Гіпергомоцистеїнемія та асоційовані з нею метаболічні та судинні фактори прогресування фіброзу і цирозу печінки: можливості патогенетичної терапії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Державний вищий навчальний заклад

Івано-франківський національний медичний університет

УДК 616.83-005:577.1:542.231.2:616.36-004:615-08

Гіпергомоцистеїнемія та асоційовані з нею метаболічні та судинні фактори прогресування фіброзу і цирозу печінки: можливості патогенетичної терапії

14.01.36 - гастроентерологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Пентюк Наталія Олександрівна

Івано-Франківськ 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І. Пирогова МОЗ України

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАМН України ХАРЧЕНКО Наталія В'ячеславівна Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, м. Київ, кафедра гастроентерології, дієтології та ендоскопії, завідувач кафедри

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор МІЩУК Василь Григорович ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет МОЗ України», м. Івано-Франківськ, кафедра терапії і сімейної медицини факультету післядипломної освіти, професор кафедри.

Доктор медичних наук, професор ЗВЯГІНЦЕВА Тетяна Дмитрівна Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, м. Харків, кафедра гастроентерології, завідувач кафедри.

Доктор медичних наук, професор СТАРОДУБ Євген Михайлович Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, м. Тернопіль, кафедра поліклінічної справи та сімейної медицини з медичною технікою медичного факультету, професор кафедри.

Захист дисертації відбудеться «23» червня 2011 року об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 20.601.01 при ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 2)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДВНЗ «Івано-Франківський національний медичний університет» МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 7)

Автореферат розісланий «16» травня 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук, професор О.І. Дєльцова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Хронічні захворювання печінки є актуальною проблемою сучасної клінічної медицини як в Україні, так і у світі завдяки їх широкій поширеності та прогредієнтному перебігу з розвитком важких ускладнень (Харченко Н.В. та співав., 2007; Бабак О.Я., 2009; Звягинцева Т.Д., 2010). Сотні мільйонів пацієнтів страждають на хронічні гепатити (ХГ) і у 25-30% із них захворювання прогресує з розвитком фіброзу та цирозу печінки (Pinzani М., 2005). Цироз печінки (ЦП) є найбільш частою причиною смерті при патології шлунково-кишкового тракту і посідає 7-е місце серед причин смерті від неонкологічних захворювань (Parola М., Pinzani М., 2009). У частини хворих ЦП трансформується в гепатоцелюлярну карциному, що веде до ще більшого зростання смертності (Cabibbo G., Craxм A., 2010).

Несприятливі умови, що склалися в останні десятиліття, а саме епідемія вірусних гепатитів, зростання споживання алкоголю, поширення ожиріння та метаболічного синдрому, а відтак і неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ), обумовлюють подальше зростання кількості пацієнтів із термінальними захворюваннями печінки, пік якого, за даними епідеміологічного аналізу, очікується у 2010 - 2020 роках (Parola М., Pinzani М., 2009). Відображенням цього процесу є зростання поширеності ЦП як у світі, так і в Україні (Харченко Н.В. та співав., 2007; Андрейчин М.А., 2008). Поширеність та захворюваність на ЦП в Україні в 1997-2005 роках зросли, відповідно, на 35,3% та 93,3% і в 2005 році смертність від цирозу та його ускладнень складала 30,1 на 100 тис. дорослого населення (Філіппов Ю.О. і співав., 2007).

Не дивлячись на значні досягнення у вивченні механізмів прогресування фіброзу і ЦП, сьогодні не розроблено ефективних підходів до гальмування цих процесів (Andrade D.R. et al., 2009; Schuppan D., Popov Y., 2009; Talwalkar J.A., 2010). Цілком очевидно, що певні шляхи прогресування фіброзу і ЦП та медіатори, що їх опосередковують, не до кінця розкриті, що і стримує пошук і апробацію дієвих терапевтичних засобів.

Накопичені в останні роки клінічні і експериментальні дані свідчать, що процеси печінкового фіброгенезу, а також регуляція печінкової і системної гемодинаміки при ЦП перебувають під контролем численних ендо-, пара-, та автокринних, метаболічних і генетичних чинників (Бабак О.Я. та співав., 2009; Friedman S.L., 2008; Colle I. et al., 2008; Balsano C., 2009). Нещодавно було продемонстровано, що C677T полімофізм по гену метилентетрагідрофолатредуктази асоціюється з більш високими темпами прогресування фіброзу печінки у хворих на ХГ С (Adinolfi L.E. et al., 2005; Toniutto Р. et al., 2008), а частота цього поліморфізму у хворих на ЦП є суттєво вищою, ніж у здорових (Zhou X.M. et al., 2005). Оскільки дана мутація веде до розвитку гіпергомоцистеїнемії (ГГЦ), то не виключено, що надлишок гомоцистеїну (ГЦ) є патогенетичним чинником прогресування хронічних захворювань печінки.

ГГЦ є загальновизнаним незалежним фактором ризику атеротромботичних та нейродегенеративних захворювань, остеопорозу, тератогенезу та канцерогенезу (Maron A. B., 2009; Brustolin S., 2010). В Україні ГГЦ виявляється в 10% здорових дорослих осіб, 2% юнаків та підлітків та 43% пацієнтів із серцево-судинною патологією (Пентюк О.О. та співав., 2007; Андрушко І.І., 2008), а частота С677Т поліморфізму гену метилентетрагідрофолатредуктази в популяції східної України сягає 40,7% (Гречанина Е.Я. и др., 2009). Доведені патогенетичні ефекти високих концентрацій ГЦ, а саме гальмування процесів метилування, стимулювання оксидативного стресу та продукції колагену в стінці судин, пряма і опосередкована вазоконстрикторна дія (Пентюк О.О. та співав., 2003; Huang T. еt al., 2008; Jin L. et al., 2007; Mel'nik A.V. et al., 2010) дають підстави вважати, що ГГЦ може бути причетна до прогресування хронічних захворювань печінки.

гіпергомоцистеїнемія фіброз цироз діагностика

У той же час сьогодні практично відсутні дослідження, присвячені впливу ГГЦ на формування фіброзу і ЦП. Залишається нез'ясованим, чи має ГЦ профіброгенну дію, і якщо так, то через які біохімічні механізми вона реалізується. Не вивчена частота ГГЦ при хронічних захворюваннях печінки різної етіології та не досліджений її зв'язок з забезпеченістю вітамінами В₆, В₉, В₁₂, які є коферментами ензимів утилізації ГЦ. Відомо, що печінка відіграє провідну роль у метаболізмі ГЦ (Brustolin S., 2010), однак не з'ясовано, чи може прогресуюче зниження функції печінки вносити вклад у порушення обміну цієї амінокислоти. Не встановлено також, чи здатні препарати з гіпогомоцистеїнемічною дією чинити гальмівний вплив на прогресування фіброзу і ЦП.

В останні роки інтенсивно досліджується роль вазоактивних субстанцій у формуванні фіброзу, ЦП та його ускладнень. У низці робіт показана протективна роль оксиду азоту при формуванні фіброзу та його депримуючий вплив на мезентеріальну і системну циркуляцію при маніфестному ЦП (Friedman S.L., 2008; Mоller S., Henriksen J.H., 2008). У той же час роль інших вазоактивних сполук практично не досліджена. Нещодавно було показано, що ГЦ, як і цистеїн, є джерелом утворення гідроген сульфіду - потужного вазодилатуючого медіатора (Lowicka E., Beltowski J., 2007). Обмін ГЦ тісно спряжений з утворенням і деградацією іншої вазоактивної сполуки - аденозину (Williams K.T., Schalinske K.L., 2010). Однак сьогодні не відомо, в якій мірі ці вазоактивні речовини причетні до прогресування фіброзу печінки та розладів системної гемодинаміки й ускладнень ЦП.

Вважаємо, що розкриття ролі ГГЦ та асоційованих із нею судинних і метаболічних порушень у прогресуванні фіброзу і ЦП та розробка підходів до їх корекції становить значний науковий інтерес і є актуальною проблемою сучасної гастроентерології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової НДР кафедри біологічної та загальної хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова «Обмін гомоцистеїну в умовах дії нутрієнтних чинників та при різних патологічних станах» № держреєстрації 0106U005134 (автор є виконавцем фрагменту НДР), а також у рамках НДР Науково-дослідного інституту реабілітації інвалідів ВНМУ ім. М.І. Пирогова «Розробити комплекс заходів по підвищенню ефективності реабілітації хворих на хронічний вірусний гепатит С» № держреєстрації 0105U007005 (автор є відповідальним виконавцем НДР).

Мета дослідження. Підвищити ефективність діагностики та лікування хронічних захворювань печінки на основі дослідження впливу гіпергомоцистеїнемії та асоційованих із нею метаболічних та судинних факторів на прогресування фіброзу і цирозу.

Завдання дослідження:

1. Дослідити здатність надлишку гомоцистеїну індукувати печінковий фіброгенез та розкрити біохімічні механізми профіброгенної дії гіпергомоцистеїнемії на основі дослідження морфологічних та біохімічних маркерів фіброзу печінки, основних шляхів обміну гомоцистеїну та метаболічно супряжених із ним сполук у щурів із моделями хронічної гіпергомоцистеїнемії, фіброзу та стеатозу печінки.

2. Визначити роль гомоцистеїну, ендотоксину та вазоактивних медіаторів (гідроген сульфіду, моноксиду карбону, оксиду азоту, аденозину) у формуванні асциту, ниркової дисфункції та ентеропатії в щурів зі ЦП.

3. Дослідити антифіброзну активність препаратів із гіпогомоцистеїнемічною, вазоактивною, антиоксидантною та антистеатогенною дією (кандесартан, периндоприл, аргінін, бетаїн, S-аденозилметіонін, фолієва кислота, піоглітазон, ізофлавоноїди сої) на моделях фіброзу та його поєднання з гіпергомоцистеїнемією або стеатозом печінки в щурів.

4. Оцінити діагностичну значимість біомаркерів клітинного ураження та стеатозу печінки, запалення та оксидативного стресу, метаболізму позаклітинного матриксу, фіброгенних цитокінів у прогнозуванні стадії фіброзу та розробити метод неінвазивної діагностики фіброзу печінки у хворих на ХГ.

5. Визначити поширеність синдрому гіпергомоцистеїнемії у хворих на ХГ і ЦП різної етіології та дослідити зв'язок гіпергомоцистеїнемії з забезпеченістю вітамінами В₆, В₉, В₁₂.

6. Дослідити вплив гіпергомоцистеїнемії та асоційованих з нею метаболічних порушень (гіпометилування, оксидативний стрес, гальмування продукції вазодилатуючих медіаторів) на формування фіброзу печінки у хворих на хронічні гепатити та ідентифікувати найбільш прогностично несприятливий метаболічний патерн прогресування фіброзу.

7. Оцінити можливість гальмування фіброзу печінки у хворих на хронічні гепатити шляхом корекції гіпергомоцистеїнемії та асоційованих з нею судинних і метаболічних порушень включенням до комплексу лікування фолієвої кислоти та кандесартану.

8. Дослідити патогенетичну роль порушень обміну гомоцистеїну та вазоактивних медіаторів (гідроген сульфіду, моноксиду карбону, оксиду азоту, аденозину) у прогресуванні цирозу та розвитку його ускладнень у хворих на цироз печінки.

9. Визначити предиктори розвитку гепаторенального синдрому в пацієнтів із цирозом печінки та оцінити можливість використання блокатора аденозинових рецепторів пентоксифіліну в якості засобу патогенетичної терапії.

Об'єкт дослідження: печінковий фіброгенез, декомпенсація ЦП.

Предмет дослідження: обмін ГЦ та метаболічно супряжених із ними сполук та їх зв'язок із процесами формування фіброзу печінки, цирозу та розвитку його ускладнень; антифіброзна активність гіпогомоцистеїнемічних засобів.

Методи дослідження: клінічні, інструментальні, морфологічні (світлова та електронна мікроскопія), біохімічні (вміст ГЦ, вазоактивних речовин, маркерів фіброзу печінки та оксидативного стресу, активність ферментів метилування, транссульфування, нуклеотидного та тіол-дисульфідного обміну, забезпеченість вітамінами В₆, В₉, В₁₂,), патофізіологічні (моделювання ГГЦ, фіброзу, стеатозу та ЦП), фармакологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше на основі експериментального та клінічного дослідження впливу порушень обміну ГЦ та метаболічно супряжених із ним сполук на формування фіброзу печінки та декомпенсацію ЦП встановлена роль ГГЦ як нового незалежного метаболічного чинника прогресування хронічних захворювань печінки, сформульована патогенетична концепція впливу ГГЦ на формування фіброзу і ЦП та індивідуалізовані підходи до патогенетичної терапії.

В експериментальних умовах доведено, що ГГЦ індукує печінковий фіброгенез в інтактних щурів, що проявляється зростанням вмісту біохімічних маркерів фіброгенезу, проліферацією печінкових фібробластів, відкладанням колагену в печінці. Показано, що ГГЦ акселерує фіброз, індукований введенням CCl₄, що веде до формування декомпенсованого ЦП у щурів. ГГЦ суттєво обтяжує важкість ниркової дисфункції, ентеропатії та бактеріальної транслокації в щурів із ССl₄ -індукованим ЦП.

Уперше встановлено, що профіброгенна дія ГГЦ реалізується через ініціювання оксидативного стресу внаслідок активації прооксидантних ензимів та зниження активності антиоксидантних ензимів у печінці, зменшення продукції вазодилататора гідроген сульфіду внаслідок інгібування активності ферментів транссульфування, зменшення продукції вазоактивного метаболіту аденозину в результаті порушення нуклеотидного обміну, гальмування процесів метилування, розвитку стеатозу печінки. Доведено, що фолієва кислота гальмує печінковий фіброгенез, індукований CCl₄ та ГГЦ у щурів, що асоціюється зі зниженням вмісту ГЦ, відновленням активності ферментних систем метилування, транссульфування, нуклеотидного обміну, про- та антиоксидантних ензимів.

Новими є дані щодо поширеності ГГЦ при хронічних захворюваннях печінки. Встановлено, що у хворих на ХГ і ЦП має місце підвищення рівня ГЦ у сироватці крові, порівняно з таким у практично здорових осіб. Оптимальні рівні ГЦ (?10 мкмоль/л) реєструвались у 78,8% практично здорових осіб і лише в 29,0 та 2,7% хворих на ХГ і ЦП, відповідно. ГГЦ (вміст ГЦ >15 мкмоль/л) виявляли в 7,6% здорових осіб та в 29,0 та 77,0% хворих на ХГ і ЦП, відповідно. Вміст ГЦ у сироватці крові хворих на хронічні захворювання печінки не залежить від статі та слабко корелює з віком хворих. ГГЦ частіше виявляється у хворих з алкогольною етіологією захворювання.

У хворих на ХГ і ЦП встановлено, що провідною мікронутрієнтною детермінантою рівня ГЦ є статус фолієвої кислоти. Серед хворих на ХГ і ЦП має місце зменшення частки осіб з оптимальним рівнем забезпеченості та зростання частки осіб із маргінальною забезпеченістю та дефіцитом цього мікронутрієнту. Статус кобаламіну та піридоксину вносить суттєво менший вклад у формування ГГЦ у пацієнтів із хронічними захворюваннями печінки.

На основі дисперсійного та регресійного аналізу з'ясовано, що вміст ГЦ у сироватці крові є найбільш значущим незалежним метаболічним предиктором формування фіброзу печінки у хворих на ХГ. Встановлено, що підвищення рівнів ГЦ у сироватці крові та важкість індукованих ГГЦ метаболічних порушень (порушення обміну гідроген сульфіду та аденозину, процесів метилування, явища оксидативного стресу) у хворих на ХГ тісно асоціюються зі збільшенням морфологічної стадії фіброзу печінки та зростанням вмісту біохімічних маркерів фіброгенезу в сироватці крові. Вклад ГГЦ та асоційованих із нею метаболічних порушень у формування стеатозу печінки є суттєво меншим.

Збільшення важкості ЦП асоціюється з наростанням ГГЦ та асоційованих із нею метаболічних порушень - гіпометилування та оксидативного стресу. Водночас, на відміну від фіброгенезу, прогресування ЦП супроводжується надмірним накопиченням вмісту вазоактивних метаболітів гідроген сульфіду, оксиду азоту, моноксиду карбону та аденозину. Провідним патогенетичним чинником, який визначає гіперпродукцію цих вазоактивних медіаторів, є надмірна проникність кишки та зростання вмісту ендотоксину в сироватці крові. Уперше встановлено, що гіперпродукція гідроген сульфіду причетна до формування асциту та гіпердинамічного типу кровообігу у хворих на ЦП.

Практичне значення і впровадження результатів роботи в практику. Одержані результати щодо ролі ГГЦ та асоційованих із нею судинних і метаболічних порушень у прогресуванні хронічних захворювань печінки суттєво поглиблюють існуючі уявлення про патогенетичні механізми формування фіброзу, ЦП та розвитку його декомпенсації, дозволяють визначити групи високого ризику швидкого прогресування захворювання та створюють підґрунтя до диференційованої патогенетичної терапії хворих на ХГ і ЦП.

Показано, що ГГЦ є частим метаболічним порушенням у пацієнтів із хронічними захворюваннями печінки і реєструється у 29% та 77% хворих на ХГ і ЦП, відповідно. Доведена роль ГГЦ як незалежного метаболічного чинника прогресування фіброзу та ЦП. Встановлено, що вагому роль у формуванні ГГЦ у хворих на ХГ і ЦП відіграє забезпеченість пацієнтів фолієвою кислотою. Застосування фолієвої кислоти дозволяє суттєво потенціювати антифіброзний ефект кандесартану у хворих на ХГ із супутньою артеріальною гіпертензією, що проявляється зниженням вмісту біохімічних маркерів фіброгенезу та асоціюється зі зниженням вмісту ГЦ у сироватці крові, зменшенням важкості асоційованих із ГГЦ метаболічних порушень.

Найбільш прогностично несприятливими метаболічними чинниками прогресування фіброзу печінки поряд з ГГЦ є інсулінорезистентність, оксидативна модифікація білків та тіол-дисульфідний дисбаланс.

На основі вивчення діагностичної цінності біохімічних маркерів фіброгенезу встановлено, що незалежними лабораторними предикторами важкості фіброзу печінки є вміст тканинного інгібітора металопротеїнази-1 (ТІМП-1), трансформуючого фактора росту-бета-1 (ТФР-в-1), г-глобулінів у сироватці крові, тромбоцитів у крові та активність сироваткової параоксонази. Створена на основі цих предикторів математична модель дозволяє з високою чутливістю та специфічністю прогнозувати наявність виразного фіброзу при біопсії у хворих на ХГ вірусної та вірусно-алкогольної етіології і може бути використана для моніторингу прогресування фіброзу печінки.

Встановлено, що формування асциту та гіпердинамічного кровообігу у хворих із субкомпенсованим та декомпенсованим ЦП асоціюється зі зростанням вмісту ендотоксину в сироватці крові та надмірним утворенням вазоактивних медіаторів гідроген сульфіду, оксиду азоту, моноксиду карбону та аденозину. Високі рівні гідроген сульфіду, нітратів і нітритів у сироватці крові та карбоксигемоглобіну в крові можуть слугувати маркерами настання декомпенсації ЦП. Вміст ГЦ у сироватці крові поряд із вмістом ендотоксину та активністю аденозиндезамінази є предикторами розвитку гепаторенального синдрому. Застосування антагоніста аденозинових рецепторів пентоксифіліну в комплексі лікування гепаторенального синдрому дозволяє досягти покращення фільтраційної функції нирок, що асоціюється зі зниженням вмісту ендотоксину, вазоактивних метаболітів, зростанням активності сироваткової аденозиндезамінази.

Показано, що перспективним напрямком подальших клінічних досліджень є вивчення антифіброзної активності ізофлавоноїдів сої, тіазолідиндіонів та донорів метильних груп.

Практичне значення результатів даного дослідження підтверджується 2 Патентами України на корисні моделі. Видані затверджені МОЗ України методичні рекомендації. Результати дослідження впроваджено в роботу міських клінічних лікарень м. Вінниці, Вінницької обласної лікарні ім. М.І. Пирогова, Харківської обласної клінічної лікарні, Республіканської клінічної лікарні ім. Н.А. Семашко (АР Крим), використовуються в навчальному процесі кафедр Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, Кримського державного медичного університету С.І. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є науковою працею здобувача. Внесок автора є основним і полягає у виборі теми дисертації, обсягу та методів дослідження, у постановці мети та формуванні завдань роботи, визначенні моделей експериментального дослідження, контингенту обстежених хворих і контрольної групи, проведенні клінічних та інструментальних обстежень, створенні бази даних та їх статистичній обробці, узагальненні результатів, формулюванні висновків, оформленні дисертації. Автор не запозичував ідеї та розробки співавторів публікацій. Матеріали, положення та висновки кандидатської дисертації не використовувалися. Частина біохімічних та морфологічні дослідження виконані сумісно зі співробітниками науково-дослідної клініко-діагностичної лабораторії ВНМУ ім. М.І. Пирогова, співучасть яких відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на другій міжнародній конференції “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Терапевтичні читання 2008” (Вінниця, 2008), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Актуальні проблеми реабілітації інвалідів» (Вінниця, 2009), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії» (Тернопіль, 2009), Х Українському біохімічному з'їзді (Одеса, 2010), VIII з'їзді інфекціоністів України (Вінниця, 2010), конференції ДУ Інститут терапії імені Л.Т. Малої НАМН України «Перспективні технології діагностики і лікування терапевтичних захворювань» (Харків, 2010), засіданнях терапевтичного товариства м. Вінниці (2008 - 2009).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 29 наукових праць, у тому числі 21 стаття в фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (одноосібних - 12), 5 - у матеріалах з'їздів та конференцій, 2 патенти України на корисні моделі, методичні рекомендації, затверджені МОЗ України.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 273 сторінках основного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, шести розділів власних досліджень, аналізу і узагальненню отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел та додатків. Робота ілюстрована 31 рисунком та 105 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 514 найменувань, з них 40 - кирилицею, 474 - латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи досліджень. Експериментальне дослідження проведено на 253 білих нелінійних щурах самцях. Усі його етапи виконані з дотриманням засад «Європейської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують з експериментальною та іншою науковою метою» (м. Страсбург, 1986) та затверджені комітетом з біоетики ВНМУ ім. М.І. Пирогова (протокол № 14 від 25.11.2010). Щурів утримували на стандартній крохмально-казеїновій дієті, яка дозволяє контролювати харчовий статус за всіма макро- та мікронутрієнтами (Пентюк О.О. та співав., 2007).

Експериментальні моделі ГГЦ, фіброзу, стеатозу та ЦП у щурів. Хронічна ГГЦ була створена шляхом інтрагастрального введення тіолактону ГЦ у дозі 100 мг/кг маси 4 дні на тиждень протягом 6 тижнів (Fischer P.A. et al., 2003). Фіброз/цироз печінки моделювали інтрагастральним введенням тетрахлорметану (CCl₄) у дозі 0,3 мл 40% розчину CCl₄ на соняшниковій олії на 100 г маси тіла тварини двічі на тиждень протягом 6 тижнів (He S.-X. et al., 2006). На моделі CCl₄ -індукованого фіброзу/цирозу печінки була досліджена антифіброзна активність блокатора рецепторів ангіотензину ІІ кандесартану («Кандесар», Ranbaxy, 8 мг/кг), інгібітора ангіотензин перетворюючого ферменту периндоприлу («Престаріум», Laboratoires Servier, 2 мг/кг), інсулінового сенситайзера піоглітазону («Актос», Eli Lilly, 3 мг/кг), ізофлавоноїдів сої ЕКСО («Одеська біотехнологія», діюча речовина гінестеїн, 100 мг/кг), які вводили щоденно інтрагастрально з 2-го тижня експерименту. Для дослідження впливу ГГЦ на перебіг уже існуючого фіброзу печінки була використана модель поєднаного введення тіолактону ГЦ та CCl₄ протягом 6 тижнів. На цій моделі була вивчена антифіброзна активність цитраргініну («Цитраргінін» Zambon France, 5 мл/кг), ізофлавоноїдів сої ЕКСО (100 мг/кг) та фолієвої кислоти (0,143 мг/кг), які вводили щоденно інтрагастрально з 2-го тижня експерименту. Для з'ясування ролі ендотоксинемії та гіперпродукції вазоактивних медіаторів у розвитку декомпенсації ЦП вивчали вплив ендотоксину Sh. Boydii (Диа-М, внутрішньоочеревинно 0,5 мг/кг, 10 останніх днів), інгібітору синтази оксиду азоту L-NAME (Sigma, інтрагастрально 10 мг/кг, 7 останніх днів) та блокатора аденозинових рецепторів пентоксифіліну («Агапурин», Zentiva, інтрагастрально 16 мг/кг, 14 останніх днів експерименту). Модель стеатозу печінки відтворювали утриманням щурів протягом 6 тижнів на високо жировій дієті (ВЖД) (Harris R.B. et al., 1998; Fan J.G., 2003; Carmiel-Haggai М., 2005). На моделі фіброзу і стеатозу печінки, індукованих CCl₄ та ВЖД, вивчали антифіброзну активність інсулінового сенситайзера піоглітазону (3 мг/кг), донорів метильних груп бетаїну (Sigma, 250 мг/кг) та S-аденозилметіоніну (Sigma, 50 мг/кг), які вводили щоденно інтрагастрально з 2-го тижня досліду. Шляхи введення, дози препаратів запозичені з літератури.

Методи експериментальних досліджень. Морфологічне дослідження печінки виконували за стандартною методикою шляхом світлової мікроскопії. Зрізи печінки забарвлювали гематоксилін-еозином. Гістологічну стадію фіброзу визначали за шкалою від 0 до 4 балів (Raetsch С. et al., 2002). В якості маркерів печінкового фіброгенезу визначали вміст трансформуючого фактора росту-в-1 (ТФР-в-1) та гіалуронату в сироватці крові (Alpco Diagnostics, ВСМ Diagnostics), вміст ретиноїдів (Wang С.С. et al., 1978) та гідроксипроліну в печінці (Siddiqi N.J., Alhomida A.S., 2003), активність сироваткової параоксонази (КФ 3.1.1.2) (Connelly P.W. et al., 2004). В якості маркерів стеатозу визначали вміст тригліцеридів та холестерину в печінці уніфікованими методами. У ліпідному екстракті печінки визначали вміст фосфоліпідів та їх фракційний склад методом тонкошарової хроматографії (Пентюк А.А. и др., 1987). Із метою оцінки процесів оксидативного стресу визначали активність ферментів аконітази (КФ 4.2.1.3), NADPH-оксидази (КФ 1.6.3.1), тіоредоксинредуктази (КФ 1.8.1.9) та ксантиноксидази печінки (Fukui Т. et al., 1997; Takemoto М. et al., 2001; Melnick J.Z. et al., 2000; Xia Y., Zweier J.L., 1995; Lu J. et al., 2006), вміст карбонільних груп білків, тіольних груп сироватки крові (Levine R.L. et al., 1994; Веревкина И.В. и др., 1977). У зразках гомогенатів печінки визначали: активність ферментів метилування - бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази (КФ 2.1.1.5) та S-аденозилметіонінсинтази (КФ 2.5.1.6) (Ericson L.E. et al., 1960; Chiang P.K. et al., 1977); активність ферментів транссульфування цистатіонін-в-синтази (КФ 4.2.1.22), цистатіонін-г-ліази (КФ 4.4.1.1) удосконаленим нами методом (Патент на корисну модель № 45018); активність ферментів нуклеотидного обміну S-аденозилгомоцистеїнгідролази (КФ 3.3.1.1), 5ґ-нуклеотидази (КФ 3.1.3.5) та аденозиндезамінази (КФ 3.5.4.4) (Isa Y. et al., 2006; Frassetto S.S. et al., 2000). У сироватці крові визначали вміст ГЦ імуноферментним методом (Axis-Shield), вміст гідроген сульфіду вдосконаленим нами методом (Патент на корисну модель №52136). Продукцію оксиду азоту оцінювали за вмістом нітритів та нітратів у сироватці крові (Коренман И.М., 1975). Продукцію моноксиду карбону оцінювали за рівнем карбоксигемоглобіну в крові та активністю гемоксигенази в печінці (Shimamoto Y. et al., 1999). Вміст аденозину в сечі визначали хроматографічним методом (Pull I., McIlwain H., 1972). Функцію нирок у щурів із ЦП оцінювали за клубочковою фільтрацією та натрійурезом. Проникність кишки оцінювали за екскрецією з сечею перорально введеної сахарози (Davies N.M. et al., 1995; Holmes E.W., 1997), вмістом ендотоксину в сироватці крові (LAL-тест, Hycult Biotechnology), активністю мієлопероксидази (КФ 1.11.1.7) печінки (Nemzek J. A. et al., 2000), вмістом глікозаміногліканів у слизовій оболонці кишки (СОК) (Ludowieg J., Benmaman J.D., 1967). Механографічні дослідження скоротливості артерій in vitro проводили шляхом реєстрації тонусу ізольованих фрагментів артерій (Назарук И.А. и др., 1983) із використанням аналогово-цифрового перетворювача National Instruments USB-6008/6009, з'єднаного з персональним комп'ютером.

Клінічна характеристика обстежених хворих. Під спостереженням перебувало 245 хворих на ХГ (156 чоловіків, 89 жінок), середній вік (38,9±0,86) років та 151 хворий на ЦП (94 чоловіків, 57 жінок), середній вік (51,0±1,01) років. При встановленні діагнозу ХГ та ЦП та обсягу клініко-лабораторних обстежень керувалися Наказами МОЗ України №271 (від 13.06.2005) та №1051 (від 28.12.2009). У 89 хворих був діагностований ХГ С, у 40 хворих - ХГ В, у 23 хворих - ХГ В+С, у 25 хворих - алкогольний гепатит (АГ), у 30 хворих ХГ вірусно-алкогольної етіології, у 38 хворих - НАСГ. Діагноз ХГ С підтверджували наявністю анти-HCV та HCV-RNA в сироватці крові, діагноз ХГ В - наявністю HbsAg, HBеAg/анти-HBе та HBV-DNA в сироватці крові. Діагноз АГ встановлювали при наявності клініко-лабораторних ознак ХГ, виявленні надмірного споживання алкоголю (опитувальники CAGE та AUDIT) та відсутності маркерів вірусного або автоімунного ураження печінки (Walsh K., Alexander G., 2000; Marsano L.S. et al., 2003; Ewing J.A., 1984; Babor T.F. et al., 2006). Діагноз НАСГ встановлювали при наявності клініко-лабораторних ознак ХГ (обов'язково стійкого підвищення активності АЛТ), сонографічних ознак стеатозу та при відсутності ознак вірусного, автоімунного, алкогольного чи токсичного ураження печінки (Bayard M. et al., 2006; Schreuder T.C. et al., 2008; Панчишин Ю.М., 2008). Вірусна етіологія ЦП була підтверджена в 71 пацієнта, вірусно-алкогольна - у 29 пацієнтів, алкогольна - у 51 пацієнта. Важкість ЦП оцінювали за класифікацією Child-Turcotte-Pugh (Шерлок Ш., Дули Дж., 1999). У 32 хворих був діагностований ЦП класу А, у 47 - ЦП класу В та в 72 - ЦП класу С. Важкість асциту та наявність гепаторенального синдрому встановлювали за рекомендаціями Міжнародної асоціації по вивченню асциту (Moore K.P. et al., 2003; Salerno F. et al., 2007). Асцит реєструвався у 117 хворих на ЦП, резистентний асцит - у 30 хворих. Гепаторенальний синдром 2-го типу був виявлений у 29 хворих. Контрольну групу склали 118 практично здорових осіб, репрезентативних за віком та статтю до групи хворих на ХГ.

Лабораторні та інструментальні методи обстеження хворих. В якості маркерів печінкового фіброгенезу визначали вміст ТФР-в-1, тканинного інгібітора металопротеїназ-1 (ТІМП-1), гіалуронату імуноферментним методом (ВСМ Diagnostics) та активність параоксонази в сироватці крові. В якості маркерів оксидативного стресу визначали вміст 4-гідроксиноненалю (Tsukamoto H. et al., 1995), карбонільних груп білків, тіольних груп сироватки крові. У плазмі крові визначали вміст фосфоліпідів та їх фракційний склад (фосфатидилхолін, лізофосфатидилхолін, фосфатидилетаноламін). У сироватці крові визначали вміст ГЦ, гідроген сульфіду та ендотоксину вказаними вище методами. Продукцію оксиду азоту оцінювали за вмістом нітратів і нітритів у сироватці крові (R&D Systems), продукцію моноксиду карбону - за рівнем карбоксигемоглобіну в крові, процеси деградації аденозину - за активністю сироваткової аденозиндезамінази (КФ 3.5.4.4) (Ungerer J.P. et al., 1992). Вміст інсуліну, феритину, лептину, інтерлейкіну-6, фактора некрозу пухлин-б визначали імуноферментним методом (Monobind, Orgentec, DBC, BCM Diagnostics). Індекс інсулінорезистентності розраховували за формулою НОМА IR (Matthews D.R. et al., 1985). Швидкість клубочкової фільтрації у хворих на ЦП оцінювали за формулою MDRD (Vervoort G. et al., 2002). Забезпеченість піридоксином визначали за ПАЛФ-ефектом (ступінь активації еритроцитарного ферменту АСТ при додаванні піридоксальфосфату) (Спиричев В.Б., 1984). Забезпеченість ціанокобаламіном оцінювали за екскрецією з сечею метилмалонової кислоти (Снегирева Л.В., Арешкина Л.Я., 1972; Rasmussen K., Nathan E., 1990). Вміст фолієвої кислоти в сироватці крові визначали мікробіологічним методом (Alpco Diagnostics). У 125 хворих на ХГ вірусної та вірусно-алкогольної етіології з метою оцінки морфологічних змін печінки була проведена черезшкірна пункційна біопсія голкою Tru-Cut G14 (Allegiance, США) та визначені ступінь активності гепатиту, стадія фіброзу за METAVIR (Bedossa P., Poynard T., 1996), ступінь стеатозу печінки (Monto A. et al., 2002). У хворих на ЦП із резистентним асцитом досліджували вміст гідроген сульфіду та нітратів і нітритів в асцитичній рідині. Для оцінки стану гемодинаміки у хворих на ЦП проводилась ехокардіографія за стандартною методикою (SonoAce 6000 C, Medison, Японія).

Лікування хворих на ХГ і ЦП здійснювали згідно Наказів МОЗ України №271 (від 13.06.2005) та №1051 (від 28.12.2009). Із метою оцінки антифіброзної активності блокатора рецепторів ангіотензину ІІ кандесартану та його поєднання з гіпогомоцистеїнемічним засобом фолієвою кислотою проведено шестимісячне відкрите контрольоване дослідження, в яке було залучено 92 хворих на ХГ. Критерії включення в дослідження: згода хворого, наявність хронічного АГ, НАСГ або ХГ вірусної етіології при відсутності стійкої вірусологічної відповіді на противірусне лікування або наявності протипоказань до нього. У залежності від призначеної терапії хворі були розподілені на три групи. Пацієнти першої групи отримували гепатопротектор силімарин («Cилімарин», Hexal AG або «Карсил Форте», Софарма) у дозі 172 - 180 мг/добу. У другу і третю групу були включені хворі на ХГ, які мали супутню гіпертонічну хворобу І-ІІ стадії. Пацієнти другої групи крім силімарину отримували кандесартан («Кандесар», Ranbaxy) у дозі 16-32 мг/добу. Хворі третьої групи крім силімарину і кандесартану отримували фолієву кислоту (Київський вітамінний завод) у дозі 5 мг/добу. Із метою оцінки ефективності застосування пентоксифіліну в комплексному лікуванні ниркової дисфункції у хворих на ЦП було проведено відкрите контрольоване дослідження, в яке було залучено 29 пацієнтів із гепаторенальним синдромом 2-го типу. У залежності від призначеної терапії хворі були поділені на дві групи. Пацієнти першої групи отримували традиційне лікування: інфузії альбуміну в дозі 20 г на добу та діуретики. Пацієнти другої групи, крім традиційної терапії, отримували пентоксифілін в/в краплинно в дозі 0,1 г на добу. Тривалість терапії складала 7-9 днів.

Статистичну обробку результатів проводили в “MS Exсel XP” та SPSS-10.0.5. Для оцінки міжгрупової різниці застосовували параметричний t-критерій Ст'юдента, для оцінки зв'язків між показниками - кореляційний аналіз за Пірсоном та Спірманом, для порівнянні частоти змін - критерій Фішера. Для визначення предикторів важкості фіброзу печінки та предикторів гепаторенального синдрому був використаний множинний лінійний регресійний аналіз. Для оцінки діагностичної цінності розробленого нами методу прогнозування важкості фіброзу печінки був застосований ROC аналіз, для встановлення нормативів окремих показників - метод персентилів.

Результати дослідження та їх обговорення. В експерименті встановлено, що ГГЦ індукує розвиток початкових стадій фіброзу печінки в щурів - (1,47±0,19) бали, що проявляється проліферацією фібробластів, відкладенням колагену навколо портальних трактів з утворенням в окремих випадках неповних септ, а також збільшенням рівня ТФР-в-1 та гіалуронату в сироватці крові (на 212 та 27%), падінням вмісту ретиноїдів (на 19%) та зростанням вмісту гідроксипроліну в печінці (на 32%), порівняно з контрольною групою. Вміст ГЦ у сироватці крові вірогідно корелював із рівнями гідроксипроліну, гіалуронату, ТФР-в-1 (r=0,63, 0,68, 0,65) та ретиноїдів (r=-0,66). ГГЦ індукувала розвиток стеатозу печінки в щурів, свідченням чого є жирова дистрофія гепатоцитів, вірогідне зростання вмісту тригліцеридів, холестерину в печінці (на 18 та 27%), порівняно з контролем.

Встановлено, що профіброгенна дія ГГЦ асоціюється з посиленням явищ оксидативного стресу, на що вказує вірогідне зростання вмісту карбонільних груп білків та падіння вмісту тіольних груп сироватки крові (на 32 та 18%), зростання вмісту продукту ліпопероксидації лізофосфатидилхоліну в печінці (на 69%), зниження активності антиоксидантних ензимів тіоредоксиредуктази, аконітази (на 34 та 21%), зростання активності прооксидантних ензимів NADPH-оксидази та ксантиноксидази (на 50 та 27%) у печінці. Активність NADPH-оксидази та ксантиноксидази виявляли вірогідні прямі, а активність тіоредоксинредуктази - обернений кореляційні зв'язки з вмістом гідроксипроліну (r=0,53, 0,52, -0,54) та ТФР-в-1 (r=0,54, 0,51, -0,49). Як відомо, оксидативний стрес є потужним фіброгенним чинником і активні форми кисню слугують провідними транскрипційними активаторами печінкових фібробластів (Novo Е., Parola М., 2008).

Профіброгенний вплив ГГЦ асоціювався з порушенням процесів метилування, транссульфування та нуклеотидного обміну (табл. 1). Про гальмування реакцій метилування свідчить вірогідне зростання вмісту неметильованого фосфоліпіду фосфатидилетаноламіну при зменшенні вмісту продукту метилування фосфатидилхоліну в печінці, зниження активності ензимів метилування бетаїнгомоцистеїнметилтрансферази та S-аденозилметіонінсинтази. Активність вказаних ферментів вірогідно обернено корелювала з вмістом гідроксипроліну в печінці (r=-0,55, -0,54) та ТФР-в-1 у сироватці крові (r=-0,59, 0,64). Відомо, що реакції метилування необхідні для синтезу фосфоліпідів, креатину, а метилування нуклеїнових кислот та білків є ключовим елементом епігенетичної регуляції активності генів та білків, включаючи й ті, що причетні до фіброгенезу (Mann D.A., Mann J., 2008).

Таблиця 1 Вміст продуктів та активність ферментів метилування, транссульфування та нуклеотидного обміну в щурів із ГГЦ (M±m)

Примітки: 1. * - р<0,05 щодо контрольної групи

2. Активність ферментів подана в нмоль/хв на 1 мг білка

Про порушення процесів транссульфування у тварин із ГГЦ свідчать падіння вмісту вазодилататора гідроген сульфіду в сироватці крові та зниження активності основних ферментів його синтезу - цистатіонін-г-ліази, цистатіонін-в-синтази в печінці. У тварин із ГГЦ реєструвалося зменшення екскреції вазодилататора аденозину з сечею (на 35%) унаслідок зниження активності ензимів синтезу аденозину (S-аденозилгомоцистеїнгідролази, 5'-нуклеотидази) та тенденції до зростання активності ферменту деградації аденозину (аденозиндезамінази). Вміст гідроген сульфіду, активність цистатіонін-г-ліази, цистатіонін-в-синтази вірогідно обернено корелювали з вмістом гідроксипроліну (r=-0,62, -0,57, -0,58) та ТФР-в-1 (r=-0,65, -0,59, -0,55). Подібні за силою і напрямом зв'язки встановлювались і щодо активності S-аденозилгомоцистеїнгідролази. Відомо, що дисбаланс у системі внутрішньопечінкової продукції вазоконстрикторів та вазодилататорів є потужним чинником прогресування фіброзу (Bataller R., Brenner D.A., 2005).

З'ясувалося, що порушення обміну ГЦ виникають й у тварин з експериментальним стеатозом печінки, індукованим ВЖД, на що вказує зниження активності ензимів метилування, транссульфування та зростання рівня ГЦ у сироватці крові в 1,7 рази. ГГЦ також виникала у тварин із класичним CCl₄ -індукованим фіброзом/цирозом. Додаткове навантаження ГЦ акселерувало ССl₄-індукований фіброгенез, що проявлялося зростанням вмісту ТФР-в-1 та гіалуронату в сироватці крові (на 33% та 18%), гідроксипроліну в печінці (на 28%), падінням вмісту ретиноїдів у печінці (на 29%), зниженням активності сироваткової параоксонази (на 57%) та формуванням декомпенсованого ЦП у більшості тварин. У щурів із ЦП, індукованим поєднаним введенням CCl₄ та ГГЦ, реєструвалися більш виразні прояви портальної гіпертензії (збільшення частоти і важкості асциту), ниркової дисфункції (падіння клубочкової фільтрації та натрійурезу), ентеропатії (підвищення гастоінтестинальної проникності для сахарози, падіння вмісту глікозаміногліканів СОК) та бактеріальної транслокації (підвищення рівня ендотоксину в сироватці крові, активності мієлопероксидази печінки), ніж у тварин з CCl₄-індукованим ЦП.

Отримані нами дані свідчать, що за умов сформованого ЦП, на противагу фіброзу, нівелюється супресивний вплив ГГЦ на продукцію вазоактивних медіаторів гідроген сульфіду та аденозину. Як видно з табл. 2, у тварин із CCl₄-

Таблиця 2 Вміст ГЦ, вазоактивних медіаторів та активність ферментів їх обміну в щурів із ЦП (M±m)

Примітки: 1. * - р<0,05 щодо групи «контроль», ^# - р<0,05 щодо групи «CCl₄» 2. Активність ферментів подана в нмоль/хв на 1 мг білка

індукованим ЦП та за умов його поєднання з ГГЦ реєструвалося надмірне утворення вазодилататорів гідроген сульфіду (зростання його вмісту в сироватці крові та активності цистатіонін-в-синтази, цистатіонін-г-ліази печінки), оксиду азоту (зростання рівня нітратів і нітритів сироватки крові), моноксиду карбону (зростання вмісту карбоксигемоглобіну крові та активності гемоксигенази печінки), аденозину (збільшення його екскреції з сечею та зростання активності S-аденозилгомоцистеїнгідролази, 5'-нуклеотидази, падіння активності аденозиндезамінази печінки). Вміст ГЦ та гідроген сульфіду в сироватці крові щурів із ЦП виявляли прямі вірогідні кореляційні зв'язки з проникністю кишки для сахарози (r=0,57, 0,65) та обернені зв'язки з швидкістю клубочкової фільтрації (r=-0,61, -0,60). Як відомо, мезентеріальна та периферійна вазодилатація є пусковим чинником формування асциту, розладів центральної гемодинаміки та органної перфузії при ЦП. Дилатація легеневих судин веде до формування гепатопульмонального синдрому, дилатація мозкових судин - до надмірного проникнення токсичних субстанцій, що спричиняють енцефалопатію, а компенсаторна гіперпродукція пресорних медіаторів - до розвитку ниркової вазоконстрикції та гепаторенального синдрому (Colle I. et al., 2008).

Дослідження тонусу мезентеріальної і ниркової артерій in vitro продемонструвало, що ГЦ та гідроген сульфід безпосередньо причетні до формування судинних порушень при ЦП. Встановлено, що мезентеріальна артерія інтактних тварин є більш чутливою, ніж ниркова артерія, до релаксуючого впливу гідроген сульфіду. При цьому чутливість мезентеріальної артерії до дії цього вазодилататора у тварин із ЦП вірогідно зростає (рис. 1А).

Ниркова артерія інтактних тварин є більш чутливою, ніж мезентеріальна артерія, до констрикторного впливу ГЦ і у тварин із ЦП ми спостерігали ще більше посилення чутливості ниркової артерії до скоротливої дії цього медіатора (рис. 1Б).

Для з'ясування ролі надмірної проникності кишки та ендотоксинемії, а також гіперпродукції вазоактивних медіаторів у розвитку декомпенсації ЦП ми вивчили вплив ендотоксину Sh. Boydii, інгібітора синтази оксиду азоту L-NAME та блокатора аденозинових рецепторів пентоксифіліну. Введення ендотоксину призвело до зростання продукції вазоактивних медіаторів, на що вказує збільшення рівнів нітратів і нітритів (на 52%), гідроген сульфіду (на 27%), карбоксигемоглобіну (на 13%), аденозину (на 19%), що супроводжувалося підвищенням активності ферментів синтезу цих речовин та асоціювалось зі збільшенням важкості асциту, ниркової дисфункції та ентеропатії у тварин із ЦП. Блокування синтезу оксиду азоту L-NAME та блокування ефектів аденозину пентоксифіліном сприяло регресу асциту, зростанню клубочкової фільтрації та зменшенню проникності кишки.

Рис. 1. А: гідроген сульфід - стимульоване розслаблення мезентеріальної та ниркової артерій інтактних і щурів із ЦП; Б: зменшення ацетилхолін-індукованого розслаблення кільцевих фрагментів мезентеріальних та ниркових артерій інтактних і щурів із ЦП під впливом ГЦ

Таким чином встановлено, що ГГЦ промотує розвиток фіброзу печінки через індукцію оксидативного стресу, порушення обміну гідроген сульфіду та аденозину, гальмування процесів метилування та формування стеатозу печінки. Печінковий фіброгенез і стеатогенез супроводжуються розвитком ГГЦ, що дає підстави вважати порушення обміну ГЦ універсальним явищем при прогресуванні захворювань печінки. На етапі сформованого ЦП патогенетичним чинником декомпенсації та розвитку ниркової дисфункції є гіперпродукція вазодилататорів гідроген сульфіду, оксиду азоту, моноксиду карбону та аденозину (який, як відомо, чинить дилатуючу дію щодо мезентеріальних та констрикторну дію щодо ниркових судин) у результаті надмірної проникності кишки та потрапляння мікробних ліпополісахаридів до кровотоку.

З огляду на встановлені нами механізми профіброгенної дії ГГЦ у наступній частині роботи було проведено порівняльне дослідження антифіброзної активності низки речовин із вазоактивною, антиоксидантною, гіпогомоцистеїнемічною та антистеатогенною дією. Встановлено, що застосування інсулінового сенситайзера піоглітазону спричиняло помітний антифіброзний ефект у щурів із класичним CCl₄-індукованим ЦП, що проявлялося вірогідним зниженням вмісту ТФР-в-1 та гіалуронату в сироватці крові, гідроксипроліну в печінці (на 36, 13 та 22%), зростанням вмісту ретиноїдів у печінці та активності сироваткової параоксонази (на 20 та 17%). Ізофлавоноїди сої (препарати з вазодилатуючою і антиоксидантною дією) мали більш істотний позитивний вплив на маркери фіброгенезу: вміст ТФР-в-1 знизився більше ніж вдвічі, а вміст гіалуронату та гідроксипроліну - на 42 та 31%, відповідно, порівняно з групою тварин із моделлю фіброзу. Найбільш потужну антифіброзну активність продемонстрували антагоніст рецепторів ангіотензину ІІ кандесартан та інгібітор ангіотензин - перетворюючого ферменту периндоприл: сироватковий рівень ТФР-в-1 знизився в 2,5 та 2,2 рази, відповідно, а вміст гідроксипроліну в печінці та гіалуронату в сироватці крові наближався до такого в інтактних тварин.

На моделі ЦП, індукованого поєднаним введенням CCl₄ та тіолактону ГЦ, була досліджена антифіброзна активність цитраргініну (прекурсор оксиду азоту аргінін + донор метильних груп бетаїн), ізофлавоноїдів сої та гіпогомоцистеїнемічного засобу фолієвої кислоти (ФК). З'ясувалося, що ізофлавоноїди спричиняли істотний регрес фіброзу печінки (зниження вмісту гіалуронату на 32%, гідроксипроліну на 33%, зростання вмісту ретиноїдів на 39% та активності параоксонази на 43%) та значною мірою запобігали формуванню асциту, ниркової дисфункції та ентеропатії. Цитраргінін виявляв значно меншу антифіброзну активність (вміст гідроксипроліну знизився на 15%, активність параоксонази зростала на 24%) та в меншій мірі запобігав розвитку асциту та ниркової дисфункції. Найбільш потужну антифіброзну активність мала ФК: вміст гіалуронату та гідроксипроліну був, відповідно, на 41 та 47% меншим, а вміст ретиноїдів, активність параоксонази - на 63 та 75% вищими, ніж у нелікованих щурів. У жодної з тварин цієї групи не виявлявся асцит, а швидкість клубочкової фільтрації майже вдвічі перевищувала таку в тварин із моделлю ЦП. Протективний вплив ФК асоціювався зі зменшенням явищ оксидативного стресу, зниженням рівня ГЦ (на 52%) та відновленням процесів метилування.

На моделі CCl₄-індукованого ЦП, що розвивається на тлі ВЖД, була досліджена антифіброзна активність речовин із відомою антистеатогенною дією: інсулінового сенситайзера піоглітазону та донорів метильних груп бетаїну та S-аденозилметіоніну. Встановлено, що піоглітазон у значній мірі попереджав формування стеатозу і фіброзу: вміст тригліцеридів та холестерину в печінці був на 54 та 60% меншим, а вміст ТФР-в-1 у сироватці крові удвічі меншим від такого в нелікованих тварин. Вплив бетаїну та S-аденозилметіоніну на маркери стеатозу був співставним із таким у піоглітазону, тоді як антифіброзний ефект бетаїну був дещо меншим, а S-аденозилметіоніну - мінімальним. Антифіброзний ефект піоглітазону та бетаїну асоціювався зі зниженням рівня ГЦ та відновленням процесів метилування.

Таким чином, вивчені нами препарати з гіпогомоцистеїнемічною, вазоактивною, антиоксидантною та антистеатогенною дією в тій чи іншій мірі позитивно впливали на перебіг експериментального фіброзу і ЦП. На моделі CCl₄-індукованого фіброзу найбільшу активність виявили препарати, що на різних рівнях блокують ефекти ангіотензину ІІ - кандесартан та периндоприл. При поєднанні фіброгенної дії CCl₄ та ГГЦ найбільшу протективну дію мала ФК. В умовах поєднання фіброгенної дії CCl₄ та стеатозу печінки найбільший ефект виявили інсуліновий сенситайзер піоглітазон та донор метильних груп бетаїн.

Отримані нами експериментальні дані стали передумовою для вивчення впливу ГГЦ та асоційованих із нею судинних і метаболічних порушень на прогресування фіброзу і ЦП в умовах клініки. На першому етапі клінічних досліджень ми оцінили діагностичну цінність низки біомаркерів фіброгенезу та розробили метод прогнозування важкості фіброзу, що дозволило включити в дослідження не лише хворих із відомою морфологічною стадією фіброзу, але й пацієнтів, яким не була виконана пункційна біопсія печінки. Обстежені хворі на ХГ вірусної та вірусно-алкогольної етіології з відомою стадією фіброзу були поділені на основну (n=76) та додаткову (n=49) групи. У пацієнтів основної групи в множинному регресійному аналізі були визначені незалежні предиктори фіброзу та розроблена математична модель прогнозування стадії фіброзу, у хворих додаткової групи проведений порівняльний аналіз діагностичної цінності створеної нами моделі та відомих індексів фіброзу AРRI (Wai Ch.T. et al., 2003) та FibroIndex (Koda M. et al., 2007).