Модифікація in vitro біологічних властивостей клітин раку легені людини інтерфероном-альфа

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев - 2008.

Диссертация посвящена исследованию возможностей и механизмов реверсии злокачественного фенотипа клеток рака легкого человека при длительном воздействии на них интерферона-альфа in vitro.

Основные задачи исследования состояли в том, чтобы в условиях длительной экспозиции с ИФН изучить морфологические и ультраструктурные особенности опухолевых клеток немелкоклеточного рака легкого человека-А-549, их ростовые характеристики и биологические особенности, экспрессию белков, связанных с пролиферативной активностью, уровнем дифференцировки, апоптозом, лекарственной резистентностью и ангиогенезом. Кроме того, была поставлена задача исследовать чувствительность клеток А-549 к цитотоксическим факторам химической, физической и биологической природы и цитогенетические особенности клеток А-549 в условиях длительной экспозиции их с ИФН.

В результате проведенных исследований показано, что продолжительная экспозиция клеток с ИФН приводит к угнетению экспрессии ядерного антигена Кі-67, вызывает повышение уровня их дифференцировки: угнетение экспрессии белка цитоскелета виментина, снижение экспрессии EGFR (с 100% до 7±0,5% в ИФН-модифицированных клетках) и усиление экспрессии белка адгезии Е-кадгерина (с 22±1,3% до 63±2,6% в ИФН-модифицированных клетках), усложнение ультраструктурной организации клеток, а именно: резко увеличилось количество канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума, лизосомальных гранул, митохондрий и цистерн комплекса Гольджи.

Продолжительное действие ИФН подавляет проявление всех признаков туморогенности клеток А-549 in vitro: рост в среде с агаром и в безсывороточной среде, клональную эффективность на субстрате. Известно, что туморогенность характеризуется in vitro автономностью роста опухолевых клеток: независимостью их деления от наличия субстрата и сниженной потребностью во внешних пролиферативных стимулах. Утрата этих особенностей ИФН-модифицированными опухолевыми клетками является существенной характеристикой утраты их туморогенности. С помощью иммуноцитохимического и иммуноферментного методов наблюдали угнетение экспрессии VEGF в клетках А-549 при длительном действии на них ИФН.

Выявлена универсальность действия интерферона относительно повышения чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическим факторам разной природы: физическим (гипертермия, механический стресс), химическим (химиопрепараты, соли некоторых металлов) и биологическим (фактор некроза опухоли (ФНО)). Высокая чувствительность ИФН-модифицированных опухолевых клеток к цитотоксическим факторам ассоциирована с повышением экспрессии Fas-антигена, каспазы-3 и топоизомеразы ІІ альфа, а также угнетением экспрессии Всl-2 (с 94±1,02% до 29±2,4% в ИФН-модифицированных клетках) и р53. Выявлено также угнетение белков-маркеров лекарственной устойчивости при длительной экспозиции клеток А-549 с ИФН: Pgp (со 100% до 27±1,8% (р<0,01) в ИФН-модифицированных клетках), Gst (с 47±3,6% до 19±2% - в ИФН-модифицированной (р<0,01)), MRP (13,4±0,76% МRP положительных клеток в контроле и только 2,26±0,05% клеток в ИФН-модифицированной популяции) и LRP (с 15,4±1,1% до 6,04±0,23% в ИФН-модифицированной популяции).

Реверсия злокачественного фенотипа клеток рака легкого человека путем продолжительной модификации их интерфероном имеет устойчивый характер и сохраняется на протяжении 2-х месяцев после прекращения прямого действия ИФН на клетки.

В модельной системе клеток рака легкого человека впервые показано, что при долгосрочной модификации клеток ИФН изменения фенотипа сопровождается и существенными изменениями в клональном составе опухолевой популяции. На это указывает значительное изменение модального класса хромосом и доминирование в популяции клеток с другими маркерными хромосомами: значительно увеличивается количество метафаз с хромосомной перестройкой der(6)t(6;1) и практически исчезают клетки с маркерами der(2)t(2;1). Характерным признаком для модифицированной ИФН сублинии становится снижение частоты клеточных делений и увеличение количества клеток с микроядрами (р<0,05), что характерно для клеток с относительно большим количеством ДНК-розрывов. Культивирование ИФН-модифицированных клеток без цитокина сопровождается дальнейшей цитогенетической унификацией популяции.

Ключевые слова: интерферон-альфа, рак легкого человека, культура клеток, фенотип, лекарственная устойчивость, хромосомы.

Annotation

Bezdenezhnykh N.О. In vitro modification of biological properties of human lung cancer cells by interferon-alpha. - Manuscript.

Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Biology, speciality 14.01.07 - Oncology. - R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2009.

On the model of human non-small-cell lung cancer (A-549 cell line) it has been shown that prolonged action of IFN alters a wide spectrum of phenotypic and cytogenetic patterns of the cells leading to the reversion of malignant phenotype.

Prolonged action of interferon on A-549 cells led to the decrease of expression of nuclear Ki-67 antigen, increase of cell differentiation level: inhibition of vimentin and EGFR expression, enhanced E-kadherin expression and more complex ultrastructural organization of the cells.

It has been shown that long-term treatment with IFN suppresses the manifestation of cell's tumorigenecity: their growth in semisolid medium and serum-free medium, clonal efficacy on substrate, and VEGF expression.

Universal action of interferon toward elevated sensitivity of tumor cells to cytotoxic factors of different nature was revealed. Such high sensitivity is associated with increased expression level of proapoptic proteins (Fas-antigen, caspase 3 and topoisomerase II alpha) and with decreased expression of Bcl-2, p53, and markers of drug resistance (Pgp, Gst, MRP, LRP).

It was demonstrated that the reversion of malignant phenotype of lung cancer cells by modification with long-term IFN treatment has a stable character. The changes of phenotypical features are accompanied by the changes on clonal composition of tumor cell population, by altered in particular modal class of chromosomes and prevalence of cells with other marker chromosomes (der(6)t(6;1), der(2)t(2;1)).

Key words: interferon-alpha, human lung cancer, cell culture, phenotype, drug resistance, chromosomes.

Размещено на Allbest.ru