Метрологічні аспекти валідації методик кількісного визначення лікарських засобів методом стандарту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державне підприємство

«ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ І МЕДИЧНОЇ ПРОДУКЦІЇ»

УДК 615.2/3.074:54.062]:006.91

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Метрологічні аспекти валідації методик кількісного визначення лікарських засобів методом стандарту

15.00.03 - стандартизація та організація

виробництва лікарських засобів

Денисенко Наталія Василівна

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі валідації та стандартних зразків Державного підприємства «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів» Міністерства охорони здоров'я України (м. Харків).

Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, старший науковий співробітник Леонтьєв Дмитро Анатолійович, Державне підприємство «Украінський науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», м. Харків, начальник відділу валідації та стандартних зразків

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор Мерзлікін Сергій Іванович, Національний фармацевтичний університет, м. Харків, професор кафедри токсикологічної хімії

кандидат фармацевтичних наук Назарова Олена Сергіївна, Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», м. Харків, завідувач лабораторії аналізу, якості та стандартизації лікарських препаратів

Захист відбудеться “_13_”__травня______2011 р. о _10^оо_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.817.01 при Державному підприємстві „Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції” (61085, м. Харків, вул. Астрономічна, 33).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державного підприємства „Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції” (61085, м. Харків, вул. Астрономічна, 33).

Автореферат розісланий “_12_”___квітня_____2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат фармацевтичних наукН.В. Бєгунова

валідація кількісний невизначеність

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Усі методики контролю якості лікарських засобів (ЛЗ) повинні бути валідованими у відповідності до вимог Державної Фармакопеї України (ДФУ) та провідних фармакопей світу, до вимог належної виробничої практики (GMP) та вимог регуляторних органів. Однак в провідних фармакопеях світу, документах Міжнародної конференції по гармонізації технічних вимог до реєстрації лікарських препаратів для людини (ICH) і в керівних документах викладається тільки методологія та загальні принципи процесу валідації. Не регламентується процедура проведення валідації та відсутні науково обґрунтовані критерії прийнятності результатів валідації.

Підходи, які описані у літературі, не мають достатнього наукового обґрунтування.

В залежності від способів проведення валідації можуть бути одержані різні висновки що до приємності результатів валідації.

У зв'язку з цим виникає необхідність стандартизації процедури валідації, оптимізації процесу валідації та розробки критеріїв валідаційних характеристик методик контролю якості ЛЗ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Державного підприємства «Науково-експертний фармакопейний центр» зі створення Державної Фармакопеї України згідно Указу президента України №615/98 від 11.06.1998 р., також виконання замовлення Державного підприємства «Державний фармакологічний центр» із розробки та підготовки монографій до видання Доповнення 2 до Державної Фармакопеї України 1-го видання (№ державної реєстрації 0107U012267).

Мета та задачі дослідження. Метою дослідження є розробка процедури проведення валідації, оптимізація процесу валідації та розрахунок критеріїв валідаційних характеристик методик кількісного визначення ЛЗ методом стандарту.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

- провести порівняльний аналіз вимог щодо проведення валідації та критеріїв прийнятності провідних Фармакопей світу та керівних документів;

- запропонувати стандартизовану схему процедури проведення валідації;

- раціонально оптимізувати процес валідації;

- сформулювати єдині критерії прийнятності валідаційних характеристик;

- провести дослідження із застосуванням розроблених підходів валідації методик кількісного визначення методом стандарту;

- скласти прогноз повної невизначеності методик аналізу, що валідуються, виходячи з фармакопейних вимог.

Об'єкти дослідження. Таблетки «Амброксол-КПМ», капсули «Флуконазол», субстанція «Апротинін, порошок (субстанція)» та лікарський засіб для парентерального застосування «Апротинін, порошок для виготовлення інїєкцій».

Предмет дослідження. Розробка критеріїв прийнятності валідаційних характеристик, а також раціональної схеми проведення валідації для методик кількісного визначення методом стандарту.

Методи дослідження. Абсорбційна спектрофотометрія в ультрафіолетовій та видимій областях, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Обробку експериментальних даних проводили за допомогою методів математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформульовані критерії прийнятності для валідаційних характеристик фармакопейних методик кількісного визначення методом стандарту із застосуванням принципу незначущості.

Вперше стандартизовано процедуру валідації фармакопейних методик кількісного визначення методом стандарту. Процедура придатна для одночасної валідації методик кількісного визначення, однорідності вмісту та тесту на розчинення відповідно до найширшого діапазону застосування та найбільш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу у відповідності зі сформульованими критеріями прийнятності.

Розроблено раціональну схему проведення валідації для одночасного оцінювання характеристик лінійності, прецизійності та правильності.

Запропоновано застосування нормалізованих координат, що дозволяє сформулювати єдині критерії, які пов'язані тільки з допусками вмісту, але не залежать від специфіки конкретних речовин та відгуку аналітичного сигналу.

Запропоновано методику оцінки невизначеності фармацевтичних кількісних методик аналізу, виходячи з фармакопейних вимог до даних випробувань.

Практичне значення одержаних результатів. Науково обґрунтовані підходи до процедури проведення валідації та розрахунку критеріїв валідаційних характеристик методик кількісного аналізу методом стандарту внесено до загальної статті «2.2.N.2. Валідація аналітичних методик і випробувань»^N ДФУ 1.2.

Проведені дослідження дозволили валідувати ряд аналітичних методик кількісного визначення діючої речовини в субстанція та готових лікарських засобах найрозповсюдженими методами: рідинної хроматографії та абсорбційної спектрофотометрії. Практичне значення підтверджується актами впровадження ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров'я» від 17.11.10, ТОВ ХФП «Здоров'я народу» від 20.01.11, ВАТ «Хімфармзавод «Червона Зірка» від 11.01.11, ТОВ «Дослідний завод «ГНЦЛС» від 3.02.11, ТОВ фірми «Новофарм-Біосинтез» від 24.02.11, ПрАТ «Біофарма» від 16.02.11, АТ відкритого типу «Галичфарм» від 10.03.11, ВАТ «Київмедпрепарат» від 2.03.11.

Методики включено до аналітичної нормативної документації (АНД), дослідження з валідації були використані при розробці реєстраційних досьє.

Особистий внесок здобувача. Особисто здобувачем проведено пошук та аналіз даних наукової літератури вітчизняних та іноземних джерел із проблем стандартизації процедури валідації аналітичних методик кількісного визначення методом стандарту. Практично апробована експериментальна схема та розраховано критерії придатності методик кількісного визначення, однорідності дозування та розчинення таблеток амброксолу методом абсорбційної спектрофотометрії. Практично апробована експериментальна схема, розроблено й обґрунтовано критерії валідації методики кількісного визначення капсул флуконазолу методом рідинної хроматографії. Розроблено і валідовано методику кількісного визначення активності апротиніну. У ході вивчення робасності розроблені вимоги до придатності аналітичної системи кількісного визначення. Сформульовано висновки за кожним розділом дисертації.

Персональний внесок у всіх опублікованих із співавторами працях (Гризодуб О.І., Підпружников Ю.В., Леонтьєв Д.А., Доценко Т.М., Зволінська Н.М., Архіпова Н.М., Січкар Л.А., Комарова Ю.А.) полягає у проведенні експериментальних досліджень, обробці та оформленні результатів валідації та обговоренні результатів експериментів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на відкритій науково-практичній конференції молодих вчених та фахівців «Наукові досягнення в області створення лікарських засобів: технологія, аналіз, фармакологія» (Харків, ДП ДНЦЛЗ 2004), науково-практичній конференції «Проблеми синтезу біологічно активних речовин та створення на їх основі лікарських субстанцій» (Харків, НФаУ 2009), всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні аспекти медицини і фармациї - 2010» (Запоріжжя, ЗДМУ 2010).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 6 наукових праць, із них 3 статті (у провідних наукових фахових виданнях) та 3 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках друкованого тексту (обсяг основного тексту 130сторінки) і складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), об'єктів і методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини власних досліджень (розділи 3-6), загальних висновків, 9 додатків та списку використаних джерел.

Робота містить 46 таблиць, 13 рисунки. Список використаної літератури містить 163 джерела, у тому числі 98 - зарубіжних авторів.

Основний зміст роботи

У вступі викладено актуальність теми, мету та основні задачі досліджень, наукову новизну і практичне значення отриманих результатів.

В першому розділі наведено аналіз літературних даних щодо питань валідації аналітичних методів контролю якості ЛЗ. З огляду літератури свідчить, що при валідації методик кількісного визначення ЛЗ не зустрічається систематизованої процедури та науково обгрунтованих критеріїв придатності характеристик валідації, пов'язаних з вимогами до невизначеності результату аналізу фармацевтичних випробувань. Більшість рекомендацій стосовно валідації аналітичних методик кількісного визначення надаються для методу ВЕРХ. Однак автори мають велику розбіжність щодо оцінювання критеріїв прийнятності. Розглянуто запропоновані підходи до проведення експерименту, однак вони ґрунтуються тільки на принципі «здравого глузду», і не містять науково обґрунтованих підходів до інтерпретації результатів валідації. Це потребує розробку науково обґрунтованих стандартних процедур проведення валідації та критеріїв прийнятності.

В керівних документах надаються тільки загальні вимоги щодо оцінки невизначеності результатів аналізу, який не стосується специфіки фарманалізу. Таким чином, необхідно розробити цю процедуру для основних фармацевтичних кількісних випробувань.

У другому розділі описано об'єкти та методи досліджень, що використані в даній роботі.

У третьому розділі дисертації запропоновано підходи до стандартизації процедури валідації методик контролю якості лікарських засобів та сформульовано єдині критерії придатності валідаційних характеристик відповідно до фармакопейних вимог.

Загальні вимоги до невизначеності аналітичної методики. Максимально припустима повна відносна невизначеність методики аналізу лікарського засобу (Д_As %) пов'язана з допусками вмісту (± В%) аналізованої речовини співвідношеннями (ДФУ):

Субстанції:	;
Готові лікарські засоби: Кількісне визначення :	;
Розчинення та однорідність дозування:
де В -	симетричні допуски вмісту аналізованої речовини для готових лікарських засобів та перевищення над 100 % в нормуванні для субстанцій.

Специфічність. У випадку хроматографічних методик аналізу специфічність визначається ступенем розділення піків аналізованих речовин. У випадку неспецифічних методик аналізу (наприклад, спектрофотометрія) підтвердження специфічності складає у доказі того, що відносна систематична похибка (д_noise %), яку вносять допоміжні речовини (д_exc) і продукти розкладу (д_imp) у визначення аналізованої речовини, є незначущою у порівнянні з максимально припустимою невизначеністю аналізу (Д_As %). Зокрема, у випадку спектрофотометрії, було сформульовано наступний критерій: .

Стабільність випробовуваних розчинів. Перевірка стабільності випробовуваних розчинів та розчинів порівняння є одним з елементів дослідження робасності методики і повинна проводитись перед початком всіх інших валідаційних випробувань. Для цього вивчають залежність від часу аналітичних сигналів (оптична густина, висота або площа піку та ін.) в умовах проведення методики аналізу впродовж обраного проміжку часу (n_t точок).

Для отриманих величин сигналів методом спектрофотометрії нами було рекомендовано розраховувати середнє відносне стандартне відхилення (RSD_t %) та відносний довірчий інтервал ( _t %). Величина _t в умовах проведення методики аналізу впродовж обраного проміжку часу повинна бути незначуща у порівнянні з (max _As): ; . Такий підхід названо «доказуючим».

Виконання аналізу методом ВЕРХ потребує суттєво більше часу. Тому для ВЕРХ нами запропоновано використовувати «підтверджуючий» підхід, тобто порівнювати два незалежних результати аналізу. При цьому різниця між знайденим значенням знайдено/введено вмісту аналізованої речовини ( _R %) має відрізнятися між свіжоприготованим модельним розчином та через певний проміжок часу не більше як на Д_As: .

Нормалізовані координати. Концентрації та аналітичні сигнали (висота або площа піку, оптична густина та ін.) різних речовин можуть знаходитися у самих різних цифрових діапазонах, що призводить до необхідності розрахунку критеріїв для кожного конкретного випадку. У той же час, нас звичайно цікавить концентрації та аналітичні сигнали не у реальних величинах, а у відсотках до номінального значення, тобто, у так званих «нормалізованих» координатах. З практичної точки зору, саме так доцільно й представляти концентрації та аналітичні сигнали. Це дозволяє сформулювати єдині критерії, які пов'язані тільки з допусками вмісту, та не залежать від специфіки певних речовин.

Нормалізовані координати уводять наступним чином. C_i - концентрація аналізованої речовини в i-ому аналізованому розчині (або зразку), C^st - концентрація тієї ж речовини у розчині порівняння (вважається, що вона дуже близька до номінальної концентрації). A_i - аналітичний сигнал аналізованої речовини для i-ого аналізованого розчину, A^st - аналітичний сигнал тієї ж речовини для розчину порівняння. Тоді нормалізовані координати X_i и Y_i розраховують наступним чином: . При проведенні валідаційних досліджень величини X_i и Y_i мають ряд переваг перед вихідними величинами C_i , C^st, A_i , A^st :

1. Величини X_i и Y_i , незалежно від специфіки аналізованої речовини та методу аналізу (сигналу відгуку), завжди знаходяться у межах одного й того самого діапазону застосування методики аналізу в районі 100 %.

2. Кут нахилу прямої (b) завжди близький до 1. Вільний член прямої (a) незначуще (статистично або практично) відрізняється від 0, оскільки припускається застосовність методу стандарту. Це стандартизує уявлення графіку лінійної залежності та робить його наочним.

3. Пряма Y_i =b* X_i + a характеризується залишковим стандартним відхиленням SD_Y,rest . Зворотна лінійна залежність X_i = (1/b)* Y_ii + (-a/b) = b'*Y + a' характеризується залишковим стандартним відхиленням SD_X,rest . Вважаючи близькість куту нахилу прямої (b) до 1 та незначущість вільного члену (a), отримаємо:

3. Облако точок Y(X) у координатах Y - X можна характеризувати стандартним відхиленням SD_Y або SD_X . Так як середнє значення величин X_i та Y_i (та , відповідно) близькі до 100 %, величини SD_Y та SD_X є відносними (по відношенню до номінальних значень) стандартними відхиленнями та близькими один до одного, тобто:

; .

Виконання цього співвідношення дозволяє регламентувати коефіцієнт кореляції. Отже, використовуючи цей підхід, нами розроблено критерій що до R_c, який являє собою загальний випадок коефіцієнту кореляції.

Діапазон застосування аналітичної методики при валідаційних дослідженнях застосовується у відповідності до ДФУ.

Критерії прийнятності лінійної залежності. Залишкове стандартне відхилення S_o. Довірчий інтервал розкиду точок навколо прямої Yi = b* Xi + a дорівнює t(95%, g-2)* RSD_o та представляє собою довірчий інтервал невизначеності методики аналізу (Д_As), виходячи з цього пропонуються критерії:

Субстанції:
Готові лікарські засоби:

У випадку тестів «Однорідність вмісту» та «Розчинення» гранична невизначеність аналізу складає Д_As = 3 % (ДФУ), що відповідає формальним допускам вмісту В = 9.3 %. Дану величину пропонується використовувати для даних тестів у розрахунку вимог до критеріїв лінійної залежності.

Вільний член. Вільний член прямої характеризує систематичну помилку при аналізі методом стандарту. Запропоновано встановлювати вимоги до нього двох типів:

Статистично незначуща відмінність від нуля: величина a повинна бути менше довірчого інтервалу своєї невизначеності (g = 9):

Практично незначуща відмінність від нуля: якщо систематична похибка не перевищує mах невизначеність аналізу:

Дана нерівність оцінює вплив а на прикінці діапазону, тобто для «найгіршого» випадку. Вираз практичної незначущості застосовують тільки в тому випадку, коли не виконується критерій статистичної незначущості.

Запропоновано розраховувати загальний коефіцієнт кореляції R_c із співвідношення:

Якщо у дане рівняння підставити величини RSD_range, то отримаємо критичні (min припустимі) значення коефіцієнту кореляції R_c для різних випробувань, для 9 точок та різних меж вмісту (табл. 1).

Зручно проводити валідацію методики, яка придатна одночасно для проведення кількісного визначення, перевірки однорідності вмісту та тесту «Розчинення». У такому випадку для даних допусків вмісту (В) необхідно використовувати критерії прийнятності з максимально широкого діапазону застосування методики та найбільш критичних вимог до невизначеності результату аналізу. Розраховані критичні значення повної невизначеності методики аналізу та вимоги до параметрів лінійної залежності Y_i = b*X_i + a для різних випробувань, g = 9 точок та різних меж вмісту В наведені в табл. 1.

Прецизійність. Прецизійність запропоновано оцінювати з даних по вивченню лінійності.

Збіжність. Величини Z_i (знайдено/введено) характеризуються середнім значенням і стандартним відхиленням SD_Z, яке, враховуючи близькість величини до 100 %, фактично є відносним стандартним відхиленням. Тому методика аналізу у всьому діапазоні концентрацій характеризується довірчим інтервалом, рівним довірчому інтервалу одиничного значення Z: . Методика являється коректною, якщо для ?_As, розрахованої за даним співвідношенням, виконуються вимоги з табл. 1.

Внутрішньолабораторна прецизійність. Для методу УФ-спектрофотометрії запропоновано підхід, який можна назвати «доказуючим». Аналізують за методикою n зразків однієї й той самої серії досліджуваного препарату в m різних дні. Випробовування проводять різні аналітики, бажано на різному обладнанні. Оскільки всі отримані результати належать до однієї генеральної сукупності, тому для всіх результатів розраховують єдине середнє значення (Z_intra), відносне стандартне відхилення (RSD_intra %) та відносний довірчий інтервал (?_intra %):

.

Сформульовані вимоги: величина ?_intra не повинна перевищувати максимально припустиму невизначеність аналітичної методики.

Для оцінки внутрішньолабораторної прецизійності методом ВЕРХ запропоновано використовувати підхід, який можна назвати «підтверджуючим», тобто порівнювають два незалежних результати аналізу. Для використання цього підходу має повністю контролюватися невизначеність аналізу. Порівнюють середній результат аналізу (не менше ніж 3 проб) однієї серії препарату наприкінці терміну придатності, одержаний у два різні дні, аналіз проводять різні аналітики. Оскільки для випробуваного розчину препарату значення «введено» невідомо, порівняння двох середніх значень (_intra) проводять за формулою: .

Правильність. Методика не повинна мати значущої систематичної похибки. Це означає, що величина повинна незначуще відрізнятися від нуля. Сформульовані наступні критерії. Статистична незначущість: величина д не повинна перевищувати довірчий інтервал середнього значення , тобто, повинна виконуватись нерівність

Практична незначущість: Систематична похибка д є практично незначущою, якщо вона незначуща у порівнянні з фактичною невизначеністю аналізу:

Субстанції:	;
Готові лікарські засоби:	;

Прогноз повної невизначеності методики кількісного визначення. Для підтвердження коректності методики при відтворенні в іншій лабораторії необхідно прогнозувати граничну невизначеність методики аналізу. Повна невизначеність результатів аналізу, яка прогнозується, не повинна перевищувати maxД_As. Повну невизначеність, яка прогнозується, запропоновано розраховувати за формулою:

,

де _SP - невизначеність пробопідготовки;

_FAO - невизначеність вимірювань, що прогнозується;

_V,i - складова невизначеності, яка пов'язана з конкретною операцією пробопідготовки (взяття наважки, аліквоти, доведення до об'єму в мірної колбі та ін.), та виражена як однобічний відносний довірчий інтервал для рівня надійності 95 %. Нами сформульовано рекомендацію, щоб невизначеність пробопідготовки була незначущою у порівнянні з maxД_As. У протилежному випадку її необхідно враховувати при прогнозі загальної невизначеності методики.

Показано, що невизначеність кінцевої аналітичної операції _FAO потрібно розраховувати різними шляхами для спектрофотометричних та хроматографічних методів аналізу. У випадку хроматографічних методик доцільно виходити з граничного відносного стандартного відхилення паралельних хроматографувань, регламентованих розділом ДФУ «Придатність хроматографічної системи». У випадку спектрофотометричного аналізу при прогнозі _FAO слід використовувати величину (RSD_A = 0.52 %) відносного стандартного відхилення оптичної густини з вийманням кювети, отриману при численному міжлабораторному експерименті у рамках Програми професійного тестування лабораторій аналізу ЛЗ.

Враховуючи наявність випробовуваного розчину та розчину порівняння, а також рекомендації ДФУ про не менше 3 паралельних вимірювань оптичної густини з вийманням кювети для кожного розчину, нами запропоновані вимоги до FAO спектрофотометричного аналізу (1,645 - коефіцієнт Гаусса для однобічної імовірності 95% ):

.

Четвертий розділ дисертації присвячений практичному виконанню валідації методик кількісного визначення, контролю однорідності вмісту та розчинення таблеток амброксолу у відповідності за розробленою стандартизованою процедурою валідації для спектрофотометричних методик кількісного визначення методом стандарту.

Вибір амброксолу гідрохлориду в якості об'єкта дослідження пов'язаний з тим, що крім кількісного визначення, необхідно проводити також випробування «Однорідність вмісту» та «Розчинення». Всі три методики кількісного аналізу проводять за допомогою прямої спектрофотометрії за власним поглинанням амброксолу у 0.01 М розчині кислоти хлористоводневої за довжини хвилі 244 нм, що дозволяє провести для них одночасну валідацію.

Вимоги до повної невизначеності результатів аналізу (_As). Для випробування кількісного визначення (КВ) _As= 2.3 %, а для «Розчинення» (Р) та «Однрідність вмісту» (ОВ) _As = 3.0 %. Отже, для сумісної валідації обрані найбільш критичні вимоги 2.3 %. Критерій незначущості дорівнює 0.75.

Вимоги щодо прогнозованої невизначеності пробопідготовки (_Sp). Розрахована _Sp для різних методик становила: КВ та Р: Д_Sp=1.06 %, ОВ: Д_Sp=1.31 %. Тобто невизначеність пробопідготовки є значущою. Для прийняття рішення про коректність вищеназваних методик при відтворюваності їх у іншій лабораторії, необхідно враховувати _Sp при прогнозі до невизначеності Д_As.

Прогноз повної невизначеності методики. Повна невизначеність результатів аналізу, що прогнозується, не повинна перевищувати _As 2.3 % . _As, яка прогнозується, для випробування КВ, ОВ та Р не перевищує максимально припустиму невизначеність результатів аналізу 2.3 %. Методики коректні та за запропонованою пробопідготовкою і обладнанням, що відповідає вимогам ДФУ/GMP/прийнятної аналітичної практиці, повинні відтворюватись в іншій лабораторії.

Специфічність. Досліджено систематичну похибку (д_nois %), котру вносять допоміжні речовини та продукти розкладу. Всі домішки мають схожий з амброксолом хромофор, тому найдений методом ВЕРХ вміст домішок д_imp = 0.50 % буде відповідати їх відносному вкладу в оптичну густину при кількісному визначенні.

Для дослідження впливу допоміжних речовин вимірювали оптичну густину (А_blank) розчину плацебо та розчину порівняння (А_st). Було знайдено: А_blank = 0.00114; А_st = 0.7322. Вплив плацебо в сумарне поглинання препарату складає д_exc = 100•0.00114/0.7322 = 0.16 %. Оцінімо сумарний вплив фону. Розрахуємо: д_noise = д_exc + д_imp = 0.16 + 0.50 = 0.66 %. Отже, фонове поглинання є незначущим, тому методика характеризується достатньою специфічністю.

Робасність. За умов перевірки робасності нами було вивчено: стабільність розчинів у часі, вплив рН, різних реактивів, аналітиків (суб'єктивний фактор). Незначущість впливу реактивів, обладнання та суб'єктивного фактору були підтверджені при передачі методики. У табл. 2 надані результати дослідження впливу рН: різність оптичної густини розчинів, рН яких різниться на ±10 %.

У табл. 3 надані результати дослідження стабільності розчинів: довірчий інтервал вимірювань оптичної густини у часі не перевищує критерію незначущості.

Діапазон застосування. У відповідності до вимог ДФУ, діапазон застосування повинен бути: КВ (80-120) %, ОВ (70-130) %. У випадку тесту «Розчинення» діапазон застосування повинен бути не вужче ніж ± 20% абсолютних від нормованої величини розчинення. Тест «Розчинення» методики, що валідується, нормується - не менш 80 % (діапазон дорівнює (80-115) %), який відповідає діапазону застосування (60-135) %. Отже, для сумісної валідації ми обрали найширший діапазон (60-135) %.

Лінійність, правильність, прецизійність досліджена у межах діапазону застосування аналітичної методики (60 - 135) % від номінального вмісту на 9 модельних розчинах, які аналізували відповідно до АНД. Побудували графік лінійної залежності аналітичного сигналу від фактичної концентрації розчину в нормалізованих координатах. Для цього розрахували “введено” і “знайдено” отриманих результатів. Методом найменших квадратів розраховано параметри лінійної залежності: вільний член а, залишкове стандартне відхилення S₀, коефіцієнт кореляції r. За даними знайдено/введено (Z), отриманими при вивчені «Лінійність», розраховані валідаційні характеристики прецизійності та правильності у відповідності до розроблених нами критеріїв. У табл. 4 представлено отримані результати.

Випробування внутрішньолабораторної прецизійності проводили на 5 пробах однієї і теж самої серії препарату. Проаналізували кожну пробу (i) за АНД, в 3 різних дні, різні аналітики з різними реактивами та посудом.

Розрахували величини знайдено/введено (Z_i%), середнє значення , стандартне відхилення SD_intra., та відносний довірчий інтервал ?_intra,, %. Величина ?_intra становила 0.77 %, що не перевищує максимально припустиму невизначеність.

П'ятий розділ дисертації присвячений апробації схеми валідації та критеріїв прийнятності методики кількісного визначення флуконазолу у капсулах за розробленою стандартизованою процедурою методом рідинної хроматографії.

Як об'єкт дослідження ми вибрали капсули флуконазолу, протигрибковий засіб. Капсули флуконазолу мають різні дозування: по 0.05 г, 0.1 г або 0.15 г. Вміст флуконазолу в одній капсулі, у перерахунку на середню масу капсули, має бути відповідно: 10 %; 7.5 %; 5%. Вміст флуконазолу для всіх дозувань визначають в однакових умовах методом зворотно-фазової ВЕРХ в режимі градієнта, методом стандарту за однакової концентрації випробовуваних розчинів. Тому нами запропоновано проводити валідацію для всіх названих дозувань сумісно. Нормування вмісту флуконазолу для цих дозувань різне, тому вимоги щодо критеріїв валідації обрано з огляду найбільш критичних вимог до відхилення від номінального вмісту флуконазолу (± 5 %, для препарату “Флуконазол, капсули по 0.15 г”). Критерії прийнятності для валідації було розраховано у відповідності із цими вимогами: Д_As? B*0.32=1.6%.

Вимоги щодо прогнозованої невизначеності пробопідготовки. Невизначеність пробопідготовки, що прогнозується (_Sp), повинна бути незначущою у порівнянні з _As,, тобто менш, ніж 0.51 %. Розрахована _Sp для різних дозувань становила: 0.05 г: Д_Sp=0.44%, 0.1 г: Д_Sp=0.46%, 0.15 г: Д_Sp=0.49%, тобто є незначущою. Отже, невизначеність пробоподготовки можна не враховувати при прогнозі загальної невизначеності методики аналізу.

Специфічність. Для ВЕРХ нами було запропоновано наступне дослідження специфічності: доказ того, що на хроматограмі випробовуваного розчину на місці піків сполук, які аналізуються, немає піків плацебо і продуктів розкладу, або їх вплив є незначущим; доказ достатнього ступеня розділення піків аналізованих сполук із найближчими піками; доказ хроматографічної (у разі спектрофотометричного детектора - спектральної) чистоти самих цільових піків.

При дослідженні впливу плацебо слід показати, що на хроматограмі розчину плацебо повинні бути відсутніми піки, що співпадають за часом утримування із піком флуконазолу на хроматограмі розчину порівняння. У разі наявності таких піків, їх площа має бути незначущою у порівнянні _As,, тобто не перевищує 0.5 % середньої площі піків флуконазолу на хроматограмах розчинів порівняння. Запропоновані вимоги виконуються. Типові хроматограми наведені на рис. 1, 2.

При дослідженні впливу продуктів розкладу на хроматограмах розчинів плацебо, підданих стресовому впливу, на місці піка флуконазолу були відсутні піки, площа яких перевищує 0.51 % середньої площі піка флуконазолу на хроматограмах розчинів порівняння, тобто критерій незначущості систематичної похибки виконується.

При дослідженні впливу ступеню розділення та спектральної чистоти на хроматограмах модельних розчинів, підданих стресовому впливу, пік флуконазолу має розділятися з найближчим піком до базової лінії. Ступінь розділення має бути не менше 1.2. Пік флуконазолу є спектрально чистим, якщо кут показника спектральної чистоти менш, ніж граничне значення, розраховане для даної хроматограми програмним забезпеченням (фірма Waters, програмне забезпечення «Millenium», версія 3.1). Результати надані у табл. 5, 6.

Робасність. При вивченні робасності, нами було доведено стійкість хроматографічної системи (табл. 7), відтворюваність результатів при використанні іншої колонки; стабільність розчинів протягом 24 години. Варіювання умов хроматографування проводили у відповідності з ЕР таким чином: температуру термостатування колонки варіювали у межах (30 5)^оС, концентрацію ацетонітрилу у межах 2 %. При цьому, за розробленими нами критеріями, різниця меж знайденим значенням введено/знайдено вмісту флуконазолу у модельних розчинах не мала відрізнятися від 100 % більш ніж на 1.6 %. При дослідженнях вимоги щодо придатності хроматографічної системи витримувались.

Для підтвердження стабільності розчинів модельний розчин препарату хроматографували через 24 години в умовах АНД. Знайдене значення знайдено/введено флуконазолу на хроматограмах модельних розчинів відрізняється від 100 % на 0.7 %. Робасність підтверджена.

Лінійність, правильність, прецизійність досліджена у межах діапазону застосування аналітичної методики ± 20 % від номінального вмісту на 9 модельних розчинах, які аналізували відповідно до проекту АНД. Розраховано середні значення площ піків флуконазолу (S_i) для кожного із модельних розчинів, а також значення “введено” відносно концентрації розчину порівняння (С_i/Сst), “знайдено” відносно площі піка розчину порівняння (S_i/Sst). Побудовано графік лінійної залежності аналітичного сигналу від фактичної концентрації розчину у нормалізованих координатах та розраховано параметри лінійної залежності. За даними знайдено/введено, отриманими при вивчені «Лінійність», розраховані валідаційні характеристики прецизійності та правильності. У табл. 8 надано отримані результати.

Для підтвердження внутрішньолабораторної прецизійності порівнювали середній результат аналізу 3-х проб однієї серії препарату наприкінці терміну придатності, одержаний у різні дні, аналіз проводили різні аналітики. Оскільки для випробуваного розчину препарату значення «введено» невідомо, порівняння двох середніх значень (_intra) проводили за формулою . За отриманими даними, різниця між середніми значеннями результатів аналізу на хроматограмах випробовуваного розчину препарату наприкінці терміну придатності у різні дні (_intra), відповідала критеріям.

Придатність хроматографічної системи. Придатність хроматографічної системи розраховували за хроматограмами розчинів порівняння, які отримали у випробуваннях на специфічність, лінійність і внутрішньолабораторну прецизійність. Розрахували для середніх даних із паралельних хроматограм: відносне стандартне відхилення, коефіцієнт симетрії, ефективність хроматографічної колонки. Отже, до проекту АНД введено обґрунтовані вимоги щодо придатності хроматографічної системи, підтверджені результатами валідації.

Шостий розділ дисертації присвячений вивченню застосування розробленої схеми та критеріїв валідації для кінетичного методу визначення активності апротиніну.

Ферментна активність трипсину визначається по реакції розкладу субстрату, внаслідок чого оптична густина розчину субстрату у часі зменшується. Активність апротиніну визначається по інгібуванню активності трипсину відомої концентрації. Інгібіторну активність апротиніну розраховують за різницею між первинною і остаточною активністю трипсину (тобто за зменшенням швидкості змінення оптичної густини розчину субстрату). Активність субстанції виражають в одиницях дії апротиніну за ЕР (ЄФО), яка має бути не менш ніж 3.0 ЄФО. Активність ЛЗ виражають в антитрипсинових одиницях (АТрО), яка нормується в межах ±20%.

Вимоги до повної невизначеності результатів аналізу (_As) встановлені у відповідності до вимог монографії ЕР на субстанцію апротинін: _As? 10 %, як більш критичні, ніж для ЛЗ “Апротинін, порошок для приготування ін'єкцій”. Критерій незначущості дорівнює 3.2 %.

Вимоги щодо прогнозованої невизначеності пробопідготовки. (_Sp) при аналізі субстанції та ЛЗ становила 1.05 % та є незначущою у порівнянні з _As.

Специфічність. Однією з основних характеристик природних інгібіторів є специфічність взаємодії з ферментами, тому специфічність підтверджується тільки у випадку ЛЗ: відсутність впливу допоміжної речовини. Різниця між активністю субстанції апротиніну й активністю апротиніну у модельному розчині препарату, становили 6.7 % і є значущою у порівнянні з вимогами:

_As ·?14.14 %.

При дослідженні робасності підтверджена стабільність розчинів (випробовуваного розчину, розчину порівняння трипсину і розчину субстрату) впродовж 2 годин - за регламентацією в АНД - у розділі “Лінійність” (всі модельні розчини готуються водночас, а потім аналізуються послідовно). Відношення введено/знайдено останнього з проаналізованих розчинів (активність 125 % від номінального значення) становило 100,2 %. Різниця від номінального вмісту 0,2 % менше за _As, що підтверджує робасність.

У ході вивчення робасності розроблені вимоги до придатності аналітичної системи кількісного визначення даного випробовування: для обраної ділянки лінійної залежності оптичної густини від часу, яку використовують у розрахунках активності, як для розчину порівняння, так і для досліджуваного розчину, коефіцієнт кореляції r повинен бути не менш 0.9990, як підтвердження ступеня не випадковості лінійного зв'язку оптичної густини і часу. В розрахунках вмісту апротиніну запропоновано використовувати кутовий коефіцієнт b лінійної залежності для більш точної статистичної оцінки зміни активності апротиніну в заданий відрізок часу.

Діапазон застосування приймається від 75% до 125% для забезпечення лінійності в межах нормування ± 20 % від номінального вмісту.

Лінійність, правильність, прецизійність. При досліджуванні лінійності готували 5 модельних розчинів у межах діапазону застосування в умовах методики. Для кожного з модельних розчинів визначали активність апротиніну у кюветі, у відсотках від номінальної активності. За номінальну активність у кюветі приймають теоретично розраховану активність, яка повинна бути для субстанції з даною активністю, зазначеною у сертифікаті, з урахуванням розведень та використанні номінальної наважки субстанції, які вказані в АНД. Побудовано графік лінійної залежності активності апротиніну у кюветі від фактичної концентрації розчину в нормалізованих координатах. Для цього розрахували “введено” і “знайдено” отриманих результатів.

За тих обставин, що стабільність розчину субстрату регламентується впродовж 2 год, правильність та прецизійність вивчали окремо на 6 модельних розчинах з активністю аналізованої речовини, близьким до номінального. Результати розрахунків наведено у табл. 9.

Внутрішньолабораторна прецизійність. Нами було досліджено по 4 зразки, приготованих із однієї серії субстанції апротиніну, в два різні дні із використанням різного посуду, аналіз проводили різні аналітики. Різниця між середнім значенням результатів аналізу субстанції в різні дні не повинна відрізнятися більше ніж на (_intra)?_As·/ = 7,1 % (в кожен день проводять 4 паралельних визначення). Різниця становила 0 %. Вимоги доведені.

Загальні висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та вирішення наукової задачі, що виявляється у розробці стандартизованої процедури проведення валідації методик кількісного визначення лікарських засобів методом стандарту.

1. Вперше обґрунтовано розрахунок критеріїв прийнятності для валідаційних характеристик з урахуванням вимог до невизначеності методики аналізу кількісного вмісту фармакопейних випробувань.

2. Розроблено раціональну схему проведення валідації для одночасного оцінювання характеристик лінійності, прецизійності та правильності.

3. Науково обґрунтовано застосування нормалізованих координат для оцінювання спільності та наочності критеріїв, що дозволяє сформулювати єдині критерії, які пов'язані тільки з допусками вмісту, але не залежать від специфіки конкретних речовин.

4. Вперше створено підходи проведення валідації методики, яка одночасно придатна для випробувань кількісного визначення, однорідності вмісту та розчинення відповідно до найширшого діапазону застосування та більш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу.

5. Із застосуванням розроблених підходів здійснено валідацію методик кількісного визначення, контролю однорідності вмісту та розчинення таблеток амброксолу методом спектрофотометрії.

6. Із застосуванням розроблених підходів здійснено валідацію методики кількісного визначення флуконазолу у капсулах з різним дозуванням методом рідинної хроматографії.

7. Із застосуванням розроблених підходів здійснено валідацію методики кількісного визначення інгібіторної активності апротиніну у субстанції та ЛЗ.

8. Валідовані методики включено до АНД на вітчизняні препарати. Результати валідації підтверджують, що методики відповідають своєму призначенню - коректно визначати якість ЛЗ.

9. Науково обґрунтовані підходи до схеми проведення валідації та критеріїв валідаційних характеристик методик кількісного аналізу методом стандарту внесено до загальної статті «2.2.N.2. Валідація аналітичних методик і випробувань»^N ДФУ 1.2.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Критерии для параметров линейной зависимости при проведении валидации аналитических методик по ГФУ / А.И. Гризодуб, Д.А. Леонтьев, Т.Н. Доценко, Н.В. Денисенко // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки і практики: Зб.наук.ст.- Запоріжжя: Видавництво ЗДМУ, 2003.- Випуск Х.- С. 30-32. (Особистий внесок полягає в аналізі та інтерпретації отриманих результатів).

2. Воспроизводимость фармакопейных спектрофотометрических методик количественного определения лекарственных средств в разных лабораториях./ А.И. Гризодуб, Н.Н. Зволинская, Н.Н. Архипова, Д.А. Леонтьев, Н.В. Денисенко, Т.Н. Доценко // Фармаком. - 2004. - № 2 - С. 20-34. (Особистий внесок полягає в плануванні, проведенні та обробці даних експерименту).

3. Стандартизованная процедура методик количественного анализа лекарственных средств методом стандарта / А.И. Гризодуб, Д.А. Леонтьев, Н.В. Денисенко, Ю.В. Подпружников // Фармаком. - 2004. - № 3. - С. 3-17. (Особистий внесок полягає в плануванні, проведенні та обробці експериментальних досліджень).

4. Валідація кількісного визначення ферментної інгібуючої активності апротиніну/ О.І. Гризодуб, Д.А. Леонтьєв, Н.В. Денисенко, Л.А. Січкар // Проблеми синтезу біологічно активних речовин та створення на їх основі лікарських субстанцій: Матер. Укр. наук.-практ. конф., присвяч. пам'яті д.х.н., проф. П.А. Петюніна (до 95-річчя з дня народження). - Харків: Видавництво НФаУ, 2009. - С. 52-53.

5. Валідація кількісного визначення флуконазолу у капсулах методом рідинної хроматографії / Н.В. Денисенко, Д.А. Леонтьєв, Ю.А. Комарова, О.І. Гризодуб // Фармаком. - 2010. - № 1. - С. 74-84. (Особистий внесок полягає в плануванні та обробці експериментальних досліджень, узагальнені одержаних результатів і написанні статті).

6. Валидация количественного определения капсул флуконазола методом жидкостной хроматографии / А.И. Гризодуб, Д.А. Леонтьев, Н.В. Денисенко, Ю.А. Комарова // Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики 2010: Тези доповідей. - Запоріжжя: Видавництво ЗДМУ, 2010. - Т. 28. - С. 90-91.

АНОТАЦІЯ

Денисенко Н.В. Метрологічні аспекти валідації методик кількісного визначення лікарських засобів методом стандарту - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 - стандартизація та організація виробництва лікарських засобів. - Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», Харків, 2011.

Дисертація присвячена стандартизації процедури проведення валідації методик кількісного визначення лікарських засобів методом стандарту.

Вперше обґрунтовано розрахунок критеріїв прийнятності для валідаційних характеристик з урахуванням фармакопейних вимог до невизначеності методик.

Запропоновано застосування нормалізованих координат, що дозволяє сформулювати єдині критерії, які пов'язані тільки з допусками вмісту, але не залежать від специфіки конкретних речовин.

Розроблено раціональну стандартизовану процедуру проведення валідації для одночасного оцінювання характеристик лінійності, прецизійності та правильності.

Вперше створено підходи проведення валідації методики, яка одночасно придатна для кількісного визначення, однорідності вмісту та тесту на розчинення, виходячи з найширшого діапазону застосування та найкритичніших вимог до критеріїв прийнятності.

Проведені дослідження дозволили валідувати ряд аналітичних методик кількісного визначення діючої речовини в готових лікарських засобах найрозповсюдженими методами: ВЕРХ та абсорбційної спектрофотометрії. Результати досліджень були використані при розробці реєстраційних досьє. Методики включено до нормативної документації.

Науково обґрунтовані підходи до схеми проведення валідації та критеріїв валідаційних характеристик методик кількісного аналізу методом стандарту внесено до загальної статті «2.2.N.2. Валідація аналітичних методик і випробувань»^N ДФУ 1.2.

Ключові слова: контроль якості, валідаційні характеристики, критерії прийнятності, невизначеність аналізу.

АННОТАЦИЯ

Денисенко Н.В. Метрологические аспекты валидации методик количественного определения лекарственных средств методом стандарта - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 - стандартизация и организация производства лекарственных средств. - Государственное предприятие «Государственный научный центр лекарственных средств и изделий медицинской продукции», Харьков, 2011.

Аналитический контроль качества лекарственных средств обеспечивается на основании экспериментального доказательства того, что методика пригодна для решения поставленных задач, то есть валидации методики.

Диссертационная работа посвящена стандартизации процедуры проведения валидации и расчету критериев валидационных характеристик методик количественного определения лекарственных средств методом стандарта.

На основании проведенного анализа требований ведущих фармакопей мира и руководящей документации касательно валидации аналитических методик, показана необходимость сформулировать и стандартизовать единые критерии приемлемости валидационных характеристик. Впервые обосновано расчет критериев приемлемости для валидационных характеристик с учетом требований к неопределенности методики фармацевтического анализа в соответствии с фармакопейными требованиями.

Разработана рациональная стандартизированная процедура проведения валидации для одновременного оценивания характеристик линейности, прецизионности и правильности.

Научно обосновано использование нормализованных координат для оценки единства и наглядности критериев, что позволяет сформулировать единые критерии, которые связаны только с допусками содержания, но не зависят от специфики конкретных веществ.

Впервые созданы подходы проведения валидации методики, которая одновременно пригодна для количественного определения, однородности содержания и теста на растворение исходя из самого широкого диапазона применения и самых критических требований к максимально допустимой неопределенности методики анализа.

На примере валидации методик количественного определения амброксола гидрохлорида, флуконазола и активности апротинина в готовых лекарственных формах апробирована корректность применения стандартизованной процедуры для метода абсорбционной спектрофотометрии и жидкостной хроматографии.

...