурні дослідження показали, що ангіогенез відбувається, як за рахунок активації та перебудови клітин ендотеліального вистилання передіснуючих судин, так і внаслідок стимуляції репаративних процесів і безпосередньої трансформації трансплантованих мультипотентних клітин. Встановлено, що введення МСК, що містяться в СВФ жирової тканини зменшує загибель клітин судинного ендотелію, знижує процеси фіброзування внаслідок ішемічного ураження м'язу, активує репаративні процеси безпосередньо в м'язовій тканині та є потужним активатором ангіогенезу за умов ішемії.

Проведені доклінічні дослідження і отримані результати стали підґрунтям для проведення клінічних випробувань трансплантації МСК жирової тканини хворим із хронічною ішемією кінцівок, які регламентуються наказом МОЗ України від 10.10.2007 р. № 630 “Про затвердження порядку проведення клінічних випробувань тканинних та клітинних трансплантатів та експертизи матеріалів клінічних випробувань”.

Клінічну частину дослідження склали 26 хворих на облітеруючі захворювання артерій кінцівок з проявами хронічної ішемії кінцівок. За нозологічними формами хворі розподілилися наступним чином: хворі на облітеруючий ендартеріїт - 14, облітеруючий атеросклероз - 9, постемболічна оклюзія артерій кінцівок - 3 пацієнта. За статтю розподіл був наступним: чоловіків - 22, жінок - 4. Середній вік хворих складав 46,1 року.

Ступінь хронічної ішемії кінцівки була різною: ІІ Б - 11 хворих, ІІІ ступінь - 5, IV ступінь - 10. Всі хворі до початку клінічних випробувань неодноразово лікувались з приводу даного захворювання, всім хворим в анамнезі застосовувались як прямі так і непрямі реваскуляризуючі оперативні втручання.

Контрольну групу (18 хворих) склали пацієнти, яким була виконана аутомієлотрансплантація в ішемізовані кінцівки. Дослідна група (8 хворих), яким застосована оригінальна методика трансплантації МСК жирової тканини, що складається з етапів: ліпоаспірація і виділення адгезивних клітин СВФ жирової тканини, частина з яких трансплантується хворому, а інша частина залишається для експансії на питомому середовищі, другим етапом отримана внаслідок культивації чиста культура МСК жирової тканини трансплантується хворому.

Особливістю розробленої методики є можливість кріоконсервування частини клітин для подальших, якщо це необхідно, трансплантацій. Відомо, що МСК жирової тканини досить добре переносять консервування і не втрачають своїх властивостей.

Перед нами не стояло питання шляху введення клітин, адже в літературі чітко доведено, що найкращий ефект при клітинних трансплантаціях спостерігається при безпосередньому введені у ділянку ішемії. Інші методи - внутрішньовенний та внутрішньоартеріальний застосовуються при неможливості безпосереднього введення, або при дифузному ураженні, проте, такі шляхи введення призводять до загибелі до 90% клітин (T. Tatsumi та співавт., 2006; T. Bartsch та співавт., 2006).

Проведені дослідження впливу трансплантації МСК жирової тканини на стимуляцію процесів ангіогенезу у хворих із хронічною ішемією кінцівок показало наявність клінічного позитивного ефекту від проведеної трансплантації: у хворих зменшувались клінічні прояви ішемії, збільшувалась дистанція безболісної ходьби, загоювались трофічні розлади при IV стадії ішемії кінцівки. Майже у всіх хворих мало місце зменшення ступеню ішемії кінцівки в посттрансплантаційному періоді. Клінічні дані підтверджувались даними ангіографічного дослідження, на якому спостерігався виражений ріст колатерального кровотоку на ішемізованій кінцівці.

Також досить цікавим фактом, який був висвітлений в процесі дослідження є той факт, що не дивлячись на явну позитивну динаміку у хворих, зменшення клінічних проявів ішемії та явну стимуляцію процесів ангіогенезу за даними ангіографічного дослідження, показники сегментарного тиску і показник ГПІ в процесі лікування після виконання трансплантації МСК жирової тканини вірогідно не збільшувався. Пояснюється цей факт тим, що покращання кровопостачання у хворих відбувалось не за рахунок відновлення кровопостачання по магістральним артеріям, яке і віддзеркалює показник сегментарного тиску, а за рахунок новоутворення нового мікроциркуляторного русла. Отже, застосування методу визначення сегментарного тиску із вираховуванням ГПІ у даної категорії пацієнтів не доцільно, оскільки не відображає реальної картини стану кінцівки, що змушує шукати інші неінвазивні методи діагностики стану артеріального кровотоку в кінцівці при застосуванні непрямих методів реваскуляризації у хворих на облітеруючі захворювання кінцівок.

Всі хворі, що входили до клінічних випробувань, були обстежені за допомогою метода лазерної флуометрії (ЛДФ) до трансплантації МСК і повторно обстежено з визначенням відповідних показників через 1, 3 та 6 місяців після трансплантації.

При аналізі показників ЛДФ у хворих із хронічною ішемією кінцівок при трансплантації мультипотентних стромальних клітин власної жирової тканини до початку лікування було достовірно більшим значення Мф - показника мікроциркуляції на фоновому запису з передпліччя лівої руки (7,04 ± 1,05) проти (4,30 ± 0,44) в контролі (р < 0,02). Значення параметрів резерву капілярного кровотоку (РККо) і резерву капілярного кровотоку після йонофорезу нітрогліцерину (РККн) було достовірно меншим у хворих до початку трансплантації клітин (117,0 ± 16,0) та (103,0 ± 45,0) проти (310,6 ± 15,4) та (442,4 ± 35,1) в контролі (р < 0,001). За даними вейвлет-аналізу у всіх хворих максимальна амплітуда ендотеліальних флаксмоцій - AmaxЕ була достовірно більшою (0,84 ± 0,12) проти (0,29 ± 0,04) в контролі (р < 0,05), а також максимальна амплітуда нейрогенних коливань - АmахН (0,90 ± 0,11) проти (0,37 ± 0,07) в контролі (р < 0,002). Тобто, відмічається компенсаторна дилатація прекапілярних сфінктерів за рахунок зменшення нейротонусу і збільшення викиду оксиду азоту. При цьому також зростає артеріоло-венулярне шунтування, як компенсаторний перерозподільний механізм, що підтверджується отриманими нами даними показника шунтування, який був більшим у досліджуваній групі і складав (2,53 ± 0,49) проти (1,13 ± 0,14) в контролі (р < 0,001).

Доведено, що у хворих на облітеруючі захворювання артерій нижніх кінцівок з наявністю хронічної ішемії кінцівок на тлі зниження рівня мікроциркуляції на відміну від показників здорових людей компенсаторно активізуються механізми регуляції мікроциркуляції (ендотеліальний, нейрогенний, міогенний), посилюється артеріовенозне шунтування, знижуються ендотелій-залежний і ендотелій-незалежний резерви капілярного кровотоку.

При порівнянні параметрів ЛДФ в динаміці лікування через 1 міс після трансплантації МСК жирової тканини відмічається достовірне зменшення Мф (3,74 ± 1,04) проти (7,04 ± 1,05) пф. од. до лікування (р₁ < 0,05). При цьому значення РККн достовірно збільшувалось. Якщо на початку дослідження воно складало (103,0 ± 45,0)%, то через місяць цей показник був (229,0 ± 39,0)% (р₁ < 0,05). Щодо показника мікроциркуляції (ПМ) відмічена тенденція до збільшення значень ПМ за рахунок, розширення існуючих капілярів і, можливо, утворення нових капілярних судин внаслідок залучення в кровоток не функціонуючих капілярів, а також за рахунок активації процесів новоутворення капілярного русла. Також має місце вплив трансплантованих клітин на ендотелій-незалежний механізм вазодилатації, здебільшого, за рахунок зниження міотонусу і нейротонусу прекапілярів.

При застосуванні трансплантації МСК жирової тканини через 1 міс відмічається покращання мікроциркуляції за рахунок новоутворення капілярного русла, дилатації прекапілярних сфінктерів за рахунок зниження нейротонусу, посилення артеріовенозного шунтування, покращання резерву капілярного кровотоку за рахунок поліпшення ендотелій-незалежної вазодилатації.

При порівнянні значень ЛДФ у хворих на ішемію кінцівок до початку трансплантації стромальних клітин і через 6 міс після лікування можна відмітити нормалізацію Мф з (7,04 ± 1,05) до (4,11 ± 0,21) пф. од. (р₁ < 0,02) у порівнянні з початковими даними. При цьому значення РККо достовірно збільшувалось з (117,0 ± 16,0) до (231,0 ± 15,0)% (р < 0,02) у порівнянні з вихідними даними, можливо за рахунок системи L-аргінін - оксид азоту, яка вивільняє NO-релаксуючий фактор під впливом ацетилхоліну (на М1 і М2 рецептори ендотелію при манжеточній пробі). Стосовно РККн відмічено тенденцію до його збільшення, але його значення все одно лишалось дещо нижче контрольних показників. При спостереженні цих хворих через 3 та 6 місяців відмічається тенденція до подальшої нормалізації показників мікроциркуляції за рахунок покращання венулярного відтоку, а також поліпшення ендотелій залежної вазодилатації, що відбувається за рахунок посилення впливу на мікрогемодинаміку активних і пасивних механізмів регуляції процесів капілярного кровотоку. Показники лазерної допплерівської флоуметрії у хворих контрольної групи покращувались незначно, суттєво відрізняючись від результатів дослідної групи пацієнтів.

Доведено, що метод лазерної допплерівської флуометрії є доцільним у використанні для визначення мікроциркуляторних процесів, що відбуваються в тканинах кінцівок після виконання методів непрямої реваскуляризації кінцівки.

Наступним етапом клінічних досліджень хворих було визначення процесів, що відбуваються безпосередньо в тканинах ішемізованих кінцівок, де було виконано трансплантацію МСК жирової тканини. Проводилось визначення гістологічної структури м'язової тканини, рівень імуногістохімічної експресії антитіл до певних факторів, а також ультраструктурна характеристика ендотеліальних клітин капілярів.

В якості контролю використовувалась м'язова тканина не ішемізованих кінцівок і тканина досліджуємих хворих в дотрансплантаційному періоді.

Встановлено, що у хворих із хронічною ішемією кінцівок мають місце значні зміни гістологічної архітектоніки м'язової тканини, заміщення м'язових волокон сполучною тканиною, має місце порушення базальних мембран судин, відсутність експресії фактору Віллебранда. При дослідженні ендотеліальних клітин капілярів м'язової тканини спостерігаються, як зменшені, так і набряклі, збільшені в розмірах ендотеліоцити. Зв'язок з базальним шаром порушений, має місце підвищення проникливості капіляру, що приводить до виходу компонентів крові в периваскулярну зону. Також суттєві зміни торкаються плазматичного ретикулуму, який представлений заокругленими каналами або цистернами. Про суттєве зниження енергетичних процесів в клітині свідчить порушення структури мітохондрій, які вражаються в ендотеліоцитах найбільше. Поодинокі ендотеліоцитоподібні молоді клітини вказують на процеси ангіогенезу, які мають дуже низьку активність і не забезпечують потреби тканини за умов ішемії.

Вже через 1 міс після трансплантації МСК жирової тканини у хворих в м'язах кінцівок спостерігаються вогнища активно проліферуючих мезенхімоподібних клітин, які набувають округлої форми. Помітне посилення проліферації малодиференційованих клітин виявляється в міжм'язовій рихлій сполучній тканині, що розташована поблизу малодиференційованих клітинних масивів. В центрі таких вогнищ інтенсивність проліферації знижується і клітини набувають подовженої форми, їх цитоплазма стає ацидофільною, зменшується в розмірах ядро.

Надалі така малодиференційована тканина трансформується в типові вогнища молодих ендотеліальних клітин. У місцях розростання новоутворених судин в межах перимізію проліферативна активність клітин зростає. Тут виявляється значна кількість перицитів і фібробластоподібних клітин. У частині спостережень (30% гістологічних препаратів) виявляються вогнища симпластів в цитоплазмі яких спостерігається наявність глікогену, активація утворення “молодих”, незрілих міонів, частіше це дрібні, окремо розташовані міони.

Експресія колагену IV типу в цій групі більш рівномірна та впорядкована (1 бал). Спостерігаються ендотеліоцити на різних стадіях розвитку. В даній групі спостережень, через місяць після введення стромальних клітин жирової тканини має місце експресія фактору Віллебранда (2 бали) в вогнищах перимізію в окремих структурах ендотеліальних клітин, або у мікросудинах, що формуються. Характерні для цього терміну спостереження активні мезенхімоподібні клітини, які утворюють бруньки росту, молоді ендотеліоцити, які поєднуються один з одним за допомогою тісних з'єднань, відмежовуючи, таким чином просвіт нового капіляру. В таких ендотеліоцитах мікрофіламети та мікротрубочки в цитоплазмі розташовуються хаотично, клітини містять велику кількість мітохондрій з добре розвинутими кристами, все це вказує на те, що клітина знаходиться в процесі розвитку і в ній відбуваються активні енергетичні та пластичні процеси. В деяких капілярах цитоплазматична мембрана ендотеліоцитів звита, контакти цитоплазматичних мембран чередуються з міжклітинними проміжками, інколи щілини вельми розширені і в них реєструються мікроворсинки.

Поверхня клітин, що обернена в просвіт судини часто має нерівні контури, а та, що обернена до базальної мембрани - гладка. Базальна мембрана має осміофільну структуру, нерівномірно потовщена. Щільні з'єднання між клітинами знаходяться ближче до люмінальної поверхні.

Морфологічна схожість з малодиференційованими клітинами виражається в наявності відростків цитоплазми, подібної електронної щільності, зовнішньому вигляді ядра. Тут виявляються локуси проліферуючих клітин, багато з яких нагадують малодиференційовані клітини мезенхіми, серед яких виявляються молоді ендотеліоцити (рис. 3). Також мали місце добре сформовані, активно функціонуючі ендотеліальні клітини з підвищеною функціональною активністю, фрагментованою базальною мембраною і наявністю виростів, а також трубочок на стороні базальної поверхні клітин з наступним подовженням бруньки зростання і утворенням тяжів ендотеліоцитів.

Через 3 міс після трансплантації МСК жирової тканини вже набагато рідше спостерігалась наявність міосимпластів з порушеною структурою, клітинна інфільтрація в ділянках активної проліферації мезенхімальних клітин не виражена. Зона проліферації характеризується на цьому етапі безліччю недиференційованих і малодиференційованих клітин, кровоносних судин. Ріст судин йде відносно рівним фронтом в зонах, що мають волокнистий каркас з однотипних волокон, і сповільнюється при зустрічі з крупнішими пучками. У цих ділянках судинна і клітинна інфільтрація йде по прошарках рихлої сполучної тканини між пучками колагенових волокон. Мають місце інфільтрати, що утворені поліморфноядерними лейкоцитами, макрофагами і фібробластами.

Визначаються великі округлі клітини зі світлим ядром, дещо на відстані - поліморфноядерні лейкоцити, далі від них - макрофаги, плазматичні клітини і ще на більшому віддаленні - фібробласти, орієнтовані уздовж волокон рихлої сполучної тканини перимізію. Найбільш виражені скупчення клітин розташовуються в колі новоутворених капілярів. На окремих ділянках спостерігався яскраво виражений поліморфізм клітин. Зона проліферації характеризується безліччю недиференційованих і малодиференційованих клітин, кровоносних судин. В даному терміні молода сполучна тканина має добре виражену судинну мережу, артеріоли і венули розташовані попарно, впорядковано, орієнтовані переважно паралельно ходу колагенових волокон, мають направлений хід.

Імуногістохімічно експресія віментину та колагену IV типу виявлена в більшості спостережень у вигляді окремих мікровогнищ в ділянках формування новоутворених судин, в окремих клітинних структурах пери- і ендомізію. Найбільш виражена експресія фактору Віллебранда спостерігається саме в IV групі у вигляді виражених кровоносних капілярів та мікросудин.

Ультраструктурно подальший розвиток капілярного русла визначається в активному формуванні базального шару, структура якого стає більш гомогенною. В утворення базальної вистілки включаються періцити та інші клітини сполучної тканини. Люмінальна мембрана ендотеліоцитів втрачає мікроворсинки та мікровирости, які розташовуються в просвіті молодого капіляру. Таким чином, капіляр покривався одношаровим плоским епітелієм. Мали місце також в цей термін і початкові стадії васкулогенезу. Часто виявляються широкі цитоплазматичні відростки значної величини, що містять гранули Вейбеля - Палладе (рис. 4). В цей термін спостереження новоутворені судини починають анастомозувати і утворюють судинну мережу за допомогою злиття зростаючих капілярів. Неклітинний компонент базального шару стає видимим чіткіше, особливо виразно виступає його фібрилярна частина. Ріст капілярів здійснюється за рахунок проліферації крайових клітин. Капіляри, що регенерують широко анастомозують між собою, формуючи незамкнуте внутрішньоорганне капілярне русло. По мірі диференціювання клітинних компонентів судинної стінки в процес утворення базальної мембрани включаються періцити і інші клітини. Поряд з регенеративними та капіляроутворюючими процесами спостерігалась незначна деструкція ендотеліальних клітин, що вказує на процеси впорядкування судинного русла на цьому етапі.

Аналіз отриманих даних дослідження тканин кінцівки показав, що найбільш виражені зміни спостерігаються в групі спостережень до трансплантації клітин з переважанням деструктивних і дистрофічних тканин міосимпластів, а також судин перимізію. Вони носять осередковий, мозаїчний характер, виражений в ділянках порушеної, “збоченої” регенерації. Імуногістохімічні дослідження експресії мезенхімального фактору віментину і колагену IV типу, що локалізуються в структурах базальної мембрани, особливо судинних утворень, виявляють їх нерівномірну експресію, з наявністю деструкції базальних мембран, в яких експресія колагену IV типу відсутня, також відсутня експресія фактору Віллебранда у цей термін спостереження.

Після трансплантації МСК жирової тканини через 1 міс і, особливо, через 3 міс виявлена суттєва динаміка поліпшення досліджуваних структур міосимпластів в більшості спостережень, в яких виявлені “молоді” міони, проліферація і утворення кровоносних капілярів в перимізії. Виявлено нерівномірне зниження і наближення експресії віментину і колагену IV типу до показників групи контролю, на тлі більш розповсюджених “полів” міосимпластів зі збереженими структурами, в окремих спостереженнях виявлені вогнища компенсаторної гіпертрофії м'язових волокон. Досить чітко спостерігається наростання експресії фактору Віллебранда з 1 до 3 міс спостереження, зі значним збільшенням експресії у вже сформованих мікросудинах наприкінці дослідження.

Ультраструктурно доведено, що в процесі репаративного ангіогенезу послідовно відбувається брунькоутворення, анастомозування, ремоделювання і диференціювання сегментів новоутворенної судинної мережі.

Чим менш звивиста цитолема ендотеліоцитів, тим нижче в них піноцитозна активність. У ендотеліоцитах матрикс цитоплазми клітин може різко прояснювався, що свідчить про зміну в клітині іонного складу. Звуження капілярів часто виникало за рахунок набрякання цитоплазми ендотеліоцитів. Така модифікація внутріклітинних структур наводила до вираженої деформації ендотеліальних клітин, їх деструкції. Крім того, в процесі репаративної перебудови відбувається локальний лізис базальної мембрани ендотелію стінки попередньої судини, поява цитоплазматичних відростків на базальній поверхні ендотеліоцитів.

Таким чином, при активації процесів ангіогенезу в ендотеліальних клітинах спостерігалися два види змін: деструктивні і репаративні.

На ультраструктурному рівні спостерігаються ознаки, що свідчать про активацію репаративних процесів при трансплантації МСК жирової тканини. Безперечно, що постачання клітин при ангіогенезі необхідними метаболітами здійснюється в ділянці базальних відділів, міжклітинних щілин і просторів. Саме цей відділ материнського ложа активується і активує малодиференційовані клітини мезенхімного походження (як трансплантованих стромальних клітин, так і власних клітин) для подальшої їх трансформації в ендотеліоцити.

Найвиразніше такі зміни реєструються через 1 міс після трансплантації. Про це свідчить поява багаточисельних складок, бруньок росту, випинань, глибоких інвагінацій, звитих канальців, як базальної мембрани, так і плазмолеми ендотеліальних клітин, що примикає до неї. Часто в матриксі таких складок можна бачити піноцитозні бульбашки, що формуються - основні структури транскапілярного транспорту.

Кінцевий термін спостереження характеризувався більш глибокою організацією первинного судинного русла, формуванням клітинного та неклітинного компоненту базальної мембрани та злиттям новоутворених судин із функціонуючим капілярним руслом. Ендотелій утворених капілярів набуває звичного стану судинного ендотелію - моношарового плоского ендотелію. Крім того і в цей же період мають місце процеси первинного утворення просвіту капілярів, про що свідчить наявність бруньок росту, достатньо велика кількість в ендотеліоцитах тілець Вейбеля - Палладе, наявність тісних контактів молодих ендотеліоцитів, що окреслюють первинну порожнину капіляру. В цей термін спостерігається більший поліморфізм процесів, що відбуваються в ендотеліоцитах.

При трансплантації МСК жирової тканини вказані вище ультраструктурні утворення виражені чітко і зустрічаються досить часто. Ці факти свідчать про те, що завдяки трансплантації стромальних клітин ангіогенез протікає активніше і без виражених деструктивних змін з боку зрілих ендотеліоцитів, як це спостерігається в період первинного забору тканини для дослідження перед трансплантацією.

Необхідно відзначити, що описані деструктивні стани мітохондрій, пластинчастого комплексу і вакуолярної системи цитоплазми новоутворених ендотеліоцитів не служать проявом патології цих клітин, а відносяться до розряду їх функціональних або репаративних змін, що пов'язані з клітинним диханням і ферментативними реакціями та етапом ангіогенезу, коли об'єднуються існуючі та новоутворені судини.

Таким чином, проведене дослідження показало, що при трансплантації МСК жирової тканини на всіх етапах ангіогенезу проліферація мезенхімоподібних клітин знаходиться в щонайтісніших взаєминах з процесами специфічного диференціювання. Така взаємозалежність цих процесів є однією із закономірностей репарації судинного русла перимізію і рихлої сполучної тканини в цілому, в якій репродукція, ріст і диференціювання клітин представляють лише різні сторони єдиного процесу новоутворення судинного русла.

Утворення первинних кровоносних судин можливе безпосередньо із трансплантованих МСК або при їх активній участі. Остання обставина, за даними електронно-мікроскопічного дослідження ендотелію капілярів м'язової тканини, не викликає ніяких сумнівів.

Наприкінці клінічного етапу нашого дослідження ми провели визначення індексу якості життя хворих, які складали групу клінічного випробування. Застосовані були індекс якості життя за W. O. Spitzer, і запитальник по визначенню дистанції ходьби Walking Impairment Questionnaire. Дані показники рекомендовані TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC) on Management of Peripheral Arterial Disease (PAD) від червня 2000 року.

Встановлено, що трансплантація МСК жирової тканини в комплексному лікуванні хворих із хронічною ішемією кінцівок призводила до стійкого зростання протягом року індексу якості життя та відстані і швидкості ходьби пацієнтів, що суттєво відрізняється від пацієнтів з подібними ураженнями артеріального русла, яким було проведено консервативне лікування. Індекс якості життя в дослідній групі пацієнтів до лікування складав 5,32 ± 0,15 балів, що відповідає показнику групи пацієнтів, яким проводилась консервативна терапія і свідчить про однорідність цих груп.

В подальшому у хворих з ураженнями артерій кінцівок, яким не можливо виконати реконструктивне оперативне втручання на тлі консервативної терапії спостерігається збільшення індексу якості життя через 3 міс, однак вже через 6 міс мало місце зниження цього показника, а через рік індекс якості життя в цій групі відповідав початковим даним.

В дослідній групі пацієнтів мало місце більш повільне збільшення індексу якості життя - через 3 міс цей індекс складав (6,07 ± 0,21) бала, що майже не відрізнялось від показника контрольної групи. Проте, вже через 6 міс і через 1 рік індекс якості життя пацієнтів дослідної групи суттєво був більшим показників контролю.

При дослідженні показників запитальника по визначенню дистанції та швидкості ходьби мало місце поступове збільшення дистанції та швидкості ходьби в обох групах пацієнтів, яке спостерігалось до 6 міс. Через рік показники контрольної та досліджуваної груп суттєво відрізнялись, в той час як в контрольній групі має місце падіння дистанції ходьби, в досліджуваній групі показники дистанції та швидкості ходьби продовжували збільшуватись, складаючи через рік (29,0 ± 1,04) бала.

Також слід зазначити, що всі хворі відмічали на початкових етапах зниження больового синдрому та зменшення скарг, що пов'язані із порушенням нервового проведення, можна припустити, що трансплантовані МСК жирової тканини також відповідним чином впливають і на ішемізовані нервові волокна і нервові рецептори, що відкриває перспективи подальших можливих досліджень в цьому напрямку.

Загалом результатом нашого дослідження є безумовне доведення факту позитивного впливу трансплантації МСК жирової тканини хворим із хронічною ішемією кінцівок. Зменшення ішемії кінцівки відбувається за рахунок активації процесів ангіогенезу, як самими трансплантованими клітинами, так і опосередковано стимуляцією МСК жирової тканини власного тканинного ангіогенного потенціалу. Впровадження даного методу в клінічну практику дозволить суттєво зменшити відсоток розвитку ішемій кінцівок тяжкого ступеню з наступною втратою хворим цієї кінцівки, відповідно зменшить відсоток пацієнтів, що отримають інвалідність і стануть тягарем для суспільства.

Проведене дослідження відкриває нові перспективи подальших наукових розробок методів трансплантації МСК жирової тканини хворим з різними нозологіями, а саме: поєднання методів клітинної трансплантації із реконструктивними оперативними втручаннями на артеріях кінцівок, вплив методів клітинної трансплантації на нервовий компонент ішемічного ураження, застосування трансплантації МСК жирової тканини, які попередньо in vitro будуть направлено диференційовані в необхідному напрямку, покращання реваскуляризації трансплантованих і реплантованих тканин, при різноманітних ситуаціях в пластичній хірургії.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення науково-практичної проблеми покращання результатів лікування хворих на облітеруючі захворювання кінцівок із хронічною ішемією кінцівок тяжкого ступеню, що базується на застосуванні оригінального способу трансплантації мультипотентних стромальних клітин власної жирової тканини субфасціально в м'язи ішемізованої кінцівки.

1. Лікування хворих із хронічною ішемією кінцівок є однією з найбільш актуальних проблем судинної хірургії. Відсутність адекватного дистального русла є причиною незадовільних результатів при реконструктивних оперативних втручаннях у 23,7% хворих. Методи клітинної стимуляції процесів ангіогенезу, на тлі загальмованої власної ангіогенної відповіді тканин кінцівки, є перспективним напрямком лікування цих пацієнтів. Жирова тканина людини є оптимальним джерелом мультипотентних стромальних клітин, які швидко розмножуються, подвоюючи популяцію кожні 24 години, зі збереженням життєздатності при культивуванні та консервації.

2. Індукція мультипотентних стромальних клітин жирової тканини в ендотеліальному напрямку протягом 14 діб у середовищі EGM-2, що містить ростові чинники FGF, EGF, VEGF, призводить до вибудовування клітинних елементів в сітчасту тривимірну структуру в товщі Матрігелю, що свідчить про появу у культивованих клітин ендотеліальних властивостей.

3. Культивування стромальних клітин в ендотеліальному середовищі EGM-2 призводить до суттєвого збільшення їх кількості (в 3,5 рази по відношенню до звичайних середовищ культивації) і зміни їх фенотипічних властивостей - більше ніж 50% клітин починають експресувати ранній маркер ендотеліальних клітин FLK-1. Доведеним слід вважати факт можливості ендотеліального диференціювання in vitro виділених стромальних клітин жирової тканини.

4. Розроблена методика трансплантації стромально-васкулярної фракції жирової тканини в експерименті, за різних умов моделювання, дозволяє вивчити окремі ланки патогенезу в тканині кінцівки після трансплантації клітин.

5. Трансплантація стромально-васкулярної фракції жирової тканини в ішемізовані кінцівки дослідних тварин дозволила вже через 11 діб після трансплантації в 2 рази збільшити дистанцію одномоментного пробігу тварин і в 2,5 рази збільшити показники тесту примусового плавання, що вказує на швидке відновлення функціонального стану тканин кінцівки.

6. Головним чинником, що визначає вектор диференціації трансплантованих стромальних клітин в тканині є характер патогенетичних процесів, що відбуваються в ділянці трансплантації. Трансплантація клітин в інтактну тканину призводить до утворення великої кількості тканинних макрофагів.

7. Трансплантація стромальних клітин жирової тканини в експерименті на тлі ішемії кінцівки призводить до появи новоутворених капілярних структур, що виявляються зрідка на 7-му добу, а на 21-шу добу капіляри зустрічаються систематично з поодинокими еритроцитами, тобто, в них здійснюється кровоток. Експресія фактору Віллебранда поступово зростає починаючи з 7-ї доби експерименту, експресія колагену IV типу вказує на впорядкованість базальних мембран новоутворених судин вже на 18-ту добу після трансплантації клітин.

8. Ультраструктурні дослідження довели, що на 11-ту і на 18-ту добу після трансплантації з'являються молоді ендотеліоцити, утворюються “бруньки росту” нових капілярів, а також утворюються трубочки ендотеліоцитів, які в подальшому вже на 22-гу добу після трансплантації утворюють розгалужену, активно функціонуючу мережу новоутворених капілярів. Ангіогенні механізми проходять наступні етапи: активації, відносного диференціювання і регресії окремих клітин ендотелію, за рахунок чого новоутворені ендотеліальні трубочки вбудовуються в існуюче судинне русло.

9. Розроблена оригінальна методика трансплантації мультипотентних стромальних клітин власної жирової тканини пацієнтів у хворих із хронічною ішемією кінцівок, що складається з двох етапів: 1. виділення і трансплантація адгезивних клітин стромально-васкулярної фракції жирової тканини в м'язи кінцівки; 2. культивація, отримання чистої культури мультипотентних стромальних клітин жирової тканини з наступною трансплантацією їх в кінцівку. Характерним моментом цієї методики є можливість тривалої консервації чистої культури клітин. Методика показана хворим, яким не можливо виконати реконструкцію судинного русла, хворим дитячого віку та пацієнтам із вираженою супутньою патологією.

10. За допомогою методу лазерної допплерівської флоуметрії доведено, що трансплантація мультипотентних стромальних клітин жирової тканини на тлі ішемії кінцівки призводить до активації ендотелій-незалежних механізмів вазодилатації, за рахунок зниження міотонусу і нейротонусу прекапілярів, поліпшення ендотелій залежного впливу на мікрогемодинаміку. Застосування методу визначення сегментарного тиску на кінцівці за умов застосування клітинної трансплантації не є доцільним, оскільки не відображає істинної картини кровообігу в кінцівці.

11. Гістологічними та імуногістохімічними показниками трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини у хворих з ішемією кінцівок є зменшення кількості міонів із деструктивними змінами, відсутність надлишкового розвитку сполучної тканини, нормалізація експресії віментину та колагену IV типу, прогресивне збільшення експресії фактору Віллебранда. Ультраструктурно процес репаративного ангіогенезу послідовно характеризується брунькоутворенням, анастомозуванням, ремоделюванням і диференціюванням сегментів новоутворенної судинної мережі.

12. Застосування методу клітинної трансплантації мультипотентних стромальних клітин жирової тканини у хворих на хронічну ішемію кінцівок тяжкого ступеню, призводить до стійкого зростання індексу якості життя, відстані безболісної ходьби і сприяє більш швидкій соціальній реабілітації пацієнтів.