Модифікація in vitro біологічних властивостей клітин раку легені людини інтерфероном-альфа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

УДК: 616-006.04: 578.245: 57.086.83

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Модифікація in vitro біологічних властивостей клітин раку легені людини інтерфероном-альфа

14.01.07 - онкологія

Бездєнєжних Наталя Олександрівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук Кудрявець Юрій Йосипович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, завідувач відділу експериментальних клітинних систем.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Коровін Сергій Ігорович, ДУ «Національний інститут раку», завідувач відділення пухлин шкіри та м'яких тканин;

доктор біологічних наук, професор Позур Володимир Костянтинович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри мікробіології та загальної імунології.

Захист дисертації відбудеться 25 березня 2009 року о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий «24» лютого 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л.М. Шлапацька

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Особливості фенотипу клітин, які формують злоякісну пухлину, у великій мірі визначають і характер пухлинного процесу, а саме - швидкість росту пухлини, інтенсивність віддаленого метастазування, реакцію на лікування і клінічний перебіг захворювання в цілому (Абелев Г.И. и соавт., 2000). Отже, дослідження особливостей фенотипу злоякісних клітин кожної конкретної пухлини є надзвичайно актуальною проблемою сучасної онкології, а пошук шляхів та засобів модифікуючого впливу на фенотипові особливості пухлинних клітин є одним із найважливіших напрямків біотерапії раку (Винсент Т., та співавт., 2002).

Сказане обумовило інтерес дослідників до вивчення патогенетичних механізмів злоякісного росту та метастазування пухлин, а також до тих процесів в організмі, які перешкоджають розвитку і прогресії пухлинного процесу. Адже відомо, що виникнення неоплазій пов'язано не тільки з безпосередньою злоякісною трансформацією клітин, але і з нездатністю захисної системи організму протистояти росту та прогресії неоплазми. Однією з таких ендогенних систем захисту є інтерферон (ІФН) - убіквітарний цитокін, який контролює цілий каскад подій на молекулярно-генетичному, клітинному та системному рівні, запобігаючи трансформації клітин (Honma Y. et al., 2007). Відомо, що ІФН має антимутагенні властивості, посилює апоптоз в пухлинних клітинах, індукований різними чинниками; пригнічує рухомість пухлинних клітин та експресію в них онкогенів, модифікує взаємовідносини клітин між собою та з різними біологічними субстанціями: антитілами, гормонами, лімфокінами, цитокінами і факторами росту (Телетаева Г.М., 2007; Decatris M. et al., 2002; Кудрявець Ю.Й. 2001; Воронцова А.Л. та співавт., 2003; Кадагидзе З.Г., 2003).

Раніше було встановлено, що ІФН викликає реверсію трансформації, індукованої вірусними онкогенами в клітинах гризунів, проте цей ефект ІФН сприймався скоріше як противірусний (Friedman R. et al., 1997). Разом з тим, чисельні, але розрізнені дані вказували, що клітини пухлин людини також можуть втрачати деякі ознаки злоякісного фенотипу під дією ІФН, однак систематичних поглиблених досліджень такого ефекту ІФН і механізмів його дії в рамках однієї пухлинної модельної системи так і не було проведено. Механізми посилення ІФН ефективності комбінованої протипухлинної терапії також залишаються повністю не розкритими. Клінічні успіхи застосування ІФН завжди значно випереджали розуміння механізмів його дії. Отже, не дивно, що цей поліпотентний цитокін широко ввійшов в схему медикаментозної терапії хворих на рак нирки, сечового міхура, меланому та при мієломній хворобі, волосатоклітинному лейкозі і хронічному мієлолейкозі, тощо (Matsui W. et al., 2003; Yanase N. et al., 2000; Коровін С.І. та співавт., 2003). Курси ІФН-терапії, як правило, тривають багато місяців, хоча механізми ефективності саме пролонгованої терапії залишаються невідомими. Сьогодні у світі зростає зацікавленість дослідників і клініцистів до ІФН (Vilcek J., 2006; Ferrantini M. et al., 2007), а по мірі розвитку молекулярної онкології розкриваються і нові механізми його дії. Сказане обумовлює необхідність дослідження не тільки ефектів, але і механізмів пролонгованої дії ІФН на біологічні властивості пухлинних клітин, його впливу на широкий спектр їх фенотипових і цитогенетичних особливостей. Такий підхід буде сприяти, з одного боку, отриманню додаткової інформації відносно механізмів протипухлинної дії ІФН на клітинно-молекулярному рівні, а з іншого - надасть вагомих аргументів щодо шляхів раціонального використання цього цитокіну в біотерапії хворих на рак, зокрема на рак легені.

Такий напрямок роботи є надзвичайно важливим: адже саме генетична та фенотипова нестабільність лежить в основі появи і селекції клітин з високим метастатичним потенціалом, і саме фенотипові особливості пухлинних клітин дають їм можливість уникнути пошкоджуючого впливу численних протипухлинних факторів і дати початок метастатичному росту. За таких обставин пошук засобів, що здатні модифікувати прояви злоякісного фенотипу пухлинних клітин, є надзвичайно актуальним напрямком, і саме цій проблемі - дослідженню активності ІФН як модифікатора біологічних властивостей пухлинних клітин - присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у відділі експериментальних клітинних систем ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України у відповідності до плану науково-дослідних робіт Інституту за темою 2.2.5.225 „Клітинний банк ліній з тканин людини та тварин. Створення нових клітинних моделей шляхом цитокінової модифікації пухлинних клітин in vitro” (2003 - 2008 рр.) та темою «Особливості функціонування онкогеному» (2002 - 2006 рр., державний реєстраційний №0102U003228). Частину роботи було виконано за підтримки гранту для молодих вчених відповідно до постанови Президії НАН України №101 від 11.04.2007 та розпорядження Президії НАН України №265 від 19.04.2007 на виконання наукових досліджень за договором №2.2.5.324 та №2.2.5.324/1.

Мета дослідження. Встановити можливість реверсії злоякісного фенотипу клітин раку легені людини при довгостроковій дії на них інтерферону-альфа та визначити її механізми.

Задачі дослідження.

За умов тривалої експозиції клітин з інтерфероном-альфа дослідити:

1) морфологічні та ультраструктурні особливості пухлинних клітин А-549 (клітинна лінія недрібноклітинного раку легені людини);

2) ростові характеристики і біологічні особливості клітин А-549 (кінетику росту, ефективність колонієутворення на субстраті та в середовищі з напіврідким агаром, ріст в безсироватковому середовищі, тощо);

3) експресію в клітинах А-549 білків, пов'язаних з проліферативною активністю, рівнем диференціювання, метастатичним потенціалом, апоптозом, лікарською резистентністю та ангіогенезом;

4) чутливість клітин А-549 до цитотоксичних факторів різної природи (хімічної, фізичної та біологічної);

5) цитогенетичні особливості клітин А-549.

Об'єкт дослідження: клітини недрібноклітинного раку легені людини - клітинна лінія А-549 та її сублінія, модифікована пролонгованою дією інтерферону-альфа in vitro.

Предмет дослідження: біологічні та цитогенетичні особливості клітин лінії А-549 та модифікованих пролонгованою дією інтерферону-альфа (ІФН).

Методи дослідження: культивування клітин, світлова та електронна мікроскопія, імунологічні (імуноцитохімічні, проточна цитофлуориметрія, імуноферментний аналіз), молекулярно-біологічні (полімеразна ланцюгова реакція із зворотною транскрипцією РНК - ЗТ-ПЛР), цитогенетичні, статистичні.

Наукова новизна. Вперше на клітинах лінії А-549 недрібноклітинного раку легені людини показано, що тривала експозиція клітин з ІФН призводить до значного пригнічення експресії ядерного антигену Кі-67, зростання часу подвоєння клітинної популяції та зменшення щільності росту клітин. Встановлено, що пролонгована дія ІФН на клітини А-549 призводить до підвищення рівня їх диференціювання, про що свідчить ускладнення ультраструктурної організації клітин, пригнічення в них експресії білку цитоскелету віментину та посилення експресії білку адгезії Е-кадгерину.

Показано, що внаслідок тривалої дії ІФН в клітинах недрібноклітинного раку легені людини послаблюється прояв основних ознак злоякісного фенотипу клітин in vitro: знижується автономність росту клітин - колонієутворення на субстраті та в середовищі з агаром, ріст в безсироватковому середовищі та ефективність клонування. Встановлено, що пригнічення ознак злоякісного фенотипу клітин ІФН проявляється також в зниженні в них експресії і секреції білку VEGF.

Вперше встановлена універсальність дії ІФН щодо підвищення чутливості пухлинних клітин до цитотоксичних чинників різної природи: хіміопрепаратів, солей деяких металів, фактору некрозу пухлин, гіпертермії, механічного стресу, тощо. Виявлено, що висока чутливість ІФН-модифікованих пухлинних клітин до цитотоксичних чинників асоційована з підвищенням базального рівня каспази-3 та топоізомерази ІІ альфа, пригніченням експресії Всl-2, р53 та ABC-транспортерів - білків множинної лікарської резистентності (Pgp, Gst, MRP, LRP).

Вперше на клітинах А-549 встановлено, що реверсія злоякісного фенотипу пухлинних клітин шляхом тривалої модифікації їх ІФН має стійкий характер: характеризується пригніченням секреції VEGF, втратою автономності росту клітин, збереженням експресії топоізомерази ІІ альфа протягом 40 діб після припинення прямої дії на клітини цитокіну.

Встановлено, що при тривалому впливі ІФН на клітини недрібноклітинного раку легені людини відбувається клональна селекція клітин, про що свідчить зміна модального класу хромосом та зміна у домінуванні клітин з характерною маркерною хромосомою (der(2)t(2;1)).

Практичне значення роботи

Одержані дані обґрунтовують доцільність тривалих курсів застосовування ІФН в онкологічній клініці не тільки як імуномодулюючого агента, але і як протипухлинного чинника з поліпотентними властивостями, здатного до стійкої зміни злоякісного фенотипу пухлинних клітин. Дана робота дозволяє зрозуміти механізми універсальності підвищення ІФН чутливості пухлинних клітин до цитотоксичних агентів різної природи, що є важливим для його комбінованого застосування з іншими протипухлинними чинниками в біотерапії хворих на рак, зокрема на рак легені.

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно планувала та виконувала наукові досліди. Автором особисто отримана модифікована ІФН клітинна лінія недрібноклітинного раку легені людини - А-549 та проведені всі роботи з культурами клітин, зокрема по дослідженню клітинної морфології, кінетики та автономності росту клітин, впливу на клітини цитотоксичних чинників різної природи за умов тривалої їх модифікації ІФН in vitro. Здобувач самостійно визначала експресію поверхневих та внутрішньоклітинних антигенів імуноцитохімічним методом, за допомогою проточної цитофлуориметрії, експресію мРНК за допомогою ЗТ-ПЛР. Автором самостійно проведено аналіз первинного матеріалу та статистична обробка отриманих даних, здійснено теоретичне узагальнення результатів та порівняння їх з даними літератури, підготовку матеріалів результатів досліджень для їх публікації; підготовлено ілюстративний матеріал і сформульовані основні наукові положення та висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: VІІ Міжнародній конференції молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології” (Київ, 2006); ХІ з'їзді онкологів України (Судак, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю „Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів” (Київ, 2006); ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології” (Київ, 2008); Міжнародній конференції „Tumor hypoxia and malignant progression” (Kyiv, 2008); школі-конференції для молодих вчених „Методы культивирования клеток” (Санкт-Петербург, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, з яких 5 статей у провідних фахових виданнях затверджених ВАК України та 10 тез доповідей у збірках українських та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 169 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаної літератури, який включає 202 посилання, у тому числі 151 зарубіжних. Дисертаційна робота ілюстрована 48 рисунками та 7 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Культивування клітинної лінії А-549 та модифікацію її до ІФН проводили в поживному середовищі RPMI-1640 з 10% ембріональної сироватки телят у зволоженій атмосфері з 5% СО₂ при 37єС. Для модифікації клітин цитокіном використовували рекомбінантний лейкоцитарний інтерферон людини І-го типу (інтерферон-альфа 2b): їх довгостроково (до 380 діб) культивували in vitro в присутності зростаючих концентрацій цитокіну (від 100 до 10 тис. МО/мл). Діапазон доз був обраний після дослідження чутливості клітин А-549 до ІФН: було виявлено, що ІС50 становить 300 МО/мл. Адаптацію клітин до ІФН починали з дози, яка становила ІС30. В результаті, через 3 місяці культивування клітин А-549 з ІФН в зростаючих концентраціях, отримали сублінію, що була резистентна до 10 тис. МО/мл ІФН. Протягом експерименту визначали біологічні та цитогенетичні характеристики клітин лінії А-549, модифікованих різними дозами цитокіну (2 тис. МО/мл, 240 діб та 10 тис. МО/мл, 360 діб). При дослідженні кінетики росту клітин А-549 та модифікованих ІФН субліній підрахунок клітин здійснювали щодоби (протягом 6 діб) за допомогою гемоцитометра, фарбували клітини вітальним барвником - трипановим синім. Для морфологічних досліджень клітин використовували живі культури, а також цитологічні препарати, фарбовані за Майн-Грюнвальд-Гімза. Для більш детального морфологічного дослідження клітин А-549 контрольних та модифікованих ІФН, зокрема їх ядер та ядерцевих структур, цитологічні препарати фарбували азотистим сріблом або/і комбінованим методом фарбування: азур-еозином та сріблом (Howell W.M., 1980).

Для дослідження ультраструктурних особливостей клітин останні вирощували на поліетиленфталатній мембрані і аналізували за допомогою методу електронної мікроскопії (Лившиц В.Л., 1985).

Цитогенетичні дослідження проводили за стандартною методикою (Мамаєва С.Е., 2002). Морфологічні і цитогенетичні препарати аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопу AxioStarPlus (Сarl Zeiss, Germanу) при збільшенні у 200-1000 разів. Препарати живих та фарбованих клітин фотографували за допомогою цифрового фотоапарату Canon (PowerShot G6, UK) та комп'ютерних програм FotoCanvas та Photostudio 5. Кількість фігур мітозу, двоядерні клітини, клітини з мікроядрами і апоптозні клітини розраховували на 1000 клітин (в промілях (‰)).

Для порівняльного дослідження біологічних властивостей пухлинних клітин, які характеризують їх злоякісний фенотип in vitro, визначали рівень автономності росту контрольних та модифікованих ІФН клітин - здатність їх до росту у безсироватковому середовищі, рівень колонієутворення у середовищі з агаром та субстраті, максимальну щільність росту, рівень їх клонування за методом кінцевих розведень та адгезію до субстрату з колагеновим покриттям (Фрешни Р., 1989, Еш Б.Б. та співавт., 1985).

За допомогою імуноцитохімічного методу (Глузман Д.Ф. та співавт. 2000) досліджували експресію ядерного антигену проліферуючих клітин - Кі-67 (MIB1, Dako), білка адгезії - Е-кадгерину (clone NCH-38, Dako), білків, пов'язаних з лікарською резистентністю - Pgp (clone C494, Dako), Gst (clone 353-10, Dako), фактора росту ендотеліальних клітин - VEGF (clone VG1, Dako), рецептора епідермального фактору росту - EGFR (K1494, Dako), білків залучених в процес апоптозу - p53 (clone DO-7, Dako), Bcl-2 (clone 124, Dako). За допомогою методу проточної цитофлуориметрії визначали кількість апоптичних клітин, а також клітин, що експресують активну форму каспази-3 (набір "mAb Apoptosis Kit FITC" BD Bioscience Pharmingen, США), CD95 (Fas-антиген), Bcl-2 та білки АВС-транспортери (Pgp, MRP, LRP). В цих дослідах використовували моноклональні антитіла (МКАТ) фірм Kamiya BioMedical Company, USA: anti-Fas (клон 3.22), anti-Pgp (клон MRK1G), anti-MRP (клон MRPm6), anti-LRP (клон LRP-56); Cymbus Biotechnology, USA - anti-Bcl-2. Дослідження проведені на проточному цитофлуориметрі FACScan (Beckton Dickinson, США).

Експресію в клітинах мРНК топоізомерази ІІ-б визначали за методом ЗТ-ПЛР з використанням комплектів „Рибо-золь-А” та „РЕВЕРТА-L” („Амплисенс”, Росія). В якості контролю якості реакції використовували специфічний праймер до GAPDH (гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа).

Рівень секреції VEGF клітинами А-549 досліджували імуноферментним методом за допомогою відповідної тест-системи до VEGF (Лісняк І.О., 2004).

При дослідженні чутливості клітин А-549 та субліній, модифікованих ІФН, до хіміопрепаратів (адріабластин, фарморубіцин, метотрексат “Ебеве”, елоксатин, флуоурацил, таксолік), солей металів (CdSO₄, MnSO₄, HgCl₂ та Pb-ацетат), гіпертермії, механічного стресу, фактору некрозу пухлин (ФНП) (Recombinant Human TNF-alpha, GF023, Chemicon - від 100 до 10 тис. МО/мл) використовували стандартні методики визначення кількості і життєздатності клітин: фарбування клітин трипановим синім, МТТ або сульфородаміном B (Skehan P. et al., 1990; Rubinstein L. et al., 1990).

Для вивчення впливу гіпертермії на клітини, останні прогрівали в суспензії при 42 або 45⁰С протягом 1 години в поживному середовищі RPMI 1640, інкубували після прогріву 24, 48 та 72 години за стандартних умов. Життєздатність клітин, що зазнали впливу гіпертермії, та їх чутливість до подальшої дії цитостатиків визначали як вказано вище.

Чутливість контрольних та ІФН-модифікованих клітин А-549 до механічного стресу проводили за рекомендаціями Kataoka et al.,(1994), Butcher D.T. et al., (2009). Морфологічні зміни в клітинах після механічного стресу проводили за допомогою електронної мікроскопії.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою математичної програми медико-біологічної статистики STATISTIСA 6.0. Обчислення і порівняння достовірності відмінностей середніх величин проводили з використанням t-критерію Ст'юдента; достовірними вважали відмінності з вірогідністю не менше 95% (Р<0,05).

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження фенотипових особливостей клітин А-549 за умов тривалої дії на них інтерферону. В процесі проведення досліджень основна увага була зосереджена на модифікації ІФН того комплексу фенотипових ознак пухлинних клітин, що характеризують їх злоякісний фенотип, а саме: морфологію та ультраструктуру, характер та автономність росту клітин, чутливість до дії різних факторів, експресію білків, пов'язаних з апоптозом, лікарською резистентністю, ангіогенезом та цитогенетичні особливості клітин. Всі характеристики ІФН-модифікованих клітин протягом всього експерименту порівнювали з такими ж характеристиками клітин вихідної лінії А-549, які не контактували з цитокіном.

Встановлено, що в процесі тривалої експозиції клітин А-549 з ІФН в них формувалась стійкість до антипроліферативної дії цитокіну. Більшість клітин при цьому набували епітелієподібної морфології, збільшувався час їх подвоєння, знижувалась щільність росту клітин за рахунок зменшення їх здатності до багатошарового росту (рис. 1). За даними електронної мікроскопії, внаслідок модифікації клітин ІФН відбулось ускладнення системи клітинних органел: різко збільшилась кількість канальців гранулярного ендоплазматичного ретикулуму, зросла чисельність лізосомальних гранул, мітохондрій та цистерн комплекса Гольджі. Такі зміни ультраструктурної організації клітин свідчать про зростання їх функціональної активності та більш високий рівень їх диференціювання.

Нами також встановлено, що довгострокова експозиція клітин з ІФН супроводжується зменшенням кількості клітин, які експресують віментин, з 98±1,4% в контрольній популяції до 73±1,7% (р<0,001) в ІФН-модифікованій. Відомо, що високий рівень експресії в епітеліальних клітинах віментину - білка цитоскелету, що грає важливу роль в міграції та проліферації клітин, свідчить про потенційну здатність пухлинних клітин до розвитку інвазивно-метастатичного фенотипу. У зв'язку з цим, одержані нами дані, щодо пригнічення експресії віментину в клітинах раку легені, підтверджують здатність ІФН індукувати реверсію злоякісного фенотипу пухлинних клітин. До аналогічного висновку приводить встановлене нами різке збільшення числа клітин, що експресують Е-кадгерин за умов тривалої їх експозиції з ІФН (рис. 2А) та зростання на 20-27% рівня їх адгезії на субстраті з колагеном. Відомо, що відновлення експресії Е-кадгерину в пухлинних клітинах за допомогою генно-інженерних конструкцій викликає перехід клітин від інвазивного до неінвазивного фенотипу, а клінічні дані свідчать, що підвищення рівня експресії Е-кадгерину при недрібноклітинному раку легені (НДРЛ) асоціюється з покращенням прогнозу виживаності хворих (K.Charalabopoulos et al., 2004). Доцільно додати, що пригнічення експресії віментину і зростання експресії Е-кадгерину в клітинах пухлин епітеліального походження розглядається як важливий показник зростання рівня їх диференціювання (Ivaska J. et al., 2007), тобто наші дані вперше обґрунтовують ефективність ІФН як індуктора диференціювання клітин раку легені людини.

В роботі показано, що антипроліферативна дія ІФН на пухлинні клітини асоціюється з пригніченням експресії ядерного антигену проліферуючих клітин Ki-67: 80±2,3% контрольних клітин експресують антиген, в той час як при пролонгованій дії ІФН кількість Кі-67 позитивних клітин зменшується до 60±2,3% (P<0,01). Дані клінічних спостережень свідчать про зворотній зв'язок між рівнем експресії даного антигену та виживаністю хворих на НДРЛ (Зборовская И.Б. и соавт., 2003): адже підвищення рівня експресії Кі-67 вказує на наявність активно проліферуючих пухлинних клітин і тенденцію пухлини до прогресії. Отже, пригнічення експресії Кі-67 в ІФН-модифікованих клітинах дає підставу прогнозувати уповільнення росту пухлин за умов пролонгованої дії досліджуваного цитокіну.

Надзвичайно важливою зміною, яка спостерігається в ІФН-модифікованих клітинах, є стрімке падіння числа EGFR-позитивних клітин (рис. 2Б), що, як відомо, призводить до гальмування проліферації пухлинних клітин. Виявлений нами феномен значної інгібіції експресії EGFR з одночасним зростанням експресії Е-кадгерину і рівня диференціювання клітин чітко корелює з результатами досліджень, автори яких інгібіцію EGFR проводили за допомогою МКАТ (K.Charalabopoulos et al., 2004).

Вивчення автономності росту досліджуваних клітин показало, що довгострокове культивування клітин А-549 з ІФН призводить до різкого пригнічення їх колонієутворюючої активності як на субстраті, так і в середовищі з напіврідким агаром (рис. 3).

Отримані дані свідчать, що тривала дія ІФН, навіть за умов формування нечутливості пухлинних клітин до його антипроліферативної дії, знижує рівень їх туморогенності. Відомо, що туморогенність характеризується in vitro значною автономністю росту пухлинних клітин: незалежністю їх ділення від наявності субстрату та зниженою потребою у зовнішніх проліферативних стимулах, зокрема, у ростових компонентах сироватки. Втрата цих властивостей ІФН-модифікованими пухлинними клітинами є значущою характеристикою втрати їх туморогенності.

Характерно, що навіть за умов припинення додавання ІФН у поживне середовище протягом 40 діб, набуті під впливом цитокіну фенотипові зміни клітин А-549 зберігаються: клітини не ростуть в агарі і гинуть при зменшенні вмісту сироватки крові у поживному середовищі, тобто набувають ростові характеристики, подібні до таких у нетрансформованих клітин (рис. 4).

Однією з умов прогресивного росту злоякісної пухлини є адекватний кровообіг в її тканині, який забезпечується інтенсивним неоангіогенезом. Враховуючи цей факт, ми дослідили вплив тривалої дії ІФН на експресію VEGF в пухлинних клітинах та на їх здатність продукувати цей цитокін. Імуноцитохімічний аналіз показав, що при довгостроковій експозиції in vitro клітин раку легені людини з ІФН значно зменшується число клітин, що експресують VEGF: 80±3,8% контрольних клітин експресують VEGF, в той час як в популяції ІФН-модифікованих клітин А-549 - лише 21±4,3%. При цьому чітко простежується дозова та часова залежність ефекту пригнічення експресії VEGF в пухлинних клітинах від дії ІФН (рис. 5).

Результати дослідження секреції клітинами VEGF, проведені за допомогою ІФА аналізу культуральної рідини, засвідчили статистично достовірне пригнічення секреції досліджуваного фактору в клітинах А-549. Зазначимо, що нами встановлено обернену кореляцію між рівнем VEGF в культуральній рідині та часом культивування клітин з ІФН.

Важливо підкреслити, що низький рівень експресії і продукції VEGF довго зберігається (>35 діб) і після припинення прямої дії цитокіну на клітини. реверсія злоякісний інтерферон рак

Одержані результати, безсумнівно, підтверджують роль ІФН як потужного антиангіогенного чинника, а також є важливим свідченням стійкості змін, які викликає цитокін в клітинах внаслідок довгострокової його дії. Описаний ефект ІФН на клітинах недрібноклітинного раку легені виявлений нами вперше і є експериментальним підґрунтям доцільності застосування ІФН як антиангіогенного агента при комплексній терапії хворих на рак легені.

Модифікація чутливості клітин до дії цитотоксичних факторів за умов тривалої дії на них ІФН. В останні роки біотерапія, зокрема з використанням ІФН, стає важливим компонентом комплексного лікування онкологічних хворих. В зв'язку з цим важливим етапом роботи було з'ясувати, яким чином впливає модифікація клітин А-549 ІФН на їх чутливість до цитотоксичних чинників, зокрема - цитостатиків, які застосовуються в клінічній практиці (адріабластин, фарморубіцин, доцетаксел, елоксатин, фторурацил, метотрексат, ірінотекан та інш.) для лікування хворих на рак легені (РЛ). Дослідження показали, що цитотоксична активність цитостатиків в модифікованих ІФН клітинах достовірно зростає в порівнянні з такою в контрольних клітинах А-549. Слід підкреслити, що чутливість клітин зростала до всіх хіміопрепаратів, незалежно від механізму їх дії. Так, чутливість модифікованих ІФН клітин до препаратів антрациклінового ряду зросла на 40% (р<0,01), до таксоліків та антиметаболітів - щонайменше на 20% (р<0,05). Дуже важливим фактом є універсальність підвищення ІФН чутливості пухлинних клітин до цитотоксичних чинників різної природи і різного механізму дії. За таких обставин цікаво було також порівняти чутливість клітин раку легені людини вихідної лінії А-549 та модифікованої тривалою обробкою ІФН до дії інших ксенобіотиків - солей металів: адже механізми дії іонів металів на клітини суттєво відрізняються від таких хіміопрепаратів. Встановлено, що модифіковані ІФН клітини стають значно чутливішими і до іонів деяких металів. Так, цитотоксичність хлориду ртуті для ІФН модифікованих клітин А-549 зростає удвічі - IC50 хлориду ртуті для цих клітинах складає - 0,01 мг/мл, а для контрольних - 0,02 мг/мл. Зберігається тенденція і до підвищення чутливості ІФН-модифікованих клітин до іонів Pb²⁺, Mn²⁺, Cd²⁺. Це може бути важливим у зв'язку з можливим використанням деяких металів у складі нових сполук-нанокомпозитів для комплексної терапії хворих з включенням ІФН.

Лікування хворих на НДРЛ - одна з найскладніших проблем клінічної онкології, що обумовлено низькою чутливістю пухлин до консервативних методів лікування і високої частоти виникнення лікарської резистентності. Оскільки учасниками активного виведення хіміопрепаратів з клітин є білки АВС-транспортери (глікопротеїн Pgp, білки GST, MRP та LRP), ми дослідили рівень їх експресії в клітинах А-549 за умов пролонгованої дії на них ІФН. Виявлено, що в контрольній популяції клітин має місце високий рівень експресії Pgp - майже у 100% клітин, тоді як в ІФН-модифікованій популяції кількість Pgp⁺-клітин знижується до 27±1,8% (р<0,01). Аналогічне зниження спостерігається і по відношенню до GST: кількість GST-позитивних клітин падає з 47±3,6% в контрольній популяції до 19±2% - в ІФН-модифікованій (р<0,01) (рис. 6).

Дослідження за допомогою проточної цитофлуориметрії експресії інших білків - MRP та LRP, що обумовлюють лікарську резистентність клітин раку легені, показало значне зменшення як експресії LRP в клітинах модифікованих ІФН (з 15,4±1,1% LRP-позитивних клітин в контролі до 6,04±0,23% - в ІФН-модифікованій популяції), так і суттєве зниження експресії МRP (13,4±0,76% МRP-позитивних клітин в контролі і лише 2,26±0,05% клітин в ІФН-модифікованій популяції). До числа білків, що відіграють важливу роль у механізмі дії деяких цитостатиків, зокрема антрациклінів, є топоізомераза ІІ альфа. На сьогодні відомо, що ампліфікація в клітинах мРНК або синтез білка топоізомерази ІІ альфа є свідченням підвищення чутливості пухлинних клітин до антрациклінів (Pritchard K.I. et al., 2008). При дослідженні експресії даного гену в клітинах лінії А-549 та сублінії, що довгостроково культивувалась з ІФН, за допомогою напівкількісного методу ЗТ-ПЛР нам вдалося виявити збільшення експресії мРНК даного ферменту лише в клітинах, модифікованих в присутності 10 тис. МО/мл ІФН, що свідчить про дозозалежність ефекту даного цитокіну. Цікаво, що в ІФН-модифікованих клітинах А-549, які культивувались за умов «виключення» ІФН із ростового середовища протягом 40 діб експресія топоізомерази ІІб залишається високою.

Таким чином, одержані дані не тільки підтверджують підвищення чутливості клітин, модифікованих ІФН, до хіміотерапевтичних препаратів але й розкривають механізми такої дії ІФН.

Відомо, що метод гіпертермії, яка є ефективним індуктором апоптозу, часто застосовують в клінічній онкології. Раніше було встановлено, що гіпертермія препаратів кісткового мозку хворих у комбінації з ІФН сприяє селективній елімінації лейкозних клітин. Отже, дослідження чутливості ІФН-модифікованих клітин НДРЛ до гіпертермічного впливу є логічним і обґрунтованим. Встановлено, що при модифікації клітин ІФН (10 тис. МО/мл) їх витривалість за умов гіпертермії стрімко падає: навіть при незначному підвищенні температури (до 42⁰С) живими залишається лише 30% ІФН-модифікованих клітин, в той час як контрольні клітини залишаються неушкодженими. Збільшення температури до 45⁰С призводить до загибелі 30% клітин в контрольних культурах, тоді як число мертвих ІФН-модифікованих при 2 тис. МО/мл та 10 тис. МО/мл ІФН клітин за цих умов становить 60% і 100% відповідно. Морфологічні дослідження показали, що причиною загибелі пухлинних клітин є апоптоз.

Досліджена чутливість до цитостатиків (доцетаксел, фарморубіцин) клітин, які залишилися живими після гіпертермічного впливу (температура нагріву - 43 - 44⁰С). Показано, що чутливість контрольних клітин та ІФН-модифікованих (2 тис. МО/мл ІФН) клітин А-549 до доцетакселу після гіпертермії дещо зменшується. Однак чутливість клітин, модифікованих при 10 тис. МО/мл ІФН, навпаки зростає (рис. 7). ). Аналогічна тенденція спостерігалась і при дослідженні впливу гіпертермії на чутливість клітин до фарморубіцину.

Одержані дані свідчать, що більш висока концентрація ІФН можливо пригнічує активність стрес-активованих білків, що впливають на чутливість клітин до ксенобіотиків. При сумісному застосуванні цитостатиків з гіпертермією використання ІФН може запобігати виникненню постгіпертермічної лікарської резистентності пухлинних клітин.

Відомо, що однією з важливих особливостей пухлинних клітин з високим метастатичним потенціалом, є їх стійкість до ушкоджень, викликаних гідродинамічною дією турбулентного току крові в кровоносних судинах. Порівняльне дослідження дії механічного стресу («shear stress») на вихідні та на ІФН-модифіковані клітини показало, що навіть за умов помірного механічного навантаження при пересіві ІФН-модифікованих клітин гине більше, ніж контрольних, а при підсиленні дії (до 10 дін/см²) пошкоджуючий ефект останнього суттєво посилюється: контрольних клітин гине 20±1,3%, а ІФН-модифікованих - 50±4,5%. При порівнянні ультраструктури контрольних та ІФН-модифікованих клітин А-549 після механічного стресу серед останніх було виявлено зростання кількості апоптичних клітин, значне пошкодження плазматичної та ядерної мембрани клітин, пошкодження мітохондрій та лізосомальних структур, що свідчить про значно меншу стійкість ІФН-модифікованих клітин до механічного стресу.

Відомо, що взаємодія ІФН з мембранними рецепторами пухлинних клітин супроводжується активацією JAK/STAT сигнального шляху, який регулює експресію широкого спектру генів, зокрема інгібіторa циклін залежних кіназ, Fas і FasL, TRAIL і TRAIL-рецептора, каспаз (S.E.Hartman et al., 2005; L.Adamkova et al., 2007). Нами були отримані дані цитофлуориметрії, які свідчать про підвищення експресії CD95, а також дані про посилення чутливості клітин до апоптозу, індукованого ФНП, який після взаємодії з відповідним рецептором на клітинах індукує загибель клітин. Цей виявлений нами феномен синергізму дії ІФН і ФНП та посилення експресії Fas-антигену є дуже важливим, оскільки в крові багатьох онкологічних хворих циркулює ендогенний ФНП, апоптична дія якого на пухлинні клітини може бути значно посилена шляхом проведення ІФН-терапії.

До категорії ІФН активованих молекул відносяться і каспази - ключові білки апоптичного процесу (A.H.H van Boxel-Dezaire et al., 2006; L.Adamkova et al., 2007). Результати цитофлуориметричних досліджень продемонстрували значне збільшення в ІФН-модифікованих клітинах базального рівня активної форми каспази-3 і подальше його зростання за умов індукції апоптозу в клітинах під дією хіміотерапевтичних чинників.

Отже, обговорюючи результати проведених досліджень, слід підкреслити цікаву закономірність: незважаючи на різницю в механізмах токсичної дії використаних чинників (вплив на ДНК клітин, на мікротрубочки, плазматичну мембрану, тощо), в ІФН-модифікованих клітинах відбувається поступове підвищення чутливості до індукції апоптозу.

Відомо, що одним з ключових регуляторів апоптозу є білок р53, який, зокрема, опосередковує загибель патологічно змінених клітин. Експресія р53 повністю відсутня у 50% хворих НДРЛ в зв'язку з делецією і мутацією гену р53. За допомогою імуноцитохімічного методу (були використані МКАТ, які виявляють як дику, так і мутантну форми р53) було встановлено, що в контрольній культурі 40% клітин експресують р53, тоді як після тривалої експозиції їх з ІФН виявляється менше 5% р53 позитивних клітин. Наведені результати є надзвичайно цікавими: адже відомо (Копнин Б.П., 2000), що при активності мутантного р53 спостерігається суттєве підвищення швидкості проліферації клітин, що обумовлено дерегулюючою дією останнього на клітинний цикл. Крім того, мутантний білок р53 може модифікувати дію цитостатиків шляхом послаблення апоптозу.

За допомогою імуноцитохімічного методу з використанням МКАТ до Bcl-2 було також виявлено різке зменшення експресуючих цей білок клітин після їх тривалої обробки ІФН (рис. 8). Отримані дані привертають до себе увагу з точки зору клінічних спостережень, які свідчать, що гіперекспресія Bcl-2 є маркером негативного прогнозу при таких новоутвореннях, як рак сечового міхура, лімфоїдні та мієлоїдні лейкемії, інш. Доведено також, що гіперекспресія мутантного гена Bcl-2 асоціюється з лікарською стійкістю пухлинних клітин до багатьох хіміопрепаратів.

На завершення слід зазначити, що більшість змін, які реєструються в пухлинних клітинах внаслідок тривалої дії на них ІФН, мають стійкий і незворотній характер. Багато властивостей, набутих модифікованими клітинами, зберігаються після припинення прямої дії цитокіну (протягом 40 діб), зокрема такі, як втрата ними автономності росту, чутливість до механічного стресу, підвищена експресія топоізомерази ІІ, низький рівень секреції VEGF, тощо.

Така стабільність прояву набутих клітинами властивостей не може бути результатом лише їх постійної індукції ІФН: нові властивості є результатом більш стійких генетичних і епігенетичних змін в клітинах або результатом специфічної, ІФН-індукованої селекції клітинної популяції. Цитогенетичний аналіз ІФН-модифікованих клітин, проведений в динаміці на різних етапах формування нової сублінії клітин, продемонстрував глибокі зміни в популяційному складі цих клітин. Змінюється модальний клас хромосом, відбуваються зміни в домінуванні клітин з певними маркерними хромосомами: значно зростає (від 6% до 80%, P<0,001) кількість метафаз з хромосомною перебудовою der(6)t(6;1) і майже зникають клітини з маркерами der(2)t(2;1), тобто під впливом ІФН відбувається клональна селекція клітин. Характерною ознакою для модифікованої ІФН сублінії А-549 стає зниження частоти клітинних поділів і зростання кількості клітин з мікроядрами (р<0,05), що характерно для клітин з відносно великою кількістю ДНК-розривів; адже саме останні зумовлюють сповільнення темпів клітинного поділу та накопичення клітин з мікроядрами. Культивування ІФН-модифікованих клітин у відсутності цитокіну супроводжується подальшою цитогенетичною і фенотиповою уніфікацією популяції - домінуванням клонів з маркерами der(6)t(6;1), модальним числом 54-59 хромосом у 80% клітин та з низьким проявом ознак злоякісного фенотипу.

Висновки

На моделі клітин недрібноклітинного раку легені людини (лінія А-549) розкрито широкий спектр фенотипових і цитогенетичних змін внаслідок тривалої дії ІФН, що свідчить про реверсію злоякісного фенотипу клітин і елімінацію з популяції найбільш злоякісних клітинних клонів.

1. Встановлено, що внаслідок тривалої модифікації клітин раку легені людини А-549 ІФН ускладнюється їх ультраструктурна організація, більшість клітин при цьому набувають епітелієподібної морфології, що разом з комплексом інших ознак (підвищення адгезії клітин та експресії Е-кадгерину (з 22±1,3% до 63±2,6% в ІФН-модифікованих клітинах), зниження експресії віментину (на 20 - 25%) та EGFR (з 100% до 7±0,5% в ІФН-модифікованих клітинах) є свідченням підвищення рівня їх диференціювання.

2. Тривала дія ІФН на клітини А-549 призводить до пригнічення проліферативного потенціалу клітин, проявів злоякісного фенотипу і ознак туморогенності in vitro, що виражається у зниженні експресії ядерного антигену Кі-67 на 20%, пригніченні автономності росту клітин (стрімко знижується здатність клітин рости в середовищі з агаром та в безсироватковому середовищі, падає їх клонуюча ефективність), зниженні рівня експресії і продукції VEGF та зростанні чутливості до механічного стресу.

3. Виявлено, що в ІФН-модифікованих клітинах відбуваються суттєві зміни в експресії апоптоз-опосередкованих білків: зростання експресії Fas-антигену, підвищення базального рівня активованої каспази-3, зниження експресії антиапоптичного білку Bcl-2 (з 94±1,02% до 29±2,4% в ІФН-модифікованих клітинах), р53 і підвищення чутливості до ФНП-індукованого апоптозу.

4. Виявлено, що внаслідок модифікації клітин ІФН відбувається підвищення чутливості клітин до цитотоксичних агентів хімічної, фізичної та біологічної природи, яке супроводжується зростанням в клітинах базального рівня активованої каспази-3, індукцією топоізомерази ІІ альфа, пригніченням експресії Всl-2, р53 та білків АВС-транспортерів - маркерів лікарської резистентності (Pgp, Gst, MRP, LRP).

5. На клітинах недрібноклітинного раку легені людини встановлено, що реверсія злоякісного фенотипу пухлинних клітин внаслідок тривалої модифікації їх ІФН має стійкий характер: втрата автономності росту клітин, експресія топоізомерази ІІ альфа, пригнічення секреції VEGF зберігаються протягом 40 діб після припинення прямої дії на клітини цитокіну.

6. В модельній системі клітин недрібноклітинного раку легені людини встановлено, що при довгостроковій модифікації клітин ІФН зміни фенотипових властивостей супроводжуються і суттєвими змінами у клональному складі популяції злоякісних клітин. На це вказує значна зміна модального класу хромосом та домінування в популяції клітин з маркерною хромосомою: значно зростає кількість метафаз з хромосомною перебудовою der(6)t(6;1) і майже зникають клітини з хромосомною перебудовою der(2)t(2;1), що свідчить про суттєвий і специфічний селективний вплив ІФН на певні клони пухлинних клітин.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Mechanochemically Activated Doxorubicin Nanoparticles in Combination with 40 MHz Frequency Irradiation on A-549 Lung Carcinoma Cells / V.E.Orel, Yu.I.Kudryavets, S.Satz, N.A.Bezdenezhnih, M.I.Danko, N.N. Khranovskaya, A.V.Romanov, N.N.Dzyatkovskaya, A.P.Burlaka // Drug Delivery. - 2005. - v.12, №3. - Р. 171-178. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи з культурою клітин А-549, досліджена їх чутливість до хіміопрепаратів та опромінення, підготовлено матеріал до друку)

2. Modifying influence of prolonged action of interferon on phenotypic characteristics of human lung cancer cells in vitro / Yu.I. Kudryavets, N.O. Bezdenezhnykh, N.Yu. Lukyanova, N.A. Tregubova, A.L.Vorontsova // Experimental Oncology. - 2008. - v.30, №4. - Р. 283 - 288. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи з культурою клітин, проведений імуноцитохімічний аналіз експресії антигенів, статистична обробка отриманих даних, підготовлено матеріал до друку)

3. Марченко М.Л. Порівняльна характеристика цитотоксичного впливу сполук важких металів на клітини людини, культивовані in vitro / М.Л. Марченко, Н.О.Бездєнєжних, Ю.Й. Кудрявець // Український журнал з проблем медицини праці. - 2008. - Т.15, №3. - С. 27-34. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи з культурою клітин, досліджена їх чутливість до солей металів, статистична обробка результатів, підготовлено матеріал до друку).

4. Синтез четвертинних солей циклопентан[с] хінолінію та дослідження їх цитотоксичної активності in vitro в культурі клітин А-549 раку легені людини / О.В.Боднарчук, Н.О.Бездєнєжних, М.В.Мельник, Ю.Й.Кудрявець // Фармацевтичний журнал.- 2008. - №6.- С. 47-52. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи з культурою клітин, досліджена їх чутливість до хіміопрепаратів, проведено морфологічні дослідження, статистична обробка результатів).

5. Підвищення чутливості пухлинних клітин людини до цитотоксичних чинників в умовах пролонгованої дії інтерферону in vitro/ Ю.Й.Кудрявець, Н.О.Бездєнєжних, М.Л.Марченко // Сучасні проблеми токсикології.- 2008.- №4.- С. 20-25. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи з культурою клітин, досліджена їх чутливість до хіміопрепаратів, солей важких металів, гіпертермії, проведений імуноцитохімічний аналіз експресії антигенів, статистична обробка результатів, підготовлено матеріал до друку).

6. Стійкі зміни біологічних властивостей і реверсія злоякісного фенотипу клітин раку легені людини при довгостроковій експозиції їх з інтерфероном in vitro / Н.О.Бездєнєжних, С.М.Цибулько, Н.А.Голярник, І.В.Абраменко, Ю.Й.Кудрявець // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології, 2-3 лютого 2006 р.: тези VІІ міжнародної конференції молодих онкологів, Київ. 2006. - С. 12.

7. Реверсия злокачественного фенотипа и снижение лекарственной устойчивости в клетках рака легкого человека при длительной экспозиции их с рекомбинантным альфа-интерфероном in vitro / Ю.И.Кудрявец, Н.А.Безденежных, И.В.Абраменко, С.М.Цыбулько, Н.А.Голярник, И.А.Лисняк, А.Л.Воронцова // ХІ з'їзд онкологів України, 29 травня - 02 червня 2006 р.: матеріали з'їзду, Судак. 2006р. - С. 28-29.

8. Реверсия злокачественности и снижение лекарственной устойчивости в клетках рака легкого человека при длительной обработке их рекомбинантным альфа интерфероном in vitro / Ю.И.Кудрявец, Н.А.Безденежных, И.В.Абраменко, С.Н.Цыбулько, Н.А.Голярник, И.А.Лисняк, Н.А.Трегубова, А.Л.Воронцова // IV съезд онкологов и радиологов СНГ, 28 сентября - 01 октября 2006 г.: материалы съезда, Баку. 2006. - С. 45-46.

9. Формирование резистентности опухолевых клеток к антипролиферативному действию интерферона in vitro не снижает его способности вызывать реверсию злокачественного фенотипа / Ю.И.Кудрявець, Н.А.Безденежных, С.Н.Цыбулько, О.А.Ковалева, А.Л.Воронцова, М.П.Завелевич, Н.Н.Храновская, И.А. Лисняк, А.А.Фильченков // Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів, 2-3 листопада 2006 р.: Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю, Київ. 2006. - С. 32.

10. Продукция ангиогенных факторов культивируемыми клетками как фенотипический признак их малигнизации / Н.А.Безденежных, И.А.Лисняк, А.Л.Воронцова, Ю.И.Кудрявец // Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології, 23-24 квітня 2008 р.: Тези ІХ Міжнародної конференції молодих онкологів, Київ, 2008 р.- С.18-19.

11. Дослідження механізмів чутливості клітин раку легені людини до комбінованого впливу хіміопрепаратів і гіпертермії в умовах пролонгованої дії інтерферону in vitro / Н.О.Бездєнєжних, Н.Ю.Лук'янова, О.О.Лихова, Ю.Й.Кудрявець // Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології, 23-24 квітня 2008 р.: Тези ІХ Міжнародної конференції молодих онкологів, Київ, 2008 р.- С. 20-21.

12. Цитогенетические изменения в клеточной популяции аденокарциномы легкого человека линии А-549 под влиянием интерферона / О.А.Ковалева, Н.С.Степаненко, Н.А.Безденежных, Ю.И.Кудрявец // Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології, 23-24 квітня 2008 р.: Тези ІХ Міжнародної конференції молодих онкологів, Київ, 2008 р.- С. 61.

13. Markers of cell proliferation, differentiation and malignance while durable exposition of cells of nonsmall cellular lung cancer with interferon in vitro / Y.I.Kudryavets, N.A. Bezdeneznykh, N.Y.Lukyanova, O.A.Kovalyova, A.L.Vorontsova // Tumor hypoxia and malignant progression, October 1-4, 2008.: scientific program and abstracts international conference, Kyiv. 2008. - P. 29-30.

14. Изменение морфофункциональных свойств и цитогенетических характеристик клеточной популяции аденокарциномы легкого человека линии А-549 под влиянием интерферона in vitro / О.А.Ковалева, Н.С.Степаненко, Н.А.Безденежных, Ю.И.Кудрявец // Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург, 6-10 октября, 2008 г.: тезисы докладов и сообщений, Цитология, т.50. - C. 807-808.

15. Маркеры клеточной пролиферации, дифференцировки и злокачественности при длительной экспозиции клеток немелкоклеточного рака легкого с интерфероном in vitro / Н.А.Безденежных, Н.Ю.Лукьянова, А.А.Лихова, Ю.И.Кудрявец // Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург, 6-10 октября, 2008 г.: тезисы докладов и сообщений, Цитология, т.50. - C. 795-796.

Анотація

Бездєнєжних Н.О. Модифікація in vitro біологічних властивостей клітин раку легені людини інтерфероном-альфа. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2009.

На моделі клітин недрібноклітинного раку легені людини (лінія А-549) виявлено широкий спектр фенотипових і цитогенетичних змін внаслідок тривалої дії ІФН, що свідчить про реверсію злоякісного фенотипу клітин і елімінацію з популяції найбільш злоякісних клітинних клонів.

Встановлено, що пролонгована дія інтерферону на клітини А-549 призводить до пригнічення експресії ядерного антигену Кі-67, підвищення рівня їх диференціювання: зниження експресії віментину та EGFR, посилення експресії Е-кадгерину і ускладнення ультраструктурної організації клітин.

Показано, що внаслідок тривалої дії інтерферону пригнічується прояв всіх ознак туморогенності клітин: ріст в середовищі з агаром та в безсироватковому середовищі, клональна ефективність на субстраті, пригнічення експресії VEGF.

Встановлена універсальність дії інтерферону щодо підвищення чутливості пухлинних клітин до цитотоксичних чинників різної природи. Ця висока чутливість асоційована з підвищенням експресії проапоптичних білків: Fas-антигену, каспази-3 та топоізомерази ІІ альфа, а також пригніченням експресії Всl-2, р53, білків-маркерів лікарської резистентності (Pgp, Gst, MRP, LRP).

Встановлено, що реверсія злоякісного фенотипу пухлинних клітин раку легені шляхом тривалої модифікації їх інтерфероном має стійкий характер. Зміни фенотипових властивостей супроводжуються змінами у клональному складі пухлинної популяції: змінюється модальний клас хромосом та домінування клітин з іншими маркерними хромосомами: значно зростає кількість метафаз з хромосомною перебудовою der(6)t(6;1) і майже зникають клітини з хромосомною перебудовою der(2)t(2;1).

Ключові слова: інтерферон-альфа, рак легені людини, культура клітин, фенотип, лікарська резистентність, хромосоми.

Аннотация

Безденежных Н.А. Модификация in vitro биологических свойств клеток рака легкого человека интерфероном-альфа. - Рукопись.