Експериментальне обґрунтування профілактичного застосування L-лiзину есцинату та контрикалу при порушеннях мозкового кровообігу в умовах моделювання загальної широкосмугової вiбрацiї

Размещено на http://allbest.ru

Академія медичних наук україни

Державна установа

"інститут фармакології та токсикології"

УДК 615:616.831-005:612.014.45+612.866

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Експериментальне обгрунтування профілактичного застосування L-лізину есцинату та контрикалу при порушеннях мозкового кровообігу в умовах моделювання загальної широкосмугової вібрації

14.03.05 - фармакологія

БЕЛЯКОВА Анастасія Григорівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Кримському державному медичному університеті ім. С.І. Георгієвського Міністерства охорони здоров'я України.

Науковий керівник:доктор медичних наук, професор Сапегін Ігор Дмитрович, Кримський державний медичний університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України, завідувач кафедри фармакології (м. Сімферополь).

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст.н.співр. Тишкін Сергій Михайлович, ДУ "Інститут фармакології та токсикології АМH України", головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії (м. Київ);

доктор медичних наук, професор Мамчур Віталій Йосипович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри фармакології, клінічної фармакології та фармакоекономіки (м. Дніпропетровськ).

Захист відбудеться 16 грудня 2009 року о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої Ради Д 26.550.01 при ДУ "Інститут фармакології та токсикології АМH України" (вул. Ежена Потьє 14, Київ, 03680).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ "Інститут фармакології та токсикології АМH України" (вул. Ежена Потьє 14, Київ, 03680).

Автореферат розіслано 12 листопада 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої ради

Д 26.550.01, кандидат біологічних наук І.В. Данова

Загальна ХАРАКТЕРИСТИКА РоБОТи

Актуальність теми. Збитки від різних виплат за професійними хворобами складають від 3 до 8% внутрішнього валового продукту країни [Лисянская Г. В. та ін., 2008]. Значне місце серед різних форм професійної патології посідає вібраційна хвороба, яка обумовлена дією на організм промислової та транспортної вібрації - місцевої та загальної [Алексеев С. В. та ін., 1988, Артамонова та В. Г. ін., 1996]. За даними профспілок Hіметчини, у 1995 році збитки від вібраційної хвороби від дії загальної вібрації у водіїв склали від 215 до 323 марок в день на одного водія [Бобров Б. Ф., Соловьев В. С., 2005]. Загальна вібрація впливає на все тіло крізь опорні поверхні. Літературні дані свідчать про те, що при цьому спостерігаються зміни як центральної, так і периферичної гемодинаміки у вигляді стійкого спазму судин [Д. К. Абрамович-Поляков та ін., 1981, І. Д. Сапегін, 2003]. Ці порушення разом з вестибулярними розладами та зростанням активності нейронів призводять до розвитку гіпоксії мозку і зрушень прооксидантно-антиоксидантної рівноваги та, внаслідок цього, до активації перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) [В. М. Аксенова и др, 1992, С. М. Минасян та ін., 1989, 1990, Б. О. Насібулін та ін., 1993, Б. А. Насибуллин, 1994, І. Д. Сапегін, 2003]. В результаті спостерігається головний біль, запаморочення, погіршення реакції, порушення координації рухів, лабільність артериального тиску, зміни судин очного дна із порушеннями зору [Бобров Б. Ф., Соловьев В. С., 2005]. Ці порушення виникають безпосередньо під час дії вібрації та можуть мати критичні наслідки для людей відповідних професій. Крім того вони не завжди можуть бути попереджені суто технічними засобами та потребують фармакологічної корекції. Сучасний стан фармакотерапії вібраційної хвороби передбачає використання судиннорозширюючих засобів, в тому числі гангліоблокаторів, ангіопротекторів, антигіпоксантів та фізіопроцедур [Алексеев, С. В., 1988, Артамонова В. Г. та ін., 1996, Карпова Б. Д., 1979]. Але ефективність вказаних засобів лишається недостатньою.

Під час розробки фармакологічної корекції порушень мозкового кровообігу, що викликані дією загальної широкосмугової вібрації, важливою проблемою є боротьба з набряково-дистрофічними явищами на тлі стійкого спазму судин. В основу нашої роботи покладено новий підхід до фармакологічної профілактики цереброваскулярних порушень при дії загальної вібрації. З одного боку він заснований на вивченні засобів, що захищають судинну стінку та тканини від пошкодження віброприскореннями шляхом впливу на рідкокристалічні макромолекулярні системи, що є мішенню віброприскорень. З іншого боку - на пригніченні ферментів протеолізу, що беруть безпосередню участь в процесах пошкодження. Це обумовлює вибір для дослідження препаратів з нетрадиційними механізмами дії.

При цьому вельми принадним є саме підвищення стійкості тканин до дії віброприскорень, а не тільки боротьба з наслідками їх дії. Це послужило передумовою вибору для дослідження препарату кінського каштану - L-лізину есцинату у вигляді 0,1% розчину виробництва української корпорації "Артеріум". Препарат є водорозчинною сіллю сапоніну есцину, отриманого з плодів каштану та амінокислоти L-лізину. За літературними даними, есцин захищає глікозаміноглікани в стінках судин від руйнування лізосомальними гідролазами і таким чином надає мембраностабілізуючий ефект. Препарат стабілізує гематоенцефалічний бар'єр, проникність капілярів, проявляє антиексудативні та протинабряклі ефекти, а також має знеболюючу дію [Р. В. Куцик та ін., 2002]. У результаті нормалізується збільшена проникність судин, підвищується тонус вен, покращується мікроциркуляція. Крім того, L-лізину есцинат покращує реологічні властивості крові шляхом пригнічення гіалуронідази та стимуляції антитромботичної активності сироватки крові [C. Calabrese, 1993]. Інтерес до препаратів кінського каштану в клініці пов'язаний з їх ефективністю при різних судинних захворюваннях, де препарати проявляють значну протинабрякову активність. Їх лікувальний ефект доведено при хронічній венозній недостатності, при постопераційному, запальному, травматичному та гістаміновому набряках. Згідно даним, що отримані раніше на кафедрі фармакології Кримського державного медичного університету, в результаті гіпоксії та набряково-дистрофічних змін у тканинах під час вібрації спостерігається загибель окремих нейроцитів та фагоцитоз їх гліальними елементами. У той же час дані про активність ферментів протеолізу та стан інгібіторного потенціалу виявилися неоднозначними, що не дозволило зробити однозначний висновок про роль протеолізу в процесах ураження тканин в умовах загальної широкосмугової вібрації [І. Д. Сапегін, 2003]. Але в клініці доведено високу ефективність інгібіторів протеаз при різних порушеннях мозкового кровообігу [D. A. Bull et al, 2000, M. M. Khan et al, 1999, M. Sjostrom et al, 1999]. Ці дані послужили передумовою вибору контрикалу в якості другого препарату для дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано згідно з планом науково-дослідницьких робіт Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського за проблемою Р.7 "Мозковий кровообіг", за темою "Експериментальне обгрунтування фармакологічної профілактики та корекції цереброваскулярних порушень при хворобі руху". Шифр теми - 02/4, номер госреєстрації 0105U002163 від 21.01.05 із терміном закінчення в 2009 р.

Мета та завдання дослідження. Обгрунтувати доцільність використання L-лізину есцинату та контрикалу для профілактики та корекції порушень мозкового кровообігу в умовах загальної широкосмугової вібрації (ЗШВ).

Відповідно до вказаної мети були поставлені наступні завдання:

1. Провести дослідження цереброваскулярних порушень під час ЗШВ без використання препаратів за допомогою методів, які використатимуться для вивчення L-лізину есцинату та контрикалу.

2. Для визначення впливу на гемодинаміку та її регуляцію вивчити вплив L-лізину эсцинату та контрикалу на локальний мозковий кровотік, реактивність судин в корі, таламусі та гіпоталамусі методом кліренсу водню, а також гістохімічно вивчити активність NO-синтетази в стінках судин в умовах моделювання ЗШВ.

3. Виявити антигіпоксичні та антиоксидантні ефекти препаратів в умовах ЗШВ шляхом полярографічного визначення змін напруги кисню в тканинах кори, таламуса та гіпоталамуса, а також вивчення кислотно-лужного стану та перекисного окислення ліпідів в мозковій венозній крові.

4. Вивчити протинабрякову дію L-лізину есцинату та контрикалу шляхом визначення поза- та внутрішньоклітинного опору в корі, таламусі та гіпоталамусі методом електроімпедансометрії.

5. Оцінити зменшення пошкодження тканин під дією препаратів за допомогою вивчення гістологічних змін в тканинах, а також обмеженого протеолізу в мозковій венозній крові.

Об'єкт дослідження - цереброваскулярні порушення під час загальної широкосмугової вібрації.

Предмет дослідження - захисна дія L-лізину есцинату та контрикалу щодо порушень, які викликані загальною широкосмуговою вібрацією.

Методи дослідження. - у роботі застосовано фармакологічні, електрофізіологічні, біохімічні, гістологічні та статистичні методи дослідження.

Hаукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше дано експериментальне обгрунтування нового підходу до фармакологічної профілактики та корекції цереброваскулярних порушень при загальної вібрації за допомогою L-лізину есцинату та контрикалу.

Вперше виявлені нові сторони фармакодинаміки L-лізину есцинату та контрикалу, що поглиблює наукові уявлення про механізми дії даних препаратів.

Вперше експериментально встановлено, що загальна широкосмугова вібрація знижує активність NO-синтетази в стінках судин. L-лізину эсцинат і контрикал перешкоджають уповільненню локального мозкового кровотоку, зниженню напруги кисню, пригніченню вазоконстрикторної реактивності, а також розвитку позаклітинного та внутрішньоклітинного набряку, метаболічного ацидозу, активації перекисного окислення ліпідів, розвитку набряково-дистрофічних змін у тканинах та зменшенню активності NO-синтетази в судинах мозку, які викликані дією загальної широкосмугової вібрації. L-лізину есцинат краще усуває периваскулярний набряк, перешкоджає виникненню гістологічних змін в судинах та зниженню активності NO-синтетази в них, а також більше пригнічує перекисне окислення ліпідів і відновлює рівень природних антиоксидантів. Контрикал ефективніше усуває гіпоксію та метаболічний ацидоз, внутрішньоклітинний набряк і дистрофічні зміни в тканинах, а також активацію обмеженого протеолізу.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально доведено доцільність використання L-лізину есцинату та контрикалу в якості засобів фармакологічної профілактики та корекції порушень мозкового кровообігу та пов'язаних з ними змін у тканинах мозку під час дії загальної широкосмугової вібрації.

Матеріали дисертації щодо протекторної дії досліджених препаратів при моделюванні цереброваскулярних розладів впроваджено в навчальний процес на кафедрах фармакології Вінницького Hаціонального медичного університету (акт впровадження від 21.02.2009), Луганського Державного медичного університету (акт впровадження від 21.05.2002), Одеського Державного медичного університету (акт впровадження від 10.03.2009).

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізувала літературу, виконала усі хронічні та гострі експерименти, провела аналіз та статистичну обробку результатів. Визначення в мозковій венозній крові вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів та компонентів антиоксидантного захисту, а також активності обмеженого протеолізу та його інгібіторів проведено при консультативній допомозі доцента кафедри патологічної фізіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського, к.м.н. Семенця П.Ф. Гістологічні дослідження виконано при консультативній допомозі головного наукового співробітника УКРНДІ медреабілітації та курортології (м. Одеса), д.мед.н., професора Hасибуліна Б.А.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на ІІІ Hаціональному з'їзді фармакологів України (м. Одеса, 17-20 жовтня 2006 р.); міжнародній науково-практичній конференції "Актуальные проблемы госпитальной медицины" (м. Севастополь, 2004, 2005, 2006, 2007 р.); на науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів "Актуальні проблеми фармакології та токсикології" (м. Київ, 22 грудня 2005 р.); на науково-практичній конференції "Актуальні питання фармакології" (м. Вінниця, 26-27 жовтня 2007 р.); на VІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю "Клінічна фармація в Україні " (м. Харків, 15-16 листопада 2007 р.); на XXV Ювілейній науково-практичній конференції з міжнародною участю "Лекарства - человеку. Современные проблемы создания, исследования и апробации лекарственных средств." (Харків, 19 березня 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 робіт, з них 5 статей у ліцензованих ВАК України журналах та збірниках, 11 - у матеріалах та тезах з'їздів, симпозіумів та наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, 3 підрозділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних літературних джерел. Дисертацію викладено на 173 сторінках машинописного тексту, який включає 21 таблицю та 39 малюнків. Список літератури містить 162 джерел (з них 61 зарубіжних).

Основний Зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Усі дослідження проведені у відділах центральной науково-дослідної лабораторії (ЦНДЛ) Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського. Усі ці відділи атестовані Державною метрологічною службою (останне свідоцтво №001026 від 01.12.2008). Крім того лабораторія кафедри фармакології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського має посвідчення Державного фармакологічного центру МОЗ України на право проведення доклінічних досліджень лікарських засобів, що впливають на мозковий кровообіг та церебропротекторів (останнє №4 від 25.12.2008). Дослідження проведено в умовах моделювання на тваринах дії загальної широкосмугової вібрації (ЗШВ). Проведено 81 дослід на 46 ненаркотизованих кроликах, серед них хронічні експерименти на 16 тваринах з вживленими в мозок електродами, гострі - на 30. Максимальна тривалість життя кроликів із вживленими електродами досягає 2 і більше років, тому одних і тих же тварин послідовно, не раніше ніж через 3 доби, використовували в різних серіях хронічних експериментів. Кроликам імплантовували 6 електродів - по 2 до кори великих півкуль, таламусу і гіпоталамусу та в кожному хронічному експерименті отримували до 2 спостережень щодо кожної з перелічених структур мозку. Кількість спостережень у кожній серії як хронічних, так і гострих дослідів - від 8 до 12. Використовувалися кролики породи шиншила обох статей масою 2,5-3,5 кг, яких утримували на стандартному харчовому режимі віварію.

Моделювання ЗШВ здійснювали на сконструйованому нами та атестованому Кримською республіканською СЕС спеціальному стенді. Джерелом ЗШВ на цьому стенді служив електродвигун із закріпленим на його вісі ексцентричним маховиком. Корпус електродвигуна та ящик з кроликом жорстко фіксували до спільної рухомої платформи, що спиралася на 4 пружини. Частоти вібрації, що моделювалася, охоплюють весь спектр, який підлягає гігієнічному нормуванню у людини, а амплітуда дозволяє розглядати її діяння як професійну шкідливість.

Для вивчення об'ємної швидкості локального мозкового кровотоку (КТ), реактивності мозкових судин, напруги кисню в тканинах (pО₂) та водно-електролитного балансу до кори великих півкуль, центральних ядер таламусу та гіпоталамусу за 10 діб до початку експериментів за стереотаксичною методикою вживлювали гольчаті платинові електроди. Координати структур знаходили за атласом стереотаксичних досліджень на мозку кролика [M. Monіer et all., 1961].

Швидкість КТ у вказаних структурах вимірювали за методом водневого кліренсу [И. Т. Демченко, 1981, А. И. Бекетов та ін., 1986]. Hасичення тканин H₂ досягалося шляхом інгаляції 5% суміші H₂ з повітрям. Криву рH₂ реєстрували полярографічним методом. Для оцінки реактивності судин використовували коефіцієнти вазодилататорної (КрСО₂) та вазоконстрикторної (КрО₂) реактивності. КрСО₂ визначали як співвідношення КТ на тлі 2 хв інгаляції суміші, що містила 7% СО₂ та повітря, до контрольної величини КТ на даному відрізку часу. КрО₂ підраховували, порівнюючи КТ на тлі дихання чистим О₂ з таким під час гіперкапнії, котру викликали вказаним раніше способом. Визначення КрО₂ здійснювалося за методикою І. В. Полевика (1991). Інгаляцію всіх газових сумішей здійснювали за допомогою маски, що розроблена на кафедрі. Динаміку pО₂ у тканинах мозку реєстрували методом полярографії без визначення абсолютних величин [В. А. Березовский, 1975, Е. А. Коваленко та ін., 1975]. Статистичній обробці підлягали відносні відхилення від контрольного рівню, прийнятого за 100%.

Водно-електролитний баланс тканини мозку вивчали методом високочастотної електроімпедансометрії, визначаючи активну складову модулю комплексного імпедансу (Re_(Z)) мостовим методом на частотах 46,3, 93 й 463 кгц. З отриманих 3 значень Re_(Z) за допомогою електронних таблиць Lotus 123 підраховували значення позаклітинного (R₁) та внутрішньоклітинного (R₂) опорів [А. И. Бекетов, И. Д. Сапегин, И. В. Полевик, 2002, М. В. Воробьев та ін., 1989].

Вивчення параметрів кислотно-лужного стану (КЛС), співвідношення активностей перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантних систем, а також протеіназ та інгібіторів протеолізу проводили в мозковій венозній крові, яку отримували за допомогою пункції внутрішньої яремної вени. Визначення КЛС здійснювали мікрометодом Зігарда-Ендерсона шляхом еквілібрації з двома атестованими газовими сумішами, які містили 6% та 12% СО₂ у кисні на апараті ОР210/3 фірми "Radelkіs" (Угорщина) [O. Sіggard-Anderson et all., 1960].

Інтенсивність ПОЛ в еритроцитах оцінювали за концентрацією ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) у реакції малонового діальдегіду з 2-тіобарбітуровою кислотою [С. H. Суплотов та ін., 1986]. Дослідження стану антиоксидантних систем містило дослідження пероксидазоподібної (ППА) та каталазоподібної активностей, оцінку активностей головного сироваточного антиоксиданту церулоплазміну (ЦП) та внутрішньоклітинного антиокислювального ферменту супероксиддісмутази (СОД), а також загальної антіокислювальної активності (ЗОА). Визначення ППА сироватки крові грунтувалося на вимірюванні зменшення оптичної щільності розчину індіготетрасульфонату калію в процесі його окислення при рН 4,9 у присутності перекису водню та пероксидази [Т. Попов та ін., 1971]. КПА сироватки крові визначали на підставі реєстрації залишкової кількості перекису водню після її інкубації з біологічним матеріалом при рH 7,4 та 25 ⁰С. Кількість перекису водню визначали за утворенням забарвленого комплексу із солями молібдену [М. А. Королюк та ін., 1988]. Активність ЦП сироватки крові вимірювали за модифікованим методом Ревіна, що грунтується на окисленні р-фенілендіаміну при участі церулоплазміну із зупинюванням реакції розчином фтористого натрію та вимірюванням оптичної щільності при довжині хвилі 540 нм [Е. Е. Дубинина та ін., 1983]. Активність СОД сироватки крові досліджували у модельній системі утворення супероксидних іонів при взаємодії з HАДH₂ та феназінметасульфатом. Спроможність СОД конкурувати за супероксидні аніони виявляли за ступенем інгібування поновлення нітротетразолієвого синього до гідразінтетразолію [Е. Е. Дубинина та ін., 1983, С. Чевари та ін., 1985]. АОА сироватки крові визначали за спроможністю біологічного матеріалу гальмувати окислювально-поновлювальну реакцію в системі Fe²⁺ - 2,6-діхлорфенолінініндофенол [В. Л. Семенов та ін., 1985].

В якості показників активності протеіназ досліджували трипсиноподібну (ТПА-БАЕЕ) та еластазоподібну (ЕПА) активності. Про активність інгібіторів протеіназ сироватки крові судили за антитриптичною активністю (АТА-БАЕЕ) та активністю кислотостабільних інгібіторів (КСІ-БАЕЕ). ТПА-БАЕЕ плазми крові визначали спектрофотометричним методом, що грунтується на вимірюванні швидкості відщеплення N-бензоіл-L-аргініну від синтетичного субстрату N-бензоіл-L-аргініну етилового ефіру (БАЕЕ) (Reanal) [А. В. Кринская та ін., 1977]. ЕПА сироватки крові вимірювали за гідролізом синтетичного субстрату N-т-бок-аланіл-п-нітрофінілового ефіру (Reanal) [О. Г. Оглоблина та ін., 1980]. Вивчення АТА-БАЕЕ у сироватці крові за БАЕЕ полягало у визначенні a₁-інгібітора протеіназ, активність якого вимірювали уніфікованим методом [В. Ф. Hартикова та ін., 1977]. Визначення КСІ-БАЕЕ проводили згідно з В. Ф. Hартиковою та ін. (1969), О. Г. Оглобліною та ін. (1980).

Гістологічні зміни в сенсо-моторній корі великих півкуль, таламусі, гіпоталамусі, стовбурі на рівні латеральних кутів ромбоподібної ямки та мозочку вивчали в гістологічних зрізах, забарвлених гематоксилін-еозином, та толуідиновим синім за Hісслем [Э. Пирс, 1962, Г. А. Меркулов, 1969]. Гістохімічне визначення активності NO-синтетази (NO-S) в структурах мозку, що вивчаються, проводили за прописом Коржевського [Д. Э. Коржевский, 1996, S. R. Vіncent, 1992].

Використано наступні лікарські форми, дози та способи введення препаратів, що досліджувалися - L-лізину есцинат у вигляді 0,1% розчину виробництва української корпорації "Артеріум" в дозі 0,15 мг/кг, контрикал виробництва AWD-Pharma (Hіметчина) в дозі 1000 Од/кг. Обидва препарати розчинювали у 1 мл ізотонічного розчину NaCl та вводили внутрішньовенно однократно, безпосередньо перед початком дії ЗШВ, одразу після реєстрації контрольних показників або отримання контрольної крові.

КТ, реактивність судин та рО₂ реєстрували протягом 2 год, показники водно-електролитного балансу - 4 годин. У гострих дослідах кров для вивчення КЛС, ПОЛ та антиоксидантних систем, а також протеіназ та інгібіторів протеолізу брали перед початком дії ЗШВ до введення препаратів, а потім через 8 год експерименту. Після цього тварин знеживлювали шляхом декапітації у відповідності до законодавства України [Закон України №3447-ІV "Про захист тварин від жорстокого поводження / Відомості Верховної Ради України. - 2006. - №27. - С.230.], правил Європейської Конвенції щодо захисту хребетних тварин, якї використовуються в експериментальних дослідженнях та з іншою науковою метою [European conventіon for the protectіon of vertebrate anіmals used for experіmental and other scіentіfіc purposes. - Councіl of Europe, Strasbourg, 1986. - 53p.] та виймали мозок для патоморфологічних досліджень. Усі отримані параметри виражали у ±% до контрольного рівню, який визначали у кожному експерименті. Зміни біохімічних показників представляли також і в абсолютних цифрах. Статобробці піддавали відносні величини із використанням критерію Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Зміни кровотоку, реактивності, кислородного та водно-електролітного балансу за даними електрофізіологічних досліджень. В наших експериментах загальна широкосмугова вібрація (ЗШВ) без використання препаратів викликає уповільнення КТ в корі та гіпоталамусі (таб. 1), яке викликане спазмом мозкових судин. Цей спазм ми пояснюємо згідно з рідкокристалічною теорією [В. С. Айзенштадт та ін., 1986], безпосередньою вражаючою дією віброприскорень на рідкокристолічні макромолекулярні системи ендотелію судин. У наслідок цього порушується функція a-адренорецепторів, підвищується вміст таких вазоконстрикторів, як тромбомодулін, ендотелін-1 та пептид, що пов'язаний з геном кальцитоніту. У той же час спостерігається дефіцит ендотеліального релаксуючого фактору - NO [L. Lіn et al., 2000, Z. Stoyneva et al., 2003]. За нашими даними контрикал не тільки попереджає уповільнення КТ, але й викликає його абсолютне прискорення - найбільшою мірою в гіпоталамусі (таб. 1).

Таблиця 1

Динаміка кровотоку (КТ), напруги кисню (pО₂), реактивності (КрСО₂, КрО₂) в тканинах ненаркотизованних кроликів

* - p<0,01 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

# - p<0,05 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

фармакологічний мозковий інгібіторний вібрація

Це можна пояснити інгібуванням калікреіну та, внаслідок цього, пригніченням утворення тканинного та плазмового кініну [Е. К. Валеев та ін., 1988, H. Chan et al., 1998, T. Kamіtanі et al., 1985]. L-лізину есцинат за впливом на перфузію поступається контрикалу в підкоркових структурах, але поперереджає уповільнення КТ в гіпоталамусі та викликає абсолютне зростання показника в корі великих півкуль (таб. 1).

Покращення перфузії під впливом L-лізину есцинату за літературними даними може бути наслідком венотонічного ефекту завдяки стимуляції вивільнення простагландіну F₂a [F. Annonі et al., 1979]. Зниження перфузії разом із відомим з літературних джерел підвищенням активності нейронів [С. М. Минасян та ін., 1989, 1990] призводить до падіння рО₂ у тканинах відповідно до уповільнення КТ (таб. 1).

Протилежність змін КТ та рО₂ в таламусі щодо інших досліджених структур пояснюється відносно меншим вмістом нейронів та слабкою реакцією судин на віброприскорення. Таким чином, у результаті спазму судин в інших структурах спостерігається переросподіл крові до таламусу. Контрикал виявляє більш значну антигіпоксичну дію, викликаючи абсолютне підвищення pO₂ в усіх досліджених структурах (таб. 1). Цей ефект значною мірою обумовлений прискоренням КТ, але слід враховувати і прямий церебропротекторний ефект препарату, що пов'язаний із пригніченням протеіназного каскаду ексайтотоксичності [H. Takahashі et all., 2005]. L-лізину есцинат лише зменшував падіння pO₂ в корі великих півкуль та гіпоталамусі, що є слідством його гемодинамічного та ангіопротекторного ефекту [Р. В. Куцик та ін., 2002]. Свідоцтвом порушення регуляції кровообігу є зміни цереброваскулярної реактивності. Зрушення КрСО₂ були невеликими та односпрямованими із змінами КТ у підкоркових структурах, а в корі великих півкуль не виявлено достовірних змін показника (таб. 1).

Під впливом препаратів, що досліджувалися, зміни КрСО₂ переважно лишалися недостовірними. У той же час відмічене глибоке пригнічення КрСО₂ в корі та гіпоталамусі протягом усього періоду спостереження, а в таламусі - тільки наприкінці експерименту (таб. 1). Більш значне падіння КрО₂ можна пояснити зниженням скорочувальної активності непосмугованих м'язів судин внаслідок гіпоксії, а також тим, що дослідження КрО₂ відбувалося на тлі вазоконстрикції, що викликана вібрацією. Обидва досліджених препарати перешкоджали пригніченню КрО₂, але ефективність контрикалу виявилася вищою завдяки більшій гемодинамічній та антигіпоксичній дії. ЗШВ викликає достовірне зменшення R₁ в корі та трохи менше - в підкоркових структурах, що свідчить про розвиток позаклітинного набряку.

Прояви внутрішньоклітинного набряку за зниженням R₂ були дещо меншими в корі великих півкуль та гіпоталамусі (таб. 2).

Таблиця 2

Динаміка позаклітинного (R₁) та внутрішньоклітинного опору (R₂) у тканинах ненаркотизованних кроликів

* - p<0,01 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

# - p<0,05 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

Виникнення набряку тканин пояснюється збільшенням проникності мембран за рахунок гіпоксії та безпосереднього пошкодження віброприскореннями.

Протекторна дія L-лізину есцинату обумовлена безпосередньою взаємодією з глікозаміногліканами стінки судин та паренхіми тканин [K. Greeske et al., 1996], а також з фосфоліпідами біологічних мембран [Л. В. Иванов та ін., 1988]. Тому препарат виявив переважну активність щодо R₁, зміни якого повністю усував у підкоркових структурах, а в корі великих півкуль викликав абсолютне зростання показника. У той же час захисна дія L-лізину есцинату щодо змін R₂ виявилася трохи меншою (таб. 2). Протинабрякова дія контрикалу пов'язана переважно з антигіпоксичною та зменшенням впливу кінінів на стінки судин [H. Takahashі et all., 2005]. Контрикал значно перевищував L-лізину есцинат за активністю щодо внутрішньоклітинного набряку, викликаючи абсолютне збільшення R₂ (таб. 2). У той же час він усував позаклітинний набряк лише в гіпоталамусі, а в таламусі збільшував зниження R₁.

Зміни кислотно-лужного стану, перекисного окислення ліпідів та антиоксидантних систем, обмеженого протеолізу та інгібіторів протеаз в мозковій венозній крові. Внаслідок зменшення перфузії та падіння рО₂ в тканинах у венозній крові, що відтікає від мозку спостерігалися прояви метаболічного ацидозу у вигляді зниження pH на 0,040, AB, SB, BB та BE. Про субкомпенсований характер ацидозу свідчить зниження pCO₂, яке є наслідком гіпервентиляції (таб. 3).

Таблица 3

Зміни показників кислотно-лужного стану в мозковій венозній крові

* - p<0,01 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

# - p<0,05 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

Hа тлі дії L-лізину есцинату прояви гіпоксії та ацидозу зменшуються більш, ніж вдвічи: зниження AB та BB зберігається, але значно знижується. У той же час зниження pCO₂ та абсолютне зростання SB свідчить про збереження компенсаторної гіпервентіляції. Під впливом контрикалу не тільки повністю усувається ацидоз, але й не спостерігається компенсаторної гіпервентіляції (таб. 3).

Рівень антиацидотичної активності препаратів співпадає з їх впливом на гемодинаміку та рО₂. Внаслідок вібраційного стресу, гіпоксії та ацидозу, спостерігалося підсилене споживання антиоксидантів і, внаслідок цього, зменшення активності ЦП, а також АОА, КПА, ППА та СОД, у результаті чого активувалося перекисне окислення ліпідів, яке виявлялося накопиченням ТБК-АП (таб. 4).

Таблиця 4

Зміни перекисного окислення ліпідів та антиоксидантних систем

* - p<0,01 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

# - p<0,05 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

L-лізину есцинат не тільки повністю усуває зниження АОА та КПА, але й викликає абсолютне зростання інших досліджених компонентів антиоксидантного захисту та сприяє абсолютному зниженню ТБК-АП. Hа тлі введення контрикалу зберігається незначне, але достовірне зростання ТБК-АП разом з аналогічним збільшенням активності інших компонентів антиоксидантного захисту (таб. 4). Отримані нами дані про зміни КЛС та ПОЛ збігається з даними літератури [В. М. Аксенова та ін., 1992, О. І. Бекетов та ін., 2002].

Перевагу контрикалу щодо впливу на КЛС слід пов'язувати із впливом на КТ та церебропротекторною дією [H. Takahashі et al., 2005]. Більше інгібування ПОЛ L-лізина есцинатом можливо обумовлено безпосередньою антиоксидантною дією [M. Guіllaume et al., 1994]. Про активацію обмеженого протеолізу на тлі ЗШВ, свідчить зростання активності ТПА-БАЕЕ та ЕПА, разом з яким відбувалося пригнічення інгібіторів протеаз у вигляді зниження АТА-БАЕЕ та КСІ-БАЕЕ (таб. 5). L-лізина есцинат практично не впливає на зміни протеолітичної активності та інгібіторного потенціалу при ЗШВ. Контрикал, як інгібітор протеолізу, майже повністю усуває зростання ТПА та викликає абсолютне зниження ЕПА. Крім того, препарат не тільки повністю поновлює рівень досліджених інгібіторів протеаз, але й викликає їх абсолютне зростання (таб. 5).

Гістологічні зміни в сенсо-моторній корі великих півкуль, таламусі, гіпоталамусі, стовбурі на рівні латеральних кутів ромбоподібної ямки та мозочку. ЗШВ без використання препаратів супроводжується змінами в усіх досліджених структурах головного мозку. Ці зміни за власним характером однакові в обох півкулях та зводяться до набухання тканин мозку (набряк білої речовини та навколо нейронів), змінам тонусу (спазм артеріол та розширення венул) та проникності судин (периваскулярний набряк), а також до набухання ендотелію судин.

Таблиця 5

Зміни обмеженого протеолізу та інгібіторів протеаз

* - p<0,01 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

# - p<0,05 показник достовірності відмінностей порівняно з контрольним вимірюванням до початку експерименту.

З боку нейронної популяції спостерігаються дистрофічні зміни клітин, змінюються характеристика глії та гліонейрональні взаємовідносини - сателітоз. Активність NO-S в паренхімі мозку суттєво не змінюється, а в стінках судин знижується.

Захистна дія L-лізину есцинату та контрикалу на тлі ЗШВ різну вираженість в судинах та нейронах, а також залежить від структур мозку, але лишається однаковою в обох півкулях. L-лізину есцинат, як ангіопротектор, має більший захистний вплив на судини, ніж на нейронну популяцію. У результаті майже зникає периваскулярний набряк та суттєво знижується набухання стінок судин, а також поновлюється активність NO-S в судинах. У той же час зберігається підвищене обводнення речовини мозку, зменшуються дистрофічні зміни в корі, але зберігаються в таламусі, гіпоталамусі та стовбурі.

Поновлюються гліонейрональні взаємовідносини, але характеристика гліоцитів лишається незмінною. Контрикал проявляє себе переважно як церебропротектор, знижуючи дистрофію нейронної популяції при збереженні незмінного стану гліоцитів, хоча гліонейрональні співвідношення повністю нормалізуються.

В результаті речовина мозку не відрізняється від нормальної. У той же час судини такі самі, як під час дії однієї вібрації. Під впливом препарату активність NO-S у паренхімі або поновлюється до норми, або дещо підсилюється в корі, в судинах - суттєво не змінюється.

Отримані дані гістологічних досліджень свідчать про те, що морфологічними проявами вищеописаного зниження перфузії та реактивності судин є спазм артеріол та розширення венул, що веде до зниження перфузійного тиску в капілярах. Гіпоксія та ацидоз відображені в гістологічних препаратах у вигляді дистрофічних змін у нейроцитах та змінах гліонерональних співвідносин. Протекторна дія досліджених препаратів є похідною їх гемодинамічних, антигіпоксичних та протинабрякових ефектів.

Висновки

У дисертації експериментально обгрунтовано новий підхід до вирішення проблеми підвищення ефективності фармакопрофілактики та корекції порушень мозкового кровообігу в умовах загальної широкосмугової вібрації (ЗШВ) шляхом використання L-лізину есцинату та контрикалу.

2-годинна дія загальної широкосмугової вібрації зменшує об'ємну швидкість локального мозкового кровотоку у ненаркотизованих кроликів в корі (-11,68%, P<0,01) та гіпоталамусі (-9,82%, P<0,01), а також пригнічує констрикторні реакції мозкових судин на вдихання кисню в корі (-63,90%, P<0,01), таламусі (-38,46%, P<0,01) та гіпоталамусі (-53,06%, P<0,01). Після 8-годинної дії вібрації гістологічно визначається спазм артеріол та розширення венул, а гістохімічно - зниження активності NO-синтетази в стінках судин і нейронах.

L-лізину есцинат (0,15мг/кг) зменшує уповільнення кровотоку в гіпоталамусі та викликає абсолютне зростання показника в корі великих півкуль (+6,48%, Р<0,01), а контрикал (1000 ОД/кг) викликає абсолютне зростання кровотоку в усіх досліджених структурах (+11,17%, Р<0,01).

Контрикал краще зменшує пригнічення констрікторних реакції мозкових судин у таламусі (-13,85 %, Р<0,01), гіпоталамусі (-26,75%, Р<0,01) у порівнянні з L-лізином есцинатом (-25,72%, Р<0,01 і -45,65 %, Р<0,01 відповідно), в корі їх ефективність істотно не відрізняється (-22,95%, Р<0,01 та -23,81%, Р<0,01 відповідно), але L-лізину есцинат більшою мірою поновлював активність NO-синтетази.

2-годинна дія вібрації знижує напругу кисню в тканинах в корі (-18,60%, P<0,01) та гіпоталамусі (-18,96%, P<0,01), а через 8 годин у мозковій венозній крові спостерігаються ознаки метаболічного ацидозу - зрушення буферних основ (BE) у кислий бік (-152,34%, P<0,01) і зниження напруги вуглекислого газу (pCO₂) в крові (-28,72%, P<0,01). Крім того спостерігається активація перекисного окислення ліпідів у вигляді зростання вмісту ТБК-активних продуктів (+83,67%, P<0,01) і пригнічння антиоксидантного захисту: зниження загальної антиокислюючої, каталазоподібної, пероксидазоподібної активністей, а також активності супероксиддісмутази і церулоплазміну.

Контрикал має більш значну антигіпоксичну дію, викликаючи абсолютне зростання рО₂ в корі (+6,45%, P<0,01) і таламусі (+7,92%, Р<0,01). L-лізину есцинат зменшує зниження рО₂ в корі (-10,62%, Р<0,01) і усуває гіпоксію в гіпоталамусі (-2%, Р<0,01). Контрикал краще усуває метаболічний ацидоз (BE +26,70%, P>0,05; pCO2 +0,39%, P>0,05; L-лізину есцинат - BE +6,67%, P>0,05; pCO₂ -8,69%, P>0,05 щодо контрольного рівню), а L-лізину есцинат більшою мірою інгібує перекисне окислення ліпідів (ТБК-АП -16,97%, Р<0,01; контрикал - +3,82%, Р<0,01).

У перші 4 години дії загальної вібрації знижується позаклітинний опір (R₁) в корі (-35,80%, P<0,01), таламусі (-20,74%, P<0,01) та гіпоталамусі (-18,92%, P<0,01) та внутрішньоклітинний (R₂) в корі (-12,87%, P<0,01), таламусі (-21,40%, P<0,01) та гіпоталамусі (-16,89%, P<0,01), що свідчить про розвиток позаклітинного та внутрішньоклітинного набряків. Після 8-годинної дії вібрації гістологічна картина в мозку кроликів характеризується набряково-дистрофічними змінами в тканинах, такими як периваскулярний і перицелюлярний набряк, втрата забарвлення за Hислем.

Результатом набряково-дистрофічних змін у тканинах після 8-годинної дії вібрації є сателлітоз, загибель окремих нейроцитів та нейронофагія, а також активація обмеженого протеолізу у вигляді зростання тріпсиноподібної (ТПА-БАЕЕ) (+18,79%, P<0,01) та еластазоподібної (ЕПА) активності (+40,83%, P<0,01), а також зниження інгібіторного потенціалу - антитріптичної активності (АТА-БАЕЕ) (-30,95%, P<0,01) та кислотостабільних інгібіторів (КСІ-БАЕЕ) (-29,56%, P<0,01).

У перші 4 години обидва препарати, особливо контрикал, усували переважно внутрішньоклітинний набряк (R₂ в корі великих півкуль: контрикал - +23,38%, P>0,05; L-лізину есцинат - -0,97%, P>0,05 щодо контрольного рівню), а дія на позаклітинний набряк у L-лізину есцинату виявилася в усіх структурах, у контрикалу - лише в гіпоталамусі (R₁ в корі великих півкуль: L-лізину есцинат - +3,30%, P>0,05; контрикал - -20,45%, P>0,05). Через 8 годин гістологічна картина свідчить про більшу ефективність L-лізину есцинату відносно періваськулярного набряку, а контрикалу - проти набряково-дистрофічних змін у нейроцитах та змін обмеженого протеолізу (ТПА-БАЕЕ +3,63%, P<0,05; ЕПА -17,95%, P<0,01; АТА-БАЕЕ +19,71%, P<0,01; КСІ-БАЕЕ +19,75%, P<0,01).

Практичні рекомендації: L-лізину есцинат та контрикал представляють інтерес для подальшого вивчення в якості засобів для профілактики та корекції цереброваскулярних порушень, які викликані загальної вібрацією.

L-лізину есцинат та контрикал перспективні для включення до комбінацій під час розробки фармакотерапії цереброваскулярних порушень при загальній вібрації.

Список робіт, що надруковані за темою дисертації

1. Гавриш, А. Г. Вплив L-лізину есцинату та контрикалу на водно-електролітний баланс мозку при моделюванні дії загальної вібрації / А. Г. Гавриш // Ліки. - 2007. - № 1-2. - С. 54-58.

2. Белякова, А. Г. Протекторное действие контрикала при нарушениях кровоснабжения и кислородного баланса мозга, вызванных действием общей широкополосной вибрации / А. Г. Белякова, И. Д. Сапегин // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: Тр. Крым. гос. мед. ун-та им. С.И. Георгиевского. - Симферополь, 2008. - Т.144, Ч.ІІІ. - C.7-11. (Проведення експериментів, обробка результатів, участь в написанні статті).

3. Белякова, А. Г. Протекторное действие L-лизина эсцината при нарушениях кровоснабжения и кислородного баланса мозга, вызванных общей широкополосной вибрацией / А. Г. Белякова, И. Д. Сапегин // Медицина сегодня и завтра. - 2008. - №1. - С.11-15. (Проведення експериментів, обробка результатів, участь в написанні статті).

4. Белякова, А. Г. Вплив L-лізину есцинату та контрикалу на гістологічні зміни в мозку ненаркотизованих кроликів при моделюванні дії загальної вібрації / А. Г. Белякова, І. Д. Сапегін, Б. А. Hасібулін // Вісник морфлогії. - 2008. - Т.14, №2. - С. 324-328. (Проведення гострих експериментів, отримання мозку, виготовлення препаратів, участь в написанні статті).

5. Влияние L-лизина эсцината и контрикала на кислотно-основное равновесие и кислородный баланс мозга бодрствующих кроликов при моделировании действия общей широкополосной вибрации / А. Г. Белякова, И. Д. Сапегин, П. Ф. Семенец, Н. Ю. Батищева // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т.11, №4(44). - С. 107-112. (Проведення гострих експериментів, отримання крові, вивчення показників кислотно-лужного стану, обробка результатів, участь в написанні статті).

6. Гаврыш, А. Г. Противоотечное действие L-лизина эсцината при моделировании общей широкополосной вибрации / А. Г. Гаврыш // Актуальные проблемы госпитальной медицины: Тез. докл. международной научно-практической конференции. - Севастополь, Военно-морской клинический госпиталь им. академика H.И. Пирогова Медицинской службы Черноморского флота Российской Федерации, 25-26 ноября 2004. - С.43.

7. Гавриш, А. Г. Антигіпоксична дія L-лізину есцинату при моделюванні загальної широкосмугової вібрації / А. Г. Гавриш // Актуальні проблеми фармакології та токсикології: Тези доп. конференції молодих вчених. - Київ, Інститут фармакології та токсикології АМH України, 22 грудня 2005. - С.16.

8. Гавриш, А. Г. Противоотечное действие контрикала при моделировании общей широкополосной вибрации / А. Г. Гавриш // Актуальные проблемы госпитальной медицины: Тез. докл. международной научно-практической конференции. - Севастополь, Военно-морской клинический госпиталь им. академика H.И. Пирогова Медицинской службы Черноморского флота Российской Федерации, 10-11 ноября 2005. - С.243.

9. Гавриш, А. Г. Антигипоксическое действие контрикала при моделировании общей широкополосной вибрации / А. Г. Гавриш // Вестник морского врача. - 2006. - №2(2). - С.141.

10. Гаврыш, А. Г. Противоотечное и антигипоксическое действие L-лизина эсцината при моделировании общей широкополосной вибрации / А. Г. Гаврыш // Фармакологія 2006 - крок у майбутнє: Тези доповідей ІІІ Hаціонального з'їзду фармакологів Україны. - Одеса, 17-19 жовтня 2006. - С. 37.

11. Гаврыш, А. Г. Влияние контрикала на локальное мозговое кровообращение и реактивность сосудов в период воздействия общей широкополосной вибрации / А. Г. Гаврыш // Актуальные проблемы госпитальной медицины: Тез. V международной научно практической конференции. - Севастополь, 26-27 октября 2007. - Вестник морского врача. - 2007. - №4. - С.201.

12. Гавриш, А. Г. Вплив L-лізину есцинат на локальний мозковий кровотік та реактивність судин під час дії загальної широкосмугової вібрації / А. Г. Гавриш // Актуальні питання фармакології: тези доп. науково-практичної конференції з міжнародною участю, присвяченої 70-річчю кафедри фармакології Вінницького Hаціонального медичного університету ім. М.І. Пірогова. - Вінниця, 25-26 жовтня 2007. - Вісник Вінницького Hаціонального медичного університету. - 2007. - №11 (2/2). - С.755.

13. Гавриш, А. Г. Противоотечное и антигипоксическое действие контрикала при моделировании общей широкополосной вибрации / А. Г. Гавриш // Клінічна фармація в Україні: матеріали VІІ Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю. - Харьків, 15-16 листопада 2007. - С.136-137.

14. Белякова, А. Г. Влияние контрикала на патоморфологические изменения в мозге бодрствующих кроликов, возникающие при моделировании действия общей широкополосной вибрации / А. Г. Белякова // Досягнення та перспективи клінічної фармакології: матеріали V Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю. - Вінниця, 12-13 травня 2008 // Вісник Вінницького Hаціонального медичного університету. - 2008. - №12(1). - С.220-221.

15. Белякова, А. Г. Влияние L-лизина эсцинат на патоморфологические изменения в мозге бодрствующих кроликов, возникающие при моделировании действия общей широкополосной вибрации / А. Г. Белякова // Современные проблемы создания, исследования и апробация лекарственных средств. - Харьков, 19 марта 2008 // " Лекарства человеку". - 2008. - C.23-24.

16. Белякова, А. Г. Вплив L-лізину есцинату на кислотно-лужний стан мозку кроликів у стані неспання, що виникає при моделюванні дії загальної широкосмугової вібрації / А. Г. Белякова // Здобутки клінічної та експериментальної медицини: Матеріали підсумкової науково-практичної конференції. - Тернопіль: ТДМУ "Укрмедкнига", 2009. - С.110.

АНОТАЦія

Белякова А.Г. Експериментальне обгрунтування профілактичного застосування L-лізину есцинату та контрикалу при порушеннях мозкового кровообігу в умовах моделювання загальної широкосмугової вібрації. - Рукопис.