Размещено на http://allbest.ru

НАЦіОНАЛЬНА АКАДЕМіЯ НАУК УКРАїНи

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

УДК 618.3:612.112.91/115.146

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Роль циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів в механізмах порушень системної гемоваскулярної регуляції при прееклампсії вагітних

14.03.04 патологічна фізіологія

КОВАЛЬ СЕРГіЙ БОРИСОВИЧ

Київ 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий консультант: член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор Сагач Вадим Федорович, Інститут фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України (м. Київ), завідувач відділу фізіології кровообігу

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Маньковська Ірина Микитівна, Інститут фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України (м. Київ), завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

доктор медичних наук, професор Лановенко Іван Іванович, Державна установа „Інститут гематології та трансфузіології НАМН України” (м. Київ), завідувач лабораторії патофізіології крові

доктор медичних наук, професор Медведь Володомир Ісаакович Державна установа „Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України” (м. Київ), завідувач відділення внутрішньої патології вагітних

Захист дисертації відбудеться “ _26_ “___квітня____2011 року

о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О. Богомольця НАН України (01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4).

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4).

Автореферат розісланий “_22_”__березня___2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день прееклампсія лишається однією з основних причин материнської смертності, невиношування, мертвонародження, кровотеч (Г.М. Савельева, 2000; Е.А. Чернуха, 2003; О.В. Макаров и др., 2006; J.M. Roberts et al., 2003; R. Cifkova, 2006; G.I. Hofmeyr et al., 2010). Частота виникнення прееклампсії становить 16-17 % і має тенденцію до зростання (Е.М. Шифман, 2003; В.И. Кулаков, 2005; О.Н. Ткачева, А.В. Барабашкина, 2006; Р.И. Шалина, 2008; A.F. Saftlas et al., 1998; G. Brichant et al., 2010). При цьому прееклампсія складає біля 15 % серед причин материнської смертності, рівень перинатальної захворюваності - 640-780 ‰, перинатальної смертності - 18-30 ‰ (И.С. Сидорова, 2008; A.P. Mackay, 2001).

Незважаючи на розвиток сучасної науки, появу нових методів діагностики і лікування, пускові механізми розвитку гіпертензивних станів під час вагітності залишаються і нині нез'ясованими (C.C. Zhou et al., 2008; P. Sosner et al., 2010). Існує близько 30 різноманітних теорій (неврогенна, гормональна, ниркова, плацентарна, імунологічна, генетична) патогенезу прееклампсії (М.Б. Охапкин и др., 2007; C. Escudero et al., 2008; B.C. Young et al., 2010), що свідчить про те, що жодна з них не розкриває його повністю. Головною складовою патогенезу цього стану, за сучасними уявленнями, є гостре пошкодження периферичної судинної системи з порушенням функції клітин ендотелію, дисфункція яких є пусковим механізмом синдрому системної запальної відповіді, пошкодження і порушення функції тромбоцитів, еритроцитів, розвитку гіповолемії, синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання (ДВЗ-синдрому), зміни регіонарного кровотоку і, як наслідок, прогресуючі порушення життєво важливих функцій, виникнення поліорганної недостатності (В.Н. Серов, 2004; Е.В. Мозговая, 2008; Г.А. Ушакова, Ю.В. Рец, 2008; A. Kezich et al., 2007; E.A. Steegers et al., 2010; V. Ysatsaris et al., 2010).

Нейтрофільні гранулоцити, беручи участь у різних стадіях запального процесу і маючи значну кількість різноманітних ферментів і біологічно активних речовин, можуть ініціювати такі гуморальні каскадні системи організму, як калікреїн-кінінова, гемокоагуляції, фібринолізу, комплементу (Д.Н. Маянский и др., 1987; S.P. Grouch et al., 1995; A.K. Gupta et al., 2006; T. Okazaki et al., 2007). Разом з цими функціями нейтрофільні гранулоцити мають властивість клітинних месенджерів, регулюючи метаболізм різних клітин і тканин, підтримуючи тканинний гомеостаз в організмі (Н.И. Бахов, 1987; J.R. Mellembakken et al., 2001; J.E. Vaunghan et al., 2005). Таким чином, система нейтрофільних гранулоцитів є однією з важливих ланок гомеостазу організму людини, яка бере участь у численних фізіологічних реакціях і патологічних процесах (C.J. Whelan, 1992; N. Gomes-Lopez et al., 2010) .

Проте до теперішнього часу не до кінця з'ясовані питання біогенезу, морфології і функції цитоплазматичних гранулярних структур нейтрофільних гранулоцитів, їх безпосередньої участі в різних фізіологічних і патологічних процесах в організмі людини (А.А. Славинский, 2002; N.B. Hampton et al., 1998; P. Luppi et al., 2006; T. Kalinski et al., 2007).

У зв'язку з вищевикладеним, актуальним є вивчення механізмів участі нейтрофільних гранулоцитів у патогенезі прееклампсії вагітних, що дасть змогу розширити існуючі уявлення про їх роль в регуляції фізіологічних і патологічних процесів в організмі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України "Роль ендотеліальних факторів у регуляції регіонарної і системної гемодинаміки" (№ держ. реєстрації 0194U019722); "Дослідження впливу активаторів калієвих каналів на функціонування систем забезпечення організму киснем при екстремальних станах" (№ держ. реєстрації 0198U001936); " Вивчення ролі ендотеліальних факторів у регуляції судинного тонусу і серцевої діяльності при різних функціональних станах організму " (№ держ. реєстрації 0100U002064); "Роль перебудови структурно-функціональних взаємовідношень у газотранспортних системах організму в розвитку гіпоксичних станів при екзо- і ендогенних впливах" (№ держ. реєстрації 0101U002634); "Вивчення ролі ендотеліальних факторів і вільних радикалів кисню в реактивності серцево-судинної системи" (№ держ. реєстрації 0103U003285).

Мета роботи - з'ясувати роль системи циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів в механізмах порушень системної гемоваскулярної регуляції при прееклампсії вагітних.

Задачі дослідження.

1. Виявити структурно-функціональні особливості циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів і тромбоцитів, а також системну активність лізосомальних ферментів, вільної форми ангіотензинперетворюючого ферменту і тромбоцитарного фактора 4 у вагітних з прееклампсією.

2. Встановити у роділь з прееклампсією структурно-функціональні особливості циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів і тромбоцитів, а також системну активність лізосомальних ферментів, вільної розчинної форми ангіотензинперетворюючого ферменту та тромбоцитарного фактора 4.

3. Вивчити на моделі стрес-синдрому стан лізомальної ферментної системи в тканинах легенів, серця, печінки і в циркулюючих нейтрофільних гранулоцитах у лабораторних тварин.

4. В умовах стрес-синдрому у лабораторних тварин дослідити безпосередній вплив циркулюючих нейтрофільних гранулоцитів на активність ангіотензинперетворюючого ферменту, циркулюючі тромбоцити і стан системи гемостазу.

5. Дослідити на моделі прееклампсії стан гранулоцитопоезу в кістковому мозку і стан нейтрофільних гранулоцитів периферичної крові у лабораторних тварин.

6. Встановити на моделі прееклампсії безпосередній вплив нейтрофільних гранулоцитів, циркулюючих в периферичній крові лабораторних тварин, на активність ангіотензинперетворюючого ферменту, циркулюючі тромбоцити і стан системи гемостазу.

7. Встановити в ізольованих нейтрофільних гранулоцитах людини наявність і локалізацію ангіотензин-перетворюючого ферменту і факторів його інгібування і активації.

8. Виявити в дослідженнях на ізольованих тромбоцитах людини особливості екстратромбоцитарної реакції вивільнення при прямій дії факторів різних цитоплазматичних гранулярних структур нейтрофільних гранулоцитів.

9. Вивчити ультраструктурні особливості нейтрофільних гранулоцитів і тромбоцитів, циркулюючих у периферичній крові вагітних з прееклампсією.

Об'єкт дослідження - системні механізми регуляції гемоваскулярних реакцій. прееклампсія лізосомальний згортання кров

Предмет дослідження - циркулюючі нейтрофільні гранулоцити в системних механізмах гемоваскулярної регуляції при прееклампсії вагітних.

Методи дослідження: клінічні, експериментальні, гематологічні, цитофлюориметричні, цитохімічні, біохімічні, гістологічні, ультраструктурні, електронно-гістохімічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше у нейтрофільних гранулоцитах, циркулюючих у периферичній крові у вагітних з прееклампсією, виявлені виражені ознаки розвитку екзоцитарної лізосомальної реакції, яка супроводжується системним підвищенням активності ангіотензинперетво-рюючого ферменту, в циркулюючих тромбоцитах - ознаки демонстративного прогресування секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення. Такі зміни поглиблюються зі збільшенням ступеня тяжкості прееклампсії. Показано, що цим синхронним змінам з характерними проявами патогенетичних процесів властиві і риси неспецифічних реакцій, які акцентуються при розвитку на тлі преекламсії спонтанних своєчасних пологів, як додаткового фактора, що поглиблює в організмі реалізацію стрес-синдрому.

Вперше в модельних дослідженнях на лабораторних тваринах при експериментальних варіантах стрес-синдрому доведено, що розвиток в циркулюючих нейтрофільних гранулоцитах (ЦНГ) екзоцитарної лізосомальної реакції викликає системне підвищення активності ангіотензинперетворюючого ферменту (АПФ) і тромбоцитарного фактора 4 (ТФ4), що супроводжується проявами гіперкоагуляції.

У модельних дослідженнях прееклампсії вагітних на лабораторних тваринах вперше доведена патогенетична роль посилення розвитку в ЦНГ екзоцитарної лізосомальної реакції, яка, по-перше, зумовлює подальше системне підвищення активності АПФ, що бере участь в АПФ-залежному механізмі регуляції судинного тонусу, і, по-друге, ініціює в циркулюючих тромбоцитах (ЦТ) певне посилення секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення, що приймає участь у патологічній активації системи гемостазу, яка виявляється в першій стадії хронічної компенсованої форми ДВЗ-синдрому.

Вперше в дослідженнях на ізольованих нейтрофільних гранулоцитах людини встановлено наявність внутрішньолейкоцитарної системи АПФ, а саме локалізацію самого ферменту, факторів його інгібування і активації, що дало змогу довести можливість безпосередньої участі циркулюючих у периферичній крові нейтрофільних гранулоцитів у АПФ-залежній регуляції судинного тонусу.

Вперше в модельних дослідженнях на ізольованих ЦТ людини доведена виражена ініціююча дія ферментів первинних лізосом (ПЛ) ЦНГ на розвиток в тромбоцитах секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення. Це дало змогу виявити механізм впливу циркулюючих ЦНГ на патологічну активацію системи гемостазу з розвитком гемореологічних порушень.

В ультраструктурних дослідженнях нейтрофільних гранулоцитів і тромбоцитів, циркулюючих в кровотоку у вагітних з прееклампсією, вперше встановлені патогенетичні особливості розвитку відповідно екзоцитарної лізосомальної реакції і секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення. Це дало можливість з'ясувати варіанти розвитку цих реакцій і деталізувати механізми участі циркулюючих гранулоцитів і тромбоцитів у системних патогенетичних реакціях в організмі.

Вперше комплексом проведених досліджень доведена тригерна участь ЦНГ з розвитком екзоцитарної лізосомальної реакції при прееклампсії вагітних у порушеннях системної гемоваскулярної регуляції.

Практичне значення одержаних результатів. Робота відноситься до фундаментальних досліджень.

Одержані результати розширюють і поглиблюють існуючі уявлення про роль нейтрофільних гранулоцитів у регуляції фізіологічних і патологічних процесів в організмі.

У результаті проведених досліджень встановлений один з раніше невідомих механізмів патогенезу прееклампсії вагітних, що створює теоретичні передумови для розробки патогенетично обгрунтованих інноваційних методів лікування і профілактики цього ускладнення.

Одержані результати можуть бути включені в лекційні курси з патофізіології і фізіології, а також акушерства і гінекології у вищих учбових закладах.

За наслідками роботи одержаний декларативний патент "Спосіб оцінки функціональної резистентності організму людини" (Патент України 31257 А, Київ, 2000). Матеріали роботи були враховані при підготовці відомчої інструкції МОЗ України "Автоматизований супровід на районному рівні диспансеризації осіб, включених у Державний реєстр постраждалих" (Київ, 1992).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто підібрана і проаналізована література, що дало можливість сформулювати тему, визначити актуальність, розробити програму досліджень. Особисто виконана клінічна і експериментальна частина роботи. Всі лабораторні та інструментальні дослідження здійснені особисто автором або при його участі. Статистична обробка результатів, теоретичний аналіз і узагальнення результатів досліджень зроблені автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені і обговорювалися на Міжнародній конференції з проблем медицини катастроф (Київ, 1991); Науково-практичній конференції "Чорнобиль і здоров'я людей" (Київ, 1993); III Міжнародному симпозіумі "Системно-антисистемна регуляція в живій і неживій природі" (Київ, 1993); Міжнародній науково-практичній конференції "Фізична культура, спорт і здоров'я" (Черкаси-Переяслав-Хмельницький, 1996); Всеукраїнській науковій конференції "Проблеми вікової фізіології" (Луцьк, 1998); Міжнародній конференції і Приельбруських бесідах (Київ-Терскол, 1998); ХV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998); Міжнародній конференції "Фізіологія розвитку людини" (Москва, 2000); II Міжнародній конференції учених-медиків країн Чорноморського басейну (BSEC) "Актуальні питання клінічної і теоретичної медицини і біології" (Трабзон, Туреччина, 2000); ХVI з'їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002); Міжнародній науковій конференції "Адаптація в спорті: стан, перспективи, проблеми" (Санкт-Петербург, 2009); ХVIII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю (Одеса, 2010); VII Міжнародній науковій конференції "Культура здоров'я" (Херсон., 2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 39 праць, з них 28 статей - у спеціалізованих наукових журналах і збірниках, рекомендованих ВАК України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 346 сторінках тексту і складається зі вступу, огляду літератури, 7 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків і списку використаних джерел, який включає 567 посилань і займає 59 сторінок. Робота ілюстрована 36 таблицями, 40 рисунками, які займають 34 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Для вирішення поставлених задач комплексно обстежені 122 вагітні жінки, 84 роділлі і 20 невагітних жінок.

Вагітні в ІІІ триместрі гестації, ускладненої прееклампсією (група 1.1, 97 жінок), були розділені залежно від ступеня: легкого (група 1.1.1, 43 жінки), середнього (група 1.1.2, 27 жінок) і середньотяжкого (група 1.1.3, 27 жінок). Роділлі в І періоді спонтанних своєчасних пологів на фоні прееклампсії (група 2.1, 59 жінок) були розділені на: роділь з прееклампсією легкого (група 2.1.1, 32 жінки) і середньотяжкого ступеня (група 2.1.2, 27 жінок).

Для контролю були сформовані наступні групи: вагітні в ІІІ триместрі фізіологічної гестації (група 1.2, 25 жінок), роділлі в І періоді спонтанних своєчасних нормальних пологів (група 2.2, 25 жінок) і невагітні жінки (група 3, 20 жінок).

У жінок усіх груп визначали: абсолютну кількість нейтрофільних гранулоцитів (Л.В. Козловская, М.А. Мартынова 1995) і тромбоцитів (Р.П. Золотницкая, 1987), одночасно циркулюючих в периферичній крові; у ЦНГ - кількість в цитоплазмі ПЛ (А.С. Головацький, 1979, J. Haveman, 1980), вміст лізосомальних низькомолекулярних неферментних катіонних білків (ЛКБ) (Е.А. Венглинская и др., 1976), активність мієлопероксидази (МПО) (N.B. Hamptonet et al., 1998) і кислої фосфатази (КФ) (F.G.J. Hayhoe, D. Quaglino, 1980; V. Stvrtinova, J. Ferencikova, 1992), стан функціональної резистентності мембран ПЛ (L. Bitensky et al., 1973), активність лужної фосфатази (ЛФ) цитоплазматичних специфічних гранул (М.Г. Шубич, Б.С. Нагоев, 1980); в ЦТ - кількість цитоплазматичних б-гранул (бГ) (A.C. Allison, M.R. Young, 1973). Визначали адгезивність (В.П. Мищенко, 1980) і АДФ-агрегацію тромбоцитів (В.П. Балуда и др., 1980); у сироватці венозної крові - активність лізосомальних маркерних ферментів, катепсину Д (КД) (A.J. Barrett, M.F. Hit, 1977; А.Л. Канцалиев и др., 1994) і кислої фосфатази (КФ) (А.В. Третьяков и др., 1974), активність АПФ (Л.В. Павлихина и др., 1977; Е.В. Кугаевская, 1994) і ТФ4 (В.Г. Лычев, 1974).

У довільно відібраних 15 жінок з групи 1.1.1, 12 - з групи 1.1.3, 17 - з групи 1.2 і 15 - з групи 3 були проведені електронно-мікроскопічні дослідження ЦНГ (U. Bretz, M. Baggiolini, 1974) і ЦТ (В.К. Вашкинель, М.Н. Петров, 1982). Були застосовані методи субклітинної морфології і морфометричні дослідження ультраструктурної організації ЦНГ і ЦТ (M. Baggiolini, B. Dewald, 1985; А.С. Шитикова и др., 1997). Електронно-гістологічними методами було визначено на субклітинному рівні вміст у ЦНГ глікогену (В.В. Лукшина, К.П. Зак, 1976), активність МПО (К.П. Зак и др., 1984), КФ (F.G.J. Hayhoe, D. Quaglino, 1980), ЛФ (Р.П. Золотницкая, 1987), в ЦТ - вміст глікогену (В.К. Вашкинель, М.Н. Петров, 1982), активність пероксидази (ПО) (J. Breton-Gorius, 1980).

Експериментальні дослідження виконані на лабораторних статевозрілих 85 білих щурах лінії Вістар масою 190-210 г і 99 кролицях сірої масті породи Шиншила масою 2200-2500 г.

Лабораторні тварини були розділені на дві серії. До серії 1 увійшли щури (серія 1.1) і кролики (серія 1.2). Щури з серії 1.1 (85 тварин) були згруповані таким чином: серія 1.1.1 - 15 тварин, які перебували в інтактних умовах; серія 1.1.2 - 20 тварин - умовах селективної мієлодепресії (вибірного пригнічення гранулоцитопоезу) мієлобромолом (М.Д. Машковский, 1986; Н.А. Когут, 1988); серія 1.1.3 - 25 тварин при моделюванні стрес-синдрому (П.Д.Горизонтов, 1979); серія 1.1.4. - 25 тварин, у яких на фоні селективної мієлодепресії (Н.А. Когут, 1988) моделювали стрес-синдром.

Після евтаназії тварин і отримання секційного матеріалу в тканинах легенів, серця і печінки (И.П. Западнюк и др., 1974) проведена оцінка реакції субклітинних структур ПЛ за функціональним станом їх лізосомальних мембран (А.А. Покровский, В.А. Тутельян, 1976) з визначенням активності КФ (А.А. Покровский, 1969) і КД (A.J. Barrett, M.F. Hit, 1977). Активність КД і КФ вызначали також у сироватці венозної крові цих лабораторних тварин (A.J. Barrett, M.F. Hit, 1977; А.В. Третьяков и др.. 1974).

Невагітні кролиці (30 тварин) були згруповані таким чином: серія 1.2.1 - 14 тварин, які знаходилися в інтактних умовах, а в згодом - в умовах моделювання іммобілізаційного стрес-синдрому (П.Д.Горизонтов, 1979; Н.А. Когут, 1988); серія 1.2.2 - 16 тварин, які знаходилися в інтактних умовах, потім - при селективній мієлодепресії (М.Д. Машковский, 1986; Н.А. Когут, 1988), а надалі - в умовах імобілізаційного моделювання стрес-синдрому.

У цих невагітних кролиць (серії 1.2.1 і 1.2.2) у динаміці проведені дослідження, які включали: підрахунок абсолютної кількості ЦНГ (Л.В. Козловская, М.А. Мартынова 1995), кількості ПЛ в ЦНГ (В.Е. Пигаревский, 1970), вміст ЛКБ (В.Е. Пигаревский, 1970). У венозній крові визначали активність ТФ4 (В.Г. Лычев, 1974) і активність АПФ (Л.В. Павлихина и др., 1977; Е.В. Кугаевская, 1994), КФ (А.В. Третьяков и др.. 1974) і КД (A.J. Barrett, M.F. Hit, 1977; А.Л. Канцалиев и др., 1994). Оцінювали стан системи гемостазу, визначаючи тромбіновий і протромбіновий час, концентрацію фібриногену, активність калікреїнового моста (В.П. Балуда и др, 1980), час Хагеманзалежного фібринолізу (В.П. Скипетров, И.П. Булочников, 1987).

До серії 2 увійшли 69 статевозрілих самиць кроликів, які були згруповані таким чином: серія 2.1 - 15 невагітних кролиць, що знаходилися в інтактних умовах; серія 2.2. - 17 сукрольних кролиць після 20 діб фізіологічної вагітності; серія 2.3 - 18 кролиць, у яких була відтворена модель прееклампсії вагітних; серія 2.4 - 19 кролиць, у яких на фоні селективної мієлодепресії відтворювалася модель прееклампсії вагітних.

Для моделюванні прееклампсії вагітних у сукрольних кролиць з 20-ї до 25-ту добу вагітності відтворювали плацентарну перманентну ішемію накладенням z-подібних шовкових лігатур через маткову стінку на преплацентарні судини плодоложа в обох рогах матки і паралельно відтворювали хронічне однобічне зниження ниркової перфузії кровотоку в результаті накладання розітнутого металевого кільця на ліву ниркову артерію, звужуючого її на одну третину від початкового діаметра (И.П. Кожура, 1984; И.В. Славов, 1980; C.W. Redman, 1991; E. Van Beek, L.L. Peeters, 1998). Стан прееклампсії у сукрольних кролиць серії 2.4 відтворювався в режимі селективної мієлодепресії: на фоні попереднього перорального введення мієлобромолу в дозі 80 мг/кг протягом 4-5 діб до зниження кількості ЦНГ на 50 % і надалі в умовах відтворення моделі прееклампсії при введенні мієлобромолу по 30 мг/кг.

У тварин серії 2 вивчали стан гранулоцитопоезу (С.Т. Наджимитдинов, 1970) і вищезгаданими методами проводили визначення в периферичній крові абсолютної кількості ЦНГ, вмісту ПЛ і ЛКБ у ЦНГ. У периферичній крові підраховували число ЦТ, а також вміст бГ у них, оцінювали адгезивно-агрегаційні властивості тромбоцитів. У венозній крові визначали активність ТФ4, АПФ, КФ і КД. Проведена оцінка плазменних компонентів гемостазу: часу рекальцифікації стабілізованої плазми, тромбінового часу, концентрації фібриногену, активності фібринстабілізуючого фактора, стан етанолового і протамінсульфатного тестів (В.П. Балуда и др, 1980).

Після взяття біологічного матеріалу у кролиць серій 2.3 і 2.4 були довільно відібрані по 10 тварин, які були піддані евтаназії і на одержаному секційному матеріалі тканин легенів, правої нирки і наднирникової залози, а також печінки (И.П. Западнюк и др., 1974) були виконані патогістологічні дослідження (Н.Н. Бокарев и др., 1989; K. Oka, K. Tanaka, 1979) і специфічне гістохімічне виявлення фібрину (Г.А. Меркулов, 1961; Н.Н. Бокарев и др., 1989).

Зі свіжозаготовленої стабілізованої цільної донорської крові виділяли фракцію гранулоцитів (И.С. Подосинников и др., 1981). Виділені гранулоцити піддавали процедурі низькошвидкісного ізопікнічного центрифугування в ступінчастому (1,090 и 1,077 г/смі) Nycodenz-градієнті для отримання високоочищеної фракції нейтрофільних гранулоцитів (A. Boyum, 1986) з подальшим морфологічним контролем (С.Т. Наджимитдинов, 1970) і оцінкою життєздатності (A.C. Allison, M.R. Young et al., 1973). З цих нейтрофільних гранулоцитів методами препартивного центрифугування (M. Baggiolini et al., 1970; U. Bretz, M. Baggiolini, 1974) були виділені субпопуляції цитоплазматичних гранул: первинні, вторинні і третинні, які піддавали індикації на ступінь інтактності і гомогенності (P. Dell'Antone, 1978) з подальшою мінімізацією структурної латентності (C. De Duve, 1976). Ці фракції виділених субпопуляцій цитоплазматичних гранул були використані для доказу наявності АПФ в ЦНГ, факторів його активації і інгібування за допомогою активаторно-інгібуючого аналізу (Ю.Е. Елисеева и др., 1976; Е.В. Кугаевская и др., 1994). Біологічну субстратну специфічність АПФ визначали також за впливом на синтетичний брадикинін в системі ізольованого органу (роги матки самиці щура) порівняно з відповідною концентрацією еталонного препарату АПФ (Ю.Е. Елисеева и др., 1970, 1974).

Зі стабілізованої венозної крові людей методом двократного диференційованого центрифугування виділяли тромбоцити (A. Boyum, 1986) з подальшим кількісним контролем (Е.П. Иванов, 1983) і визначенням життєздатності (Ч.С. Гусейнов, 1971). У модельних дослідженнях на одержаних тромбоцитах (А.Н. Филатов, 1973; R.D. Lille, 1965) при прямій дії різних цитоплазматичних гранулярних структур нейтрофільних гранулоцитів вивчали особливості екстратромбоцитарної реакції вивільнення: визначали число бГ в цитоплазмі тромбоцитів (А.А. Маркосян, 1973; A.C. Allison, M.R. Young et al., 1973) і активність ТФ4 у нетромбоцитарному середовищі (В.Г. Лычев, 1974).

Результати роботи піддавали статистичній обробці методами, адаптованими для медико-біологічних досліджень (М.Ю. Антамонов, 2006). Визначали достовірність різниці отриманих результатів досліджень двох груп і тих, що отримані в динаміці повторних спостережень у одній і тій же групі з використанням t-критерію Стьюдента. Різниця оцінювалась як достовірна при р<0,05 (ймовірність різниці більше 95 %).

Дослідження на людях виконані відповідно до Гельсінської декларації прав людини, Конвенції Ради Європи про права людини і біомедицину, а експерименти на тваринах виконано з урахуванням Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються в експерименті і інших наукових цілях.

Результати досліджень та їх обговорення. Встановлено, що у вагітних жінок з прееклампсією при підвищенні ступеня її тяжкості в периферичній крові наростає абсолютний нейтрофільний гранулоцитоз: достовірне збільшення абсолютної кількості ЦНГ від 4,28±0,193 у невагітних жінок і 9,26±0,631 при фізіологічній вагітності до 10,93±0,454; 12,95±0,682 і (14,68±0,375) · 10⁹/л при легкому, середньому і середньотяжкому ступені прееклампсії, а також поглиблюється тромбоцитопенія: достовірне зменшення кількості тромбоцитів, циркулюючих в периферичній крові, від 252,5±8,31 і 223,8±7,89 до 190,2±6,11; 171,1±6,48 і (153,3±5,37)·10⁹/л відповідно по групах обстежених жінок.

При цьому в самих нейтрофільних гранулоцитах і тромбоцитах були виявлені наступні зміни.

У ЦНГ виявлені ознаки розвитку екзоцитарної лізосомальної реакції (табл. 1) - зменшення в цитоплазмі числа ПЛ, зменшення вмісту ЛКБ, зниження рівня активності МПО і КФ, а також зниження функціональної резистентності мембран ПЛ і системне підвищення рівнів активності маркерних лізосомальних ферментів - КД і КФ. Цей комплекс ознак супроводжується збільшенням активності АПФ, що дає підстави допустити участь у патогенезі прееклампсії ЦНГ шляхом залучення їх до АПФ-залежного механізму регуляції вазомоторними реакціями, який підтримує розвиток синдрому артеріальної гіпертензії.

Таблиця 1

Ознаки розвитку в ЦНГ екзоцитарної лізосомальної реакції і зміни активності АПФ при вагітності, що ускладнилася прееклампсією

Показник	Невагітні жінки (група 3)	Вагітні у ІІІ триместрі фізіологічної гестації (група 1.2)	Вагітні у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією
			легкого ступеня (група 1.1.1)	середнього ступеня (група 1.1.2)	середньотяжкого ступеня (група 1.1.3)
ПЛ, од. PPU	19,8±0,67	16,4±0,75 *	14,1±0,51 * #	12,6±0,38 * # ^	11,2±0,42 * # ^ &
ЛКБ, од. PPU	25,9±0,88	22,1±0,66 *	19,8±0,74 * #	17,4±0,59 * # ^	15,3±0,63 * # ^ &
МПО ПЛ, СЦК	1,75±0,039	1,59±0,027 *	1,48±0,034 * #	1,38±0,023 * # ^	1,29±0,025 * # ^ &
КФ ПЛ, СЦК	0,67±0,021	0,56±0,024 *	0,49±0,015 * #	0,45±0,011 * # ^	0,40±0,018 * # ^ &
Проникність мембран ПЛ, хв.	45,9±1,60	33,5±1,53 *	26,1±1,39 * #	21,2±1,35 * # ^	16,1±1,14 * # ^ &
Активність КД, ?Е280	0,02±0,001	0,11±0,013*	0,17±0,022 * #	0,26±0,031* # ^	0,38±0,023 * # ^ &
Активність КФ, ммоль · год.-1 · л-1	0,057±0,0033	0,250±0,0211*	0,432±0,0152* #	0,477±0,0134* # ^	0,541±0,0221* # ^ &
Активність АПФ, нмоль· хв.-1· мл-1	14,3±0,61	25,4±0,80 *	31,9±0,72 * #	36,1±0,087* # ^	39,5±0,69 * # ^ &

Примітки:

* - відмінності достовірні щодо значень у невагітних жінок (p < 0,05);

# - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі фізіологічної гестації (p < 0,05);

^ - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією легкого ступеня (p < 0,05);

& - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією середнього ступеня (p < 0,05).

У ЦТ встановлено зменшення кількості цитоплазматичних бГ і підвищення тромбоцитарної адгезивно-агрегаційної активності (табл. 2). Разом з цим слід відмітити підвищення активності антигепаринового фактора тромбоцитів.

Тобто встановлені ознаки розвитку секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення в тромбоцитах.

Таблиця 2

Ознаки екстратромбоцитарної реакції вивільнення, зміни активності ТФ4 і адгезивно-агрегаційних властивостей тромбоцитів при вагітності, що ускладнилася прееклампсією

Показник	Невагітні жінки (група 3)	Вагітні у ІІІ триместрі фізіологічної гестації (група 1.2)	Вагітні у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією
			легкого ступеня (група 1.1.1)	середнього ступеня (група 1.1.2)	середньотяжкого ступеня (група 1.1.3)
Кількість бГ у тромбоциті, Од. PPU	9,2±0,37	7,0±0,21 *	5,2±0,22 * #	3,7±0,19 * # ^	2,6±0,14 * # ^ &
ТФ 4, с	2,3±0,29	4,7±0,42 *	6,6±0,35 * #	8,7±0,49 * # ^	9,8±0,21 * # ^ &
Адгезивні тромбоцити, %	23,4±1,21	27,1±1,39 *	35,2±2,23 * #	43,4±2,67 * # ^	59,8±2,74 * # ^ &
Ступінь агрегації тромбоцитів, %	47,5±3,88	59,8±4,12 *	77,1±4,91 * #	89,9±5,23 * # ^	98,7±3,95 * # ^ &

Примітки: * - відмінності достовірні щодо значень у невагітних жінок (p < 0,05);

# - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі фізіологічної гестації (p < 0,05);

^ - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією легкого ступеня (p < 0,05);

& - щодо значень у вагітних у ІІІ триместрі гестації, що ускладнилася прееклампсією середнього ступеня (p < 0,05).

Це дало змогу припустити, що екзоцитарна лізосомальна реакція, яка розвивається при прееклампсії в ЦНГ, ініціює розвиток секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення в тромбоцитах, які можуть таким чином брати участь в патогенезі ДВЗ-синдрому.

Виявлені зміни поглиблюються з підвищенням ступеня тяжкості преекламсії. Пологи на фоні прееклампсії, як додатковий стресогенний фактор, за нашими результатами, ще більше поглиблюють виявлені зміни.

Для виявлення неспецифічних проявів у змінах, які встановлені у вагітних з прееклампсією, були проведені експериментальні дослідження на лабораторних тваринах при моделюванні стрес-синдрому.

У експериментальних дослідженнях при моделюванні стресу (серія 1.1) із застосуванням селективної мієлодепресії і без неї доведена участь лізосомальних ферментів клітин різних тканин (легенів, серця і печінки) в розвитку лізомальної гіперферментемії. Так, співвідношення вільної активності КФ до її загальної активності в тканинах легенів при стресі становило 0,355±0,007, при стресі на фоні селективної мієлодепресії - 0,358±0,005 щодо 0,163±0,006 у інтактних тварин і 0,168±0,011 у тварин з мієлодепресією (р < 0,001), у тканинах серця - 0,15±0,005 і 0,153±0,004 щодо 0,089±0,005 і 0,088±0,008 відповідно (р < 0,05), у тканинах печінки - 0,219±0,002 і 0,22±0,003 щодо 0,13±0,003 і 0,126±0,004 (р < 0,05). Встановлені зміни в тканинах різних органів однакові в групах із застосуванням селективної мієлодепресії і без неї.

При цьому виявлено значне підвищення активності лізосомальних маркерних ферментів в крові лабораторних тварин при моделюванні стресу. Так, активність КФ становила (0,160±0,00054) ммоль·год.^-1·л^-1 щодо 0,087±0,0051 і (0,085±0,00047) ммоль·год.^-1·л^-1 у інтактних тварин і тварин з міелодепресією (р < 0,001), а КД - (0,037±0,0013) ?Е₂₈₀ щодо 0,009±0,0011 і (0,008±0,0010) ?Е₂₈₀ відповідно (р < 0,001). Підвищення активності цих ферментів набагато менш виражене при реалізації стрес-синдрому на фоні селективної мієлодепресії: КФ - (0,105±0,0035) ммоль·год.^-1·л^-1 (р > 0,05 відносно інтактних тварин) і КД - (0,019±0,0012) ?Е₂₈₀ (р > 0,05 відносно інтактних тварин). Це свідчить, що саме циркулюючі в периферичній крові нейтрофільні гранулоцити є визначальним чинником у розвитку лізомальної гіперферментемії.

Нашими дослідженнями встановлено (серія 1.2), що при реалізації в організмі лабораторних тварин стрес-синдрому значно збільшується абсолютна кількість нейтрофільних гранулоцитів на (1,81±0,151) · 10⁹/л при реалізації стресу без селективної мієлодепресії і на (0,29±0,048) · 10⁹/л при реалізації стресу на фоні мієлодепресії (р <0,001). На фоні такого гранулоцитозу в цитоплазмі самих ЦНГ зменшується кількість ПЛ (збільшення абсолютної кількості ЦНГ, що містять менше ніж 10 штук ПЛ на 1,21±0,21 і (1,22±0,192) · 10⁹/л відповідно при стресі без мієлодепресії і на її фоні, р > 0,05) і їх інгредієнтів (збільшення абсолютної кількості ЦНГ, що містять менше ніж 10 штук гранул ЛКБ на 1,21±0,201 і (1,22±0,176) · 10⁹/л відповідно, р > 0,05), відносна кількість ЦНГ, що містять менше 10 шт. ПЛ становила 30,8±1,72 і (30,4±1,64) % відповідно (р > 0,05), а відносна кількість ЦНГ, що містять менше ніж 10 штук гранул ЛКБ - 30,8±1,72 і (30,4±1,63) % (р > 0,05), у інтактних тварин ЦНГ з таким ступенем дегрануляції і декатіонізації не знайдені.

Таким чином, мієлодепресія, знижуючи абсолютну кількість ЦНГ у крові, не впливає на процеси дегрануляції і декатіонізації. При цьому встановлене підвищення при стресі системної активності лізосомальних маркерних ензимів. Так, системна активність КФ виросла на 0,014±0,0019 і на (0,005±0,0011) ммоль·год.^-1·л^-1 відповідно при стресі без мієлодепресії і на її фоні (р < 0,001), а активність КД на 0,041±0,0034 і (0,023±0,0027) ?Е₂₈₀ відповідно (р < 0,001), тобто при стресі на фоні селективної мієлодепресії рівень підйому активності цих ферментів істотно нижче. Отже, ступінь лізосомальної ферментемії при стресі зумовлений значною мірою лізосомальними реакціями ЦНГ.

У експериментальних тварин при стресі розвиток у ЦНГ екзоцитарної лізосомальної реакції викликає підвищення активності АПФ на (2,64±0,292) нмоль·хв.^-1·мл^-1 і ТФ4 на (0,5±0,12) с, менш виражене при мієлодепресії: на (1,08±0,257) нмоль·хв.^-1·мл^-1 і (0,2±0,07) с відповідно (р < 0,05 відносно тварин зі стресом без мієлодепресії). Це супроводжується проявами гіперкоагуляції, що може бути зумовлено збільшенням активності в плазмі крові ТФ4, який має здатність безпосередньо нейтралізувати гепарин і інгібувати активність антитромбіну III, тим самим ініціюючи прояви в крові гіперкоагуляції (Л.А. Лаврова, 1986; F.G.J. Hayhoe, 1980). У коагуляційній ланці відмічено скорочення тромбінового часу на 1,9±0,21 щодо (0,8±0,18) с при моделюванні стресу на фоні мієлодепресії (р < 0,05), протромбінового часу на 2,3±0,15 і (0,9±0,22) с відповідно (р < 0,05), кефалін-коалінового часу на 7,4±0,33 і (3,2±0,19) с (р < 0,05), збільшення концентрації фібриногену на 0,12±0,018 і (0,04±0,006) г/л (р < 0,05). У фібринолітичній ланці зменшувався час Хагеманзалежного фібринолізу на 25,8±3,14 і 8,9±1,76 хв. (р < 0,05), у кініногенезі - скорочувався протромбіновий час у тесті холодової активації калікреїнового моста на 15,3±1,18 і (6,1±1,29) с (р < 0,05). Таким чином, усі ці зміни менш виражені при мієлодепресії, яка зумовлює зниження кількості ЦНГ в крові, що підтверджує важливу роль саме ЦНГ у цих процесах.

Для вивчення специфічної складової в реакціях, виявлених нами у вагітних з прееклампсією, були проведені експериментальні дослідження на лабораторних тваринах з відтвореною моделлю прееклампсії.

При відтворенні моделі прееклампсії вагітних у експериментальних тварин (серія 2) встановлена виражена активація гранулоцитопоезу: збільшення абсолютної кількості клітин проліферуючого (43,9±2,23 щодо 29,2±2,14 і (5,8±0,56) · 10⁹/л у сукрольних кролиць з неускладненою вагітністю і невагітних кролиць, р <0,001) і дозріваючого пулів (70,3±3,92 щодо 48,9±3,16 і (26,7±2,23) · 10⁹/л відповідно, р <0,001) нейтрофільного гранулоцитарного ряду в кістковому мозку. Це зумовлює збільшення числа нейтрофільних гранулоцитів в периферичній крові до 15,8±0,47 щодо 8,7±0,41 і (4,0±0,21)·10⁹/л у сукрольних кролиць з неускладненою вагітністю і невагітних кролиць (р<0,001).

Водночас у тварин з прееклампсією і мієлодепресією показники були значно зниженими: абсолютна кількість клітин проліферуючого пулу становила (34,9±3,45) · 10⁹/л, дозріваючого пулу - (49,2±4,12) · 10⁹/л, абсолютна кількість ЦНГ у периферичній крові - (9,3±0,33) · 10⁹/л.

Проведене дослідження стану ПЛ у ЦНГ показало, що у сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії абсолютна кількість ЦНГ, які містять у своїй цитоплазмі менше ніж 10 штук ПЛ, значно перевищує значення у сукрольних кролиць з нормальною вагітністю (9,8±0,36 щодо (5,1±0,18) · 10⁹/л, р<0,001), у невагітних тварин таких ЦНГ не виявлено. Абсолютна кількість ЦНГ, що містять менше ніж 10 гранул ЛКБ при прееклампсії становила 5,7±0,39 щодо (5,1±0,20) · 10⁹/л (р<0,001), у невагітних тварин таких ЦНГ не виявлено.

При цьому рівень дегрануляції і декатіонізації при прееклампсії на фоні мієлодепресії не відрізнявся від такого у тварин з неускладненою вагітністю (кількість ЦНГ, що містять у цитоплазмі менше ніж 10 штук ПЛ, становила (5,7±0,42) · 10⁹/л, а кількість ЦНГ, що містять менше ніж 10 гранул ЛКБ - (5,7±0,39) · 10⁹/л).

Виконана цитофлюоресцентна індикація ПЛ ЦНГ дала змогу виявити також значне зниження цього показника при прееклампсії до 11,6±0,31 і до (12,1±0,58) од. PPU при прееклампсії на фоні мієлодепресії щодо (14,2±0,46) од. PPU у сукрольних кролиць (р<0,001), у яких цей показник вище, ніж у невагітних - (17,3±0,57) од. PPU (р<0,001). На зниження числа ПЛ не впливає застосований нами варіант селективної мієлодепресії, який різко знижує кількість у крові ЦНГ, що доводить адекватність наших експериментальних досліджень задачам з'ясування їх участі в патогенетичних реакціях прееклампсії вагітних.

У сукрольних кролиць з прееклампсією встановлене істотне підвищення в крові активності лізосомальних ферментів. Так, активність КД становила 0,212±0,0153 і (0,114±0,0138) ?Е₂₈₀ при мієлодепресії щодо (0,094±0,0149) ?Е₂₈₀ у сукрольних кролиць і (0,018±0,0022) ?Е₂₈₀ у невагітних (р<0,001), активність КФ - 0,138±0,0112 і (0,079±0,0067) ммоль·год.^-1·л^-1 щодо 0,062±0,0083 і (0,021±0,0031) ммоль·год.^-1·л^-1 відповідно (р<0,001). При цьому значення показників при мієлодепресії не відрізняються від таких у кролиць з неускладненою вагітністю (р>0,5) і значно знижені в порівнянні з сукрольними кролицями з прееклампсією (р<0,001).

У сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії виявлена висока вільна активність АПФ (24,49±1,634) нмоль·хв.^-1·мл^-1 в порівнянні з показником як у кролиць з фізіологічною вагітністю (13,32±1,452) нмоль·хв.^-1·мл^-1 (р<0,001), так і у невагітних кролиць (6,22±1,251) нмоль·хв.^-1·мл^-1 (р<0,001). Проте при мієлодепресії значення показника достовірно нижче (18,03±1,522) нмоль·хв.^-1·мл^-1, ніж у сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії (р<0,05).

Таким чином, у сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії спостерігається посилення абсолютного нейтрофільного гранулоцитозу в периферичній крові, при цьому в цитоплазмі ЦНГ знижується кількість ПЛ, що супроводжується значущим підвищенням активності лізосомальних маркерних ензимів КД і КФ у сироватці венозної крові та активності АПФ.

На відміну від цього у кролиць з прееклампсією на фоні мієлодепресії при вираженому зменшенні кількості ЦНГ у їх цитоплазмі зменшене число ПЛ і вміст ЛКБ, знижений в крові вміст маркерних лізосомальних ензимів КД і КФ і активність АПФ. Все це є експериментальним підтвердженням існування при прееклампсії патологічного взаємозв'язку експресивного розвитку екзоцитарної лізосомальної реакції в ЦНГ і підвищення в крові вмісту активності вільної форми АПФ.

Встановлено, що у сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії кількість тромбоцитів, циркулюючих у периферичній крові, істотно знижена:191,1±9,9 щодо 270,9±9,8 і (302,9±10,3)·10⁹/л при нормальній вагітності і у невагітних тварин (р<0,001). При цьому у кролиць з прееклампсією на фоні мієлодепресії значення показника (273,96±10,14) ·10⁹/л не відрізняється від рівня при нормальній вагітності (р>0,05). У сукрольних кролиць з моделлю прееклампсії різко знижена кількість бГ у тромбоциті в порівнянні з сукрольними кролицями і невагітними (5,3±0,22 щодо 7,2±0,19 і (9,0±0,31) од.PPU відповідно, р<0,001), що супроводжується підвищенням активності в крові ТФ4 (9,7±0,61 щодо 5,9±0,46 і (2,8±0,31) с відповідно, р<0,001), тобто розвиваються ознаки тромбоцитарної реакції вивільнення. При прееклампсії на фоні мієлодепресії, яка зумовлює зниження в крові ЦНГ з розвитком екзоцитарної лізосомальної реакції, знижуються і прояви тромбоцитарної реакції вивільнення: зменшення кількості бГ у тромбоциті (7,0±0,25 од.PPU) і активності в крові ТФ4 (6,4±0,58 с).

При визначенні адгезивності і АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів встановлено, що у сукрольних кролиць з прееклампсією значно збільшена кількість адгезивних тромбоцитів (48,9±2,23 %) як відносно значень у кролиць з фізіологічною вагітністю (34,5±16,7 %, р<0,001), так і невагітних кролиць (29,7±1,39 %, р<0,001). Аналогічно підвищується і ступінь агрегації тромбоцитів (88,1±4,65 щодо 58,3±3,92 і 46,2±4,10 % відповідно, р<0,001). При мієлодепресії адгезивно-агрегаційні властивості тромбоцитів не відрізняються від таких при фізіологічній вагітності (37,6±2,14 і 65,1±3,76 %).

При дослідженні стану плазменної ланки системи гемостазу встановлено (табл. 3), що у сукрольних кролиць з відтвореною моделлю прееклампсії в порівнянні з кролицями з нормальною вагітністю і з невагітними істотно зменшується час рекальцифікації і тромбіновий час, підвищується вміст фібриногену і збільшується активність фібринстабілізуючого фактора, а також стають позитивними етаноловий і протамінсульфатний тести, тобто виявляються ознаки розвитку першої стадії ДВЗ-синдрому.

Таблиця 3

Показники стану плазменного компоненту системи гемостазу у кролиць

Показник	Кролиці невагітні	Сукрольні кролиці	Сукрольні кролиці з прееклампсією	Сукрольні кролиці з прееклампсією на фоні мієлодепресії
Час рекаль-цифікації, с	79,1±2,52	68,4±2,83*	48,9±4,15 * #	69,5±3,64 * ^
Тромбіновий час, с	17,9±0,41	15,4±0,76*	11,2±0,84 * #	15,8±0,87 * ^
Концентрація фібриногену, г/л	0,93±0,052	1,14±0,049*	1,75±0,091 * #	1,23±0,104 * ^
Фібринстабі-лізуючий фактор, с	54,6±3,23	67,3±2,94*	86,1±3,51 * #	67,9±2,54 * ^
Етаноловий тест	«0»	«0»	«1»	«0»
Протамін-сульфатний тест	«0»	«0»	«1»	«0»

Примітки:

* - відмінності достовірні щодо значень у невагітних кролиць (р < 0,05);

# - щодо значень у сукрольних кролиць (р < 0,05);

^ - щодо значень у вагітних у сукрольних кролиць з прееклампсією (р < 0,05).

Принципово важливим є те, що при моделюванні прееклампсії вагітних у сукрольних кролиць прояви гіперкоагуляції на тлі вираженої тромбоцитопенії і поява продуктів деградації фібрину характеризують патологічну активацію гемостазу, тобто розвиток ДВЗ-синдрому. У дослідженнях плазменної ланки системи гемостазу при моделюванні прееклампсії на фоні мієлодепресії ознак останнього не виявлено.

Патогістологічні дослідження тканин легенів, правої нирки, надниркової залози і печінки тварин з моделлю прееклампсії виявили наявність мікротромбів і агрегатів формених елементів крові, що супроводжується геморагічними проявами і некротичними змінами на тлі генералізованого вазоспазму артеріальної ланки гемомікроциркуляторного русла, тобто одержані патогістологічні докази проявів ДВЗ-синдрому. Проте при моделюванні прееклампсії на фоні селективної мієлодепресії були виявлені лише виражені ознаки вазоспазму кінцевих відділів артерій малого калібру і артеріол, тобто нам не вдалося встановити доказових ознак розвитку ДВЗ-синдрому. Отже, такі порівняльні дослідження у сукрольних кролиць з моделлю прееклампсії вагітних, з моделлю прееклампсії на фоні мієлодепресії, у сукрольних та невагітних кролиць свідчать, що розвиток у ЦНГ лізосомальної екзоцитарної реакції ініціює у ЦТ посилення екстратромбоцитарної реакції вивільнення, яка, в свою чергу, бере участь в патогенезі ДВЗ-синдрому.

З цільної стабілізованої донорської крові була виділена високоочищена фракція ЦНГ з вмістом ЦНГ понад 98-99 %. Застосувавши методи препаративного центрифугування, з одержаних життєздатних нейтрофільних гранулоцитів були виділені три субпопуляції цитоплазматичних гранул (азурофільні, специфічні і малі лізосомоподібні).

У першій серії досліджень був вивчений вплив різних субпопуляцій цитоплазматичних гранул нейтрофільних гранулоцитів людей на активність еталонного АПФ. Встановлено, що саме субпопуляція специфічних гранул ЦНГ людини має виражену інгібуючу дію на АПФ, а субпопуляція малих лізосомоподібних гранул - активуючу дію.

У другій серії досліджень встановлена наявність активності АПФ у фракції ПЛ: (18,7±0,48) нмоль·хв.^-1·мл^-1 (р<0,001), і при цьому її практично не було знайдено ні у фракції специфічних гранул, ні у фракції малих лізосомоподібних гранул.

Ці результати пояснюють факт відсутності змін при внесенні фракції ПЛ у фермент-субстратне середовище в першій серії досліджень. Таким чином, результати двох серій досліджень вказують на те, що АПФ-активність зосереджена в субпопуляції азурофільних гранул (ПЛ) ЦНГ.

У третій, четвертій і п'ятій серіях досліджень вивчалася тільки субпопуляція ПЛ ЦНГ.

У третій серії досліджень встановлено, що АПФ-активність елюата фракції ПЛ ЦНГ (95,5±0,20 %) різко пригнічується каптоприлом (3,4±0,04 %, р<0,001) і виражено знижується (8,3±0,29 %, р<0,001) при використанні ЕДТА, які є інгібіторами АПФ.

У четвертій серії досліджень виявлено, що АПФ-активність елюату фракції ПЛ ЦНГ у реакційному середовищі без наявності іонів хлору (21,7±0,39 %) і значно підвищується при їх застосуванні (94,6±0,43 %, р<0,001), які є активаторами АПФ.

У п'ятій серії досліджень виявлено, що елюат ПЛ ЦНГ має здатність руйнувати брадикінін. Це виявляється в дуже різкому зниженні його окситоцинової дії (5,2±0,07 %, р<0,001), що тестується біологічним методом на ізольованій ділянці рога матки щура. Згідно з літературними даними, брадикінін, є біологічним субстратом, на який впливає АПФ в цілісному організмі (М.Д. Машковський, 2005).

Таким чином, результати досліджень на ізольованих нейтрофільних гранулоцитах свідчать, що АПФ міститься в ПЛ ЦНГ, фактори його інгібування знаходяться в специфічних гранулах, а фактори активації - в малих лізосомоподібних гранулах.

Одержані результати доводять безпосередню участь циркулюючих у периферичній крові нейтрофільних гранулоцитів в регуляції судинного тонусу за АПФ-залежним механізмом через утворення пресорного пептиду - ангіотензину II і руйнування депресорного пептиду - брадикініну, пептидів - функціональних антагоністів, які виражено впливають на вазомоторні реакції, що беруть участь у підтримці відповідного рівня артеріального тиску. Проведені також дослідження в системі in vitro з вивчення особливостей секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення в ЦТ людини під впливом інгредієнтів, що містяться в різних субпопуляціях цитоплазматичних гранул ЦНГ людини.

При внесенні до ЦТ у першій серії досліджень фракції ПЛ ЦНГ, починаючи з першої хвилини спостережень, без видимого латентного періоду, відбувається прогресуюче зменшення кількості бГ (4,1±0,29 щодо (8,6±0,37) од.PPU в інтактних тромбоцитах і (8,3±0,27) од. PPU у контрольній серії, р<0,001). Одночасно більш виражено ніж в контрольній серії підвищуєтся активність ТФ4 (3,5±0,25 щодо 0,3±0,02 с, р<0,001) у позатромбоцитарному середовищі.

Динаміка зменшення кількості бГ і підвищення активності ТФ4 у другій і третій серії досліджень, коли застосовувалися відповідно специфічні і третинні гранули, була менш вираженою і практично не відрізнялася від контрольної серії. Встановлене в третій серії досліджень деяке збільшення секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення можна пояснити тим, що третинні гранули ЦНГ відносяться до лізосомоподібних, які містять деякі лізосомальні ферменти.

Таким чином встановлено, що ферменти ПЛ ЦНГ мають ініціюючу дію на розвиток в тромбоцитах секреторної екстратромбоцитарної реакції вивільнення з підвищенням системної активності антигепаринового фактора тромбоцитів, який бере участь у розвитку гіперкоагуляції, що сприяє, в свою чергу, реалізації ДВЗ-синдрому. Проведені дослідження особливостей ультраструктури нейтрофільних гранулоцитів і тромбоцитів, що циркулюють в периферичній крові у вагітних з прееклампсією.

У результаті вивчення було встановлено збільшення кількості ЦНГ з вираженою активацією (співвідношення кількості активованих ЦНГ до неактивованих збільшується від 0,133±0,04 у невагітних жінок до 1,801±0,15, 4,587±0,53 і 14,385±1,22 у вагітних з фізіологічною гестацією, з прееклампсією легкого і середньотяжкого ступеня відповідно, р<0,05). У самих ЦНГ на тлі видозміни рельєфу лейкоцитарного профілю відбуваються реформації ядра: перерозподіл співвідношення вмісту гетеро- і еухроматину у бік останнього (збільшення співвідношення від 1,375±0,16 % у невагітних жінок до 2,0±0,09, 3,525±0,17 і (7,850±1,19) % у вагітних з фізіологічною гестацією, з прееклампсією легкого і середньотяжкого ступеня відповідно, р<0,05), а також виявляються локальні розшарування нуклеоми.

...