Патогенетичне обґрунтування застосування спрямованої індукції апоптозу та супровідної терапії для підвищення ефективності променевого лікування онкологічних хворих

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 616.24-006.6-031.14-036.8

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Патогенетичне обґрунтування застосування спрямованої індукції апоптозу та супровідної терапії для підвищення ефективності променевого лікування онкологічних хворих

14.03.04 - патологічна фізіологія

Пушкар Сергій Миколайович

Харків-2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківській медичній академії післядипломної освіти МОЗ України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН і АМН України, заслужений діяч науки і техніки України Резніков Олександр Григорович, ДУ “Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України” (м. Київ), завідувач відділу ендокринології репродукції та адаптації;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Коляда Тетяна Іванівна, ДУ ”Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова АМН України” (м. Харків), завідувач лабораторії клінічної імунології та алергології;

доктор медичних наук, доцент Березнякова Марина Євгеніївна, Національний фармацевтичний університет МОЗ України (м. Харків), професор кафедри клінічної лабораторної діагностики.

Захист відбудеться 09.10.2008 року об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському національному медичному університеті (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий 08.09.2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук, доцент О.Ю. Степаненко.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Глобальне стійке зростання захворюваності на злоякісні новоутворення, висока смертність від них, у тому числі в 47 % випадків - людей працездатного віку, стають очевидними при ознайомленні із статистичними матеріалами, що регулярно публікуються Міжнародним агентством з вивчення раку (Parkin D.M. et al., 2001; 2002), і даними Національного ракового реєстру України (Канцер-реєстр України, 2005; 2006; 2007). При цьому рак грудної залози (РГЗ) займає перше місце в структурі онкологічних захворювань серед жіночого населення не лише в Україні, але і в усіх економічно розвинених країнах світу. В середньому РГЗ складає 58,8 випадків на 100000 жіночого населення, смертність же в Україні від цієї недуги досягає 27,0 осіб проти 17,9 на 100000 жінок в світі.

При первинно неоперабельних місцево поширених пухлинах реальна допомога хворим може бути надана шляхом проведення променевої терапії (ПТ) (Дарьялова С.Л., 1999; Мардынский Ю.С., 2004). Проте майже половина всіх видів злоякісних новоутворень є радіорезистентною (Голдобенко Г.В., Канаев С.В., 2000). Проблема радіорезистентності пухлин має принципове значення, оскільки не лише обмежує лікувальний ефект, але і є причиною, яка сприяє виникненню рецидивів і метастазів.

Подолання радіорезистентності пухлинних клітин, підвищення ефективності ПТ є однією з актуальних проблем сучасної онкології. На цей час розроблені різні методи радіомодуляції, мета яких - посилення деструктивних процесів у пухлині. У клінічній практиці часто вживаються різні режими управління радіаційним полем для створення підвищеної концентрації радіаційної дози в зоні пухлини; ряд методів селективної радіомодифікації пухлини - за допомогою гіпербаричної оксигенації, гіпертермії, короткострокової індукованої гіперглікемії, електронноакцепторних сполук, щільноіонізувальних випромінювань, в тому числі швидких нейтронів, та ін. (Павлов А.С. та ін., 1986; Ярмоненко С.П., 1995; Голдобенко Г.В., Канаев С.В., 1997; Циб А.Ф. та ін., 2003).

На жаль, не всі із загальновизнаних на даний час способів ПТ і підходів в подоланні радіорезистентності пухлин забезпечують очікуваний результат, підтвердженням чого є високий відсоток метастазування, рецидивування, пролонгації пухлинного процесу (Даценко В.С., 1990).

Найбільш перспективним напрямом досліджень з метою підвищення ефективності ПТ злоякісних новоутворень є дослідження з селективного управління радіочутливістю пухлинної тканини із використанням фармакологічних радіомодифікаторів (5-фторурацил, гідроксисечовина, кселода, капецитабин, цисплатин, таксани). Радіомодифікувальний і цитотоксичний ефекти цих препаратів призводять до загибелі пухлинних клітин (ПК) шляхом апоптозу (Frings S. 1998; Keys H.M. et al., 1999; Milas L. et al., 1999; Іванкова В.С., 2002;).

У рецепторно незалежних шляхах апоптозу центральне місце належить цитотоксичному ліпіду - цераміду (Ц). Апоптозній загибелі клітин передує накопичення в них Ц (Hannun I.A. et al., 1995; Барабой В.А. та ін., 2001), у тому числі і після дії іонізувального випромінювання на радіочутливі ПК (Haimovitz-Fridman A. et al., 1994). З порушенням в ПК різних ланок обміну Ц зв'язують явища множинної резистентності до дії ліків і радіації (multidrug resistance) (Liu Y.Y. et al., 1999, 2001; Radin N.S., 2002).

Все це підкреслює високу актуальність подальшого глибокого вивчення механізмів обміну Ц, особливостей обміну і накопичення різних видів сфинголіпідів (СФЛ) в злоякісній пухлині та зв'язок цих процесів з радіочутливістю ПК.

Особливого значення при цьому набувають дослідження, спрямовані на пошук речовин, які індукують церамідний шлях апоптозу.

ПТ злоякісної пухлини негативно впливає на стан гомеостатичних систем організму, порушення в яких відіграють найважливішу патогенетичну роль в розвитку променевих ушкоджень, а також можуть істотно впливати на кінцеву ефективність протипухлинних заходів у вигляді розвитку рецидивів і метастазування. Тому останнім часом почали більше уваги приділяти супровідній терапії, спрямованій на корекцію імунних, метаболічних, гемокоагуляційних і інших видів гомеостатичних розладів (Михалевич О.Д., Горожанская Е.Г., 1994; Воронцова Л.Л., Каширин В.А., 2004).

В цілому проблема пошуку нових способів і радіомодифікаторів, здатних селективно модулювати апоптоз, зокрема церамідний шлях апоптозу, а також пошуку засобів і методів, що коригують гомеостатичні порушення, які виникають в процесі протипухлинної терапії, є актуальною, а її вирішення є реальним резервом підвищення ефективності лікування онкологічних хворих.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до планів науково-дослідних робіт кафедри онкохірургії і онкогінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України і ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України» і є самостійним фрагментом в рамках науково-дослідної роботи кафедри і складовою комплексної теми “Пошук шляхів направленої індукції апоптозу для обґрунтування та розробки нових технологій променевої терапії злоякісних пухлин” (АМН.03.01), номер державної реєстрації 0101U000188, 2001-2004 рр.

Мета дослідження - патогенетичне обґрунтування використання направленої індукції церамідного шляху апоптозу, а також введення в курс комбінованого антибластомного лікування коригувальної супровідної терапії на основі виявлення закономірностей ряду гомеостатичних порушень в динаміці променевої терапії з індуктором апоптозу таксотером.

Завдання дослідження. Для досягнення поставленої мети були визначені наступні завдання:

1. Вивчити особливості дії індукторів апоптозу (таксотеру і етопозиду) на експресію проапоптозних СФЛ в тканинах злоякісних пухлин експериментальних тварин і людини.

2. З'ясувати механізм участі СФЛ в регуляції резистентності ПК до дії променевої терапії без і з радіомодифікаторами в умовах експериментального і спонтанного онкогенезу.

3. Визначити роль церамідного шляху апоптозу в подоланні стійкості ПК до дії іонізувального випромінювання і радіомодифікаторів.

4. Вивчити закономірності змін показників ряду гомеостатичних систем у хворих на РГЗ до лікування і в процесі променевої терапії з таксотером для вибору критеріїв коригувальної супровідної терапії, а саме:

4.1. Стан показників про-антиоксидантної системи.

4.2. Стан ліпідного і ліпопротеїнового спектрів сироватки крові.

4.3. Стан системи гемостазу.

4.4. Вираженість ендогенної інтоксикації.

5. На підставі встановлення закономірностей змін основних показників в системах гомеостазу розробити схему супровідної терапії для метаболічної корекції гомеостазу у хворих на РГЗ в процесі променевої терапії з таксотером.

6. Провести аналіз рівня апоптозу і променевого патоморфозу в ПК при променевій терапії з індуктором апоптозу таксотером.

Об'єкт дослідження - підвищення ефективності променевого лікування онкологічних хворих.

Предмет дослідження - патогенетичне обґрунтування використання направленої індукції апоптозу за церамідним шляхом і супровідної терапії.

Методи дослідження - патофізіологічні, клініко-лабораторні і інструментальні, біохімічні, коагулологічні, імунологічні, радіоізотопні, гістологічні, електронно-мікроскопічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Проведене комплексне експериментально-клінічне вивчення механізмів індукції церамідного шляху апоптозу, механізмів синтезу і накопичення проапоптозного ліпіду Ц в пухлині, впливу кількісного вмісту Ц на вираженість апоптозу і можливості використання медикаментозних радіомодифікаторів таксотеру і етопозиду для селективного управління радіочутливістю.

Експериментально встановлено, що цитостатики таксотер і етопозид в умовах in vivo сприяють більш ніж трьох- і п'ятиразовому (відповідно) збільшенню в радіорезистентних клітинах пухлини Герена вмісту проапоптозного ліпіду Ц, що дозволяє застосовувати ці препарати як радіомодифікатори.

Встановлено, що механізм подолання радіорезистентності ПК карциноми Герена при використанні таксотеру і етопозиду в якості радіомодифікаторів спільно з локальним рентгенівським опроміненням пухлини пов'язаний з істотним (у 4 і майже в 6 разів відповідно) підвищенням в них синтезу і накопичення Ц.

Вперше шляхом визначення активності синтезу окремих фракцій СФЛ за допомогою радіоактивного попередника - ¹⁴С-пальмітинової кислоти -показані різні механізми накопичення Ц в ПК при дії таксотеру і етопозиду. Зростання вмісту Ц і індукції апоптозу при введенні таксотеру здійснюється за рахунок синтезу Ц de novo; при введенні етопозиду накопичення Ц відбувається не лише за рахунок його синтезу de novo, але і в результаті перетворення СФЛ на Ц і зниження рівня деградації Ц, про що свідчить низький вміст сфінгозину. пухлинний апоптоз церамідний

Вперше експериментально встановлено, що надмірне підвищення синтезу і накопичення проапоптозного СФЛ цераміду в ПК при введенні етопозиду супроводжується незначною активацією (на 25%) синтезу пропроліферативного ліпіду - глюкозилцераміду (ГЛЦ), як компенсаторною відповіддю на підвищену апоптозну загибель клітин. Високий показник співвідношення Ц/ГЛЦ в ПК порівняно з контролем свідчить про превалювання апоптозної спрямованості дії етопозиду.

Вперше в клітинах пухлини хворих на РГЗ показана активація церамідного шляху апоптозу під впливом радіомодифікації таксотером.

Вперше розроблено і впроваджено в клінічну практику метод неоад'ювантної ПТ з толерантними дозами таксотеру при первинно неоперабельному РГЗ, що забезпечує високий ступінь редукції пухлини, можливість переведення пухлини в операбельний стан, а також дозволяє знизити рівень катаплазії ПК, що, можливо, збереглися.

Вперше встановлені закономірності змін ряду систем гомеостазу (про- і антиоксидантної, гемостатичної, ліпідного обміну, вираженості ендотоксемії) у хворих на РГЗ до і на тлі ПТ з радіомодифікатором таксотером, що дозволило розробити патогенетично обґрунтовану супровідну терапію для попередження і корекції гомеостатичних розладів.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані нові наукові дані про механізми дії радіомодифікаторів таксотеру і етопозиду на активацію церамідного шляху апоптозу дозволили дати патогенетичне обґрунтування і розробити метод неоад'ювантної ПТ з толерантною дозою таксотеру при комбінованому лікуванні хворих з первинно неоперабельним РГЗ. На метод ПТ з індукцією апоптозу таксотером отримано патент. Метод впроваджений в клінічну практику. Патогенетично обґрунтовано і впроваджено в практику клінічної медицини метод супровідної терапії із застосуванням препаратів природного (тваринного і рослинного) походження для запобігання і корекції розладів гомеостазу при ПТ з таксотером.

Розроблені методи променевого лікування з цілеспрямованою індукцією апоптозу ПК толерантними дозами таксотеру і супровідної терапії впроваджені в практику відділень променевої терапії і маммології Харківського обласного клінічного онкологічного диспансеру і клініки ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України».

Теоретичні положення про механізми церамідного шляху апоптозу в експерименті in vivo і у хворих на РГЗ включені в навчальний процес кафедр патологічної фізіології і онкології Харківського національного медичного університету, кафедр патологічної фізіології Донецького, Дніпропетровського і Луганського медичних університетів, кафедри онкологічної гінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти. На підставі отриманих патентів на спосіб ПТ з індукцією апоптозу таксотером і на спосіб супровідної терапії при комплексному лікуванні РГЗ написані рекомендації для практичних лікарів стаціонарів онкологічного профілю.

Гіпохолестеринемію, гіпертригліцеридемію, зростання рівня ЛПВЩ і явища гіперкоагуляції можна розглядати як несприятливі прогностичні ознаки протікання онкологічного процесу.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним дослідженням. Автором самостійно виконано планування і організацію досліджень, розроблено протоколи і методологію досліджень, проведено патентно-інформаційний пошук за темою, виконано експерименти і клінічну частину роботи, проведено аналіз і узагальнення отриманих результатів, сформульовано основні положення і висновки, розроблено схеми неоад'ювантної ПТ з таксотером і супровідної терапії, яка попереджає і корегує гомеостатичні розлади, самостійно написані всі розділи дисертації.

Визначення обміну і накопичення СФЛ проведено за допомоги зав. відділом фізіології онтогенезу НДІ біології Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна, д.б.н., професора Н.А. Бабенко, якій автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дослідження апробовані на конференціях, з'їздах і конгресах республіканського і міжнародного значення: Українському конгресі радіологів “Україна-2000” (Київ, 2000); ІI з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); Х з'їзді онкологів України (Київ, 2001); Міжнародній науковій конференції "Нові технології в медичній радіології" (Санкт-Петербург, 2001; 2003); IV Міжнародному конгресі "Паліативна медицина і реабілітація в охороні здоров'я" (Кріт, 2002); Науково-практичній конференції “ОНКОЛОГІЯ - XXI” (Київ, 2003); III з'їзді онкологів країн СНД (Мінськ, 2004); Науково-практичній конференції “Цитологічна і клінічна діагностика пухлин грудної порожнини і молочної залози” (Київ, 2004); IV з'їзді онкологів і радіологів країн СНД (Баку, 2006); ХІ з'їзді онкологів України (Судак, 2006); Науково-практичній конференції УТТРО “Актуальні питання комбінованих методів в онкології” (Одеса, 2006); Науково-практичній конференції УТТРО “Актуальні питання променевої терапії” (Харків, 2007); а також на засіданні Харківського товариства патофізіологів (2008) та спільному засіданні кафедр онкологічної гінекології Харківської медичної академії післядипломної освіти та патологічної фізіології Харківського національного медичного університету (2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 42 роботи, з них 21 стаття в спеціалізованих журналах, що входять до переліку провідних фахових видань, затвердженого ВАК України, 4 статті в інших виданнях, 13 тез доповідей в матеріалах конгресів, з'їздів і конференцій, у тому числі за кордоном, 4 патенти.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 267 сторінках друкованого тексту і складається з наступних розділів: вступ, огляд літератури, матеріали і методи дослідження, 3 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, висновки, практичні рекомендації, перелік використаних джерел літератури, якій містить 424 назви: 146 робіт вітчизняних авторів та 278 - іноземних. Дисертаційна робота ілюстрована 45 рисунками, 34 таблицями (обсяг - 31 сторінка).

Основний зміст роботи

Матеріал і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на 128 щурах-самцях лінії Wistar масою 180-240 г з підшкірно перевитою карциномою Герена (Guerin's carcinoma). Трансплантацію пухлини здійснювали шляхом введення під шкіру 0,5 мл 20 % суспензії клітин пухлини Герена. Експеримент починали, коли розміри пухлинного вузла досягали в діаметрі 2,0-2,5 см.

Відповідно до поставлених завдань щурів-пухлиноносіїв розподілили за групами: 1) локальне рентгенівське опромінення пухлини (10,0 Гр); 2) в/м введення таксотеру «Рен-Пуленк Рорер» (6 мг/кг); 3) в/м введення етопозиду «Ебеве» (5 мг/кг); 4) локальне рентгенівське опромінення пухлини + таксотер; 5) локальне рентгенівське опромінення + етопозид; 6) щури-пухлиноносії - контроль.

Експерименти здійснювали відповідно до правил «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються в експериментальних і інших наукових цілях» (1986) і методичних рекомендацій “Біо-етична експертиза доклінічних та інших наукових досліджень, що виконуються на тваринах” (Резніков О.Г. та ін., 2006).

Для визначення СФЛ в сироватці крові і тканинах використаний метод Блайя і Дайра (1959) з екстракцією ліпідів і розділенням СФЛ на класи (Dolgachev V. еt al., 2004). Кількісний вміст Ц визначали хроматографічно за методом March J.B., Weinstein D.B. (1966). Активність синтезу СФЛ визначали за допомогою міченого попередника - ¹⁴С-пальмітинової кислоти (2,07 Гбк/ммоль; Amersham, G. E. Healthcare, Великобританія). Радіоактивність проб вимірювали на лічильнику ВЕТА.

Вираженість апоптозу і променевого патоморфозу пухлини Герена визначали шляхом морфологічної оцінки на гістологічному і ультраструктурному рівнях за допомогою стандартних методів. Напівтонкі зрізи забарвлювали метиловим синім і підраховували кількість мітозів у полі зору світлового мікроскопа МБІ-6 (окуляр10, об'єктив20, бінокуляр2,5). Ультратонкі зрізи забарвлювали за Рейнольдсом і досліджували під електронним мікроскопом ЕМ-125 (Сумське ВО «Електрон», Україна).

У клінічній частині роботи наведені результати дослідження 122 хворих у віці 37-65 років з місцево поширеним РГЗ, яке проведене на базі Харківського обласного клінічного онкодиспансеру і ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України».

Оцінку ефективності розроблених методів неоад'ювантної ПТ з толерантною дозою таксотеру (I гр. хворих) і супровідної терапії (II гр. хворих) проводили у пацієнток з первинно неоперабельним РГЗ (IIБ-IIIБ ст., Т2-3N0-1M0 - T1-4N0-3M0) (67 хворих). У хворих на ранніх стадіях РГЗ (IIA-IIБ ст., T1N1M0 - T2N0M0) (55 хворих) проводили тільки дослідження закономірностей змін окремих систем гомеостазу. Референтну групу склали 25 практично здорових жінок адекватного віку (донори Харківського обласного центру служби крові).

Для порівняльного аналізу патоморфозу ПК при різних видах антибластомного лікування використаний архів морфопрепаратів професора Т.П. Якимової - патологоанатомічна лабораторія ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор'єва АМН України».

Досліджували закономірності змін показників ряду систем гомеостазу - перекисного окислення ліпідів і антиоксидантної системи, ліпідного обміну, системи гемостазу, а також вираженість ендотоксемії.

Оцінку динаміки онкопроцесу, візуалізацію безпосередніх результатів під впливом запропонованих схем комбінованого лікування проводили з використанням УЗД, а також морфологічних досліджень, останні проводили на матеріалі біопсії.

Методика проведення променевої терапії в класичному режимі хворим на РГЗ IIБ - IIIБ ст. Опромінення проводили на гамма-терапевтичних апаратах РОКУС-АМ, РОКУС-М дрібними класичними фракціями в режимі 2,0 Гр по 5 фракцій протягом тижня за програмою: на область онкологічного вогнища - СОД 60,0 Гр, на аксилярну область - СОД 45,0 Гр, а в разі наявності конгломерату лімфовузлів додавали 20,0 Гр з тим же режимом фракціонування; на над- і підключичну області та на парастернальну зону -СОД 40,0 Гр.

Методика проведення ПТ з толерантними дозами таксотеру хворим на РГЖ IIБ-IIIБ ст. ПТ з таксотером хворі отримували як передопераційну складову частину комбінованого антибластомного лікування. Хворим впродовж всього курсу ПТ 1 раз на тиждень за 24 години до опромінення внутрішньовенно крапельно вводили 20,0 мг таксотеру на 400 мл ізотонічного розчину NaCl (разова толерантна доза). Премедикацію проводили
дексаметазоном перорально 2 рази на день по 8,0 мг (16,0 мг на добу) протягом 3-х діб. Таксотер вводили на 2-гу добу після початку премедикації.

Методика проведення супровідної терапії. Використані препарати тваринного і рослинного походження - Біполан і Карінат, складові яких беруть участь у функціонуванні основних метаболічних систем. Метаболічний і терапевтичний ефекти Біполану зумовлює наявність в ньому фізіологічно важливих протеїнових комплексів, глікополіпептидів, мукопротеїнів, амінокислот, в т.ч. всіх незамінних, інсуліноподібних речовин, уронових і сіалових кислот, вуглеводів у вигляді гексоз, біогліканів; біогенних макро- і мікроелементів (Ca, P, K, Na, Mg, Mn, Fe, Cu, Cr, Zn, I, Se); вітамінів А, Е, РР, С, U і групи В; поліненасичених жирних кислот (Пат. №10463, Губанова А.Г., Пушкар С.М., 1996; Пат. №17362, Губанова А.Г., Пушкар С.М., 1997; Пушкар С.М., 2008).

Фітопрепарат Карінат - екстракт часнику - містить -каротин, вітаміни Е, С. Має антиагрегантні, антитромботичні і імуномодулювальні властивості (Пат. № 2129874, Орехов А.Н., 1999).

Біполан приймали по 12 г (1 десертна ложка) 1 раз на день перед їжею; Карінат - по 1 капсулі 2 рази на день під час їжі. Обидва препарати призначали одночасно впродовж всього курсу ПТ.

Методика морфофункціональної оцінки променевого патоморфозу. Для морфологічного дослідження після оперативного видалення окремі ділянки злоякісної пухлини і лімфатичних вузлів фіксували в 10 % формаліні і після целоїдинової або парафінової проводки гістологічні зрізи забарвлювали гематоксилін-еозином і за методом Ван Гізона. Враховували мікроскопічні ознаки патоморфозу (дистрофічні зміни, мітотичну активність та ін.) (Якимова Т.П., 1986; 1995), а також макроскопічні характеристики.

Ультраструктурні зміни вивчали на ультратонких зрізах видаленої пухлини грудної залози (стандартний метод із забарвленням за Рейнольдсом - Harris J.R., 1991).

Кількісна оцінка апоптозних клітин. Підраховували апоптозний індекс (АІ) - кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу. Депарафіновані гістологічні зрізи промивали фосфатним буфером і забарвлювали барвником Hoechst-33342 (5 мг/мл). За допомогою флюоресцентного мікроскопа підраховували кількість клітин з характерною для апоптозу «структурою» (конденсація ядра, фрагментація ядра і клітин, дискретні апоптичні тіла). Результати виражали в процентному відношенні апоптозно змінених клітин (з фрагментами ДНК, що флюоресціюють) на 100 досліджених клітин в полі зору. Рівень спонтанного апоптозу визначали в матеріалі біопсії нативних пухлин (92 випадки), а індукованого апоптозу - в клітинах видалених пухлин.

Ультразвуковий метод дослідження РГЗ. Для уточнення локалізації процесу, оцінки місцевого поширення пухлини, динаміки візуалізації процесу використовували метод ультразвукової діагностики (апарат для УЗД - Siemens G-50). За даними УЗД оцінювали безпосередні результати протипухлинного лікування - протипухлинний ефект (повна або часткова регресія, стабілізація процесу, прогресування процесу) (Maurel J. et al., 2005).

Методи визначення показників ПОЛ і АО-системи. Визначення показників ПОЛ і АО-системи проводили в плазмі крові і в еритроцитах, використовуючи останні як модель клітини. Про інтенсивність ПОЛ судили за рівнями його стабільних продуктів - дієнових кон'югатів (ДКпл, ДКер), які визначали за методом И.Д. Стальной в модифікації В.И. Львовской (1991), а також малонового діальдегіду за методом Uchiyma M. і Michara M. у модифікації А.И. Карпищенко (1997).

Стан АО-системи оцінювали за активністю АО-ферментів і АО-вітамінів. Активність АО-ферментів визначали: супероксиддисмутази (СОД) - за методом В.О. Костюка із співавт., (1990); каталази (К) - за методом М.А.Королюк (1988); глютатіонпероксидази (ГП) - за А.И. Карпищенко (1997); церулоплазміну (ЦП) - за методом Т.І. Мжельської та ін. (1989). АО-вітаміни визначали: аскорбінову кислоту (Віт. С) колориметричним методом (Сурай П.Ф., Ионов И.А., 1990); Віт. А та Е за методиками I.N. Thompson et al. (1974); П.Ф. Сурай, И.А. Ионова (1990).

Методи визначення ліпідного профілю. Рівень загального холестерину (ЗХ) і тригліцеридів (ТГ) визначали ферментативним методом за допомогою стандартних діагностикумів виробництва фірми Dia System Int., Німеччина. Ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) визначали в супернатанті після осадження ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) і ліпопротеїнів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) за допомогою гепаринмарганцевого реактиву. У пробі супернатанту визначали ЛПВЩ на ФЕК (Рифаман Н. та ін., 1997; Климов А.Н. та ін., 1999). Розрахунок ТГ після послідовної обробки специфічними ферментами проводився за формулою:

ТГ (ммоль/л) = (Е зразка/ Е стандарту) (концентрація стандарту),

де Е - екстинкція вимірюваних проб.

Зміни в системі гемостазу оцінювали за допомогою електрокоагулографічного методу (електрокоагулограф Н-333) (Беляков П.Д. та ін., 1982) з урахуванням наступних структурно-хронометричних параметрів: початок згортання - Т₁ (хв); мінімальна амплітуда (щільність фібринових згустків, що утворилися) - А_О (ум. од). Стан фібринолітичної активності оцінювали за рівнем сумарної і неферментативної фібринолітичної активності (Кудряшов Б.А. та ін., 1978). Для отримання інформації про можливість розвитку ДВС-синдрому використовували паракоагуляційні тести - етаноловий і протамінсульфатний (Карпищенко А.И., 1997).

Методи визначення ендогенної інтоксикації. Вираженість ендогенної інтоксикації встановлювали на підставі визначення в плазмі крові середньомолекулярних пептидів за методами Н.И. Габриэлян і В.Н. Липатовой (1984), Н.И. Габриэлян та ін. (1985) та циркулюючих імунних комплексів (Гриневич Ю.А., Алферов А.И., 1981).

Статистичну обробку проводили за допомогою пакету програм «Statistica» із застосуванням комплексного підходу: числове наведення даних за допомогою описових статистик; порівняння взаємозв'язаних і невзаємозв'язаних груп з використанням методів параметричної і непараметричної статистики (критерії Манна-Уітні, Стьюдента-Фішера, Вілкоксона); методи багатовимірної класифікації (кластерний аналіз); аналіз зв'язків за допомогою коефіцієнтів Пірсона і критеріїв Манна-Уітні, Стьюдента-Фішера, Вілкоксона (Гланц С., 1999).

Результати дослідження та їх обговорення. У виконаних нами дослідженнях показано, що в радіостійких ПК карциноми Герена при рентгенівському опроміненні пухлини спостерігається низьке накопичення проапоптозного ліпіду Ц (4,37±0,74 нмоль/мг білка проти 3,10±0,40 нмоль/мг білка в нативній пухлині) із зниженням активності його синтезу на 35% на тлі дворазового збільшення синтезу апоптознеактивного сфінгомієліну (СФМ).

Обрані як індуктори церамідного шляху апоптозу ПК препарати Таксотер і Етопозид збільшували вміст Ц в пухлинній тканині. При введенні таксотеру маса Ц збільшувалася більш ніж в 3 рази (10,2±1,2 нмоль/мг білка проти 3,10±0,40 нмоль/мг білка, p<0,001). Збільшення маси Ц в пухлинній тканині корелює з підвищенням його рівня в сироватці крові (18,62 нмоль/мг білка проти 6,06±0,48 нмоль/мг білка в контролі, p<0,001). Рівень СФМ в ПК також збільшується і вірогідно (на 40 %) перевищує контрольні показники. Ці дані дозволяють визначити, що накопичення Ц, індуковане таксотером, здійснюється не за рахунок механізму, пов'язаного з активацією сфінгомієліназ, субстратом яких є СФМ, а шляхом синтезу de novo.

При введенні етопозиду вміст Ц зростав більш ніж в 5 разів (17,5±1,90 нМоль/мг білка проти 3,10±0,40 нмольл/мг в контролі), при цьому кількість СФМ залишалася на рівні інтактної пухлини (35,42±12,48 нмоль/мг білка після введення етопозиду проти 30,91±6,50 нмоль/мг білка в контролі).

Для розуміння глибоких механізмів накопичення Ц в клітинах нативної пухлини і при введенні індукторів апоптозу найбільш адекватною є оцінка активності синтезу різних фракцій СФЛ після інкубації гомогенатів пухлини Герена з попередником синтезу СФЛ - [¹⁴С]-пальмітиновою кислотою. Введення щурам-пухлиноносіям етопозиду збільшувало до 140,8 % сумарну активність синтезу СФЛ (120884±2405 і 85852±2680 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1] в групах з введенням етопозиду і з нативною пухлиною відповідно).

Аналіз активності синтезу окремих фракцій СФЛ показав, що етопозид підсилював синтез Ц до 190,3% - 40173±1380 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1], СФМ до 153,3 % - 27760±1031 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1], ГЛЦ до 124,2 % - 21986±790 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1] і не впливав на процес накопичення продукту деградації [¹⁴С]-цераміду - [¹⁴C] сфінгозину (108,3% - 28579±1333 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1] в порівнянні з контролем). Висока активність синтезу СФМ (до 153,3% по відношенню до інтактної пухлини) при низькому рівні накопичення його маси в ПК (до 114,2% по відношенню до інтактної пухлини) підтверджує літературні дані про перетворення СФМ в Ц під впливом сфінгомієліназ, що активувалися (Sawada M. et al., 2000).

Отримані результати дозволили показати різні механізми накопичення Ц в ПК при дії таксотеру і етопозиду. Зростання вмісту Ц при введенні таксотеру здійснюється за рахунок синтезу Ц de novo; при введенні етопозиду накопичення Ц відбувається не лише за рахунок його синтезу de novo, а і в результаті перетворення СФМ на Ц одночасно із зниженням рівня деградації Ц, що підтверджується низьким вмістом сфінгозину (СФЗ). В цілому, цитостатики таксотер і етопозид є потужними індукторами накопичення в тканині пухлини відомого стимулятора апоптозу ракових клітин - Ц, що дозволяє застосовувати ці препарати в якості радіомодифікаторів.

Виявлене незначне, але статистично вірогідне (на 24,2 %) збільшення вмісту пропроліферативного СФЛ - ГЛЦ - на тлі високої активності синтезу [¹⁴С]-цераміду (190 % від норми) і більшого його накопичення в ПК (у 6 разів порівняно з контролем) можна розглядати як фізіологічну реакцію на високий рівень апоптозної церамідзалежної загибелі клітин. Відомо, що збільшення в клітинах синтезу і вмісту Ц супроводжується активацією, поряд із церамідазою, глюкозилцерамідази, яка каталізує перенесення UDP-глюкози на Ц з утворенням ГЛЦ (Bleicher R.J., Cabot M.C., 2002). Ці процеси розглядаються як підтримка певного співвідношення біологічно активних СФЛ (Ц, ГЛЦ), спрямованого на виживання клітини (Lucci A. et al., 1999).

Вивчення метаболічних механізмів, які визначають радіорезистентність і розвиток радіочутливості ПК, проводили в умовах in vivo при локальному рентгенівському опроміненні пухлини Герена (10,0 Гр) на тлі введення радіомодифікаторів. Локальне рентгенівське опромінення пухлини не викликало суттєвого збільшення маси Ц в ПК порівняно з нативною пухлиною (4,37±0,714 та 3,10±0,40 нмоль/мг білка відповідно, p>0,05). Активність синтезу [¹⁴С]-цераміду в ПК навіть пригнічується після дії іонізувальної радіації (21109±524 і 13668±112 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1], p<0,05 - контроль, рентгенівське опромінення). Вміст СФМ знаходився майже на рівні інтактної пухлини (35,8±3,8 проти 30,91±6,50 нмоль/мг білка в інтактній пухлині, p>0,05), а активність його синтезу ([¹⁴С]-сфінгомієлін) - збільшувалася до 182,3 % (34948±953 проти 18464±391 [імп. Ч (хв Ч г тканини)-^-1], p<0,05). У даній ситуації рентгенівське опромінення підсилює як синтез СФМ, так і його деградацію під дією сфінгомієліназ. Рентгенівське опромінення практично не впливало на синтез і утворення інших метаболітів Ц: [¹⁴C]-глюкозилцераміду і [¹⁴C]-сфінгозину (16652±444 проти 17701±521 і 27613±906 проти 28579±1333 [імп. Ч (хв. Ч г тканини)^-1] - ГЛЦ і СФЗ відповідно). Низький рівень синтезу [¹⁴C]-цераміду (Schwander R., et al., 1998) під дією рентгенівського опромінення визначає стабільний, на рівні інтактної пухлини, вміст Ц і решти фракцій СФЛ в опроміненій пухлинній тканині і є однією з найважливіших причин радіорезистентності пухлинних клітин.

Радіомодифікатор таксотер при спільній дії з рентгенівським опроміненням на пухлину Герена підсилював акумуляцію проапоптозного СФЛ - Ц - до 400,4%, а в сироватці крові - до 341,5% відносно контролю (p<0,05). Радіомодифікатор етопозид при опроміненні пухлини Герена сприяв збільшенню синтезу токсичних для клітин СФЛ - Ц до 183,2% і СФЗ - до 120%, що свідчить про підвищення під впливом радіомодифікатора етопозиду чутливості пухлини до дії опромінення. Також визначалося дворазове збільшення синтезу [¹⁴С]-сфінгомієліну (192,8%), а накопичення його маси залишалося на рівні контрольних значень (35,42±12,8 проти 30,91±6,50 нМоль/мг білка в контролі), що демонструє додатковий шлях накопичення Ц - за рахунок ферментативного перетворення СФМ в Ц. Активність синтезу пропроліферативного ліпіду - ГЛЦ - в групі етопозид + рентгенівське опромінення не відрізнялася від такої в групах інтактних і опромінених тварин (p>0,05), і на 10% знижувалася в порівнянні з тваринами, що отримували тільки етопозид, що додатково сприяло пригніченню проліферативної активності клітин. Отримані дані дають підставу стверджувати, що таксотер і етопозид є потужними модуляторами обміну проапоптозних СФЛ в ПК і істотно змінюють відповідь радіорезистентних клітин злоякісної пухлини на дію опромінення.

При морфологічному дослідженні встановлено, що ультраструктура більшості клітин після рентгенівського опромінення пухлини Герена практично не відрізняється від інтактної пухлини, зважаючи на високу її радіорезистентність. Після введення таксотеру в більшості ПК ультраструктура зберігається, але в частині з них з'являються ознаки, що вказують на диференцію цих клітин із зростанням білоксинтетичної активності (розширені профілі шЕПМ, гіпертрофований комплекс Гольджі). Кількість клітин, що мітотично діляться, різко і вірогідно знижується, що підтверджує літературні дані про блокування таксотером ділення клітин на межі G₂ - M фаз клітинного циклу (Tishler R.B. et al., 1992).

На ультраструктурному рівні показано, що в клітинах пухлин, підданих франкціонованому рентгенівському опроміненню на тлі радіомодифікації таксотером, відбувався променевий патоморфоз з фатальними наслідками. Основний об'єм пухлини складала некротизована тканина, а життєздатні клітини спостерігалися у вигляді невеликих скупчень лише довкола судин. Процеси ділення в них вірогідно гальмуються - число мітозів мінімальне (0,33±0,19) як в порівнянні з групою контролю (інтактна пухлина - 1,69±0,47), так і з групою тільки опромінених тварин (1,37±0,26). У частині клітин, що збереглися, визначалися відхилення в ультраструктурі: спотворення форми ядра, наявність в цитоплазмі окремих вакуолей, фагосом, ліпідних крапель, розширених цистерн шЕПМ, явища апоптозу. Картина ультраструктурних змін демонструє, що при дії одного таксотеру основним механізмом ушкодження ПК є блокування клітинного циклу на тлі незначних змін ультраструктури карциноми Герена.

Спільна дія таксотеру і опромінення супроводжується великим накопиченням Ц і СФЗ в ПК із загибеллю більшості з них. У цій ситуації таксотер не лише гальмує процеси ділення, але і виражено сенсибілізує клітини карциноми до дії радіації, що робить їх високорадіочутливими.

Отримані в експерименті дані, які показали велике накопичення Ц, підвищення радіочутливості і високий рівень загибелі ПК під дією радіомодифікатора таксотеру спільно з локальним рентгенівським опроміненням пухлини, дали підставу для розробки методу оптимізації церамідного шляху апоптозу у хворих з місцево поширеним, первинно неоперабельним РГЗ шляхом використання толерантних доз таксотеру на тлі ПТ в неоад'ювантному режимі. Після курсу ПТ з таксотером кількість Ц збільшувалася на 400 % порівняно з такою у хворих, опромінених в тому ж режимі, але без таксотеру, і на 455,0 % - по відношенню до вмісту Ц в інтактній пухлині грудної залози. У сироватці крові вміст Ц перевищує контрольні показники на 90,3 і 68,8% (по відношенню до контролю і до групи з тільки рентгенівським опроміненням). Відповідно більш ніж в три рази АІ підвищувався у хворих після ПТ з таксотером (10,5±0,71%) відносно до нативної пухлини (3,38±0,27%) і в 2,5 разу - відносно до групи з ПТ без таксотеру (4,25±0,41%) (рис. 1).

Рис. 1. Вміст цераміду в тканині пухлини та величина апоптозного індексу у хворих на РГЗ при променевій терапії без та з таксотером.

ПТ з індукцією апоптозу таксотером у хворих з первинно неоперабельним РГЗ за даними УЗД викликала високий рівень «відповіді пухлини на лікування». У 10,5% випадків спостерігалася повна (100%) регресія злоякісної пухлини, 80-95% ефект мав місце у 69,8% пацієнток, і у 19,7% хворих відбувалася часткова регресія (в межах 60-75% об'єму пухлини). Більш ніж у половини хворих (63%), що отримали ПТ + таксотер, мала місце 100 % регресія регіонарних метастазів. ПТ в класичному режимі практично в усіх хворих завершувалася «частковою регресією пухлини» (50-60% у 95% хворих).

Післяопераційне гістологічне дослідження показало, що ПТ з таксотером збільшує показники променевого ушкодження клітин, що збереглися. Це виражається у вірогідному зниженні мітотичного індексу: він в 2 рази менше, ніж в нативній пухлині, а також на 25 % - в порівнянні з мітотичним індексом в контрольній групі. При індукції апоптозу таксотером кількість патологічних мітозів і ступінь дистрофічних змін ПК значно (у 1,5 і 3 рази відповідно) збільшувалися в порівнянні як з групою, де застосовувалася тільки ПТ, так і з нативною пухлиною. На тлі ПТ з таксотером клітинні стромальні реакції зменшуються щодо показників в перших двох групах (нативні пухлини і пухлини після фракціонованого опромінення), що свідчить про зниження бар'єрних функцій ложа пухлини.

Ця обставина створює сприятливі умови для проникнення в пухлину циторедуктивних препаратів, що підтверджується дуже низьким рівнем мітотичного індексу з великою часткою патологічних мітозів і високими показниками редукції пухлинної тканини (75-100 %) у хворих, в схему ПТ яких вводили таксотер. Гістіоцитоз синусів лімфатичних вузлів був найвищим у хворих, які отримали ПТ з таксотером (2,16±0,15 проти 1,41±0,17 ум. од. у нативній пухлині), що може бути свідченням активації імунної системи і ушкоджень пухлинної тканини.

Якісна характеристика широкого діапазону морфофункціонального патоморфозу отримана за допомогою ультраструктурних досліджень. У зонах регресії на місці новоутворення серед волокон фіброзної тканини визначаються лише залишки зруйнованих ракових клітин у вигляді невеликих електроннотемних структур. Серед структурно збережених клітин більшість нежиттєздатна (темні пікнотичні ядра, вакуолізація цитолазми з накопиченням в ній мікрофіламентів, білкової рідини або багаточисельних кристалів солей кальцію). Таким чином, літературні дані (Sathishkumar S. et al., 2005; Chan S.Y.et al., 2006) і результати нашої роботи дозволяють зробити висновок, що продукція і накопичення ендогенного Ц в пухлинній тканині, індуковані таксотером, є важливим стимулом апоптозного сигнального каскаду, з антипроліферативним ефектом на ракові клітини грудної залози, і, тим самим, однією з найважливіших причин подолання їх резистентності до дії ПТ.

При вивченні стану ряду ланок гомеостазу, що відображають характер метаболічних процесів, які протікають в організмі (про- і антиоксидантної систем, ліпідного обміну, гемостазу, проявів ендогенної інтоксикації), встановлено, що початкові зміни в указаних системах у хворих на РГЗ були тісно пов'язані зі стадією розвитку пухлинного процесу.

Показники перекисних процесів у хворих на РГЗ середнього ступеня тяжкості (IIA-IIБ ст.) практично не відрізнялися від фізіологічних значень, за винятком збільшення вмісту МДА в еритроцитах більш ніж на 20%. Проте відбувалося вірогідне зниження концентрації Віт. С (на 25 %) і активності ГП (на 20,0%), а також компенсаторне збільшення активності К на 20 %, ЦП на 40 % і концентрації Віт. Е на 16 %. Це свідчить про досить високу напруженість АО-системи і початок виснаження аскорбатної і глютатіон-пероксидазної її ланок. Онкопроцес, навіть на ранніх стадіях, сприймається організмом як окислювальний стрес, і, не дивлячись на компенсаторні зусилля АО-системи, розвивається активація перекисних процесів у всіх клітинах організму (про що свідчить високий показник МДАер).

На відміну від характеру змін ПОЛ у хворих на РГЗ на ранніх стадіях (IIА-IIБ ст.) - з вираженою спрямованістю до активізації ПОЛ, на пізніх стадіях РГЗ (IIБ-IIIБ ст.) мало місце істотне пригнічення інтенсивності первинних і вторинних перекисних реакцій. Це виявлялося зниженням вмісту ДК і МДА як в плазмі крові, так і в еритроцитах від 20,0 до 40,0 % (ДКер - 3,32±1,53 ммоль/л і МДАер - 8,65±2,56 ммоль/л при 5,41±1,13 і 10,30±3,02 ммоль/л в контролі відповідно). Вміст МДА в еритроцитах, що відображає активацію перекисних процесів у всіх клітинах організму, при розвитку онкопроцесу знижується на 16,0 % від норми і на 38,0 % в порівнянні з рівнем у хворих на РГЗ IIА ст. Зниження концентрації молекулярних дериватів ПОЛ відображає продовження росту злоякісної пухлини і активний розпад клітинних структур (Серкиз Я.И. та ін., 1984; Барабой В.А., 1992).

З боку показників АО-системи спостерігалося істотне виснаження у вигляді пригнічення активності АО-ферментів і зниження концентрації АО-вітамінів. Активність АО-ферментів - СОД, К, ГП - знижувалася в середньому на 30-40 %, але активність ЦП, перевищуючи нормальні значення на 19,0 % (218,0 ум. од. проти 182,0 ум. од. у контролі), була на 30 % менше в порівнянні з компенсаторним сплеском активності ЦП на ранніх стадіях РГЗ. Концентрація АО-вітамінів в плазмі крові хворих на пізніх стадіях РГЗ також істотно знижувалася (Віт. С - на 22,6 %, Віт. Е - 16,0 % і Віт. А - на 18,2 %).

В міру прогресування захворювання, збільшення розміру пухлини і кількості метастазів ліпідний склад сироватки крові змінювався у бік зниження рівня ЗХ і його носія ЛПНЩ, що збігається з даними літератури (Vitols S.et al., 1985; Law M.R. et al., 1991; Kritchevsky S.B., 1992). Так, у хворих на РГЗ показники ЗХ і ЛПНЩ знижувалися з 84,9 до 62,9 % і з 77,9 до 32,0% (відповідно) у міру збільшення стадії пухлинного процесу: IIАIIБIIIБ ст. Істотне зниження вмісту ЗХ в сироватці крові пояснюється активним захопленням специфічними мембранними рецепторами ПК метаболітів, які містять холестерин, для побудови мембранних структур злоякісними клітинами, що активно діляться, а також для «захисту» надлишковою кількістю холестерину зовнішньої клітинної мембрани від багатьох хіміопрепаратів і радіації - синдром підвищеної резистентності до дії ліків та радіації (Чехун В.Ф. і ін., 2000). Виявлено закономірне зростання фракції ЛПВЩ, рівень якої при РГЗ IIIБ ст. перевищував норму в 1,3 разу (p<0,05), а також зростання рівня ТГ (гіпертригліцеридемія) і фракції ЛПДНЩ, показники яких при РГЗ IIIБ ст. досягали максимальних значень (майже триразове перевищення норми).

Висока агресивність «ракових прокоагулянтів» викликає розлад в системі гемостазу у вигляді тромбоемболічних ускладнень і розвитку ДВЗ-синдрому (Gordon S.G., 1992; Edwards R.L. et al., 1993). На ранніх стадіях РГЗ розбалансування всіх ланок згортальної системи у 52 % обстежених хворих було направлене на гіперкоагуляцію (прискорення згортання крові майже в 2 рази за відсутності компенсаторного підвищення активності фібринолітичної ланки). У решти пацієнток (48,0%) мала місце гіпокоагуляція при надмірній активації системи фібринолізу (42,34±1,28 ум. од. в порівнянні з 27,62±0,69 ум. од. в контролі). При цьому в обох групах хворих на ранніх стадіях РГЗ виявлялися ознаки ДВЗ-синдрому у підгострій і хронічній стадіях (позитивні паракоагуляційні тести - в 70 % випадків при гіперкоагуляції і в 38,4 % випадків - при гіпокоагуляції). Із зростанням пухлини і збільшенням стадії пухлинного процесу (IIБ-IIIБ ст.) відбувається різке скорочення хронометричних параметрів початкових і кінцевих фаз згортання крові (початкова фаза - Т₁ - скорочувалася на 12,7 %, кінцева фаза - Т - зменшувалася на 32,5 %, p<0,05) на тлі різкого пригнічення системи фібринолізу (показник сумарної фібринолітичної активності знижувався до 62,4 % від норми). Явища паракоагуляції (поява в плазмі крові відсутніх в нормі розчинних фібрин-мономерних комплексів і продуктів деградації фібрину), що свідчать про загрозу розвитку ДВЗ-синдрому, фіксуються у 80 % хворих на пізніх стадіях ракового процесу.

В процесі життєдіяльності злоякісної пухлини збільшуються кількість і спектр метаболітів, багато з яких в нефізіологічних концентраціях мають токсичні властивості, сприяють розвитку загальних клінічних симптомів, які в сукупності з метаболічними порушеннями складають синдром ендогенної інтоксикації. Метаболічні ознаки ендогенної інтоксикації - збільшення концентрацій токсичних метаболітів: СМП, ЦІК, ДКер, МДАер на 36,0; 68,3; 14,9 і 22,3 % в порівнянні з донорським контролем відповідно - передували клінічним проявам; останні практично були відсутні у всіх хворих. На пізніх стадіях РГЗ ендогенна інтоксикація за метаболічними показниками відповідала 2-му ступеню триступеневої класифікації (Фецич Т.Г., 1998; 2003).

Неоад'ювантна ПТ з толерантними дозами таксотеру поряд з вищезгаданим високим лікувальним ефектом була досить сильним індуктором метаболічних порушень гомеостазу. Не дивлячись на усунення чинника пухлини в результаті ПТ з таксотером у хворих на ранніх стадіях РГЗ початково підвищене ПОЛ вірогідно активувалось (на 17,0 і 20,0 % для ДКер і МДАер відповідно). Вірогідне підвищення вмісту ДК і МДА в еритроцитах (на 17,0 і 32,0 % відповідно), які є аналогами клітин інтактних тканин організму-пухлиноносія, свідчило про розвиток загального синдрому пероксидації.

Зростання активності вільнорадикального окислення розвивалося на тлі дефіциту ферментної і вітамінної ланок АО-системи. Активність ключових АО-ферментів - К і ГП - знижувалася майже на третину, а ЦП - наполовину в порівнянні з початковими даними. Вміст АО-вітамінів знижувався по відношенню до норми на 20-50 % (p<0,05). Таке виснаження АО-системи пов'язане як з дією радикалів безпосередньо на активні центри ферментів, так і з великими витратами антиоксидантів на інгібування активованих процесів ПОЛ.

У хворих на РГЗ на пізніших стадіях розвитку ракового процесу (IIБ-IIIБ ст.) дія радіації і цитостатика виявлялася в більш вираженому пригніченні (майже на 50 %) утворення моногідроперекисів (молекул ДК), що може свідчити про максимальне використання резервів поліненасичених жирних кислот в клітинних мембранах. Цей факт підтверджує розвиток значних мембранодеструктивних процесів в пухлинних і інших клітинах організму хворих на пізніх стадіях ракового процесу. Проте, окремі ланки АО-системи характеризувалися стабілізацією і навіть тенденцією до зростання (активність АО-ферментів - СОД і ГП) в порівнянні з початковим рівнем, що можна пов'язати з високим антибластомним ефектом ПТ з таксотером (70-95 % редукції пухлини) і компенсаторним виходом клітинних антиоксидантів. Дисбаланс у вмісті АО-вітамінів поглиблювався - початково низький рівень Віт. С досягав мінімальних значень (61 % від норми) на тлі дефіциту Віт. А і Е, що свідчить не лише про крайню напругу АО-системи, але і про її глибоке виснаження.

Після ПТ з таксотером на тлі значної редукції злоякісної пухлини спостерігалася виражена тенденція до нормалізації ліпідного обміну (відновлення вмісту ЗХ, ЛПВЩ, ЛПНЩ в середньому до 80 % від норми). Залишався високим рівень атерогенних ліпопротеїнів (спостерігалося дворазове перевищення рівня ТГ і ЛПДНЩ). Чинник пухлини впливає на ліпідний обмін, ступінь зміни якого може служити діагностичною, прогностичною ознакою і оцінкою ефективності антибластомної терапії.

Руйнування пухлинної тканини під впливом ПТ з таксотером показало, що зниження впливу чинника пухлини, а значить і значне ослаблення негативного впливу тканинних ракових прокоагулянтів, що продукуються злоякісним новоутворенням, істотно відбивалося на стані гемостазу. Після закінчення курсу ПТ з таксотером коагуляційний потенціал крові обстежених продовжував мати гіперкоагуляційну спрямованість, але вираженість коагуляційних показників значною мірою знижувалася в порівнянні з початковим рівнем. Це проявлялося у вірогідному збільшенні часу початкової (на 20,7 %) і кінцевої (на 15,3 %) фаз згортання крові. Проте зберігалася висока готовність переходу паракоагуляційних процесів в розвиток гострого ДВЗ-синдрому (протамін-сульфатний тест був позитивним у 40,0% обстежених і етаноловий тест - в 66,7% випадків).

Курс ПТ з таксотером у хворих на місцево поширений РГЗ (IIБ - IIIБ ст.) підсилював метаболічні розлади, що відбивалося на збільшенні у 90 % хворих концентрацій ДК, МДА, ЦІК, які відповідали 2-му ступеню ендогенної інтоксикації за метаболічними показниками і 1-му ступеню за гематологічними ознаками.

Продемонстровані наявність і прогресування в безперервній послідовності потенційно негативних змін окислювального гомеостазу: початкові стадії пухлинного процесу пізні стадії злоякісної пухлини променева терапія променева терапія з таксотером, з поступовим виснаженням АО-системи, особливо після курсу ПТ з таксотером, відсутність вираженого відновлення і дисбаланс показників ліпідного обміну, збереження гіперкоагуляційної спрямованості з високою готовністю переходу паракоагуляційних процесів в розвиток гострого ДВЗ-синдрому, високий рівень ендогенної інтоксикації, не дивлячись на масову загибель і девіталізацію ПК після ПТ з таксотером (усунення чинника пухлини), диктують патогенетично виправдану необхідність корекції виявлених ранніх ознак «метаболічного полому» з метою обриву патогенетичного ланцюга і відновлення гомеостазу. При цьому доцільно використовувати препарати, що володіють здатністю включатися в нормалізацію гомеостазу, як виконуючи замісну роль, так і будучи джерелом елементів субстрату метаболічних реакцій. Як засоби фармакологічного захисту в ранній патогенетичній терапії для онкологічних хворих, особливо в період комбінованої терапії, що включає курси ПТ і ПТ з таксотером, доцільно використовувати препарати тваринного і рослинного походження з антирадикальною, антиоксидантною і антикоагулянтною спрямованістю, а також з широким спектром інших біологічних ефектів. У підібраній нами схемі супровідної терапії використані препарати природного походження - Біполан (глікопротеїновий комплекс чорнорморських молюсків) і Карінат (препарат екстракту часнику).