Біохімічні особливості індукованого низькодозовим опроміненням пухлинного росту та його інгібування кумариновими похідними урацилу

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

03.00.04. - Біохімія

АВТОРЕФЕРАТ на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Біохімічні особливості індукованого низькодозовим опроміненням пухлинного росту та його інгібування кумариновими похідними урацилу

Копильчук Галина Петрівна

Чернівці-2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії та біотехнології Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор

Марченко Михайло Маркович,

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, завідувач кафедри біохімії та біотехнології, декан факультету біології, екології та біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри біохімії, директор ННЦ «Інститут біології»;

доктор біологічних наук, професор

Сибірна Наталія Олександрівна

Львівський національний університет імені Івана Франка, завідувач кафедри біохімії;

доктор біологічних наук, професор

Столяр Оксана Борисівна

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка,

керівник науково-дослідної лабораторії порівняльної біохімії і молекулярної біології.

Захист відбудеться «01» червня 2011 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича за адресою: 58012, м. Чернівці,

вул. Лесі Українки, 25, ауд. 81.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: м. Чернівці, вул. Лесі Українки, 23.

Автореферат розісланий « » 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доцент Легета У.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Зважаючи на те, що вже тривалий час значна частка онкологічних захворювань виникає та протікає в умовах підвищеного фонового рівня радіації (Сидорчик Е., Бурлака А., 2000), актуальним видається дослідження пухлинного росту в організмі за дії низькодозового іонізуючого опромінення, канцерогенний потенціал якого реалізується через посилення вільнорадикальних процесів (Михайлов В. и др., 2003; Bianchi N., 2010; Ishikawa K. et al., 2008; Modica-Napolitano J., Sing K., 2004). Ескалація продукування АФК у пухлині, будучи джерелом мутацій і генетичної нестабільності, визначає метаболічні переваги малігнізованих клітин в організмі та виконує роль ендогенного промотора пухлинної прогресії (Juranek I., Bezek S., 2005; Valko M. et al., 2003; Wu L. et al., 2004; Zhou Y. et al., 2003). З огляду на автономність росту нео- плазми в організмі, попереднє опромінення якого викликає розвиток адаптивної відповіді та перерозподіл метаболітів (Михайлов В.и др., 2003; Сидорчик Е., Бурлака А., 2000; Benhar M. et al., 2001; Chiou C. et al., 2003; Senthil K. et al., 2004; Wu L. et al., 2004), стає зрозумілим, що зміни в попередньо опроміненому організмі з пухлиною не можуть бути прогнозовані простою екстраполяцією результатів досліджень метаболічних змін, які виникають під час росту новоутворення чи після дії радіації.

Знання біохімічних закономірностей злоякісного росту в організмі, що зазнав дії попереднього низькодозового іонізуючого опромінення, відкриває нові можливості дослідження природи онкогенезу та розробки раціональних принципів його інгібування.

Вирішення проблем низької селективності дії та високої загальної токсичності сучасних антибластичних препаратів (Богуш Е. и др., 2001, Checkhun V., 2008) здійснюється шляхом хімічної модифікації їх структури та розробки векторних систем доставки. Враховуючи високий антиканцерогенний потенціал похідних урацилу (Бычков М., 1996, Богуш Т. и др., 2000, Вінник Ю. та ін., 2001) та широкий спектр біологічних властивостей кумаринів поряд з їх низькою гепатотоксичністю для людини (Vassalo J.et al., 2004), перспективним видається створення протипухлинних препаратів на основі кумаринових похідних урацилу, до яких належить розроблений нами й інкапсульований у ліпосому 5-(5',6'-бен-зокумароїл-3')-метиламіноурацил гідробромід (БКУ). Використання ліпосом як вектора доставки лікарских препаратів до мішені їх дії, завдяки їхній природній спорідненості з ліпідними компонентами клітинних мембран, забезпечує високий ступінь акумуляції антибластичного агента в трансформованій тканині та зниження його загальної токсичності (Кулик Г. и др., 2009; Kawasaki E., Player A., 2005).

Викладений вище стан проблеми зумовив формулювання мети та завдань даної дисертаційної роботи.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами наукових держбюджетних тем кафедри біохімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича. Дисертантка була одним із виконавців тем: «Дослідження захисних систем організмів у нормі та вражених карциномою Герена при дії опромінення та різних видів хімічних агентів» (1999-2002 рр., № д/р 0197U014415), «Біохімічні особливості онкогенезу при опроміненні та застосуванні протипухлинних комплексів» (2003-2005 рр., № д/р 0102U004994), «Системний вплив злоякісних новоутворень на біохімічні характеристики органів попередньо опромінених пухлиноносіїв» (2006-2008 рр., № д/р 0106U001452), «Метаболічна корекція нанобіотехнологічними препаратами наслідків дії малих доз радіації та пухлинного росту» (2009-2010 рр., № д/р 0109 U002246), а також кафедральних наукових тем «Пошук, розробка та рекомендації комплексних природних радіопротекторних та протипухлинних засобів для корекції захисних систем організмів, вражених низькими дозами радіації та при канцерогенезі (№ д/р 0100U005500), «Біохімічна адаптація організмів за умов дії стресорних факторів різної природи» (№ д/р 0103U004526), «Біохімічні особливості онкогенезу та його корекція речовинами природного та синтетичного походження» (№ д/р 0103U012349).

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - з`ясування біохімічних особливостей пухлинного росту в організмі тварин за умов їх попереднього фракціонованого низькодозового опромінення та перспективності використання кумаринових похідних урацилу як антибластичних засобів.

Для досягнення мети поставлені наступні завдання:

визначити інтенсивність росту трансплантованої карциноми Герена в організмі щурів, які зазнали дії фракціонованого низькодозового опромінення;

дослідити взаємозв`язок інтенсивності генерації супероксидного аніон-радикала зі ступенем фрагментації мітохондріальної ДНК (мтДНК), окислювальної модифікації мітохондріальних білків і рівнем сукцинатдегідрогеназної та АТРазної активностей у клітинах печінки та карциноми Герена, трансплантованої після фракціонованого низькодозового опромінення організму тварин;

з`ясувати структурно-функціональні зміни хроматину клітин печінки та карциноми Герена, трансплантованої після фракціонованого низькодозового опромінення організму тварин, за рівнем окислювальної модифікації ядерних білків і ступенем їх протеолізу, інтенсивністю включення [3H]-тимідину в ДНК, [3Н]-уридину в РНК і співвідношенням частки транскрипційно активного та репресованого хроматину, ступенем фрагментації ядерної ДНК;

оцінити функціональний стан детоксикаційної системи клітин печінки щурів-пухлиноносіїв за величиною ферментативних активностей системи цитохрому Р-450 та глутатіонтрансферази (КФ 2.5.1.18) мікросомної фракції;

визначити протипухлинну здатність неліпосомної та ліпосомної форм 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду;

дослідити біохімічні процеси, які лежать в основі протипухлинної активності 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду;

оцінити функціональний стан детоксикаційної системи клітин печінки щурів-пухлиноносіїв при введенні неліпосомної та ліпосомної форм БКУ за величиною ферментативних активностей системи цитохрому Р-450 і глутатіонтрансферази мікросомної фракції, а також визначити рівень аспартат- (АсТ, КФ 2.6.1.1), аланін- (АлТ, КФ 2.6.1.2) і г-глутамілтрансферазних (ГГТ, КФ 2.3.22) активностей у сироватці крові.

Об`єкт дослідження - радіаційно індуковані метаболічні зміни в злоякісно трансформованих і умовно нормальних клітинах in vivo.

Предмет дослідження - біохімічні зміни в субклітинних фракціях на різних стадіях пухлинного росту.

Методи дослідження - біохімічні, фізико-хімічні, радіобіологічні, експериментальної онкології та статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше експериментально обгрунтовано біохімічні особливості інтенсифікації росту трансплантованого злоякісного новоутворення в організмі тварин, які зазнали дії попереднього фракціонованого низькодозового опромінення.

Встановлено, що етап інтенсивної пухлинної прогресії в попередньо опроміненому організмі супроводжується посиленнням генерації супер-оксидного аніон-радикала в мітохондріях клітин неоплазми, суттєвим підвищенням ступеня фрагментації мтДНК і окислювальної модифікації мітохондріальних білків поряд зі зниженням рівня фрагментованої ядерної ДНК і активацією процесів реплікації та транскрипції.

Показано, що дія на організм попереднього опромінення та злоякісного новоутворення інтенсифікує метаболічні процеси, які визначають поглиблення дисфункцій детоксикаційних систем, аеробного енергозабезпечення та зниження транскрипційної активності хроматину клітин печінки порівняно з неопроміненими пухлиноносіями, що проявляється вже на латентній стадії росту карциноми Герена. На термінальних етапах онкогенезу дія попереднього фракціонованого низькодозового опромінення на організм тварин-пухлиноносіїв нівелюється.

Доведено, що протипухлинний ефект 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду реалізується через посилення процесів генерації супероксидного аніон-радикала в мітохондріях та інтенсифікацію вільнорадикального пошкодження біомолекул, а також шляхом його безпосередньої взаємодії з ядерною ДНК, наслідком чого є структурно-функціональні порушення хроматину клітин неоплазми.

Практичне значення роботи. Отримані результати розширюють уявлення про біохімічні особливості пухлинного росту з позицій метаболічної взаємодії злоякісно трансформованих та умовно нормальних клітин в попередньо опроміненому низькодозовою радіацією організмі тварин і можуть бути використані для розробки ефективних антибластичних засобів із низьким рівнем токсичності.

В роботі продемонстровано перспективність використання кумаринових похідних урацилу як протипухлинних засобів і отримано патент на метод синтезу 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду, склад та режим введення його ліпосомної форми.

Встановлені біохімічні особливості пухлинного росту за умов введення хімічного засобу 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду та методичні підходи модуляції онкогенезу з його використанням дозволяють створити базову концепцію щодо механізму протипухлинної дії кумаринових похідних урацилу. детоксикаційний урацил опромінення пухлинний

Запропонований спосіб введення та оптимізований компонентний склад ліпосом використовуються для зниження гепатотоксичності поряд із підвищенням протипухлинної активності експериментальних антибластичних засобів у системі in vivo в наукових дослідженнях співробіт-ників і магістрантів кафедри біохімії та біотехнології Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича.

Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес підготовки магістрів біохімії під час читання спецкурсів кафедри біохімії та біотехнології «Функціональна біохімія», «Біохімічна трансформація ксенобіотиків», «Канцерогенез», «Наноструктури в біохімії».

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає в здійсненні інформаційного пошуку та проведенні аналізу наукової літератури за темою дисертації; визначенні завдань щодо дослідження функціональної активності хроматину та мітохондрій, проведенні низки експериментальних досліджень функціонального стану печінки за умов злоякісного росту та за дії антибластичного хімічного засобу, інтерпретації результатів і підготовці їх до публікації у співавторстві. Дисертантом особисто сформульовані основні положення та висновки роботи. Концепція дисертації розроблена спільно з науковим консультантом.

При спільному виконанні дослідів зі співробітниками кафедри біохімії та біотехнології Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича співвиконавці наводяться як співавтори відповідних публікацій. Штам карциноми Герена люб'язно наданий Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Експериментальні дослідження з використанням [3H]-тимідину та [3H]-уридину проводились на базі кафедри біохімії Київ-ського національного університету імені Тараса Шевченка відповідно до угоди про співпрацю.

Синтез хімічного засобу 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду здійснено в лабораторії кафедри органічної та фармацевтичної хімії Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи представлено на: VІІI Українському біохімічному з`їзді (Чер-нівці, 2002), міжнародних наукових конференціях “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Минск, 2004), «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине» (Минск, 2004), 31th FEBS Congress “Molecules in Health and Disease” (Istanbul, 2006), V з`їзді з радіаційних досліджень (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность, Москва, 2006), IХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІІ з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), IV міжнародній науково-практичній конференції «Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения (Северск-Томск, 2007), 6 Parnas conference (Краків, 2007), Всеукраїнській конференції «Акту-альні проблеми біохімії та біотехнології» (Київ, 2007), ІХ Міжнародній конференції онкологів України «Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології» (Київ, 2008), Х Українському біохімічному з`їзді (Одеса, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 42 статті в наукових фахових виданнях, отримано 1 патент на винахід та 14 тез доповідей у матеріалах українських біохімічних з`їздів, вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 303 сторінках друкованого тексту (загальний обсяг - 241 сторінок), містить 115 рисунків та 2 таблиці. Структура дисертації: зміст, перелік умовних позначень, вступ, огляд літератури, матеріали та методи, результати та їх обговорення, узагальнення, висновки, список використаних джерел (592 посилання).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У розділі наводяться відомості вітчизняної та зарубіжної наукової літератури стосовно ефектів дії низькодозового іонізуючого опромінення та участі активних форм кисню в реалізації його канцерогенного потенціалу. Особлива увага приділяється мітохондріям як продуцентам супероксидних радикалів; розглядаються питання функціональних взаємозв`язків між органами за умов розвитку неопластичного процесу в організмі. Систематизовано дані літератури стосовно підходів до терапії онкозахворювань.

Матеріали та методи досліджень

Дослідження проводили на самках білих безпородних щурів масою 110-130 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Маніпуляції з експериментальними тваринами проводили з дотриманням вимог «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та наукових цілей» (Страсбург, 1986) і «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (І національний конгрес з біоетики, Київ, 2001).

Модель дослідження злоякісного росту на фоні попереднього фракціонованого опромінення організму щурів низькими дозами радіації передбачала поділ експериментальних тварин на групи:

інтактні щури, які складали групу контролю (K);

щури з трансплантованою карциномою Герена (П);

тварини, які зазнали дії фракціонованого низькодозового опромінення (Р);

щури, яким після дії фракціонованого низькодозового опромінення трансплантували карциному Герена (Р+П).

Опромінення проводили протягом семи діб через 24 години щоденно в дозі 36,12·10-4 Кл/кг (13 сГр) при потужності дози 2,58·10-4 Кл/(кг·с) (0,93 сГр/с). Карциному Герена трансплантували на наступний день після припинення опромінення шляхом підшкірного введення в ділянку стегна 0,5 мл 30 % суспензії пухлинних клітин у фізіологічному розчині. Евтаназію тварин здійснювали на 7-у (латентна стадія пухлинного росту), 14-у (логарифмічна стадія пухлинного росту) та 21-у (термінальна стадія пухлинного росту) доби після імплантації карциноми Герена.

З метою дослідження протипухлинної активності 5-(5?,6-бензо-кумароїл-3?)-метиламіноурацил гідроброміду додатково формували групи тварин:

щури з карциномою Герена, яким вводили 5-(5?,6?-бензокумароїл-3?)-метиламіноурацил гідробромід (П+БКУ);

щури-пухлиноносії, яким вводили ліпосомну форму протипухлинного засобу 5-(5?,6?-бензокумароїл-3?)-метиламіноурацил гідроброміду (П+лБКУ);

щури-пухлиноносії, які отримували суспензію фосфатидилхолі-нових ліпосом за дві години до введення ліпосомного протипухлинного засобу 5-(5?,6?-бензокумароїл-3?)-метиламіноурацил гідроброміду (Л+лБКУ).

Суспензію фосфатидилхолінових ліпосом, хімічний засіб БКУ та його ліпосомну форму вводили щоденно через 24 години per os, починаючи з 7-ї доби після трансплантації карциноми Герена з розрахунку 6 мг хімічного засобу та 100 мг фосфоліпіду на 1 кг маси тіла тварини.

Протипухлинну активність БКУ оцінювали за величиною гальмування росту пухлини (ГРП) та збільшення тривалості життя (ЗТЖ) щурів у дослідних групах.

Для приготування бішарових ліпосом використовували суміші спиртових розчинів фосфатидилхоліну та холестеролу в мольному співвідношенні 7:3 та 9:2.

Субклітинні фракції отримували методом диференційного центрифугування. Хроматин виділяли за Уманським (Уманский С. и др., 1975). Виділення ДНК проводили за стандартним фенольним методом (Херрингтон С., Макги Дж., 1999); РНК - за Шмідтом і Тангаузером у модифікації Трудолюбової (Трудолюбова М., 1977). ДНКазні активності (3.1.21.1, 3.1.22.1) визначали за (Мозжухина Т., Литошенко А., 1996).

Електрофорез ДНК проводили в агарозному гелі (Херрингтон С., Макги Дж., 1999). У ролі маркерів використовували препарати ДНК фага л, отримані при розщепленні рестриктазами EcoRI та HindIII, а також препарати Gene RulerТМ DNA Ladder Mix („MBI Fermentas”, Литва). Електрофорез білків проводили в ПААГ за методом Laemmli. Гелі сканували на апараті „GelDoc 2000” та аналізували з використанням програми „Quantity One” („Bio-Rad”, США).

Про інтенсивність реплікації судили за включенням [3Н]-тимідину (питома радіоактивність 3,15 ТБк/ммоль, «Amersham Biosciences», Велика Британія); про інтенсивність транскрипції - за включенням [3Н]-уридину (питома радіоактивність 1,55 ТБк/ммоль).

Утворення супероксидного аніон-радикала реєстрували за допомогою теста з нітросинім тетразолієм (НСТ) (Костенко В., Цебржинський О., 2000). Виділення мітохондріальних білків проводили за (Kitagawa Y., Sugimoto E., 1980). Інтенсивність окислювальної модифікації протеїнів оцінювали за рівнем їх карбонілювання (Дубинина Е. и др., 1995) та вмістом білкових сульфгідрильних груп (Murphy M., Kehrer P., 1989).

Активність системи мікросомних ферментів клітин печінки оцінювали за величиною n-гідроксилазної та N-деметилазної активностей цитохрому Р-450 (Орехович В., 1977). Визначення глутатіонтрансфе-разної активності проводили за початковою швидкістю утворення кон'югату відновленого глутатіону (GSH) із субстратом 1-хлор-2,4-ди-нітробензолу (ХДНБ) (Власова С., 1990). Аланін-, аспартат- і г-глу-тамілтрансферазні активності визначали спектрофотометрично (Камышников В., 2000).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Excel, використовуючи t-критерій Ст'юдента (Лакин Г., 1990).

Результати досліджень та їх обговорення

Інтенсивність росту карциноми Герена, трансплантованої після фракціонованого низькодозового опромінення організму тварин. Нами встановлено, що ефект дії фракціонованого низькодозового опромінення організму щурів, яке передувало трансплантації карциноми Герена, виявляється в інтенсифікації пухлинного росту на латентній та логарифмічній стадіях із нівелюванням його індукуючого впливу на термінальних етапах онкогенезу. Поява пухлинного зародка в організмі попередньо опромінених тварин прискорюється на три доби порівняно з неопроміненими (рис.1).

Очевидно, що наведені вище факти інтенсифікації росту злоякісного новоутворення в попередньо опроміненому низькими дозами радіації організмі зумовлені метаболічними порушеннями, які в першу чергу індукують утворення токсичних продуктів вільнорадикального окислення, що розглядаються як ендогенні промотори канцерогенезу (Oberley T., 2002; Benhar M., 2001).

Інтенсивність генерації супероксидного аніон-радикала та струк-турно-функціональні зміни мтДНК і білків мітохондріальної фракції карциноми Герена попередньо опромінених тварин. Аутоокислення компонентів мітохондріального електронотранспортного ланцюга та робота системи цитохрому Р-450 ендоплазматичного ретикулуму розглядаються як основні джерела супероксидного аніон-радикала в клітині (O2-) (Войеков В., 2002; Серебровська Т. та ін., 1999).

Нашими дослідженнями встановлено, що ріст карциноми Герена в попередньо опроміненому організмі характеризувався посиленням генерації супероксидного аніон-радикала в мітохондріальній фракції пухлини на латентній та логарифмічній стадіях. Водночас рівень генерування O2- мікросомною фракцією клітин новоутворення статистично не відрізнявся від рівня аналогічних показників у неопромінених пухлиноносіїв (рис. 2). Очевидно, що в пухлинній тканині, яка розвивається в опроміненому організмі саме мітохондріальна фракція виявляється основним сайтом продукування АФК.

За умов інтенсифікації генерації АФК в першу чергу пошкоджуються молекулярні структури мітохондрій (Bergamini C. et al., 2004; Wei Y. et al., 2005).

Особливо чутливою мішенню вважається мітохондріальна ДНК (Aral C. & Цzer A., 2007; Carew J., 2002), оскільки вона не захищена білками, локалізована поблизу електронотранспортного ланцюга (Brandon M. et al., 2006, Bianchi N., 2010), не містить інтронних ділянок, і механізми її репарації менш ефективні, ніж ядерної ДНК (Larsen N. et al., 2005; Wilding C. et al., 2006). Встановлено, що в мтДНК клітин, які підлягали дії іонізуючої радіації, пошкодження виникають з більшою частотою, ніж в яДНК. Пошкодження в генах мтДНК призводять до виникнення дефектів у компонентному складі ферментних комплексів електронотранс- портного ланцюга мітохондрій, що призводить до збільшення продукування АФК і відповідно формування нових пошкоджень мтДНК. На-слідком мутацій мтДНК є порушення мітохондріального транспорту, а також активації різних транскрипційних факторів, які викликають експресію генів, задіяних у прогресії пухлини (Amutham G. Et al., 2002; Nishikawa M. et al., 2005).

Результати проведених нами досліджень засвідчують, що низькодозове фракціоноване опромінення, яке передувало трансплантації карциноми Герена, сприяло поглибленню фрагментації мтДНК на логарифмічній стадії росту новоутворення зі збільшенням частки делетованих молекул розмірами 14,5 т.п.н. (Марченко М. та ін., 2008).

У нормі швидкості розпаду та синтезу молекул мтДНК таким чином скоординовані, щоб підтримати їх постійну кількість в клітині (Орличенко Л. и др., 1993). У трансформованій тканині ця рівновага різноспрямованих процесів порушується, про що свідчить зниження інтенсивності включення [3Н]-тимідину в мтДНК карциноми Герена в динаміці її росту як у групі неопромінених, так і попередньо опромінених пухлиноносіїв (рис. 3). Ймовірно, що в карциномі Герена, трансплантованій після дії фракціонованого опромінення на організм, підвищення кількості пошкоджень мтДНК та посилення її матричного синтезу на латентній стадії пухлинного росту (рис. 3) значною мірою сприяють закріпленню змін у ДНК мітохондрій, які врешті-решт можуть призвести до порушення енергозалежних шляхів клітинного метаболізму.

На фоні інтенсифікації генерації супероксидного аніон-радикала (рис.2) в клітинах злоякісно трансформованої тканини в організмі попередньо опромінених тварин спостерігається підвищення рівня окислювальної модифікації мітохондріальних білків, які кодуються мтДНК (рис. 4). Найбільш виражені відмінності щодо накопичення карбонільних похідних та вмісту SH-груп білків мітохондріальної фракції карциноми Герена виявляються на стадії активного росту новоутворення (7, 14 доби експерименту) (рис.4 а, б).

а б

Рис. 4. Вміст карбонільних похідних (а) та SH-груп (б) білків мітохондріальної фракції карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Резонно припустити, що високий ступінь пошкоджень мтДНК поряд із посиленою окислювальною модифікацією мітохондріальних білків у клітинах карциноми Герена, трансплантованої після опромінення, призводять до виникнення дефектів у І, ІІІ та IV ферментативних комплексах електронотранспортного мітохондріального ланцюга, окремі субодиниці яких кодуються мтДНК. Ці дефекти порушують роботу ди-хального ланцюга і перешкоджають синтезу АТР (Тодоров И., 2007).

Підтвердженням висловленого припущення слугують отримані нами результати щодо інгібуючого впливу попереднього фракціонованого рентгенівського опромінення на Н+-АТРазну та сукцинатдегідрогеназну активності, що фіксується вже на латентній стадії пухлинного росту (рис. 5 а, б).

а б

Рис. 5. Н+-АТРазна (а) та сукцинатдегідрогеназна (б) активності в мітохондріальній фракції карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Отже, інтенсифікований ріст карциноми Герена в попередньо опроміненому організмі супроводжується посиленням генерації супероксидного аніон-радикала в мітохондріальній фракції клітин злоякісно трансформованої тканини, високим ступенем фрагментації мтДНК та зростанням рівня окислювальної модифікації мітохондріальних білків, що сприяє зниженню активності ферментів аеробного енергозабезпечення.

Структурно-функціональний стан хроматину клітин карциноми Герена, трансплантованої після дії на організм тварин фракціонованого низькодозового опромінення. Посилена проліферація клітин неоплазми за умов інтенсифікації генерації супероксиду невід`ємна від структурно-функціональних змін хроматину. Одним із первинних факторів контролю функціональної активності хроматину вважається обмежений специфічний протеоліз гістонів (Протас А., Чаяло И., 1991). У наших експериментах максимальний показник гістоноспецифічної протеолітичної активності хроматину клітин карциноми Герена зафіксовано на латентній стадії злоякісного росту як у групі неопромінених, так і попередньо опромінених тварин. Підвищений рівень протеолітичної активності в ядрі на початкових

Рис. 6. Фракційний склад гістонів карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів

етапах росту пухлинного зародка супроводжується перерозподілом фракцій гістонів, свідченням чого слугують електрофореграми (рис. 6). Електрофоретичні профілі гістонів клітин карциноми Герена попередньо опромінених тварин (трек Р+П) характеризується відсутністю білкової смуги, яка відповідає гістону Н1, та появою додаткових смуг у зоні низьких молекулярних мас. Відмічені особливості, очевидно, є наслідком посиленого гідролізу лінкерних білків, оскільки відомо, що в складі ядерного матриксу функціонує Н1-специфічна протеїназа (Малахова Л., Газиев А., 1988). Водночас спостерігається кількісний перерозподіл фракцій корових гістонів (рис. 6, трек Р+П). Більша частина всіх сульфгідрильних груп ядра належить гістонам і знаходиться в основному в аргінінозбагаченій фракції. Ймовірно, ця особливість робить їх чутливішими до дії АФК і продуктів пероксидації (Мишуніна Т., 2009), чим і зумовлює посилений протеоліз.

На підтвердження вищесказаного можна навести встановлений нами факт зниження кількості вільних сульфгідрильних груп гістонів на латентній стадії пухлинного росту, що розглядається як прояв їх посиленої окислювальної модифікації, в клітинах карциноми Герена, трансплантованої після фракціонованого низькодозового опромінення організму (рис. 7).

Рис. 7. Вміст вільних сульфгідрильних груп гістонів ядерної фракції карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів.

Примітка: * - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05

Висока протеолітична активність та гідроліз гістонів у складі хроматину, особливо Н1, специфічними протеїназами є фактором, що забезпечує динамічність структури хроматину в клітинних ядрах і є одним із механізмів забезпечення матричної активності ДНК. В основі високої проліферації пухлинних клітин та реалізації метастатичних потенцій злоякісних новоутворень лежить посилення синтезу ядерної ДНК. Набуття цих властивостей пухлинними клітинами прискорюється за дії екзогенних чинників, оскільки останні активують адаптивні механізми, які підвищують життєздатність пухлинного клону (Коган Е., 2002; Окулов В., Зубова С., 2000; Шарыкина Н. и др., 2002).

Проведений нами аналіз інтенсивності включення [3Н]-тимідину в ДНК клітин карциноми Герена засвідчив, що в попередньо опроміненому організмі всі етапи росту карциноми характеризуються посиленням включення міченого попередника в ядерну ДНК трансформованої тканини порівняно з неопроміненими тваринами (рис. 8).

Отримані дані узгоджуються з відомостями літератури (Golden T., Melov S., 2001; Kauffman J., 2003) про стимулюючу дію низьких доз радіації щодо процесів реплікації та клітинної проліферації і надають право розглядати попереднє фракціоноване низькодозове опромінення як індукуючий фактор у запуску адаптивних реакцій клітин злоякісного новоутворення, спрямованих на посилення пухлинної прогресії.

Одна з передумов інтенсифікованого росту неоплазми - збереження цілісності ядерної ДНК. Нами встановлено відсутність фрагментованої ДНК в клітинах карциноми Герена, трансплантованої попередньо опроміненому організму тварин, не лише на латентній (як у групі неопромінених пухлиноносіїв), але й на логарифмічній стадії пухлинного росту (рис. 9).

Рис. 8. Включення [³Н]-тимідину в ядерну ДНК карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Рис. 9. Електрофоретичні профілі фрагментованої ядерної ДНК карциноми Герена попередньо опромінених та неопромінених щурів у логарифмічну фазу пухлинного росту.

Примітка:по осі абсцис на графіках - довжина пробігу фрагментованої ДНК, ум. од.; по осі ординат - оптична густина фрагментованої ДНК, ум. од.

Складовою комплексу біохімічних змін, спрямованих на збереження цілісності ДНК та забезпечення ефективного функціонування геному пухлинних клітин в попередньо опроміненому організмі, виявляється встановлене нами зниження активності лужної ДНКази (рис. 10).

Рис. 10. Вміст ПДН в ядерній фракції карциноми Герена неопромінених та попередньо опромінених щурів за умов активації лужної ДНКази.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Виявлені особливості метаболізму ДНК у карциномі Герена попередньо опромінених тварин знаходять своє об'єктивне відображення у зростанні інтенсивності процесів синтезу в ядрі, зокрема на латентній стадії. В цей період спостерігається підвищення інтенсивності включення [3H]-уридину в РНК клітинних ядер карциноми опромінених тварин порівняно з неопроміненими (рис. 11 а) та зростає частка транскрипційно активного хроматину (рис. 11 б).



А б

Рис. 11. Інтенсивність включення 3[H]-уридину в РНК (а) та співвідношення вмісту фракцій транскрипційно активного і репресованого хроматину (б) карциноми Герена

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Отже, характеризуючи в цілому функціональну активність хроматину в клітинах карциноми Герена, трансплантованої після дії фракціонованого опромінення організму низькими дозами радіації, слід відзначити, що за даних умов під час активного росту пухлини спостерігається пригнічення фрагментації ДНК й активація процесів синтезу в ядрі. Молекулярна стабільність ДНК поряд з еухроматинізацією, ймовірно, й зумовлюють ефективніше функціонування ДНК як матриці, що, очевидно, впливає на клітинну проліферацію та лежить в основі посилення пухлинної прогресії в опроміненому організмі.

Функціональна активність печінки в процесі росту карциноми Герена, трансплантованої після фракціонованого низькодозового опромінення організму тварин. Провідна роль в адаптивних реакціях організму належить печінці, від характеру протікання та надійності біохімічних процесів у якій значною мірою залежить повноцінне функціонування інших органів і систем організму (Шабалкин И. и др., 2002; Van Remmen H., Richardson A., 2001).

Результати наших досліджень доводять, що дія двох пошкоджуючих чинників на організм, якими є опромінення і трансплантація карциноми Герена, призводить до посилення генерації О2- в мітохондріальній фрак-ції печінки, причому, починаючи з логарифмічної стадії злоякісного росту, домінуючим виявляється вплив онкогенезу (рис. 12).

Незважаючи на відсутність статистично вірогідних відмінностей щодо інтенсивності продукування О2- в клітинах печінки опромінених та неопромінених тварин із карциномою Герена, ознаки пошкодження компонентів мітохондрій більш виражені в пухлиноносіїв, які попередньо зазнали дії радіації. Зокрема, вже на ранніх стадіях експерименту в мітохондріальній фракції печінки опромінених пухлиноносіїв відбувається посилення окислювальної модифікації мітохондріальних білків та фрагментації мтДНК, в той час як у неопромінених тварин із пухлиною в цей період виявляються молекули мтДНК, за розмірами ідентичні до нативних (Волощук О. та ін., 2007; Марченко М. та ін., 2009). Посилене пошкодження досліджуваних біополімерів супроводжує порушення функціонування аеробних систем енергозабезпечення клітин печінки, підтвердженням чого є встановлене нами підвищення рівня Н+-АТРазної актив-ності в мітохондріальній фракції печінки попередньо опромінених пухлиноносіїв порівняно з контролем і неопроміненими пухлиноносіями впродовж усього експериментального періоду (рис. 13 а).

А б

Рис. 13. Н+-АТРазна (а) та сукцинатдегідрогеназна (б) активності мітохондріальної фракції печінки щурів із трансплантованою карциномою Герена.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця показників групи Р+П з показниками групи контролю, р < 0,05;

** - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Оскільки активність мітохондріальної Н+-АТРази може бути спрямована як на синтез АТР, так і на її гідроліз, то, ймовірно, що у досліджуваних умовах встановлена активація Н+-АТРази спрямована на підтримку електрохімічного потенціалу. Стосовно динаміки сукцинатдегідрогеназної активності, то на латентній стадії відбувається її різке зниження порівняно з показниками групи неопромінених пухлиноносіїв із нівелюванням відмінностей на логарифмічній стадії росту неоплазми (рис. 13 б).

Виявлені нами зміни в мітохондріальному компартменті супроводжуються зниженням частки транскрипційно активного хроматину та інтенсивності включення [3Н]-уридину в РНК клітин печінки попередньо опромінених тварин із карциномою уже на латентній стадії росту неоплазми порівняно з тваринами-пухлиноносіями, які не зазнавали дії радіаційного чинника. На подальших етапах інтенсифікованого опроміненням пухлинного росту вплив радіації на показники функціональної активності хроматину в клітинах печінки нівелюється (рис. 14).

А б

Рис. 14. Співвідношення вмісту фракцій транскрипційно активного і репресованого хроматину (а) та інтенсивність включення [3H]-уридину в РНК клітин печінки щурів із карциномою Герена.

Примітка: * - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р < 0,05.

Тривале функціонування печінки в екстремальних умовах призводить до виснаження її детоксикаційної функції. Нами встановлено, що дія фракціонованого опромінення на нетрансформовані тканини організму, в якому розвивається пухлинний зародок, зумовлює зниження ферментативних активностей компонентів І та ІІ фаз біотрансформації в мікросомній фракції печінки (рис. 15, 16). Порівняльний аналіз інтенсивності реакцій мікросомального окислення та кон`югації в клітинах печінки пухлиноносіїв засвідчив зниження досліджуваних ферментативних активностей у попередньо опромінених тварин в періоди латентного та логарифмічного росту карциноми Герена з нівелюванням відмінностей у стаціонарну фазу пухлинного росту (рис. 15, 16).

а б

Рис. 15. N-деметилазна (а) та n-гідроксилазна (б) активності в мікросомній фракції печінки щурів із карциномою Герена.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця між показниками груп Р+П і П, Р< 0,05.

Встановлена нами динаміка біохімічних процесів, спрямованих на зниження функціональної активності печінки в організмі попередньо опромінених пухлиноносіїв, може розглядатися як прояв системного впливу пухлини на організм, що в кінцевому рахунку сприяє інтенсифікації онкогенезу.

Вплив 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду на ріст карциноми Герена та функціональний стан печінки організму пухлиноносія. Вивчення впливу різних концентрацій 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду на ріст карциноми Герена продемонструвало оптимальну ефективність даного засобу в кількості 6 мг/кг, напівлетальною виявилася концентрація 14,8± 4,2 мг/кг.

З метою подолання пасивного розподілу 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду в організмі пухлиноносія, підвищення його антибластичної активності шляхом збільшення концентрації в пухлині та зниження ступеня токсичності, нами проведено конструювання його ліпосомної форми. Режим введення ліпосомної форми БКУ передбачав попереднє застосування ненавантажених ліпосом із метою корекції ліпідного складу клітинних мембран печінки в організмі пухлиноносія. Як наслідок, протипухлинна активність ліпосомної форми БКУ значно посилювалася, що виражалося в підвищенні ступеня гальмування росту пухлини до 93 %, збільшенні тривалості життя тварин на 82%, а також повній регресії карциноми Герена у 65 % дослідних тварин (табл. 1).

Таблиця 1.

Протипухлинна активність похідних урацилу

засіб	концен-трація, мг/кг	гальмування росту пухлини, % (доба)	збільшення тривалості життя %	повна регресія пухлини,%
		10	14	17	21	26
лБКУ	6	37	38	62	74	89	71	50
Л+лБКУ	6	42	58	71	86	93	82	65

Переваги застосування ліпосомної форми 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду в поєднанні з попереднім введенням ненавантажених ліпосом, ймовірно, пов`язані з суттєвим зменшенням його пасивного розподілу в організмі, що зумовлює концентрування хімічного засобу в пухлині. Водночас насичення клітинних мембран печінки ліпідами ненавантажених ліпосом зумовлюють зниження проникності мембран клітин печінки для БКУ, запобігаючи тим самим гепатотоксич-ності досліджуваного хімічного засобу.

Результати досліджень біохімічних змін за умов введення в організм пухлиноносія 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацил гідроброміду засвідчують, що однією з ланок його механізму дії є посилення продукування супероксидного аніон-радикала в мітохондріальній фракції клітин карциноми Герена (рис. 17).

Водночас посилюється фрагментація мітохондріальної ДНК, зростає рівень окислювальної модифікації мітохондріальних білків (Марченко М. та ін., 2008). У ядрі порушується структурно-функціо-нальний стан хроматину, що проявляється у підвищенні рівня окислювальної модифікації гістонових білків після двотижневого введення хімічного засобу (рис. 18).

а б

Рис. 18. Вміст карбонільних похідних (а) та вільних сульфгідрильних груп (б) гістонів хроматину клітин карциноми Герена за дії БКУ.

Примітка: * - статистично достовірна різниця між показниками дослідних груп тварин, Р<0,05.

Модифікація гістонів, очевидно, вносить суттєвий вклад у конформаційні перебудови хроматину, «оголюючи» певні ділянки ДНК, які стають сайтами для вбудовування БКУ між площинами основ, що сприяє порушенню молекулярної організації ядерної ДНК. Можливість прямої взаємодії БКУ з ядерною ДНК підтверджене нами спектроскопічними дослідженнями сумішей ДНК та БКУ в системі in vitro (Kopylchuk et al., 2007).

Рис. 19. Електрофореграми фрагментованої ядерної ДНК карциноми Герена пухлиноносіїв (1) та пухлиноносіїв, які отримували БКУ (2).

При дослідженні характеру накопичення фрагментованої ДНК у клітинних ядрах карциноми Герена встановлено, що семиденне введення досліджуваного хімічного агента зумовлює появу високомолекулярних фрагментів ДНК довжиною від 10 до 50 т.п.н. (рис. 19). Ймовірно, що посилення деградації хромосомної ДНК за умов введення БКУ, яке спостерігається в період активного росту новоутворення, стає критичною подією в метаболізмі пухлинних клітин, створюючи основу для регресії новоутворення.

Побічним ефектом дії БКУ є зниження активності ферментів детоксикації мікросомної фракції клітин печінки (рис. 20, 21). Послідовне введення ненавантажених ліпосом (мольне співвідношення фосфатидилхолін : холестерол 9:2) з метою насичення клітин ретикуло-ендотеліальної системи та ліпосомної форми БКУ (мольне співвідношення фосфатидилхолін : холестерол 7:3) дало можливість нормалізувати ферментативні активності компонентів І та ІІ фаз біотрансформації ксенобіотиків (рис. 20, 21).

а б

Рис. 20. N-деметилазна (а) і n-гідроксилазна (б) активності в мікросомній фракції печінки щурів із карциномою Герена за дії ліпосомної та неліпосомної форм БКУ.

Примітка:* - статистично достовірна різниця показників дослідних груп з показниками групи контролю, Р< 0,05.

Рис. 21. Глутатіонтрансферазна активність у мікросомній фракції печінки щурів із карциномою Герена за дії ліпосомної та неліпосомної форм БКУ.

Примітка:

* - статистично достовірна різниця показників дослідних груп з показниками групи контролю, Р < 0,05.

Водночас наближаються до значень контролю показники ферментативних активностей АлТ, АсТ та ГГТ у сироватці крові (Копильчук Г., Кеца О., 2009).

Таким чином запропонований режим введення ліпосомної форми хімічного засобу 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацилу гідроброміду після попереднього застосування ненавантажених ліпосом дозволяє підвищити його антибластичний ефект поряд із відновленням функціонування детоксикаційних систем печінки.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено обгрунтування біохімічних особливостей пухлинного росту в організмі тварин за їх попереднього фракціонованого низькодозового опромінення і перспективності використання кумаринових похідних урацилу як антибластичних засобів. Встановлена стадійна взаємозалежність метаболічних змін злоякісно трансформованої тканини і функціонального стану печінки та їх значення для пухлинної прогресії.

Встановлено, що дія попереднього фракціонованого опромінення організму низькими дозами радіації проявляється в інтенсифікації пухлинного росту на латентній і логарифмічній стадіях із нівелюванням його індукуючого впливу на завершальних етапах онкогенезу.

Показано посиленння генерації супероксидного аніону в мітохондріях трансформованої тканини на стадії активного пухлинного росту за умов попереднього фракціонованого низькодозового опромінення організму, що супроводжується підвищенням рівня фрагментації мтДНК, інтенсифікацією процесів окислювальної модифікації мітохондріальних білків, а також зниженні АТРазної та сукцинатдегідрогеназної активностей.

Встановлено, що інтенсифікація росту карциноми Герена за умов попереднього фракціонованого низькодозового опромінення організ-му супроводжується зростанням включення [3Н]-тимідину в яДНК та [3H]-уридину в РНК, збільшенням частки транскрипційно активного хроматину при відсутності фрагментації ядерної ДНК пухлинних клітин.

Встановлено, що підвищення рівня фрагментації ДНК і окислювальної модифікації протеїнів у мітохондріальній фракції клітин печінки попередньо опромінених тварин із карциномою Герена супроводжується поглибленням дисфункцій ферментів систем аеробного енергозабезпечення, вже починаючи з латентної стадії пухлинного росту.

Встановлено зниження інтенсивності включення [3Н]-тимідину в яДНК та [3H]-уридину в РНК, а також зменшення частки транскрипційно активного хроматину в клітинах печінки попередньо опроміненого організму пухлиноносія вже на початкових етапах прогресії злоякісного новоутворення.

Встановлено, що інтенсифікація пухлинного росту в попередньо опроміненому організмі супроводжується зниженням активностей ферментів гідроксилювання системи цитохрому Р 450 та глутатіон-трансферази в клітинах печінки.

Встановлено, що протипухлинна дія 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіноурацилу гідроброміду визначається його здатністю посилювати продукування супероксидного аніон-радикала у мітохондріях та деградацію ДНК в ядрах клітин карциноми Герена.

Запропонований компонентний склад ліпосом і режим введення інкапсульованого в ліпосому 5-(5',6'-бензокумароїл-3')-метиламіно-урацил гідроброміду дозволяє підвищити його протипухлинну активність і знизити гепатотоксичність в організмі тварин із карциномою Герена.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Marchenko M.M. Low Doses of X-Ray Irradiation Influence the Liver Detoxication System in Rats with Transplanted Guerin?s Carcinoma / M.M. Marchenko, G.P. Kopyl?chuk, O.V. Ketsa // Biochemistry (Moscow) Sup.Ser B: Biomed. Chem. - 2009. - Vol. 3, №4. - Р. 377-381.

(Здобувач брала участь в обговоренні та узагальненні результтів, формулюванні висновків та написанні статті).

Kopylchuk H.P. A possible mechanism of antitumor activity of 5-(5`,6`-benzocoumarol-3`)-methylaminouracil in vivo / H.P. Kopylchuk, I.O. Shmarakov, M.M. Marchenko // Experim. oncol. - 2007. - V.29, №4. - P. 320-322.

(Здобувачем здійснена інтерпретація результатів досліджень та підготовка статті).

Марченко М.М. Влияние фракционированого рентгеновского облучения малых доз на активность гистонспецифических протеиназ и содержание малонового диальдегида в хроматине клеток печени крыс / М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук, Е.В. Григорьева // Радиац. биол. Радиоэкология. - 2002. - Т. 42, № 5. - С. 488-491.

(Здобувачем проведено планування експерименту, узагальнення результатів і підготовка статті).

Копыльчук Г.П. Влияние опухолевого роста и предварительного облучения на состояние процессов деградации ДНК ядер клеток печени / Г.П. Копыльчук, И.А. Шмараков, М.М. Марченко // Радиац. биол. Радиоэкология. - 2005. - Т. 45, вып. 4. - С. 403-410.

(Здобувачем здійснена інтерпретація результатів і підготовка статті).

Марченко М.М. Влияние предварительного облучения на ДНКазную активность и степень фрагментации ДНК ядер клеток карциномы Герена / М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук, И.А. Шмараков // Вопр. онкол. - 2006. - Т. 52, № 1. - С. 63-65.

(Здобувачем здійснена інтерпретація результатів і підготовка матеріалів для статті).

Марченко М.М. Синтез и противоопухолевая активность гидробромида 5-(5?,6?-бензокумароил-3?) метиламиноурацила и его липосомальной формы / М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук, И.А. Шмараков и др. // Хим. - фарм. журн. - 2006. - Т. 40, № 6. - С. 6-7.

(Здобувачем проведено узагальнення результатів та підготовка матеріалів для статті).

Марченко М.М. Особенности окислительной деструкции продуктов митохондриальной трансляции в условиях предварительного фракционированного облучения крыс-опухоленосителей / М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук, О.Н. Волощук // Бюлл. эксперим. биол. мед. - 2007. - Т. 144, № 10. - С. 401-403.

(Здобувачем здійснена інтерпретація експериментальних результатів підготовка статті).

Марченко М.М. Влияние малых доз рентгеновского облучения на детоксикационную систему печени крыс с трансплантированной карциномой Герена / М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук, О.В. Кеца // Биомед. химия. - 2010. - Т. 56, вып. 2. - С. 266-273.

(Здобувач брала участь в обговоренні та узагальненні результатів, а також підготовці статті).

Марченко М.М. Гідроліз гістонів в ізольованих ядрах клітин печінки і трансплантованої карциноми Герена у щурів-пухлиноносіїв в процесі розвитку онкозахворювання / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, О.В. Григор'єва // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 5. - С. 1-5.

(Здобувачем проведено планування та постановка експерименту).

Марченко М.М. ДНКазна активність і ступінь фрагментації хроматину клітинних ядер у ході росту злоякісного новоутворення / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, І.О. Шмараков // Біополімери і клітина. - 2004. - Т. 20, № 6. - С. 506-511.

(Здобувачем проведено отримання ядер і хроматину, узагальнення результатів досліджень).

Марченко М.М. Оцінка генотоксичності пухлинного росту в попередньо опроміненому малими дозами організмі / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, І.О. Шмараков, Л.В. Блинда // Біополімери і клітина. - 2009. - Т. 25, № 3. - С. 234-239.

(Здобувач брала участь в обговоренні та узагальненні результатів і підготовці статті).

Марченко М.М. Активність цитоплазматичних протеїназ печінки щурів із карциномою Герена у процесі росту пухлини за дії на них лікувальних засобів / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, О.В. Григор`єва // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, №3. - С. 91-94.

(Здобувачем проведено планування експерименту, узагальнення результатів та підготовка статті).

Копильчук Г.П. Окислювальна модифікація білків хроматину печінки та карциноми Герена щурів-пухлиноносіїв / Г.П. Копильчук, Л.В. Худа, М.М. Марченко // Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, № 2. - С. 111-114.

(Здобувачем проведено інтерпретацію та узагальнення результатів досліджень і підготовка статті).

Марченко М.М. Позаклітинні фрагменти ДНК та ДНК-азна активність сироватки крові щурів з трансплантованою карциномою Герена на фоні багаторазового рентгенівського опромінення низькими дозами / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, І.О. Шмараков // Укр. біохім. журн. - 2004. - Т. 76, № 3. - С. 131-135.

(Здобувачем узагальнено результати досліджень і взято участь у підготовці статті).

Марченко М.М. Вплив ліпосомного протипухлинного препарату гідробромід 5-(5?,6?-бензокумароїл-3?)-метиламіноурацилу на цитохром Р-450 у мікросомній фракції печінки щурів-пухлиноносіїв / М.М. Марченко, Г.П. Копильчук, О.В. Кеца, І.О. Шмараков // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 6. - С. 86 - 92.

...