Комбінована трансплантація кріоконсервованих органотипових культур ендокринних залоз (експериментальне дослідження)

Гормональна активність органотипових культур ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім’яників і наднирників) при комбінованому культивуванні. Оцінка змін гормонального стану і метаболічних показників у тварин до і після трансплантації залоз.

Рубрика Медицина
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 29.08.2015
Размер файла 83,9 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

Національний інститут хірургії та трансплантології імені О.О. Шалімова

УДК 616-089.843:615.361.43/.44.014.41

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Комбінована трансплантація кріоконсервованих органотипових культур ендокринних залоз (експериментальне дослідження)

14.01.08 - трансплантологія і штучні органи

14.01.35 - кріомедицина

Легач Євген Іванович

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, завідувач відділом кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Денісов Віктор Костянтинович, Донецький Національний медичний університет ім. М.Горького, професор кафедри урології та нефрології,Донецький трансплантаційний центр, керівник центру

доктор медичних наук, професор Малижев Вадим Олексійович, Український науково-практичний центр ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, завідувач лабораторією клінічної імунології

доктор медичних наук, професор Бобирьова Людмила Єгорівна, Вищий державний навчальний заклад України «Українська медична стоматологічна академія», завідувач кафедри ендокринології з лікувальною фізкультурою та спортивною медициною

Захист відбудеться «_16__» __січня_______ 2009 р. о _10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.561.01 при Національному інституті хірургії та трансплантології імені О.О. Шалімова АМН України (03680, м. Київ, вул. Героїв Севастополя, 30)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного інституту хірургії та трансплантології імені О.О. Шалімова АМН України (03680, м. Київ, вул. Героїв Севастополя, 30)

Автореферат розіслано «_15_» ____грудня______ 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук О. М. Литвиненко

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Статистичні дані свідчать про зростання кількості захворювань ендокринної системи серед населення працездатного віку в світі та зокрема в Україні. Поширеність маніфестного гіпотиреозу в світі складає за різними оцінками 1,5-6%, а субклінічного - 4,3-15% (Н.А. Петунина, 2006; В.В. Фадеев, 2007). За даними ВООЗ смертність від цукрового діабету (ЦД) складає 5,2% від загальної летальності, а кількість людей, що страждають на ЦД, збільшиться до 2030 року майже до 366 млн осіб (S. Wild, 2004; G. Roglic, 2005). Загальновизнано, що 40-60% усіх випадків безпліддя чоловіків спричинено гіпогонадизмом, а віковий дефіцит андрогенів (синдром PADAM) спостерігається у 20% (С.Ю. Калиниченко, 2003; J.J. Brennan, 2006). Частота зустрічаємості первинної хронічної надниркової недостатності (ХНН) складає 0,0001% (И.И. Дедов, 2002), однак розвиток синдрому ХНН після відміни глюкокортикоїдів, що були призначені як протизапальні та імуносупресивні препарати, спостерігається у 50-70% хворих (М.И. Балаболкин, 2002).

Практично при всіх формах гіпотиреозу, гіпокортицизму, ЦД 1 типу та дефіциті андрогенів замісна гормональна терапія (ЗГТ) є терапією вибору. Велика кількість спостережень вказує на важливу роль ЗГТ у патогенезі порушень серцево-судинної, імунної систем та системи травлення (R. Polikar, 1993; B. Papaziogas, 2002; Г.А. Мельниченко, 2003; Ю.А. Орлова, 2006; М.Д. Тронько, 2006). Не можна також не враховувати те, що в організмі, скомпрометованому нейроендокринними порушеннями, існує загроза виникнення порочного метаболізму екзогенного гормонального препарату з проявом токсичних ефектів його дериватів, що веде до нечутливості або непереносимості препарату і, в результаті до повернення проблеми лікування гормональної недостатності.

Альтернативою ЗГТ є трансплантація клітин/тканин ендокринних залоз. Експериментальні та клінічні дані свідчать про успішне лікування методом трансплантації таких ендокринних порушень, як цукровий діабет та його ускладнення (В.И. Шумаков, 1993; A.M. Shapiro, 2000; R.A. Valdes-Gonzalez, 2007), гіпопаратиреоз (М.Д. Тронько, 2003; І.П. Пастер, 2004), гіпотиреоз (І.С.Турчин, 1996), недостатність наднирників (Р.М. Сичинава, 1997), гіпопітуїтаризм, дефіцит статевих гормонів (И.Д. Кирпатовский, 2005). У багатьох роботах трансплантація ендокринного органа, тканини або клітин розглядається як найбільш фізіологічний підхід до терапії ендокринних розладів (О.С. Ларін, 2007). Трансплантовані ендокринні залози, крім синтезу і секреції певних гормонів, здатні до продукції біологічно активних медіаторів в основному пептидної природи, що виконують функції як паракринних, так і аутокринних фізіологічних регуляторів.

Суттєвим недоліком методу лікування ендокринної недостатності шляхом трансплантації є нетривалий ефект. Без використання імуносупресантів максимальна тривалість дії трансплантату складає від 1,5 місяців до 1 року (Р.М. Січінава, 2003; S. Schlatt, 2006). Використання імуносупресивної терапії небажано і навіть протипоказано, тому що вона має пригнічуючий вплив на гормональну секрецію ендокринної тканини, яка пересаджується (T.G. Hammond, 1995; A. Penfornis, 2006). Ці обставини суттєво зменшують привабливість використання методу трансплантації у клінічній ендокринології.

У зв'язку з цим пошук способів подовження функціонування трансплантату є актуальною медичною проблемою. Одним з напрямків її рішення є комбінована трансплантація. В літературі зустрічаються поодинокі роботи щодо значної переваги комбінованих трансплантатів у порівнянні з монотрансплантатами. Ця перевага полягає в збільшенні продуктів секреції (C. Ricordi, 1991; A.M. Davalli, 1999), стимуляції проліферативних процесів (R.B. Aramant, 1999), а також імунопротекції (G.S. Selawry, 1993; H.P. Korbutt, 2000). Захисний агент - додатковий трансплантат, який пересаджують разом з основним трансплантатом - виконує протективну роль (наприклад, клітини Сертолі) та допомагає запобігти реакції відторгнення (J.M. Dufour, 2004). Використання комбінованої трансплантації може сприяти покращенню функціонування основного трансплантата за рахунок регуляторно-трофічних факторів, що секретуються додатковим трансплантатом. Це особливо важливо для гетеротопічних тканинних/клітинних трансплантатів, які при пересадці спочатку не мають васкулярної підтримки, внаслідок чого спостерігаються некроз і деструкція трансплантата.

Однак до теперішнього часу відсутнє комплексне дослідження результативності комбінованої трансплантації у корекції гормонодефіцитного стану. Крім того, безумовно актуальним є всебічне вивчення комбінованої трансплантації у разі необхідності заміщення функції одночасно декількох залоз, наприклад при поліендокринопатії.

На сучасному етапі розвитку технологій клітинного культивування використання тканинних і клітинних трансплантатів стає все більш розповсюдженим. Однак, при застосуванні цього методу для лікування ендокринних порушень необхідно враховувати, що функціональною одиницею ендокринних тканин є клітинні конгломерати (фолікули, острівці та ін.), тому в трансплантаті важливо зберегти нативну тканинну архітектуру і регуляторні взаємовідношення, а це можливо при отриманні органотипової культури.

Використання нового напрямку в трансплантаційних технологіях - комбінованої трансплантації - обумовило появу нових питань. Перш за все, це питання про можливість комбінованого культивування тканин перед трансплантацією. Особливо це стосується ендокринних тканин, функціонування яких пов'язано складними гуморальними взаємовідносинами в рамках гіпоталамо-гіпофізарно-ефекторної осі. Необхідно також оцінити можливість використання тканин наднирників, що секретують імуносупресорні гормони, як допоміжного трансплантату, який буде здійснювати імунопротекторний ефект. Також для досягнення трофічного ефекту і попередження пригнічення секреторної функції або життєдіяльності основного трансплантата при комбінованій трансплантації важливо врахувати, в яких регуляторно-метаболічних взаємозв'язках знаходяться ті чи інші тканини.

Потреба у довгостроковому зберіганні донорського матеріалу сприяла розробці технологій кріоконсервування клітин та тканин ендокринних залоз (В.І. Грищенко, 1993; В.А. Чуйко, 1995; Б.П. Сандомирський, 2000). Але, незважаючи на певні успіхи в галузі кріобіології, ряд принципових питань залишається невирішеним, що гальмує впровадження методу трансплантації у клінічну практику. Зокрема, це стосується питання заморожування фрагментів тканин або органотипової культури, тому що ці об'єкти мають більш складну структурну організацію в порівнянні з клітинами. Способи кріоконсервування, що були розроблені для клітинних суспензій, не прийнятні для органотипової культури, у зв'язку з чим розробка методів кріоконсервування органотипових культур ендокринних залоз є дуже актуальною.

Таким чином, актуальність вищезазначених проблем обумовила необхідність розробки оптимальних умов комбінованого культивування та кріоконсервування органотипових культур ендокринних залоз, а також вивчення їх гормонопродукуючого потенціалу при лікуванні гормональної недостатності методом комбінованої трансплантації.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України в рамках двох науково-дослідних тем: «Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин» (шифр 2.2.6.03, № державної реєстрації 0101U003478) та «Властивості ендокринних тканин за умов кріоконсервування та трансплантації експериментальним тваринам» (шифр 2.2.6.32, № державної реєстрації 0106U002163), в яких автор був відповідальним виконавцем.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - вивчити ефективність та доцільність застосування комбінованого підходу на етапах передтрансплантаційної обробки біологічного матеріалу (тканин щитовидної, підшлункової залоз, наднирників та сім'яників) шляхом культивування та кріоконсервування, а також при трансплантації тваринам з експериментальними гіпотиреозом, інсулінозалежним діабетом, гіпокортицизмом та андрогендефіцитним станом.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі.

1. Вивчити гормональну активність органотипових культур ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім'яників і наднирників) при комбінованому культивуванні в порівняльному аспекті з монокультурами, на основі чого розробити оптимальні умови комбінованого органотипового культивування кожної із зазначених залоз.

2. На основі оцінки життєздатності та функціональної активності органотипових культур ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім'яників і наднирників) розробити способи їх кріоконсервування з використанням високих швидкостей охолодження.

3. Оптимізувати умови відновлення гормональної активності органотипових культур ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім'яників і наднирників) після кріоконсервування за допомогою комбінованого рекультивування.

4. Створити модель експериментальної гормональної недостатності відповідних ендокринних залоз у тварин (хірургічним способом або з використанням фармакологічних препаратів).

5. Оцінити зміну гормонального стану та метаболічних показників у експериментальних тварин до та після трансплантації біологічного матеріалу ендокринних залоз, який піддавали різним видам передтрансплантаційної обробки (нативні фрагменти тканини, органотипові культури, кріоконсервовані органотипові культури та рекультивовані органотипові культури).

6. Порівняти стан експериментальних тварин з гормональною недостатністю після моно- та комбінованої трансплантації нативних фрагментів та незаморожених органотипових культур ендокринних залоз, а також культур, яких піддавали кріоконсервуванню і рекультивуванню, шляхом дослідження фізіологічних і біохімічних показників; на основі одержаних результатів зробити висновки про активність і тривалість функціонування ало - і ксенотрансплантатів.

7. В порівняльному аспекті оцінити гормонопродукуючий потенціал та ефективність корекції гормонодефіцитного стану за умов ауто-, ало- та ксенотрансплантації органотипових культур ендокринних залоз.

8. Провести гістологічний аналіз ало- і ксенотрансплантатів у різні терміни після моно- та комбінованої трансплантації, на основі чого зробити висновок про морфофункціональний стан та виживання застосованого біологічного матеріалу.

9. Виявити найбільш ефективні комбінації тканин зазначених залоз для подовження тривалості виживання та функціонування трансплантата, на основі чого обґрунтувати можливість використання методу комбінованої трансплантації для лікування гормонодефіцитного стану.

Об'єкт дослідження: гормональний статус і процеси метаболізму у тварин з гормональною недостатністю після комбінованої трансплантації нативних фрагментів ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім'яників і наднирників), незаморожених органотипових культур вищевказаних залоз та культур, яких піддавали кріоконсервуванню і наступному рекультивуванню, а також морфофункціональний стан трансплантаційного матеріалу.

Предмет дослідження: нативні фрагменти і органотипова культура ендокринних залоз (щитовидної і підшлункової залоз, сім'яників і наднирників) при комбінованому культивуванні, кріоконсервуванні та комбінованій трансплантації.

Методи дослідження: органотипове культивування, комбіноване культивування, кріоконсервування в присутності диметилсульфоксиду, комбінована трансплантація під капсулу нирки, в підшкірну жирову клітковину та інтрапортально, визначення вмісту гормонів радіоімунним та імуноферментним методами, спектрофотометричне визначення біохімічних характеристик культур і показників крові реципієнтів, світлова та флуоресцентна мікроскопія, гістологічний аналіз, статистичний аналіз результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Дисертаційна робота містить теоретичне обґрунтування і експериментальну розробку нового підходу до вирішення науково-практичної проблеми лікування гормональної недостатності (гіпотиреозу, гіпокортицизму, андроген-дефіцитного стану, цукрового діабету I типу) методом комбінованої трансплантації кріоконсервованих органотипових культур ендокринних залоз (щитовидної, підшлункової залоз, наднирників і сім'яників).

Вперше детально вивчено параметри активації та інгібування секреторної функції ендокринних залоз (щитовидної, підшлункової залоз, наднирників і сім'яників) при комбінованому культивуванні, на підставі чого встановлено оптимальні умови отримання біоматеріалу для трансплантації, які дозволять подовжити тривалість його гормонопродукуючої функції в організмі реципієнта.

На основі порівняльної оцінки гормонопродукуючої здатності органотипових культур ендокринних залоз, отриманих від тварин різного віку, встановлено перевагу використання неонатального біоматеріалу в умовах in vitro та при комбінованій трансплантації.

В роботі вперше було проведено аналіз і зроблено наукове обґрунтування комбінованого підходу до трансплантації клітин/тканин ендокринних залоз для терапії гормонодефіцитних станів. Показана перспективність застосування комбінованих трансплантатів тканин щитовидної залози з тканиною наднирників та сім'яників, а також тканини наднирників з експлантатом гіпофіза.

Уперше в трансплантології випробовано метод комбінованої трансплантації з тканиною наднирників в якості імунопротектора основного трансплантата і зроблено висновки про можливість його використання при трансплантації щитовидної, підшлункової залоз і сім'яників. Доведено доцільність використання такого підходу за умов трансплантації тканини щитовидної залози.

Вперше проведено комбіновану інтрапортальну трансплантацію острівців підшлункової залози з клітинами Сертолі, що дозволило збільшити виживання острівців в 2,3 рази.

На підставі проведеної оцінки віддалених результатів трансплантації доведено, що комбінована трансплантація позитивно впливає на активність гормональної секреції та проліферативний потенціал пересаджуваної тканини, що має вирішальний вплив на тривалість виживання та ефективність її функціонування після трансплантації.

Уперше нами було запропоновано та апробовано метод реабілітації кріоконсервованого біологічного матеріалу перед трансплантацією - комбіноване рекультивування, що дозволяє значно покращити гормональну функцію in vitro та in vivo за умов трансплантації.

Практичне значення одержаних результатів. Вивчення впливу факторів комбінованої трансплантації дозволило з'ясувати деякі імунобіологічні аспекти клітинної і тканинної терапії, розробити методи посилення активності функціонування трансплантата з метою покращення терапевтичної дії препаратів ендокринних клітин. На підставі отриманих даних розроблена стратегія найбільш ефективного використання органотипових культур ендокринних залоз для комбінованої трансплантації, яка дозволяє подовжити тривалість функціонування трансплантата в організмі реципієнта.

Розроблені способи кріоконсервування культури адренокортикальної тканини (Патент України №34848), органотипової культури щитовидної залози (Патент України №9367) і органотипової культури сім'яників (Патент України №80497) дозволяють зберегти високий рівень гормонопродукуючої здатності і морфологічних властивостей біоматеріалу, що надає перевагу для його використання при трансплантації.

Розроблений спосіб підготовки кріоконсервованих органотипових культур після відігріву (Патент України №4845) дозволяє забезпечити довготривале виживання і функціонування культур ендокринних залоз після трансплантації.

Розроблений спосіб хірургічного моделювання гіпотиреозу (Є.І. Легач, 2005) дозволяє максимально зменшити рівень тиреоїдних гормонів у плазмі крові дрібних лабораторних тварин (щурів, мишей) у порівнянні з відомими хірургічними способами, що дає можливість використати даний спосіб при експериментальних медико-біологічних дослідженнях.

Отримані результати щодо можливості комбінованого культивування різних ендокринних тканин та їх комбінованої трансплантації мають науково-прикладне значення для розуміння механізмів регуляторно-метаболічних взаємовідношень ендокринної системи та можуть використовуватися в біотехнології.

Матеріали дисертаційного дослідження використовуються в навчальному процесі кафедри ендокринології Харківської медичної академії післядипломної освіти, в ДУ «Інститут загальної і невідкладної хірургії» АМН України, в Українському науково-практичному центрі ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України, кафедри фізіології людини і тварин Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційного дослідження, планування мети і задач, методологічна структура роботи належать авторові. Винесені до захисту результати роботи отримано дисертантом особисто. Експериментальні дослідження проведено самостійно на базі лабораторій і віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, консультацію надавали к.б.н. Божок Г.А. та співробітники відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Дисертант самостійно провів патентний та інформаційний пошук з використанням Internet, аналіз отриманих результатів, написав всі розділи дисертації, сформулював висновки.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення дисертації доповідались і обговорювались на засіданнях секцій вченої ради ІПКіК НАН України, Українського науково-практичного центра ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України; 32nd Annual Meeting of the Society for Cryobiology (Madison, 1995); 35th Annual Meeting of the Society for Cryobiology (Pittsburgh, 1998); 2nd World Congress on Tissue Banking & 8th International Conference of EATB (Warsaw, 1999); V Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 1999); Всеукраїнській конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми відновлювальної хірургії» (Київ, 2001); 13th & 18th European Students' Cоnferences for promising biomedical scientists and future doctors (Berlin, 2002, 2007); III Міжнародній конференції «Medicine - Health XXI century» (Донецьк, 2002); Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); науково-практичних конференціях «Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології» (Харків, 2002, 2004, 2005); з'їздах трансплантологів України (Запоріжжя, 1995; Київ, 2000; Донецьк, 2004; Київ, 2007); 5th Parnas Conference «Molecular mechanisms of cellular signaling» (Kyiv, 2005); ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006); науково-практичній конференції «Профілактика, діагностика та лікування - основні складові терапії» (Харків, 2006); III Всеросійському симпозіумі з міжнародною участю «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007).

Публікація матеріалів. Загальні положення дисертації викладені у 70 наукових публікаціях, які відображають зміст виконаної роботи: в 27 статтях у наукових фахових виданнях; 4 деклараційних патентах України; 37 тезах матеріалів конференцій; 2 методичних рекомендаціях, затверджених МОЗ України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 336 сторінках машинописного тексту і містить вступ, огляд літератури, розділи «Матеріали і методи дослідження», «Результати та їх обговорення», узагальнення, висновки і список літератури, який включає 616 джерел, з них 489 - іноземні. Робота ілюстрована 8 таблицями, 76 мікрофотографіями і 62 рисунками.

Основний зміст роботи
Матеріали і методи дослідження. Робота була виконана на нативних і кріоконсервованих органотипових культурах ендокринних залоз (ОКЕЗ) (щитовидна, підшлункова, надниркова залози, сім'яник, гіпофіз), що отримували від новонароджених поросят. Реципієнтами для трансплантації були щури масою 150-200 г та кролі масою 3-3,5 кг. Експерименти на лабораторних тваринах проводились з дотриманням загальних Національних норм з біоетики (І Національний конгрес з біоетики, Київ, 2001) і положень Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною або іншими науковими цілями (Страсбург, 1985), та були підтримані Комітетом з біоетики ІПКіК НАН України.
Органотипове культивування здійснювали за методом (І.С. Турчин, 1993).
ОКЕЗ піддавали кріоконсервуванню з використанням диметилсульфоксиду (ДМСО) як кріопротектора. Заморожування здійснювали в кріостійких ампулах-контейнерах фірми „Nunc” на програмному заморожувачі „Cryoson 115” (Німеччина) або над дзеркалом азоту з наступним занурюванням у рідкий азот. Частина кріоконсервованих зразків була використана для рекультивування. Для цього розморожені зразки ОКЕЗ рекультивували протягом 2 діб у живильному середовищі 199 з додаванням 10% інактивованої ембріональної телячої сироватки та антибіотиків. Заміну середовища культивування здійснювали кожну добу.
Сумісне культивування ОКЕЗ у різних комбінаціях проводили в умовах, підібраних для основної культури, при цьому супутня культура була відокремлена від основної напівпроникненою перегородкою.
Життєздатність клітин контролювали методом суправітального забарвлення трипановим синім. Для вимірювання життєздатності ОКЕЗ суспензію клітин отримували ферментативним методом за допомогою 0,25% розчину трипсину.
Базальну секрецію гормонів ОКЕЗ вимірювали в живильному середовищі кожну добу культивування. Стимульовану секрецію гормонів вивчали при додаванні до ОКЕЗ дибутирил - цАМФ (1 мM), хоріонічний гонадотропін (1,5 ОД/мл) і екстракт гіпофіза.
Острівці підшлункової залози (ОПЗ) новонароджених поросят для інтрапортальної трансплантації отримували за методом (G.S. Korbutt, 1996), суспензію клітин Сертолі новонароджених поросят - за методом (R.V. Rajotte, 1997).

Для всіх хірургічних операцій і трансплантацій використовували комбінований наркоз (внутрішньочеревно): кетамін і ксилазин у концентрації 2,5 і 0,5 мг на 100 г маси тварини. Операції двосторонньої адреналектомії проводили за методом (M. Hoffmann, 2000), тиреоїдектомії - за методом (Є.І. Легач, 2005), двосторонньої орхіектомії - за методом (Я.М. Кабак, 1945). Цукровий діабет викликали у щурів массою 180-200 г шляхом одноразової внутрішньочеревної ін'єкції стрептозотоцину (СТЗ) в дозі 55 мг/кг маси тварини, у кролів ? одноразової внутрішньовенної ін'єкції алоксану в дозі 100 мг/кг маси тварини.

Рівень глюкози в крові контролювали за допомогою індикаторних пластинок «Гемоглан» на глюкометрі Глюкофот-II.

В залежності від ендокринної недостатності виконували трансплантацію ОКЕЗ під капсулу лівої нирки тварини (органотипові культури щитовидної залози, наднирників та сім'яників), у підшкірну жирову клітковину (органотипова культура підшлункової залози) та інтрапортально (острівці підшлункової залози). Трансплантації органотипової культури щитовидної залози (ОКЩЗ), органотипової культури надниркових залоз (ОКНЗ) і органотипової культури сім'яників (ОКС) проводили безпосередньо після тиреоїдектомії, адреналектомії або орхіектомії. Доза трансплантованого матеріалу в цих випадках складала 35-40 мг. Щурам з ЦД виконували трансплантацію органотипової культури підшлункової залози (ОКПЗ) через тиждень після ін'єкції СТЗ в дозі, яка відповідала ендокринному матеріалу, отриманому з двох залоз новонароджених поросят для одного щура. При комбінованій трансплантації додатково використали ендокринний матеріал, отриманий з одного сім'яника або одного наднирника. Кролям з ЦД трансплантували ОПЗ на 21-23 добу після ін'єкції алоксану в дозі 8,7х106 острівців.

Рівень Т4, ТТГ, тестостерону, кортизолу в середовищі культивування, а також в плазмі крові тварин проводили радіоімунним методом з використанням тест-наборів TOTAL T4 RIA KIT (Immunotech), РІА-Т4-СТ (Білорусь), TSH RIA KIT (Immunotech), РІА-Тестостерон-СТ (Білорусь), СТЕРОН-К-125І-М (Білорусь). Вміст інсуліну вимірювали імуноферментним методом за допомогою набору INSULIN ELISA KIT (DRG Diagnostic) на АІФ-Ц-01С. Кількість гормонів у середовищі культивування нормували на білок, який вимірювали за методом (M. Bradford, 1985).

Вміст альбуміну, холестерину і альфа-амілази досліджували спектрофотометричним методом за допомогою тест-наборів «Філісіт-діагностика» (Україна) та Chol 150 (Lachema), вміст фракції глікозильованого гемоглобіну HbA1c - за допомогою стандартних наборів GHB 100 та HB 400 S (Lachema).

Гістологічному аналізу піддавали цілу ендокринну залозу новонародженого поросяти як первинний досліджуваний матеріал, ОКЕЗ - після різної попередньої обробки, моно- і комбіновані трансплантати, отримані на 30 і 120 добу, - після трансплантації. Матеріал для гістологічного дослідження фіксували в 10%-му розчині нейтрального формаліну, за стандартною методикою заливали в парафін. Виготовлені на мікротомі зрізи (5-7 мкм) забарвлювали гематоксиліном і еозином та досліджували під світловим мікроскопом.

Для візуалізації острівців після інтрапортального введення в організм реципієнта використовували флуоресцентний поліметиновий барвник DiOC18. Досліджували забарвлені зразки та здійснювали мікрофотозйомку за допомогою люмінесцентного мікроскопа Olympus IX-71.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою MS EXCELL 7.0 з використанням функції описової статистики; значення оцінки варіації виражали за допомогою довірчого інтервалу, використовували: t-критерій Стьюдента для кількісних нормально розподілених ознак, однофакторний дисперсійний аналіз. Дані представлені як середні значення, отримані у 2-х аналогічних експериментах і виміряних у 2-х паралельних пробах, стандартна похибка; вірогідними вважались відмінності при Р<0,05 і Р<0,01.

Основні результати дослідження

При підборі умов культивування ендокринної тканини важливо зберегти її гормональну функцію, тому на першому етапі досліджень необхідно було провести аналіз секреторної активності ОКЕЗ, отриманих від новонароджених поросят та статевозрілих щурів.

В експериментах з фрагментами тканин щитовидної залози, наднирників та сім'яників було встановлено падіння базальної гормональної секреції при тривалому культивуванні. Здатність до відповіді на стимуляцію (ХГ, дибутирил-цАМФ, сінактен, екстракт гіпофіза) зберігалася у ОКЕЗ на строці культивування, що не перевищував 3 доби. Гістологічні дослідження показали структурну і функціональну цілісність 2-3-добових органотипових культур щитовидної залози, наднирників та сім'яників, які були використані в подальшому для комбінованого культивування, кріоконсервування та трансплантації. Органотипова культура підшлункової залози зберігала інсулінопродукуючу функцію протягом усього дослідженого періоду (8 діб).

1. Гормонопродукуючий потенціал кріоконсервованої органотипової культури щитовидної залози при комбінованому культивуванні та трансплантації

При вивченні параметрів збереження гормональної функції ОКЩЗ після кріоконсервування ми порівняли два режими заморожування: з низькою (2С/хв) та високою (85-100С/хв) швидкостями охолодження. В обох випадках використовували ДМСО в концентрації 7%. Встановлено, що заморожена зі швидкістю охолодження 2С/хв ОКЩЗ відразу після відігрівання зберігає лише 35% гормональної активності, тоді як при швидкому режимі заморожування зберігалося 56% секреції Т4. Рекультивування ОКЩЗ приводило до підвищення гормональної активності та життєздатності культури за рахунок елімінації пролітичних клітин.

Для покращення збереженості функціональних властивостей ОКЩЗ при кріоконсервуванні ми вивчили декілька режимів насичення ОКЩЗ кріопротектором. Інкубацію ОКЩЗ з 7% ДМСО проводили за 4 режимами: 1) 15 хв при 4С; 2) 15 хв при 4С і 15 хв при 37С; 3) 15 хв при 22С; 4) 30 хв при 22С.

Виявилось, що найбільш пошкоджуючим для тироцитів є другий режим насичення ДМСО (табл. 1). Четвертий режим насичення ДМСО (30 хв при 22С), при якому зберігається максимальна кількість живих клітин (97,2%) і високий рівень секреції Т4, було обрано для подальших експериментів.

Таблиця 1. Секреція Т4 і життєздатність клітин ОКЩЗ після кріоконсервування при різних режимах інкубації з 7% ДМСО та після 48 годин рекультивування (n=10)

Умови інкубації з ДМСО

Т4

Життєздатність, %

нмоль/мг білка

%

Нативна ОКЩЗ

30,474,36

100

100

Режим 1

29,783,81

97,7

60,9*

Режим 2

24,762,11*

81,2*

50,1*

Режим 3

32,485,15

106,5

79,9*

Режим 4

29,151,01

95,6

97,2

Примітка. *- у порівнянні з нативною ОКЩЗ, Р<0,05.

В експериментах з вивчення впливу комбінованого культивування ми використовували експлантати гіпофіза (ЕГ), ОКНЗ та ОКС для культивування сумісно з тканиною ОКЩЗ. Показано, що присутність ЕГ у комбінованій культурі викликає типову реакцію активації секреції Т4 (на 52% в порівнянні з монокультурою), яка зберігається протягом всього строку культивування. Встановили, що комбіноване культивування в присутності ОКНЗ призводить до значного підвищення вмісту Т4 (в 1,5-2,5 рази) при порівнянні з монокультурою. Андрогенні фактори, що виділяються ОКС в умовах комбінованого культивування, не змінювали рівень секреції Т4.

На 2 добу рекультивування після кріоконсервування гормональна продукція ОКЩЗ була зменшена в порівнянні з інтактною культурою, але при комбінованому рекультивуванні з ЕГ відбувалося збільшення продукції гормону на 40%. Присутність ОКНЗ та ОКС не впливала на рівень Т4 в живильному середовищі.

Гістологічний аналіз ОКЩЗ показав, що в зразках культур, комбінованих з ОКНЗ та ЕГ, спостерігаються нормофолікулярні елементи зі збільшеними розмірами епітеліальних клітин і наявністю внутрішньоколоїдних вакуолей резорбції. Тканина мала всі ознаки підвищення гормональної секреції. При комбінованому культивуванні ОКЩЗ з ОКС було виявлено ознаки процесу проліферації тиреоїдної паренхіми.

У наступних експериментах було вивчено гормонопродукуючий потенціал ОКЩЗ при трансплантації в алогенній та ксеногенній системах. Тиреоїдектомію виконували за розробленим нами методом, який дозволяє максимально видалити щитоподібну залозу (ЩЗ). Відомо, що при видаленні ЩЗ у щурів важко добитися повного зникнення тиреоїдних гормонів. Як правило, вже наприкінці першого місяця після операції спостерігається тенденція до відновлення рівня Т4 у плазмі крові. В роботі (Л.М. Шкуматов, 2001) на 28 добу після тиреоїдектомії у щурів спостерігали 45% Т4 від контрольних значень. За нашим методом видалення ЩЗ рівень Т4 в групі тиреоїдектомованих тварин на 30 добу знаходився в межах 11,3-18,0 нмоль/л (21-35% від контролю). Це свідчить про перевагу розробленого нами способу видалення ЩЗ.

Слід зазначити, що жоден з використаних видів трансплантатів повністю не відновлював гормональний рівень у тиреоїдектомованих тварин до контрольних значень. На 30 добу після ауто-, ало- і ксенотрансплантації нативних фрагментів ЩЗ у сироватці крові реципієнтів спостерігався рівень Т4 29,6±3,1, 34,6±9,8 і 27,8±1,34 нмоль/л відповідно (рис. 1). В середньому ці значення відповідали 55% компенсації рівня гормону в порівнянні з контролем.

Відомо, що органотипове культивування перед трансплантацією приводить до зменшення імуногенності пересаджуваної тканини і, як наслідок, ? до пролонгування строку ії функціонування (P.Y. Benhamou, 1998). Однак ми не встановили позитивного впливу органотипового культивування ЩЗ алогенного походження на активність її гормонопродукції після трансплантації. Напроти, рівень Т4, що спостерігався в даному випадку, був нижчим в порівнянні з алотрансплантацією нативних фрагментів ЩЗ. У випадку використання ОКЩЗ ксеногенного походження в крові реципієнтів після трансплантації спостерігався такий же рівень Т4, як і у випадку використання некультивованих фрагментів. Кріоконсервована ОКЩЗ характеризувалась зменшенням гормональної активності після трансплантації. При цьому трансплантація кріоконсервованої ОКЩЗ, яку піддавали рекультивуванню, приводила до зростання рівня Т4 у плазмі крові щурів. гормональний ендокринний залоза трансплантація

Ці факти свідчили про відновлення секреторної активності трансплантатів кріоконсерованої ОКЩЗ після рекультивування. Рівень ТТГ практично у всіх випадках змінювався за принципом зворотної залежності від рівня тироксину.

У подальших експериментах з комбінованою трансплантацією встановлено, що на 30 добу за умов пересадки тканини ЩЗ сумісно з ЕГ рівень Т4 в плазмі крові щурів деяких експериментальних груп збільшується в порівнянні з монотрансплантатом, а саме у груп з трансплантатами кріоконсервованих (на 43%) та рекультивованих (на 17%) ОКЩЗ. Після комбінованої трансплантації з тканиною наднирників найбільш високі показники рівня Т4 в плазмі крові спостерігались у реципієнтів нативних фрагментів ЩЗ (на 39% вище за монотрансплантат).

Після комбінованої трансплантації фрагментів тканини ЩЗ і сім'яників рівень Т4 в крові реципієнтів всіх експериментальних груп досягав 37,81±2,83 нмоль/л, що склало 71% від контрольних значень та було на 18% вище за результат, отриманий за умов монотрансплантації. Також значний ефект комбінованої трансплантації був помітний у випадках трансплантації кріоконсервованих та рекультивованих органотипових культур ОКЩЖ і ОКС, на 55 та 16% відповідно вище за монотрансплантат. Треба відзначити, що ці результати спостерігались на досить тривалому терміні після трансплантації (на 120 добу), тому рівень Т4 є показником не тільки функції трансплантата, але й процесу регенерації власної залози реципієнта.

Для оцінки вкладу трансплантата в загальний тиреогормонопоез ми видалили нирку, що несе трансплантат. Тестували рівень Т4 на 7 добу після нефректомії, тому що за цей проміжок часу відбувається напіврозпад гормону в крові (В.В. Потемкин, 1999). При визначенні відсотка вмісту Т4 в плазмі крові щурів після нефректомії встановлено, що зменшення рівня Т4 відбулося у групі з комбінованою трансплан-тацією ОКЩЗ з ОКС на 18,05%, кріоконсервованих ОКЩЗ з ОКС - на 33,7%, кріоконсервованих і рекуль-тивованих ОКЩЗ з ОКС - на 26,4%. Це свідчило про те, що у тварин даних груп основним депо синтезу тиреоїдних гормонів є трансплантат, видалення якого з організму разом з ниркою привело до падіння рівня Т4.

Макроскопічно трансплантат на 30 добу добре визначався як утворення білого кольору під капсулою нирки. Гістологічний аналіз аутологічного транс-плантата на 30 добу показав під капсулою нирки розташовані в декілька рядів фолікули рожевого кольору, які активно секретують колоїд. Більшість зразків алотрансплантатів фрагментів ЩЗ на 30 добу являли собою групи дезінтегрованих клітин ЩЗ, що не утворюють фолікули. Подібна морфологічна картина спостерігалась і у випадку трансплантації ксеногенних фрагментів ЩЗ. Однак після комбінованої ксенотрансплантації фрагментів ЩЗ з наднирковою залозою під нирковою капсулою спостерігались численні фолікули різного розміру, круглої або овальної форми, з кубічним та ущільненим епітелієм, що підтверджувало кращу збереженість секреторного епітелію. Після комбінованої трансплантації фрагментів ЩЗ з фрагментами сім'яників на гістологічних зразках були присутні ознаки проліферації тиреоїдної паренхіми.

2. Гормонопродукуючий потенціал ОКС при комбінованому культивуванні та комбінованій трансплантації

На основі існуючих даних щодо кріоконсервування фрагментів тканини сім'яників новонароджених хом'яків (S. Schlatt, 2002) і фрагментів фетальних сім'яників людини (В.А. Керос, 2001) для розробки способу кріоконсервування 3-добової ОКС новонароджених поросят ми обрали кріопротектор ДМСО. При вивченні впливу ДМСО на гормональну активність ОКС встановлено, що інкубація з 5 і 10%-м ДМСО протягом 45 хв при 32С практично не впливала на рівень базальної секреції тестостерону ОКС, тоді як 15%-й розчин ДМСО пригнічував цей показник. При порівнянні показників дибутирил-цАМФ-стимульованої гормональної секреції ОКС виявлено значне зростання рівня тестостерону в культурах, попередньо інкубованих з концентраціями ДМСО 5 і 10%, в той час як відсутність стимульованої продукції гормону при інкубації з розчином ДМСО 15% підтверджувала при цій концентрації пошкоджуючий вплив кріопротектора на клітинні структури, що відповідають за стероїдогенез.

Для подальшої розробки режиму кріоконсервування ОКС ми обрали концентрацію ДМСО 10%, тому що при використанні такої концентрації спостерігались найвищі показники секреції тестостерону. Заморожування здійснювали за двохступінчастою програмою, варіюючи швидкості охолодження на першому етапі, які складали 1, 5 і 10оС/хв. Зразки заморожували до -60оС з наступним занурюванням у рідкий азот. Також було використано заморожування над дзеркалом рідкого азоту зі швидкістю 85-100С/хв протягом 3 хв при наступному занурюванні в рідкий азот. При дослідженні стероїдогенної активності ОКС встановлено, що мінімальна швидкість охолодження (1С/хв) і швидкість вище 10С/хв є пошкоджуючими для базальної та ХГ-стимульованої продукції тестостерону (табл. 2).

Таблиця 2. Базальна і стимульована ХГ (1,5 ОД/мл) секреція тестостерону інтактною 3-добовою ОКС (контроль) і кріоконсервованою ОКС (n=9)

Умови експерименту

Базальна секреція

Стимульована секреція

нмоль/мг білка

%

нмоль/мг білка

%

Контроль

25,461,47

100

32,031,99

100

1С/хв

12,891,99 *

50,62

33,436,47

104,37

5С/хв

23,943,74

94,02

42,198,99*

131,72

10С/хв

17,481,89*

68,65

23,923,14*

74,67

85-100С/хв

17,072,01*

67,04

15,061,24*

47,01

Примітка. * - в порівнянні з контролем, Р<0,05.

Аналіз життєздатності клітин ОКС після кріоконсервування методом суправітального забарвлення трипановим синім виявив зменшення кількості клітин, що активно виключають барвник, до 76% - при швидкості охолодження 10С/хв і до 71% -при швидкості 85-100С/ хв. у порівнянні з контролем. Для ОКС, кріоконсервованої зі швидкістю 1С/хв, цей показник складав 84%. Найбільший відсоток життєздатних клітин (94%) був при кріоконсервуванні ОКС зі швидкістю 5С/хв. Таким чином, режим кріоконсервування ОКС, що включав насичення 10%-м ДМСО протягом 20 хв та охолодження зі швидкістю 5С/хв, ми використали в подальших експериментах.

На наступному етапі роботи проведено комбіноване культивування ОКС у поєднанні з ЕГ і ОКНЗ. При 3-добовому культивуванні ОКС сумісно з ЕГ встановлено падіння продукції тестостерону, що ймовірно відбувалося внаслідок десенситизації клітин Лейдіга під впливом довготривалої аплікації гонадотропіну, що секретується ЕГ на протязі декількох діб культивування. Також було встановлено негативний вплив присутності ОКНЗ на гормональну функцію ОКС, що підтверджувало дані щодо пригнічення секреції тестостерону глюкокортикоїдами, отримані іншими авторами in vivo (P. Juniewicz, 1987). Ці ефекти були встановлені нами при дослідженні ОКС на двох видах тварин (новонароджених поросятах та статевозрілих щурах).

Рекультивування ОКС у присутності ЕГ після кріоконсервування не приводило до вірогідної різниці в гормонопродукції при порівнянні з монокультурою, але спостерігалася тенденція до підвищення секреції тестостерону. Рекультивування в присутності ОКНЗ характеризувалось зменшенням секреції гормону на 63,8%. Гістологічне дослідження підтвердило пригнічення функції клітин Лейдіга ОКС після культивування в присутності ЕГ і ОКНЗ, а також рекультивування в присутності ОКНЗ після кріоконсервування ОКС.

Гормонопродукуючий потенціал ОКС новонароджених поросят при порівнянні з ОКС статевозрілих щурів вивчали при трансплантації щурам, яких піддавали орхіектомії. Орхіектомія різко знижувала рівень тестостерону в крові щурів з 5,980,42 (контроль) до 0,200,11 нмоль/л. Аутотрансплантація фрагментів сім'яників на 30 добу приводила до підвищення рівня гормону до 2,170,31 нмоль/л, однак у зв'язку з невеликою дозою трансплантованого матеріалу (35-40 мг) в порівнянні з інтактними сім'яниками не була здатна повністю компенсувати дефіцит андрогенів. Слід також враховувати той факт, що при гетеротопічній пересадці тканини з мошонки в черевну порожнину під капсулу нирки, підвищується температура, яка необхідна для нормального стероїдогенезу сім'яниками.

Ксенотрансплантація нативних фрагментів тестикулярної тканини підвищувала рівень тестостерону в плазмі крові орхіектомованих щурів у 3 рази. Культивування протягом 3 діб сприяло кращому виживанню ксенографта сім'яників і збільшенню гормональної продукції тестостерону в 4 рази у порівнянні з орхіектомією. Рекультивування кріоконсервованої ОКС не призводило до підвищення секретуючої функції тестикулярних ксенотрансплантатів у порівнянні з нативними фрагментами та незамороженою культурою, але за умов комбінованої з ЕГ трансплантації спостерігалось підвищення рівня тестостерону в плазмі крові на 47% в порівнянні з монотрансплантацією. Комбінована трансплантація ОКС з ОКНЗ у всіх випадках характеризувалась пригніченням продукції тестостерону. Зміна маси сім'яних пухирців, яка, як відомо, є дуже чутливим показником рівня андрогенів у крові (Я.М. Кабак, 1945), відповідала зміні рівня тестостерону в плазмі крові в усіх вивчених групах тварин.

Таким чином, при комбінованій трансплантації ОКС з ОКНЗ фактор пригнічення стероїдогенезу переважав над імунопротекцією трансплантата глюкокортикоїдами, що секретуються тканиною наднирників.

3. Гормонопродукуючий потенціал кріоконсервованої ОКНЗ при комбінованому культивуванні та комбінованій трансплантації

Встановлено, що в умовах комбінованого культивування з двома експлантатами аденогіпофізу (ЕАГ) ОКНЗ новонароджених поросят на 3 добу секретувала 107,4 нмоль/л кортизолу, що на 66% вище контролю (64,2 нмоль/л).

На момент виконання роботи існував розроблений нами раніше режим кріоконсервування 5-добової ОКНЗ новонароджених поросят (Т.П. Бондаренко, 1999), відповідно до якого заморожували зразки зі швидкістю охолодження 1С/хв до -70С, а потім їх занурювали в рідкий азот. Даний режим дозволяв зберігати 90% секреції кортизолу після розморожування і видалення кріопротектора.

Однак, враховуючи те, що за умов використання високих швидкостей охолодження процес заморожування може сприяти селективному видаленню антиген-презентуючих клітин (АПК), присутніх у тканині (А.О. Цуцаєва, 1988; M. Taylor, 1990), нами було апробовано метод кріоконсервування ОКНЗ зі швидкістю 85-100С/хв.

При вивченні експресії антигенів ГКГ ІІ класу ми встановили, що вони виявляються одразу після розморожування кріоконсервованої ОКНЗ, однак після 2 діб рекультивування їх не спостерігали (Г.А. Божок, 2004). Цей факт свідчив про можливість пошкодження АПК після заморожування з високою швидкістю охолодження та їх видалення при наступному рекультивуванні протягом 2 діб. Таким чином, рекультивування - це важливий і основний етап для видалення АПК перед трансплантацією ОКНЗ для зменшення імуногенності трансплантата.

При аналізі секреторної активності ОКНЗ, кріоконсервованої за швидкого режиму (85-100С/хв), відразу після відігрівання і видалення кріопротектора було встановлено зменшення продукції кортизолу на 21,1% від початкових значень гормону. На 2 добу рекультивування в такій культурі зберігався ще нижчий рівень кортизолу (на 36,5% менше від початкового рівня). Враховуючи важливість рекультивування і феномен зменшення активності стероїдогенезу в процесі органотипового культивування, ми дослідили можливість кріоконсервування фрагментів НЗ безпосередньо після їх забору.

В результаті використання такого підходу ми досягли збереження гормональної активності рекультивованих фрагментів НЗ на рівні, який перевищує рівень 5-добової ОКНЗ на 17%, а 5-добової кріоконсервованої і рекультивованої ОКНЗ - на 47%. Тому у подальших експериментах комбінованого рекультивування та трансплантації використовували кріоконсервування фрагментів НЗ, а не ОКНЗ.

Нами було встановлено, що рівень секреції кортизолу кріоконсервованими фрагментами НЗ був меншим за показники секреції інтактними фрагментами. Комбіноване рекультивування фрагментів НЗ у присутності ЕАГ дозволяло отримати рівень продукції кортизолу після розморожування на 43% вище, ніж при рекультивуванні поодиноких фрагментів НЗ.

Ефективність ксенотрансплантації ОКНЗ новонароджених поросят при комбінації з ЕАГ була досліджена на моделі післяопераційного гіпокортицизма у щурів. Трансплантацію проводили безпосередньо після адреналектомії. Летальність тварин у перші післяопераційні дні складала 15%. В результаті трансплантації у тварин всіх експериментальних груп зникали симптоми гіпокортицизма.

Поява кортизолу в крові реципієнтів була виявлена вже на 7 добу. На 20 добу після трансплантації в комбінації з ЕГ усі використані види тканини НЗ (фрагменти НЗ до та після кріоконсервування, органотипова культура), значно краще компенсували глюкокортикоїдну недостатність в порівнянні з монотрансплантацією.

Слід підкреслити, що у щурів основним з 11-оксикортикостероїдів, які циркулюють в крові, є кортикостерон, а у свиней - кортизол. Тому наявність кортизолу в сироватці крові слід розглядати як функцію трансплантата НЗ новонароджених поросят. Рівень кортизолу на досліджуваному терміні після монотрансплантації зростав до 82,5 нмоль/л (у випадку трансплантації нативних фрагментів), 115,66 нмоль/л (у випадку трансплантації органотипової культури) та 46,6 нмоль/л (у випадку трансплантації кріоконсервованих та рекультивованих фрагментів). Комбінована трансплантація з використанням ЕАГ дозволила підвищити ці показники відповідно на 34, 42 та 94% в порівнянні з монотрансплантатом.

Гістологічний аналіз трансплантатів показав, що характерною особливістю монотрансплантатів тканини НЗ була чітко виражена некротична реакція клітин, що знаходяться всередині фрагмента. Некроз був виражений не тільки на більш пізніх строках після трансплантації, але вже на 7 добу. При комбінованій трансплантації з ЕАГ не спостерігається некротичних зон, клітини розташовуються рівномірно по об'єму тканини, більшість з них знаходиться в функціонально активному стані. Це свідчить про чутливість клітин наднирників новонароджених донорів до регуляторно-метаболічних факторів саме неонатального періоду, що є підставою для використання тканини НЗ та гіпофіза у комбінованих культурах і для сумісної трансплантації.

4. Гормонопродукуючий потенціал кріоконсервованої ОКПЗ при комбінованому культивуванні та комбінованій трансплантації

При дослідженні функціональної активності ОКПЗ після кріоконсервування з використанням 10% ДМСО та швидкості охолодження 1С/хв за методом (Б.П. Сандомирський, 2000) було встановлено, що відразу після відігрівання і видалення кріопротектора ОКПЗ втрачала частину гормонопродукуючої здатности, однак рекультивування протягом 2 діб приводило до відновлення секреції інсуліну ОКПЗ.

Відомо, що постнатальна підшлункова залоза (ПЗ) за стандартних умов органотипового культивування практично повністю втрачає ацинарні клітини внаслідок аутолізу (L. Murrell, 1975). Культивування в присутності природних (гідрокортизон, кортикостерон) або синтетичних (дексаметазон) глюкокортикоїдів дозволяє зберегти екзокринний компонент ПЗ з нормальною функцією секреції амілази та інших ферментів (R. McEvoy, 1980). Однак відомо, що підвищений рівень глюкокортикоїдів може індукувати інсулінову резистентність і, як наслідок, інтолерантність до глюкози (R. Rizza, 1982). Враховуючи дані факти, ми перевірили морфофункціональний стан ОКПЗ новонароджених поросят при комбінованому культивуванні з ОКНЗ.

З даних випливає, що комбіноване культивування з ОКНЗ приводило до прогресуючого зменшення секреції інсуліну культурою ПЗ. Між секрецією контрольної культури і культури, комбінованої з ОКС, значних і вірогідних відмінностей не спостерігалось. Для виявлення ефекту комбінованого культивування на функціональний стан ацинарного компонента в органотиповій культурі ПЗ ми вимірювали рівень -амілази. Встановлено, що рівень ферменту після 1 доби культивування є дуже високим, однак це обумовлюється не активністю ацинарних клітин, а, скоріш за все, їх лізисом і руйнуванням зимогенових гранул. На 2 добу після заміни живильного середовища рівень ферменту в монокультурі ОКПЗ різко зменшується і продовжує падати в процесі культивування. У комбінованих культурах зниження вмісту -амілази відбувається протягом 2 діб культивування, а вже на 4 добу спостерігається деяке його підвищення.

...

Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.