Біологічні та імуногенні властивості епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

УДК 619:616.98:578.834.11:636.52/.58 (043)

БІОЛОГІЧНІ ТА ІМУНОГЕННІ ВЛАСТИВОСТІ ЕПІЗООТИЧНИХ ШТАМІВ ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОГО БРОНХІТУ КУРЕЙ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Нестерова Лариса Юріївна

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук Пархоменко Людмила Іванівна, Луганський національний аграрний університет, доцент кафедри мікробіології і вірусології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор

Білокінь Віктор Степанович, Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», головний науковий співробітник відділу вірусології;

доктор ветеринарних наук, професор

Фотіна Тетяна Іванівна, Сумський національний аграрний університет, завідувач кафедри ветсанекспертизи, мікробіології та зоогігієни.

Захист відбудеться «11» листопада 2008 р. о 9 30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий «8» листопада 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор А. Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інфекційний бронхіт курей (ІБК), спричинений коронавірусом, є актуальною проблемою для галузі птахівництва (Джонис Р. С., 1996; Борисов А. и др., 2001; Cavanagh D., 2003; Bijlenga G., 2005; Shi P., 2006). Збудник має широке поширення серед курей майже в усіх країнах світу та викликає захворювання, що характеризується трьома клінічними синдромами: респіраторним, нефрозо-нефритним та репродуктивним (Cook J. K., 1977; Endo-Munoz L. B., Faragher J. J., 1989; Escorcia M., 2000; Meulemans G. et al., 2001; Farsang А. et al., 2002; Seyfi Abad Shapouri M. R, 2004; Батченко Г. В., 2006; Ignjatovic J., 2006).

Перебіг інфекційного бронхіту курей у птиці супроводжується розвитком кишкових захворювань та провентрикулітів (Wang-Yu Dong, Zhang-Zi Chun, 1997; Tian-Hui Fang, Zhu-Guo Qiang, 1998; Zhang-An Guo et al., 1999). До ВІБК сприйнятливі всі вікові групи птиці, але найбільш чутливі курчата 7-45_добового віку та доросла птиця в репродуктивний період.

Виділено та ідентифіковано понад 20 серотипів збудника інфекційного бронхіту курей, кількість яких з кожним роком збільшується. Популяція вірусу за антигенною структурою в кожній країні не є постійною. Це, головним чином, пов'язано з генетичною і еволюційною мінливістю вірусу, що призводить до появи нових варіантів, які значно відрізняються за антигенними й біологічними властивостями від раніш відомих штамів (Azab А., 1989; Williams А. К., 1993; Дрыгин В. В., 1999; Shi Q., 2000; Бочков Ю. А., 2002; Dolz R., 2006).

Інфекційний бронхіт курей завдає значних економічних збитків за рахунок гибелі молодняка, зниження яєчної й м'ясної продуктивності, зниження якості тушки - у бройлерів (Jordan, 1968), зниження резистентності організму і затримки росту перехворілої птиці (Van Bockele, 1951; Лихачев Н. В., Голод Я. Р., 1972; Герман В. В. та ін., 1995). При ускладненні бактеріальними й іншими вірусними збудниками хвороба має хронічний перебіг, тому економічні збитки неможливо встановити заздалегідь (Klinger, 1964; Терюханов А. Б., 1986; Ganapathy K., 1999; Matthijs M. G., 2005, Пархоменко Л. І. та ін., 2005). Крім того, великі кошти витрачаються на проведення ветеринарно-санітарних та протиепізоотичних заходів.

Хоча Україна вважається благополучною щодо інфекційного бронхіту курей, у птахогосподарствах задля його профілактики здійснюються планові щеплення птиці з необґрунтованим застосуванням імпортних вакцин (Вербицький П. І., 2004). Моніторинг ефективності вакцинопрофілактики захворювання свідчить про створення недостатнього імунітету і циркуляцію епізоотичних штамів серед курей, декоративної та синантропної птиці (Білявцева О. А., 2000; Ігнатов М. М., 2001; Спасов А. М., 2002; Панікар І. І., 2002; Музика Д. В., 2003; Стегній Б. Т., 2004; Сікачина В. І., 2006).

На підставі вищезазначеного виділення і вивчення біологічних та імуногенних властивостей епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей (ВІБК), циркулюючих на території України, з подальшим їх використанням в якості вакцинних є пріоритетним і актуальним напрямком наукових досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідної роботи, виконаної згідно з тематичними планами кафедри мікробіології і вірусології Луганського національного аграрного університету, зокрема, у 2002 р. «Розробити ефективні методи боротьби з інфекційними захворюваннями тварин при різних умовах їх утримання й запропонувати засоби специфічної і неспецифічної профілактики і лікування захворювань»; у 2003-2007 рр. «Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці, розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно-східної частини України» (номер державної реєстрації 0104U005403); у 2008 р. «Розробити та впровадити засоби антивірусної терапії птиці, ссавців при моно- та асоційованих інфекціях» (номер державної реєстрації 0108U006380).

Мета і задачі досліджень. Мета досліджень - з'ясування за серологічним моніторингом і вірусологічним дослідженням птахопоголів'я ефективності вакцинопрофілактики інфекційного бронхіту курей, індикація та вивчення біологічних та імуногенних властивостей збудника.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні задачі:

- провести серологічний моніторинг інфекційного бронхіту курей у птахогосподарствах з різним напрямком продуктивності та форми власності;

- ізолювати та ідентифікувати польові штами вірусу;

- вивчити біологічні, фізико-хімічні та імуногенні властивості епізоотичних ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей у порівнянні з вакцинними штамами Н_120, 4/91 і Ма_5.

Об'єкт дослідження. Інфекційний бронхіт курей.

Предмет дослідження. Біологічні, фізичні, хімічні, імуногенні властивості епізоотичних і вакцинних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей.

Методи дослідження. У роботі використовували епізоотологічний, клінічний, патологоанатомічний, гістологічні, серологічні, вірусологічні, мікробіологічні, імунологічні, біохімічні, молекулярно-генетичні та статистичні методи досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше ідентифіковано та вивчено деякі біологічні, фізико-хімічні та імуногенні властивості епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей, які за електрофореграмою білків, гемаглютинацією та впливом на циліарну активність трахеї курчат відрізняються від вакцинних штамів, що використовуються в Україні. Патогенність ізолятів експериментально підтверджено в біопробі на курчатах, курячих ембріонах і за допомогою циліостатичного тесту. Визначено мітотичний режим (мітотичний індекс, фази мітозу та кількість патологічних мітозів клітин, які діляться) перещеплюваних культур клітин Vero, інфікованих ізолятами вірусу ІБК. Наукова новизна розробок захищена двома деклараційними патентами на корисні моделі України: № 26102 «Ізолят ЛІ_1 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей» (заявл. 25.12.2006 р., опубл. 10.09.2007 р.) та № 26692 «Ізолят ЛІ_2 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей» (заявл. 27.12.2006 р., опубл. 10.10.2007 р.).

Практичне значення одержаних результатів. Впроваджено критерії оцінки патогенності епізоотичних штамів вірусу ІБК за впливом на циліарний апарат трахеї курчат і показниками мітотичного режиму інфікованої перещеплюваної культури клітин Vero, що узагальнені в методичних рекомендаціях «Визначення циліарної активності трахеї курчат та мітотичного режиму перещеплюваної культури клітин Vero, інфікованих штамами вірусу інфекційного бронхіту курей», які затверджено науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 1 від 20.12.2007 р.). Матеріали дисертації використовуються в навчальній програмі курсу вірусології, епізоотології та гістології факультету ветеринарної медицини Луганського національного аграрного університету, Полтавської державної аграрної академії і Дніпропетровського державного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному аналізі літературних джерел за темою дисертації, проведенні серологічного моніторингу інфекційного бронхіту курей, виконанні експериментальних, зокрема, вірусологічних, цитологічних і гістологічних, а також аналітичних досліджень, здійсненні аналізу та узагальнення одержаних результатів, формулюванні висновків і практичних рекомендацій.

Напрямок і схеми досліджень обрано та обґрунтовано за допомогою наукового керівника кандидата ветеринарних наук, доцента Л. І. Пархоменко. Індикацію збудника за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) здійснено в лабораторії молекулярної діагностики Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» разом з кандидатом ветеринарних наук А. П. Геріловичем. Електронно-мікроскопічні дослідження проведені з кандидатом біологічних наук М. В. Рєпіним в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації доповідались і обговорювались на звітних сесіях вченої ради та науково-практичних конференціях факультету ветеринарної медицини Луганського національного аграрного університету (м. Луганськ, 2002-2007 р.); міжнародній конференції молодих вчених (м. Харків, 2003 р.); на семінарі з хвороб птиці (м. Луганськ, 2004 р.); Всеукраїнській науковій конференції студентів, магістрантів та аспірантів, присвяченій пам'яті професора I. Г. Мороза «Майбутнє ветеринарної медицини, біології та біотехнології» (м. Луганськ, 2005 р.); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми молекулярної діагностики у ветеринарній медицині та біології» (м. Феодосія, 2007 р.); міжнародній науково-практичній конференції «Регіональні проблеми екології ветеринарної медицини» (м. Житомир, 2007 р.); міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми ветеринарної медицини з питань епізоотології, біотехнології та імунології» (м. Полтава, 2008 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 15 наукових праць, у тому числі 10 - у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, з них 4 - одноосібні, а також два описи отриманих деклараційних патентів на корисні моделі та методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 117 сторінках комп'ютерного друку, ілюстрована 10 таблицями, 21 рисунком та включає вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки, пропозиції виробництву, список літературних джерел, що містить 350 найменувань, у тому числі 244 зарубіжних авторів, та додатки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

вірус бронхіт штам кури

Дослідження проведені на моделі вакцинних штамів вірусу ІБК: Н_120 (жива ліофілізована вакцина TAD ІВ vac I Н120, 5000 доз 106,7 EID50, штам Н_120 серотипу Массачусетс); Ма_5 (жива ліофілізована вакцина Нобилис® ІВ Ма5, 2500 доз, 103,0 EID50 штам Ма_5 серотипу Массачусетс); 4/91 (жива атенуйована вакцина Нобилис® ІВ 4/91, 1000 доз, 103,6 EID50 штам 4/91 серотипу 4/91) і епізоотичних ізолятів ЛІ, ЛІ_1, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5, ЛІ_6.

Серологічний моніторинг і визначення рівня антитіл до ВІБК здійснено з використанням реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), яку ставили мікрометодом за загальноприйнятою методикою (Панікар І. І., 1997) із застосуванням еритроцитарного діагностикуму. Досліджено 1140 зразків сироватки крові птиці. Антитіла в сироватці крові птиці до вірусу ньюкаслської хвороби виявляли за допомогою реакції затримки гемаглютинації. Кількісну оцінку результатів групових серологічних досліджень проведено за З. Лярски (1980).

Для ізоляції, індикації, визначення патогенності та інфекційності епізоотичних ізолятів ВІБК використано 310 курячих ембріонів, 222 курчата породи Арбор-Айкерс, культури первинних фібробластів курячих ембріонів, що одержували методом трипсинізації (Троценко Н.І., 2000), і перещеплюваних клітин Vero, які надійшли з Колекції клітинних культур для ветеринарної медицини та біотехнології Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Вірус виділяли з патологічного матеріалу, відібраного від трупів загиблої та тушок забитої з діагностичною метою птиці, а також із зразків ембріональних тканин і органів курячих ембріонів 16_добової інкубації. Інфікування курячих ембріонів 9-11_добової інкубації здійснювали за аплікацією досліджуваного матеріалу на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО) за загальноприйнятою методикою. Інфекційність ізолятів визначали за методом Ріда і Менча.

Цитологічний контроль культури клітин Vero, яку вирощували на накривних скельцях, здійснювали після фіксації сумішшю льодяної оцтової кислоти і абсолютного спирту з наступним фарбуванням гематоксиліном Карачі й еозином. За мітотичний індекс, який виражали в проміле (‰), приймали кількість клітин, які діляться, віднесених до загальної кількості клітин. Патологічні форми мітозів інфікованої культури клітин визначали за класифікацією І. А. Алова (1965).

Біопробу проводили на курчатах 13- і 3_добового віку методом інтраназального інфікування ізолятами ЛІ_1, ЛІ, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 та ЛІ_6. Спостереження за клінічним станом курчат і серологічний контроль рівня антитіл до ВІБК у сироватці крові здійснювали впродовж 25 діб. Патологоанатомічний розтин курчат проводили через 7 і 25 діб після інфікування. Піддослідні групи курчат утримувались в окремих ізольованих приміщеннях віварію.

Циліарну активність трахеї курчат, яким вводили інтратрахеально та інтраокулярно епізоотичні ізоляти й вакцинні штами ВІБК, визначали за допомогою циліостатичного тесту (впродовж 5 діб). Загальний циліостатичний бал, за умов повного циліостазу, становив 40. Бал менше 20 свідчив про наявність захисту трахеї від даного вірусу (Мало А., 2002). Для гістологічних досліджень відбирали зразки трахеї, нирок, легень інфікованих курчат на момент максимального циліостатичного балу.

Визначення гемаглютинуючої активності ізолятів ЛІ_1, ЛІ_2 і штаму Н_120 проведено за допомогою реакції гемаглютинації (РГА) за температури 4, 18-22 та 37 °С. За умов отримання негативного результату реакції до зразків вірусовміщуючого матеріалу додавали 1 %_й розчин трипсину у співвідношенні 1:1 та інкубували 90 хвилин за температури 37°С, після чого ставили реакцію.

Терморезистентність ізолятів вивчали за чутливістю до прогрівання на водяній бані за температури 45 °С впродовж 90 хвилин (Сюрин В. Н., 1998) з визначенням залишкової інфекційності в курячих ембріонах.

Біохімічні та електронно-мікроскопічні дослідження проводили після концентрації і очищення ізолятів ультрацентрифугуванням у градієнті щільності 30 %_ї сахарози. Для визначення білкового складу проводили горизонтальний електрофорез ізолятів і вакцинних штамів ВІБК у 2 %_му поліакриламідному гелі за методикою A. Cцrg (1985).

Морфологічні властивості ізолятів вивчали за негативним контрастуванням з використанням електронного мікроскопу моделі ПЕМ_125 К (AO «SELMI», м. Суми).

Аутентичність польових ізолятів вірусу ІБК визначали за допомогою ПЛР з використанням системи праймерів, що фланкують 320 п. н. ділянку S1 гену.

Детекцію геному вірусу ньюкаслської хвороби здійснювали за допомогою праймерних систем D 1_2, B 1_2 та LaS 1_2 (ФДУ ВНДІЗЗТ, м. Владимир) та базових наборів виробництва фірми «Амплісенс» (м. Москва). Ізоляцію вірусної РНК і реакцію зворотної транскрипції здійснювали за допомогою наборів «РИБО_сорб_50» та «РЕВЕРТА_L» виробництва Центрального науково-дослідного інституту епідеміології (м. Москва).

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали з визначенням критеріїв вірогідності за Ст'юдентом. Результати обраховували за допомогою персонального комп'ютера ІВМ РС/АТ, програми «Excel XP» з програмного пакету MS Office XP.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Серологічний моніторинг ефективності специфічної профілактики. Для визначення ефективності специфічної профілактики і виявлення циркуляції польових штамів ВІБК серед курей впродовж 2003-2006 рр. проведено серологічний моніторинг птиці різного віку в 5_ти птахогосподарствах Луганської області різних напрямків продуктивності - ВАТ «Червоний прапор», птахофабрика «Лисичанська», ВАТ «Сімейкінське», СТОВ «Авіс» та СТОВ «Агроукрптаха». В якості заходів специфічної профілактики, направлених на запобігання виникнення ІБК, у птахогосподарствах застосовують різні програми вакцинації з 2-5_разовим використанням живих та інактивованих вакцин, до складу яких входили штами Н_120, Ма_5 і 4/91 ВІБК, виробництва фірм «TAD» (Німеччина), «Intervet» (Нідерланди), «Ceva» (Франція).

У 2003 р. у птиці вказаних птахогосподарств, три з яких - яєчного напрямку продуктивності, одне спеціалізується на вирощуванні бройлерів та одне - племрепродуктор ІІ порядку, специфічні антитіла до ВІБК виявлені в 90-100 %. Проте груповий захист проти ВІБК у птиці сформований на низькому рівні (42,4-66,0 %), особливо у СТОВ «Авіс» (49,0 %) та ВАТ «Сімейкінське» (42,4 %).

Упродовж 2004 р. спостерігались незначні зміни рівня сероконверсії. Так, у ВАТ «Червоний прапор» та в п/ф «Лисичанська» добові курчата, одержані від імунного батьківського стада, мали низький рівень антитіл (1,8±0,09-2,1±0,22 lоg2) при 20 і 30 % сероконверсії відповідно. У СТОВ «Агроукрптаха» показники напруженості імунітету в добових курчат становили: сероконверсія - 60 %; середній титр - 2,8±0,39 lоg2. Відсутність материнського імунітету до ВІБК також встановлена в курчат у СТОВ «Авіс» і ВАТ «Сімейкінське», де сероконверсія складала 30-40 %, а середній титр антитіл - від 1,85±0,09 до 2,8±0,24 lоg2.

Підвищення сероконверсії до 100 % і середніх титрів антитіл до 3,2±0,15-4,3±0,25 lоg2 вказує на достатній імунний захист птахомолодняка в 108-230_добовому віці у ВАТ «Червоний прапор», п/ф «Лисичанська» та СТОВ «Агроукрптаха» перед продуктивним періодом. Максимальне підвищення титрів антитіл до 3,6 lоg2 при 100 % сероконверсії зареєстровано в 180_добових курей у ВАТ «Сімейкінське», після чого в 340_добовому віці спостерігалось зниження напруженості імунітету: сероконверсія - 72,5 %, титр антитіл - 3,0 lоg2. Зниження титрів антитіл до 2,55-3,0 lоg2 у птиці у ВАТ «Червоний прапор» та п/ф «Лисичанська» наприкінці експлуатації (410-478 діб) порівняно з попередніми дослідженнями є логічним після більше, ніж піврічного післявакцинального періоду.

Проте в СТОВ «Авіс» упродовж експлуатації птиці середній рівень антитіл до ВІБК не досяг захисних, тобто птиця після щеплення не була захищена проти польових штамів ВІБК. Крім того, у 351-436_добових курей титр антитіл збільшився з 2,6±0,16 до 3,05±0,12 lоg2, що може бути ознакою проникнення в стадо птиці польового ВІБК.

У 2005 р. спостерігалось незначне збільшення напруженості імунітету в птиці СТОВ «Авіс», ВАТ «Червоний прапор» СТОВ «Агроукрптаха» та п/ф «Лисичанська» до 58,2, 69,0, 62,7 і 82,2 % відповідно. Проте у ВАТ «Сімейкінське» виявлено зниження рівня сероконверсії до 53,2 % порівняно з показником 2004 р. - 57,2 %.

Епізоотологічним обстеженням курей 240-270_добового віку СТОВ «Авіс» встановлено зниження рівня яєчної продуктивності на 20,0 %, появу 5,0 % яєць із деформованою та тонкою шкаралупою. Загибель з ураженням репродуктивних органів і органів травлення становила 13,7 % від загальної кількості загиблої птиці. Серед відходів інкубації виявлено 25,0 % задохликів, а також карликовість і муміфікацію ембріонів. На розтині загиблої птиці реєстрували оваріосальпінгіти, кісти і дистрофії яєчників, жовтковий перитоніт, збільшення нирок та відкладення солей у ниркових канальцях.

У птиці 120-130_добового віку у ВАТ «Сімейкінське» спостерігали зниження несучості на 15,0 %, а також вибраковування батьківського стада і загибель 4,6 % птахопоголів'я внаслідок ураження репродуктивних органів (клоацити, дистрофії яєчників), порушення умов утримання та світлового режиму. У курей реєстрували збільшення нирок, гіперемію легень. Під час патологоанатомічного розтину відходів інкубації встановлена наявність 30,0 % задохликів, карликовість і прилипання ембріонів до підшкаралупної оболонки.

Збереженість у стадах птиці у ВАТ «Червоний прапор», п/ф «Лисичанська» і СТОВ «Агроукрптаха» становила 97-99 %, продуктивність - у межах інструктивних технологічних норм.

Отже, за серологічним моніторингом ефективності специфічної профілактики ІБК у 5_ти птахогосподарствах Луганської області встановлено низький груповий імунітет до ВІБК птиці, особливо у СТОВ «Авіс» і ВАТ «Сімейкінське», де виявлено клінічні ознаки захворювання, що характерні для перебігу репродуктивного і нефрозо-нефритного синдромів ІБК. Про наявність ВІБК у птиці СТОВ «Авіс» також може свідчити підвищення титрів антитіл у кінці експлуатації. Тому для проведення подальших досліджень нами були обрані два птахогосподарства, а саме СТОВ «Авіс» і ВАТ «Сімейкінське».

У 2006 р. у ВАТ «Сімейкінське» під час уведення вакцини зі штаму 4/91 встановлено збільшення сероконверсії на 9,7 % по відношенню до показників 2005 р. Але захисні титри антитіл (3,0-3,2 lоg2) спостерігали лише через 120-150 діб після імунізації інактивованою вакциною зі штаму Н_120 у 90 % птиці (рис. 1). Збільшення титрів антитіл до 4,0±0,26 lоg2 та їх «строкатість» ближче до кінця експлуатації птиці (306-480 діб) свідчили про циркуляцію польового вірусу.

Упродовж 2006 р. у СТОВ «Авіс» встановлено поступове підвищення як титрів антитіл, так і рівня сероконверсії, з незначними коливаннями, після чого у 327_добовому віці, тобто через 232 доби після останнього щеплення інактивованою вакциною, зареєстровані антитіла до ВІБК у титрі 4,8±0,25 lоg2 і сероконверсія 100 %, що обумовлено циркуляцією польового штаму ВІБК.

Отже, відсутність або низький рівень пасивного імунітету до ВІБК у птиці раннього віку, «строкатість» та збільшення середньо-геометричних титрів антитіл до 4,0-4,8 lоg2, починаючи з 200_добового віку, свідчать про неефективність застосовуваних схем вакцинопрофілактики і циркуляцію в стаді польового ВІБК. Крім того, в курей СТОВ «Авіс» та ВАТ «Сімейкінське» виявлені ознаки захворювання, що характерні для перебігу репродуктивного і нефрозо-нефритного синдромів ІБК.

Ізоляція та ідентифікація польових ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей. За результатами вірусологічних досліджень з патологічного матеріалу виділено 6 ізолятів, що були позначені як ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4 (ВАТ «Сімейкінське»), ЛІ, ЛІ_5, ЛІ_6 (приватні господарства). Крім вказаних ізолятів, у дослідженнях використовувався ізолят ЛІ_1, наданий М. М. Ігнатовим, що виділено у 2003 р. від птиці 240_добового віку СТОВ «Авіс», хворої на інфекційний бронхіт.

З 1_го пасажу більшість досліджуваних ізолятів уражали 10-80 % інфікованих ембріонів та спричиняли їх загибель, карликовість, набряк ХАО, збільшення об'єму екстраембріональної рідини з наявністю уратів, крововиливи на тілі ембріонів. Найбільш високу загибель та карликовість ембріонів у 1_му пасажі порівняно до інших досліджуваних штамів ВІБК викликали ізолят ЛІ_2 та штам Н_120. У загиблих (до 80 %) ембріонів встановлено набряк ХАО та гіперемію і крововиливи на тілі. Ізолят ЛІ_2, як і штам 4/91 ВІБК, індукував збільшення об'єму екстраембріональної рідини та наявність фібринозного нальоту на тілі 10 % зародків. Характерними патологічними змінами ембріонів, інфікованих ізолятом ЛІ_1, було збільшення об'єму екстраембріональної рідини з наявністю уратів у 70 і 40 % ембріонів відповідно. У той же час штам 4/91 ВІБК призводив до утворення уратів тільки в 10 % заражених ембріонів.

Ізоляти ЛІ, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 та ЛІ_6 після 1_го пасажу викликали патологічні зміни в 10-20 % ембріонів. Під час розтину ембріонів, інфікованих ізолятами ЛІ, ЛІ_1, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 і ЛІ_6 та штамами 4/91, Н_120, Ма_5, після 1_го пасажу зареєстровано збільшення розміру печінки і серця, які мали дряблу консистенцію, а також крововиливи в підшкірній клітковині та м'язах. Збільшення нирок спостерігали в ембріонів, інфікованих ізолятом ЛІ_2 та штамами 4/91, Н_120, а гіперемію легень - ізолятом ЛІ_1 і штамом Н_120.

Патологоанатомічні ознаки в ембріонів, заражених ізолятом ЛІ_2, стабільно проявлялись впродовж 4_х пасажів, тоді як зі збільшенням пасажів кількість змін ембріонів, індукованих ізолятом ЛІ_2, знижувалась. Лише ізолят ЛІ впродовж 4_х пасажів спричиняв карликовість 10 % ембріонів, у той час як ізоляти ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 та ЛІ_6 не викликали жодних патологічних змін.

Інфекційна активність ізолятів ЛІ_1 і ЛІ_2 становила 106,26 та 107,0 ЕІД50/см3 відповідно.

У результаті проведеної ампліфікації та електрофоретичної детекції продуктів ПЛР встановлено, що всі польові ізоляти ЛІ, ЛІ_1, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5, ЛІ_6 є аутентичними та належать до виду Avian Coronavirus (Infectious bronchitis virus), а також не містять РНК вірусу ньюкаслської хвороби.

Визначення патогенності польових ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей. Патогенність виділених ізолятів ЛІ, ЛІ_1, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 і ЛІ_6 вивчали в біопробі на невакцинованих серонегативних до ВІБК курчатах 3- та 13_добового віку після інтраназального інфікування за показниками захворюваності, клінічного прояву захворювання, летальності та патологоанатомічних змін упродовж 25 діб.

Через 36 годин після інфікування ізолятом ЛІ_1 у 40 % курчат 13_добового віку спостерігали пригнічення, сонливість, зниження апетиту, згодом - важке дихання. Підвищену збудженість та водянистий пронос виявлено через 48 годин після зараження. Клінічне одужання птиці настало на 14 добу після інфікування. Під час патологоанатомічного розтину курчат через 7 діб після зараження виявлена помірна кількість серозно-слизового ексудату в трахеї, гіперемія і незначне збільшення легень в об'ємі. Антитіла до ВІБК у сироватці крові 70 % курчат, інфікованих ізолятом ЛІ_1, зареєстровано лише через 25 діб у титрі 1:4.

Ізолят ЛІ_2 у 100 % курчат 3_добового віку через 12 годин після інфікування призвів до пригнічення, зниження апетиту, відмови від води. Згодом у курчат відмічали важке дихання, хиткість ходи та водянистий пронос. Розвиток клінічних ознак відбувався впродовж тижня. Починаючи з 3_ї доби після зараження, виявлені антитіла до ВІБК у 100 % курчат у титрі 1:16. Під час патологоанатомічного розтину, проведеного через 7 діб після інокуляції курчатам ізоляту ЛІ_2, зареєстрована дегідратація, нерівномірне забарвлення скелетних м'язів, скупчення серозного ексудату в трахеї. Через 25 діб після зараження ізолятами ЛІ_1 та ЛІ_2 у курчат жодних патологічних змін не встановлено.

Ізоляти ЛІ, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 і ЛІ_6 після інфікування курчат 3_добового віку не викликали клінічних ознак захворювання, патологоанатомічних змін внутрішніх органів. У сироватці крові курчат, інфікованих ізолятами ЛІ, ЛІ_1, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 і ЛІ_6, виключена наявність антитіл до вірусів ньюкаслської хвороби, інфекційного ларинготрахеїту та синдрому зниження несучості.

При з'ясуванні патогенності ВІБК у курячих ембріонах паралельно проведено вивчення його репродуктивних властивостей у культурі фібробластів курячого ембріону та культурі Vero. Одержані дані свідчать, що репродукція ізолятів ЛІ_1, ЛІ, ЛІ_2, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 і ЛІ_6 залежала від пристосовуваності. Установлено, що в первинних культурах фібробластів курячих ембріонів розмножуються і викликають зміни лише ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2, цитопатогенна дія яких проявлялась деструктивними змінами клітинного моношару відповідно через 24 і 36 годин після інокуляції. Інфекційність ізолятів після 2_х пасажів у культурі фібробластів курячого ембріону становила 104,72 ТЦД50/см3 (ЛІ_1) та 105,9 ТЦД50/см3 (ЛІ_2).

У подальших дослідженнях для інокуляції культури перещеплюваних клітин Vero використовували ізоляти ЛІ_1, ЛІ_2 та штами 4/91, Н_120.

Встановлено, що ізолят ЛІ_1 і штам 4/91 ВІБК викликають цитопатичні зміни через 96 годин після інфікування моношарової культури клітин з 1_го пасажу за типом симпластоутворення. Через 48 годин після утворення симпластів спостерігалась повільна дегенерація клітин і руйнування моношару. У 1_му пасажі ізолят ЛІ_2 індукував дрібнозернисту дегенерацію через 96 годин, у той час цитопатогенна дія штаму Н_120 супроводжувалась розвитком деструктивних змін клітинного моношару. Адаптація ізолятів ЛІ_2 та ЛІ_1 до культури Vero впродовж 3_х пасажів дала позитивні результати: час появи ЦПД відповідно скоротився з 96 до 48 і 24 годин.

Мітотична активність культури клітин Vero через 2 години після інокуляції ізоляту ЛІ_1 становила 17,75±0,48 ‰, ізоляту ЛІ_2 - 17,50±0,29 ‰, штамом 4/91 - 17,50±0,65 ‰ проти 21,0±0,41 ‰ в контрольних інтактних культурах.

Після незначного пригнічення мітозів у культурі перещеплюваних клітин Vero, інфікованих ізолятами ЛІ_1, ЛІ_2 і штамом 4/91, через 4-8 годин підвищувався рівень мітотичної активності. Починаючи з 8_ї та 10_ї годин після інфікування клітин ізольованими штамами ЛІ_1 та ЛІ_2, мітотична активність клітин поступово знижувалась. Теж саме відбувалось і через 12 годин у клітинах, інфікованих штамом 4/91. Проте через 24 години виявлено достовірне зменшення кількості клітин, які діляться: мітотична активність клітин, інфікованих ізолятом ЛІ_1 становила 6,25±0,48 ‰, ізолятом ЛІ_2 - 3,0±0,41 ‰, штамом 4/91 - 7,25±0,63 ‰ проти 14,25±0,48 ‰ в інтактних культурах.

Підвищення мітотичної активності інфікованих культур супроводжувалось збільшенням кількості патологічних форм мітозів порівняно до контрольних клітин Vero. Так, максимальна кількість патологічних мітозів встановлена через 8 годин після інфікування клітин ізолятом ЛІ_2 (51,25±0,25 %) та штамом 4/91 (47,00±0,41 %) та через 10 годин - ізолятом ЛІ_1 (47,50±0,15 %).

Незначну кількість патологічних мітозів виявляли і в контрольних інтактних культурах, частка яких коливалась від 4,25±0,13 до 7,75±0,13 %.

Переважною формою патологічних мітозів у культурі клітин Vero, інфікованій ізолятами, була пола метафаза, яка складала 40,48 % (ЛІ_2), 42,58 % (4/91) та 44,6 % (ЛІ_1) від загальної кількості патологічних мітозів. Крім того, у клітинах Vero, інфікованих ізолятом ЛІ_1, виявляли відставання хромосом у метакінезі (24,73 %), триполюсну метафазу (22,68 %), «мікроядра» (8,93 %). Ізолят ЛІ_2 індукував відставання хромосом у метакінезі (24,40 %), відокремлення хроматид у профазі (22,42 %) та утворення хромосомних мостів (12,70 %), а штам 4/91 - триполюсну метафазу (22,38 %), відставання хромосом у метакінезі (19,65 %) і хромосомні мости (15,40 %).

Основною формою патології мітозів у контрольній неінфікованій культурі були «мікроядра».

Встановлено, що одночасно зі скороченням терміну репродукції штамів вірусу відбувається зниження їх інфекційності: титр ізоляту ЛІ_1 після 3_х пасажів становив 104,59 ТЦД50/см3 проти 104,64 ТЦД50/см3 після 1_го пасажу, тоді як інфекційність ізоляту ЛІ_2 сягала 105,25 ТЦД50/см3 порівняно з початковим титром (105,81 ТЦД50/см3).

Визначення гемаглютинуючої активності польових ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей. Установлено, що ізольовані штами ЛІ_1 і ЛІ_2 ВІБК мають гемаглютинуючі властивості до еритроцитів півня. При цьому титр гемаглютининів не залежав від температури, за якої проводили реакцію (4, 18-22 та 37 °С). Здатність до гемаглютинації ізолят ЛІ_1 і вакцинний штам Н_120 ВІБК набували після обробки розчином трипсину. Гемаглютинуючий титр ізоляту ЛІ_1 становив 1:16, що на 1 lоg2 нижче за титр вакцинного штаму. У той час гемаглютинуючі властивості ізоляту ЛІ_2 ВІБК проявлялись без попередньої обробки трипсином (титр 1:16). Після обробки трипсином гемаглютинуючий титр штаму був дещо нижчим (1:4). У процесі зберігання ізолятів у замороженому стані встановлено зниження рівня гемаглютининів. Так, реакція аглютинації, індукована ізолятом ЛІ_1 ВІБК, через 3 роки зберігання за температури мінус 20 °С відбувалась без обробки розчином трипсину в титрі 1:8, а через 4 роки зберігання - була зовсім відсутня. Втрата гемаглютинуючої активності також встановлена в ізоляту ЛІ_2 ВІБК, що зберігався впродовж 2_х років за температури мінус 20 °С. Отримані дані свідчать, що ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2 ВІБК потребують оптимізації регламенту довготривалого зберігання.

Фізико-хімічні властивості ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей. В ізолятів ЛІ_1 і ЛІ_2 встановлено чутливість до прогрівання за температури 45 °С впродовж 90 хвилин. Їх інфекційність на відміну від вакцинного штаму Ма_5 (який за цього режиму повністю інактивувався) зменшилась на 4,33 і 4,00 lg ЕІД50/см3 відповідно.

Електрофоретичними дослідженнями ізолятів ЛІ_1, ЛІ_2 порівняно до вакцинних штамів Н_120, Ма_5 і 4/91 ВІБК виявлені відмінності в складі їх білкових компонентів. Зокрема, в ізолятів ЛІ_1 та ЛІ_2 були наявні білки з молекулярною масою 25,1-99,4 кD, тоді як молекулярна маса основних структурних білків вакцинних штамів становила 14,5-155,0 кD. Визначено, що саме білки з молекулярною масою 25,1 та 28,8 кD є характерними для всіх досліджуваних штамів ВІБК (окрім вакцинного 4/91), тоді як основу ізолятів складала білкова фракція масою 67,0 кD. При цьому схожість між вакцинним штамом 4/91 та ізолятами доведено за наявністю білків масою 14,5 і 99,4 кD (ізолят ЛІ_1) та 77,6 кD (ізолят ЛІ_2). Білкові фракції 25,1 і 28,8 кD за молекулярною масою відповідають внутрішньому мембранному білку (М) та матриксному глікопротеїну (Е1), а фракція з молекулярною масою 155 кD - поверхневому глікопротеїну S1 ВІБК.

За негативним контрастуванням ізолятів ЛІ_1 та ЛІ_2 під час електронної мікроскопії встановлено сферичні віріони неправильної форми.

Досить рідко спостерігали віріони з вираженою зовнішньою оболонкою, що мала булавоподібні виступи довжиною 10-18 нм. У деяких віріонів з подвійним контуром зовнішньої мембрани потовщення на дистальних кінцях виступів змикались і утворювали суцільне «кільце-корону». Деякі вірусні частки зі світлою центральною частиною відносили до незрілих, неповних форм вірусу. Розмір віріонів ізоляту ЛІ_1 становив 122-150 нм, ізоляту ЛІ_2 - 122-169 нм.

Вплив ізолятів вірусу інфекційного бронхіту курей на циліарний апарат трахеї та гістоморфологію трахеї, легень і нирок курчат. За результатами циліостатичного тесту встановлено, що ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2, як і вакцинні штами Н_120, Ма_5, 4/91 ВІБК, уведені в п'ятикратній імунізуючій дозі, викликають уповільнення і припинення руху війок трахеї впродовж 3-4 діб у курчат з різним рівнем материнських антитіл до ВІБК (табл. 1).

Таблиця 1

Циліарна активність трахеї курчат, інфікованих вірусом інфекційного бронхіту курей, M±m, n=4

Штами ВІБК	Циліостатичний бал трахеї курчат з рівнем материнських антитіл
	нижче захисного	вище захисного
	час після інфікування, доба
	1-а	2-а	3-я	4-а	1-а	2-а	3-я	4-а
ЛІ_1	25,5± 1,55***	34,5± 1,55	33,0± 0,71	0,25± 0,25	6,25± 0,48	35,75± 0,48	39,25± 0,48	0,25± 0,25
ЛІ_2	40,0***	37,5± 1,04**	31,75± 0,48	0	10,75± 1,11	32,25± 0,48	40,0	0,25± 0,25
4/91	14,75± 1,93***	12,75± 1,55***	0	0	0,25± 0,25	0,25± 0,25	0	0
Н_120	19,25± 1,03***	10,0***	0	0	3,25± 0,25	3,75± 0,25	3,5± 0,29	0,75± 0,25
Ма_5	20,5± 0,87**	20,25± 1,11***	8,5± 2,9*	0	11,75± 1,25	0,75± 0,25	0	0
Контроль	0	0	0	0	0	0	0	0

Примітка. * - Р?0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001 між дослідними групами.

Встановлено достовірне (Р?0,01-Р?0,001) підвищення циліостатичного балу в групі курчат, які мали рівень материнських антитіл нижче захисного, у перші 2 доби після інфікування порівняно до даного показника в курчат із захисним рівнем материнських антитіл; повний циліостаз трахеї зареєстровано на 1_шу добу після введення ізоляту ЛІ_2, тоді як максимальне зниження циліарної активності трахеї до 34,75±1,55 балів індукував ізолят ЛІ_1 на 2_гу добу. У групі курчат із захисним рівнем материнських антитіл відбувалось поступове зниження активності війок трахеї до повного циліостазу під дією ізолятів ЛІ_1 та ЛІ_2 впродовж 3_х діб. Загальний циліостатичний бал менше за 20,5±0,87 у курчат після інокуляції вакцинних штамів Н_120, 4/91 і Ма_5 у дозі 104 ЕІД50/0,2 см3 свідчить про наявність захисту трахеї.

Під час визначення динаміки приросту антитіл до ВІБК у сироватці крові встановлено, що в курчат, які мали рівень материнських антитіл нижче захисного, після інфікування ізолятами ЛІ_1 та ЛІ_2 антитіла у титрах 3,75±0,25 і 4 log2 відповідно з'явились через 3 доби (табл. 2). Те ж саме відбувалось у курчат після введення штамів 4/91, Н_120 і Ма_5, але титри антитіл були дещо нижчими та становили відповідно 3,25±0,25, 3,5±0,29 та 3,5±0,29 log2. У курчат контрольної групи не виявлено накопичення антитіл у захисних титрах.

Таблиця 2

Рівень антитіл у сироватці крові курчат, інфікованих вірусом інфекційного бронхіту курей, M±m, n=4

Штами ВІБК	Титр антитіл (log2) сироватки крові курчат з рівнем материнських антитіл
	нижче захисного	вище захисного
	час після інфікування, доба
	1-а	2-а	3-я	4-а	1-а	2-а	3-я	4-а	5-а
ЛІ_1	1,75± 0,25	1,5± 0,29	3,75± 0,25	4,0	3,0	2,75± 0,25	2,75± 0,25	2,75± 0,25	3,0
ЛІ-2	1,5± 0,29	1,25± 0,25	4,0	4,5± 0,29	3,0	2,75± 0,25	3,0	3,25± 0,25	3,25± 0,25
4/91	1,25± 0,25	2,75± 0,25	3,25± 0,25	4,25± 0,25	3,75± 0,25	3,0	3,75± 0,25	3,5± 0,29	2,75± 0,25
Н_120	1,75± 0,25	1,5± 0,29	3,5± 0,29	3,75± 0,25	3,0	2,75± 0,25	2,75± 0,25	3,25± 0,25	3,5± 0,29
Ма_5	1,5± 0,29	2,75± 0,25	3,5± 0,29	4,0	3,0	2,0	3,5± 0,29	3,25± 0,25	2,75± 0,25
Контроль	1,5± 0,29	1,25± 0,25	1,25± 0,25	0,5± 0,29	3,75± 0,25	3,75± 0,25	3,5± 0,29	2,75± 0,25	2,5± 0,29

У курчат з захисним рівнем антитіл через 2 доби після інфікування ізолятами ЛІ_1, ЛІ_2 і штамами Н_120, 4/91, Ма_5 титр антитіл дещо знижувався. Проте ізолят ЛІ_2 нарівні з вакцинними штамами 4/91 і Ма_5 індукував поступове збільшення титру антитіл через 3 доби, тоді як ізолят ЛІ_1 викликав приріст антитіл до ВІБК через 5 діб. У контрольних курчат титр антитіл фактично знаходився на одному рівні.

Встановлено, що зменшення циліостатичного балу відбувається на тлі накопичення антитіл до ВІБК у сироватці крові курчат. За рівнем ймовірності найбільш вірогідний (Р?0,01-Р?0,001) коефіцієнт кореляції установлено в курчат після інфікування штамом Н_120 та ізолятом ЛІ_2.

За гістологічними дослідженнями в трахеї інфікованих курчат з різним рівнем материнських антитіл до ВІБК встановлено наявність запальних та деструктивних процесів, в які залучені всі шари слизової оболонки. Ізолят ЛІ_2, як і штам Ма_5, індукував помірний набряк, дециліацію, десквамацію та альтерацію більшості клітин респіраторного епітелію, а також збільшення кількості келихоподібних клітин слизової оболонки. Ізолят ЛІ_1 подібно до штаму Н_120 спричиняв набряк, дегенерацію та слизове переродження епітеліальних клітин трахеї курчат, які мали рівень материнських антитіл нижче захисного.

У легенях курчат, інфікованих штамами ВІБК, виявлено виражене кровонаповнення судин, помірний набряк периваскулярної, інтерстиціальної, перибронхіальної сполучної тканин, особливо після інокуляції ізоляту ЛІ_1 та штаму Ма_5, незалежно від рівня материнських антитіл у сироватці крові курчат. Крім того, виявлено лімфоїдну інфільтрацію перибронхіальної сполучної тканини та власно слизової оболонки бронхів.

Гострий венозний застій і лімфоїдна інфільтрація відмічались по всій площі коркового та мозкового шару нирок курчат, інфікованих ізолятами ЛІ_1 та ЛІ_2.

ВИСНОВКИ

У дисертації узагальнено результати серологічного моніторингу та вірусологічного дослідження птахопоголів'я з визначенням ефективності профілактики інфекційного бронхіту курей при застосуванні в птахогосподарствах імпортних вірус-вакцин. Проміж вакцинованого птахопоголів'я встановлено циркуляцію епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей, які за біологічними, фізико-хімічними і імуногенними властивостями мають відмінності від вакцинних штамів вірусу.

За серологічним моніторингом птиці, щепленої моно- і бівалентними вакцинами, виготовленими на основі штамів Ма_5, Н_120 та 4/91, встановлено низький рівень сероконверсії в курчат 1-30_добового віку (0-40 %), строкатість та підвищення до 4,0-4,8 log2 титрів антитіл до вірусу інфекційного бронхіту в птиці починаючи з 200_добового віку, зниження на 15-20 % яєчної продуктивності, появу деформованого яйця (до 5 %) і наявність 25-30 % задохликів серед відходів інкубації.

За ідентифікацією 7_ми інфекційних агентів, виділених з патологічного матеріалу від курей 2_х промислових і 3_х індивідуальних птахогосподарств, методом ампліфікації фрагменту кДНК ділянки S1 гену віднесено до виду Avian Coronavirus (Infectious bronchitis virus).

Ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2 є патогенними для курячих ембріонів 9-11_добової інкубації і спричиняють загибель, карликовість, набряк хоріоналантоїсної оболонки, наявність уратів у екстраембріональній рідині. На відміну від вакцинних штамів 4/91 і Н_120 характерною патологоанатомічною зміною ембріонів, заражених ізолятом ЛІ_1, є збільшення об'єму екстраембріональної рідини, а ізолятом ЛІ_2 - гіперемія та крововиливи на тілі ембріонів. Титр інфекційності ізоляту ЛІ_2 становить 5Ч106,26 ЕІД50/см3, ізоляту ЛІ_1 - 5Ч107,0 ЕІД50/см3.

У біопробі на курчатах 3- і 13_добового віку за інтраназальним інфікуванням встановлено, що ізоляти ЛІ, ЛІ_3, ЛІ_4, ЛІ_5 та ЛІ_6 є непатогенними. Ізоляти ЛІ_1 і ЛІ_2 через 12-36 годин після інфікування викликають захворювання в 40 і 100 % курчат відповідно, з індукцією вірусоспецифічних антитіл, що виявляються в сироватці крові в титрах 1:4 і 1:16 на 25-ту (ЛІ_1) та 3-тю доби (ЛІ_2).

Ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2 вірусу інфекційного бронхіту курей подібно до вакцинних штамів 4/91 і Н_120 розмножуються в культурі первинно трипсинізованих фібробластів курячого ембріону і перещеплюваних клітин Vero з ознаками симпластоутворення і деструктивних змін. Репродукція вірусу в інфікованих культурах клітин супроводжується пригніченням мітотичної активності зі збільшенням кількості патологічних мітозів до 47,5±0,15-51,25±0,25 % (у нормі 4,25±0,13-7,75±0,13 %). Інфекційність ізоляту ЛІ_1 у культурі клітин Vero становить 104,59 ТЦД50/см3, ізоляту ЛІ_2 - 105,25 ТЦД50/см3.

Ізоляти ЛІ_1 та ЛІ_2 є віріонами сферичної форми діаметром 122-169 нм з булавоподібними виступами довжиною 10-18 нм. Білкова фракція молекулярною масою 25,1 кD, що відповідає внутрішньому мембранному білку (М) та матриксному глікопротеїну (Е1) вірусу інфекційного бронхіту, є загальною як для ізолятів ЛІ_1 та ЛІ_2, так і для вакцинних штамів 4/91, Н_120, Ма_5, тоді як білкова фракція 67,0 кD виявлена лише в ізолятів.

Установлено більш виражену терморезистентність ізолятів ЛІ_2 (5Ч106,23 ЕІД50/см3) та ЛІ_1 (5Ч105,33 ЕІД50/см3) до температури 45 °С впродовж 90 хвилин, під впливом якої титр їх інфекційності знизився відповідно на 4,0 і 4,33 lg ЕІД50/см3, у порівнянні до вакцинного штаму Ма_5, який за цього температурного режиму повністю інактивується.

На відміну від вакцинного штаму Н_120 вірусу інфекційного бронхіту курей встановлено лабільність гемаглютинуючих властивостей ізолятів ЛІ_1 та ЛІ_2 впродовж зберігання за температури мінус 20 °С і тенденцію до зниження рівня гемаглютининів як без, так і після обробки трипсином.

Ізольовані штами ЛІ_1 та ЛІ_2 нарівні з вакцинними штамами Ма_5, Н_120 та 4/91 викликають запальні та деструктивні процеси в організмі курчат: помірний набряк власно слизової оболонки трахеї, збільшення кількості келихоподібних клітин, дециліацію, деструкцію та відшаровування епітеліальних клітин трахеї, гостру венозну гіперемію і лімфоїдну інфільтрацію легень та нирок.

Встановлено зворотно-пропорційну кореляцію між циліарною активністю трахеї й титром антитіл до вірусу інфекційного бронхіту в курчат після інокуляції ізоляту ЛІ_2 і штаму Н_120. З підвищенням титру антитіл від 3,75 до 4,5 log2 подовжується термін (до 3-4 діб) та знижується ступінь прояву циліостазу трахеї від 40,0 до 31,75 і від 19,25 до 10,00 балів відповідно.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Методичні рекомендації «Визначення циліарної активності трахеї курчат та мітотичного режиму перещеплюваної культури клітин Vero, інфікованих штамами вірусу інфекційного бронхіту курей», які затверджені науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 1 від 20 грудня 2007 р.).

Ізолят ЛІ_1 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей (родина Coronaviridae, Coronavirus) (деклараційний патент України на корисну модель № 26102 від 10.09.2007 р.).

Ізолят ЛІ_2 як продуцент антигену вірусу інфекційного бронхіту курей (родина Coronaviridae, Coronavirus) (деклараційний патент України на корисну модель № 26692 від 10.10.2007 р.).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Пархоменко, Л. І. Серологічний контроль деяких інфекційних хвороб птиці в птахогосподарствах Луганської області [Текст] / Л. І. Пархоменко, Л. Ю. Петренко, О. О. Землянська, О. В. Івлєва // Біол. науки : зб. наук. праць Луганського ДАУ. - Луганськ, 2001. - № 13 (25). - С. 143-146. (Дисертанткою проведені серологічні дослідження птиці до вірусу інфекційного бронхіту курей у птахогосподарствах Луганської області).

Петренко, Л. Ю. Антигенна та імуногенна варіабельність вірусу інфекційного бронхіту курей [Текст] / Л. Ю. Петренко, О. О. Землянська, Д. О. Пономаренко, Л. І. Пархоменко // Вісник Сумського НАУ : наук.-метод. журн. - Суми, 2003. - № 33 (93), вип. 9 : Вет. медицина. - С. 99-101. (Дисертантка самостійно здійснила науковий пошук та аналіз літератури щодо варіабельності вірусу інфекційного бронхіту курей, брала участь у написанні статті).

Петренко, Л. Ю. Некоторые биологические свойства эпизоотического штамма вируса инфекционного бронхита кур [Текст] / Л. Ю. Петренко // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2004. - Вип. 83. - С. 185-188.

Петренко, Л. Ю. Культивирование штаммов вируса инфекционного бронхита кур в разных биологических системах [Текст] / Л. Ю. Петренко // Вет. науки : зб. наук. праць Луганського НАУ. - Луганськ, 2005. - № 50/73. - С. 168-172.

Нестерова, Л. Ю. Визначення електрофоретичних профілів білків епізоотичного і вакцинного штамів вірусу інфекційного бронхіту курей [Текст] / Л. Ю. Нестерова // Вет. науки : зб. наук. праць Луганського НАУ. - Луганськ, 2006. - № 63/86. - С. 102-107.

Нестерова, Л. Ю. Молекулярно-генетичний аналіз епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей [Текст] / Л. Ю. Нестерова, А. П. Герілович // Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2007. - Вип. 88. - С. 159-161. (Дисертантка брала участь у проведенні ідентифікації ізолятів, узагальнила результат, брала участь у написанні статті).

Нестерова, Л. Ю. Морфологічні особливості епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей [Текст] / Л. Ю. Нестерова, Л. І. Пархоменко // Вет. науки : зб. наук. праць Луганського НАУ. - Луганськ, 2007. - № 78/101. - С. 445-448. (Дисертантка визначила морфологічні особливості ізолятів вірусу інфекційного бронхіту, узагальнила результат, брала участь у написанні статті).

Нестерова, Л. Ю. Вплив епізоотичних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей на мітотичний режим перещеплюваної культури клітин Vero [Текст] / Л. Ю. Нестерова // Вісник Житомирського ДАУ : наук.-теоретич. зб. - Житомир, 2007. - Вип. 2 (19), т. 1. - С. 130-135.

Нестерова, Л. Ю. Визначення впливу польових і вакцинних штамів вірусу інфекційного бронхіту курей на циліарний апарат та гістоморфологію трахеї, легень, нирок [Текст] / Л. Ю. Нестерова, М. Аль Равашдех // Вет. науки : зб. наук. праць Луганського НАУ. - № 84. - Луганськ, 2008. - С. 80-84. (Дисертантка визначила вплив штамів вірусу інфекційного бронхіту курей на циліарний апарат та гістоморфологію трахеї, легень, нирок курчат, узагальнила результат, брала участь у написанні статті).

...