Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Фармакотерапевтична ефективність ліпосомальних препаратів при патологічних станах оксидативного генезу (експериментальне дослідження)

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Останні десятиліття позначились стрімким розвитком технічного прогресу, техногенними катастрофами та зростанням, пов'язаних із цим змін екології і здоров'я людей. Збільшення захворюваності серед населення впливає на демографічні, економічні та соціальні показники розвитку країн. Після Чорнобильської катастрофи в Україні суттєво зросла кількість серцево-судинних та онкологічних захворювань ( Leliuk V.G., Guskova A.K., 1998). Серед уражень кровоносного русла найчастіше спостерігається розвиток гіпертензії, яка погано піддається лікуванню традиційними препаратами (Khomajuk I., 1998; A.I. Soloviev, 2002). До ускладнень радіотерапії у пацієнтів онкологічних клінік теж належать гіпертензія, аритмії, лейкопенія та ін. Хоч для попередження та усунення названих вище небажаних симптомів застосовують різноманітні групи препаратів, все ж ефект від їх застосування, як правило, незначний.

Патологія шлунково-кишкового тракту є не менш розповсюдженою, ніж серцево-судинна. В багатьох країнах до 40 % пацієнтів гастроентерологічного профілю страждають на виразкову хворобу шлунку (Василишин Р.И., 1999; Звягинцева Т.Д. и соавт., 2002), а понад 20% - ураженнями гепатобіліарної системи і щорічно кількість таких хворих збільшується (Москаленко Л.Ф. і співавт., 2000; Т. Лопаткина, Э.Бурневич, 2003). Відзначається також зростання уражень органів шлунково-кишкового тракту, викликаних застосуванням лікарських засобів. Медикаментозні виразки і гепатити часто пов'язані із тривалим застосуванням або передозуванням ліків, зокрема це стосується нестероїдних протизапальних засобів і ненаркотичних аналгетиків, антибіотиків та протитуберкульозних препаратів (Lewis J.H., 1999; А.О. Буеверов, 2002; Радченко В.Г., 2004). Науковими досліженнями доведена провідна роль оксидативного стресу, а саме, активних форм кисню, у розвитку серцево-судинної, гастро-ентерологічної, постпроменевої, опікової патології та багатьох інших захворювань (Гончарук Є.Г., 2004; Гродзинський Д.М., 2000; Asok B.T., Ali R., 1999). Для лікування вище означених патологічних станів застосовують препарати різних фармакологічних груп, що мають етіотропний, патогенетичний або симптоматичний вплив (Дроговоз С.М., 2004; Нейко Є.М., Бабенко О. І., 2002;). Однак, частина препаратів має ряд протипоказів, інші - виражену побічну дію або незначну ефективність (Харченко Н.В., 2001). За останні десятиліття в клініці обгрунтовано зросло застосування антиоксидантів та препаратів, що містять фосфоліпіди (Дроговоз С.М., 1998; Гордиенко А.Д., 2001; Гуревич К.Г., 2004). Перелік сучасних препаратів - антиоксидантів, що зареєстровані в Україні, досить невеликий. До нього входять «еталонні» засоби, такі як токоферол, кислота аскорбінова, неферментативні антиоксиданти (ліпін, кверцетин) та інші. Фосфоліпідні препарати завдяки антиоксидантним, мембраностабілізуючим, протизапальним властивостям є ефективними в якості гепато-, кардіо- та церебропротекторів (О.В. Стефанов і співавт., 1997; Посохова К.А, 1997; Григор'єва Г.С. і співавт., 2005).Тривалий час нерозчинний в воді кверцетин застосовувався у вигляді пігулок або гранул, мав низьку біодоступність, що обмежувало його використання. Включення кверцетину до ліпосом дозволило не тільки суттєво збільшити біодоступність кверцетину, але й розширило можливості застосування його при різних патологічних станах, для корекції яких необхідний препарат з багатовекторною фармакодинамікою, а саме із антиоксидантною, антирадикальною, антигіпоксичною, протиішемічною та мембраностабілізуючою дією. Спроба поєднати властивості кверцетину та фосфатидилхоліну в одному препараті призвела до створення нового лікарського засобу Ліпофлавону, всебічне дослідження якого дає можливість поглибити знання про його ефективність за умов різноманітних патологій і, відповідно, розширити показання до застосування в клініці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі фармакології Івано-Франківського державного медичного університету відповідно до теми «Фармакологічне обгрунтування використання ліпосомального засобу «Ліпофлавон» та протизапального препарату «Амізон» у лікуванні ерозивно-виразкових захворювань шлунково-кишкового тракту та токсичних уражень печінки» (№ 0102V006751 Державної реєстрації). Окремі фрагменти роботи виконані у ДУ “Інститут фармакології та токсикології АМН України”.

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити особливості та ступінь вираженості лікувальних та профілактичних властивостей ліпосомальних препаратів ліпофлавону та ліпіну, визначити риси подібності та відмінності їх дії в залежності від характеру оксидативної патології.

Для досягнення поставленої мети були визначені наступні завдання дослідження:

1. Вивчити дію ліпосомального кверцетину і ліпіну за умов гострої променевої патології при лікувально- профілактичному та лікувальному режимах введення.

2. Дослідити особливості впливу ліпосомального кверцетину на ендотелій-залежні реакції судин та рівень артеріального тиску у тварин після радіоактивного опромінення.

3. Дослідити ефективність ліпосомального кверцетину за умов гострої та субхронічної виразки шлунку при профілактичному, лікувально-профілактичному та лікувальному режимах введення і співставити їх активність з такою еталонних антиоксидантів.

4. Дослідити терапевтичну ефективність ліпосомального кверцетину за умов модельованих токсичних гепатитів різного походження у порівнянні з еталонними антиоксидантами та його вплив на показники ПОЛ і системи АОЗ. Визначити риси подібності та відмінності певних показників за умов різних моделей гепатитів, які найбільш повно характеризують перебіг процесу, відзначити місце ліпосомального кверцетину серед інших антиоксидантів у лікуванні гепатитів різного генезу.

5. Вивчити терапевтичну активність ліпосомального кверцетину та ліпіну за умов термічного пошкодження шкіри.

Об'єкт дослідження. Ліпосомальна форма кверцетину (Ліпофлавон, ЛК) та ліпін за умов експериментальних моделей патологічних станів, в основі патогенезу яких лежить оксидативний стрес.

Предмет дослідження: фармакотерапевтична ефективність та фармакодинаміка Ліпофлавону і Ліпіну за умов опромінення, експериментальних виразок шлунка, токсичних гепатитів, термічного опіку.

Методи досліджень: фармакологічні, біохімічні, електрофізіологічні, гістологічні, електронномікроскопічні, статистичні. Робота проводилась на білих мишах та щурах з врахуванням вимог біоетики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше теоретично і експериментально обгрунтовано доцільність застосування оригінального препарату ЛК при патологічних станах, ключовим ланцюгом патогенезу котрих є оксидативний стрес.

На основі комплексного підходу вперше доведено, що дія ліпосомальних препаратів ЛК і ліпіну реалізується шляхом пригнічення активності ВРО та ефективної регуляції прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. В результаті цього ЛК та ліпін нормалізують стан системи антиоксидантного захисту організму, попереджують формування деструктивно-некротичних процесів у пошкоджених тканинах, проявляють мембранопротекторні ефекти, відновлюють метаболічні процеси за умов обраних для досліджень модельних патологій..

Отримані нові дані щодо радіопротекторних властивостей ЛК і ліпіну. Доведено профілактичну та лікувально-профілактичну та лікувальну ефективність ЛК на моделях гострої та субхронічної виразок шлунку. Вперше детально досліджені гепатопротекторні властивості ЛК, а також його вплив на вміст мікроелементів у тканинах печінки за умов парацетамолового гепатиту. На основі статистичного аналізу вперше доведено, що ЛК може слугувати препаратом вибору при лікуванні токсичних гепатитів різного походження. Вперше також доведено, що ДК і АлАТ можуть бути використані в якості маркерів для визначення важкості перебігу гепатиту і диференційованого лікування. Вивчена також репаративна активність ЛК і ліпіну при термічних опіках шкіри.

У проведених вперше порівняльних дослідженнях знайдено риси подібності та відмінності впливу ЛК та референтних препаратів на процеси ПОЛ, функціональну активність системи АОЗ, доведено переваги ЛК перед референтними препаратами, як при лікувально-профілактичному, так і при лікувальному режимі введення, в якості радіо-, гастро-, гепатопротекторного засобу, засобу лікування опікової хвороби.

Одержано нові дані щодо впливу іонізуючої радіації на ендотеліальну функцію та здатності ліпосомального кверцетину зменшувати амплітуду вазоконстрикторних реакцій, що розвинулись внаслідок впливу іонізуючої радіації на ендотелій судин, з попередженням розвитку післяпроменевої гіпертензії.

Практичне значення отриманих результатів. Експериментально обгрунтований підхід до фармакотерапії захворювань різної етіології, які супроводжуються порушенням окисного гомеостазу (променева патологія, виразкова хвороба, токсичні гепатити різного походження, термічні опіки), що дозволяє значно розширити спектр нових показань до використання ліпосомального кверцетину і ліпіну. На основі даних поглибленого статистичного аналізу можна рекомендувати визначення ДК і АлАТ для діагностики важкості процесу і контролю лікування за умов гепатитів різного генезу. Отримані в роботі дані є експериментальним обгрунтуванням можливості і доцільності застосування препаратів ліпофлавон та ліпін за новими показаннями з метою оптимізації фармакотерапії патологічних станів та захворювань з порушенням прооксидантно-антиоксидантної рівноваги.

Матеріали досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології та клінічної фармакології ряду медичних та фармацевтичних ВУЗів України.

За матеріалами дисертації підготовлено три інформаційні листи про нововведення в системі охорони здоров'я з питань нових підходів до фармакотерапії захворювань.

Особистий вклад дисертанта. Автор самостійно провела патентно-інформаційний пошук з використанням серверів Yandex, Rambler, Medline, аналіз даних літератури за темою дисертації, експериментальні дослідження, статистичну обробку даних, аналіз і систематизацію отриманих результатів, сформувала висновки. Разом із науковим консультантом була розроблена програма, визначені мета і завдання досліджень, методичні підходи до експериментальних досліджень. Окремі серії біохімічних досліджень проведені за консультативної допомоги співробітників кафедри біоорганічної та медичної хімії Івано-Франківського Державного медичного університету, гістоморфологічних та електронно-мікроскопічних - із співробітниками кафедри патологічної анатомії та гістології того ж університету, електрофізіологічних - в лабораторії експериментальної терапії ДУ “Інститут фармакології та токсикології АМН України”.

В наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом подані результати власних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися й одержали позитивну оцінку на: II Міжнародній науково-практичній конференції «Гепатопротектори в Україні - реалії і перспективи» (м. Харків, 2003), Всеукраїнській науково-практичній конференції «Нові вітчизняні розробки лікарських засобів для гастроентерології» (м. Харків, 2004), на ІV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання фармакології» (м. Вінниця, 2004), на Х Конгресі світової федерації українських лікарських товариств (м. Чернівці, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок (м. Тернопіль, 2004), Ювілейному з'їзді Всеукраїнського Лікарського Товариства (м. Івано-Франківськ, 2005), II науково-практичній конференції з міжнародною участю «Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів» (м. Чернівці, 2005), Третьому Національному з'їзді фармакологів України (Одеса, 2006), Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання фармакології» (Вінниця, 2007), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Досягнення та перспективи клінічної фармакології” (Вінниця, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 33 наукові роботи, з них 23 статті в наукових спеціалізованих журналах, затверджених ВАК, а також 9 тез доповідей на наукових форумах різних рівнів, опубліковано 3 інформаційні листи. Отримано 1 патент України на корисну модель.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 343 сторінках машинопису та складається з вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали і методи досліджень”, чотирьох розділів власних досліджень, розділу «Аналіз результатів досліджень», висновків, рекомендацій, переліку використаних літературних джерел та додатку. Дисертація містить 117 рисунків (в тому числі світло-оптичних та електронно-мікроскопічних фотографій) і 54 таблиці. Бібліографія містить 452 джерела, з яких 282 вітчизняних та 170 іноземних.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експерименти проведено на 580 білих щурах нелінійних та лінії Вістар та 180 білих мишах лінії BALB/C. Тварини перебували на стандартному раціоні віварію та одержували їжу і питво ad libitum. В експериментах використано ін'єкційну форму ліпофлавону (ліпосомального кверцетину) у вигляді ліофілізованого порошку у флаконах («Біолік», Україна); ін'єкційну форму ліпіну у вигляді ліофілізованого порошку у флаконах («Біолік», Україна); розчинником слугував розчин натрію хлориду 0,9% виробництва ..... В якості референтних препаратів, залежно від модельованої патології, були використані: a-токоферолу ацетат, 10 % олійний розчин (ICN Pharmaceuticals АО "Октябрь", Росія); силібор в таблетках, вкритих оболонкою по 0,04 г («Здоров'я», Україна); тіотриазолін розчин для ін'єкцій 1% («Галичфарм», Україна); кверцетин в гранулах по 2 г у пакетах ("Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод", Україна). Всі препарати, які були обрані в якості референтних мають антиоксидантні властивості і застосовуються в клінічній практиці для лікування аналогічних модельованим патологій. Використання ліпіну і кверцетину дало можливість з'ясувати вклад кожного із складників ліпофлавону у здійснення його фармакотерапевтичного ефекту. Дозування ЛК, за умов певної модельованої патології, 10 мг/кг, 30 мг/кг, 60 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг (відповідно 0,3 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3,5 мг/кг і 5 мг/кг за кверцетином). Дослідження протипроменевої ефективності ЛК і ліпіну проводили трьома серіями експериментів. Всіх тварин опромінювали одноразово в середньолетальній дозі (6,2 Гр). У першій серії експериментів за тваринами спостерігали щоденно протягом 30-ти діб та вивчали показники виживання, середньої тривалості життя загиблих тварин, частоти розвитку характерних постпроменевих синдромів - кишкового та кістково-мозкового. У другій групі експериментів спостереження проводилось теж протягом 30-ти діб, але евтаназію частини тварин (під легких ефірним наркозом, шляхом декапітації) проводили на 10, 21 і 30 добу після опромінення та вивчали показники клітинного складу периферійної крові та кісткового мозку, робили відбір тканин тонкої кишки для гістологічного та електронно-мікроскопічного дослідження. Третя група дослідів була проведена для вивчення антиоксидантної дії ліпосомальних препаратів. У цій серії експериментів евтаназію тварин під легким ефірним наркозом шляхом декапітації проводили на 10 добу після опромінення та відбирали кров для визначення вмісту первинних і вторинних продуктів ПОЛ (ДК та ТБК-АП; Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977), активності церулоплазміну (Бабенко Г.О., 1968) каталази (Мамонтова Н.С. и соавт., 1994) і СОД (Е.Е. Дубинина и соавт. 1992). Вивчення впливу ЛК за умов пострадіаційного пошкодження серцево-судинної системи здійснювали шляхом дослідження ефектів ЛК на скоротливу активність судинних препаратів, одержаних від опромінених та інтактних тварин, при додаванні в інкубаційну камеру норадреналіну та ацетилхоліну (А.И. Соловьев и соавт., 1992). Реєстрація скоротливої активності ізольованих судинних препаратів проводилась в ізометричному режимі за допомогою ємнісних датчиків напруження. Запис скоротливої активності ізольованих судинних препаратів здійснювали на папері в прямокутній системі координат за допомогою багатоканального фізіографа «Cole Parmer» (США). Вимірювання систолічного артеріального тиску у хвостовій артерії проводили за допомогою комплексу Sphygmomanometer S-2 (HSE, Німеччина). Противиразкова активність ЛК вивчалась на моделях гострої преднізолонової та підгострої аспіринової виразок шлунку за загальноприйнятими методиками (Зупанець І.А. і співавт., 1998). Тварин евтаназували шляхом декапітації під ефірним наркозом; шлунки вилучали для макро- і мікроскопічного дослідження (Меркулов Г.А., 1969). Активність процесів ПОЛ (ТБК-АП і ДК) досліджували в сироватці крові. Вивчення гепатопротекторної дії ЛК проведене на моделях етанолового, тетрахлорметанового, парацетамолового, тетрацикліновогго та ізоніазидового гепіатитів (Стефанов О.В. і співавт., 2001). Ефективність лікування досліджуваним засобом та референтними препаратами оцінювали за наступними показниками: летальність та масовий коефіцієнт печінки; стан прооксидантно-антиоксидантної системи за вмістом ДК, ТБК-АП, ЦП, КТ, СОД в сироватці крові; активність маркерів цитолізу та холестазу - АсАТ і АлАТ, ЛФ; стан синтезуючої функції за кількістю загальних білків, ліпідів, холестерину в сироватці крові та глікогену в печінці; інтенсивність детоксикуючої функції - за тривалістю гексеналового сну. Крім того, за умов парацетамолового гепатиту вивчали вміст мікроелементів у печінці методом атомно-абсорбційного вимірювання на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115.ПК. Після виведення тварин з експерименту і відбору зразків тканин для дослідження частинки органів промивали і фіксували у формаліні, далі готували парафінові блоки. Гістоструктуру печінки досліджували після зафарблення гематоксиліном та еозином і за методом Маллорі (Меркулов Г.А., 1969) за допомогою бінокулярного мікроскопа Olympus CH 20 і фотографували фотоапаратом Nikon E 4500 Coolpix 4500. Для дослідження ультраструктури тканин тонкої кишки і шлунку після опромінення та печінки, з модельованими гепатитами, робили зрізи ультрамікротомом УМТП-6м і «TESLA BS-492» для наступного вивчення під електронним мікроскопом марки ЕМ-100 АК з прискорюючою напругою 75 кВ та фотографували при збільшенні 2000 - 25 000 разів (Гайер Г., 1974). Для вивчення репаративної активності ЛК при термічних опіках на попередньо депiльовану поверхню спини щурiв під ефірним наркозом накладали марлевий тампон, розмiром 2х3 см, змочений 3 мл етанолу, i пiдпалювали (тривалiсть горiння -30 секунд). Навколо тампону накладали зволожену у водi серветку, чим забезпечували стандартну площу опiку 2-3А ступеню. Ефективнiсть лiкування оцiнювали згiдно з динамiкою раневого процесу: час вiдторгнення струпу i появи грануляцiй, площа рани. Площу ран визначали в мм² за допомогою прозорої плівки з міліметровою сіткою. Дослідження окремих гематологічних показників проводили на 7 та 28 добу, для чого брали периферійну кров з хвостової вени. Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програм Origin, Statistica та Exel на персональному комп'ютері. Вірогідність отриманих результатів оцінювали, використовуючи критерій t Стьюдента, коефіцієнт Фішера, дисперсійний, дискримінантний, факторний та кластерний аналізи.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Пострадіаційні пошкодження тканин організму пов'язані зі значною кількістю активних форм кисню (АФК), які утворились внаслідок радіолізу води та ліпідних радикалів, котрі є продуктом взаємодії кисневих радикалів з фосфоліпідами, ненасиченими жирними кислотами та ін. Оскільки «жертвою» ВРО за участю АФК є фосфатидилхолін, як головний компонент біологічних мембран, то ми вважали за доцільне дослідити активність ЛК і ліпіну при гострому постпроменевому ураженні. Дослідження проводили в декілька етапів. На першому етапі вивчали показники, що характеризують виживання тварин в умовах опромінення середньолетальною дозою: виживання до 30 доби, середню тривалість життя (СТЖ) та динаміку загибелі тварин у різні терміни розвитку пострадіаційних синдромів. ЛК і ліпін вводили на першому етапі в профілактично-лікувальному, а на наступних етапах - у лікувальному режимі, тобто після опромінення, у різних дозуваннях. Аналізуючи результати дослідження слід відзначити, що введення ЛК і ліпіну двічі на добу при обох використаних дозуваннях сприяло суттєвому збільшенню виживання опромінених тварин на 30 добу експерименту (табл.1). Динаміка загибелі тварин у визначені терміни після опромінення підтверджує позитивний вплив ЛК при обох дозуваннях та ліпіну в дозі 20 мг/кг. Так, у ранній пострадіаційний період (з 2 до 5 доби) - час розвитку кишкового синдрому - не відмічено летальності у групі лікованих ЛК при обох дозуваннях і режимах введення.

Таблиця 1 Показники виживання та середньої тривалості життя мишей через 30 діб після опромінення середньолетальною дозою 6,2 Гр та за умов введення ЛК і ліпіну

Примітка: ¹ - р 0,05 порівняно з групою опромінених нелікованих тварин.

Це, на нашу думку, може бути свідченням протективної дії ЛК, який сприяв відновленню біологічних мембран в клітинах кишки і зменшував деструктивний вплив ВРО. На другому етапі радіобіологічних експериментів вивчали вплив ЛК на кровотворення та стан системи АОЗ, для чого досліджували периферійну кров та кістковий мозок, біохімічні показники сироватки крові, а також морфогістологічну та ультраструктурну картину слизової оболонки тонкої кишки у відповідні терміни - 10, 21 та 30 добу. На другому етапі дослідження, встановлено, що введення ЛК в дозі 20 мг/кг маси тіла після опромінення забезпечило позитивний вплив на перебіг ранніх пострадіаційних синдромів. Зокрема, виражений кишковий синдром на 3 добу спостерігали тільки у 52% тварин (p<0,05), лікованих ЛК, що було достовірно менше, ніж у контролі (80%). Загибель опромінених тварин у ранні терміни пов'язана із репаративною загибеллю ентероцитів (3-5 доба) та різким пригніченням кровотворення внаслідок деструкції клітин кісткового мозку (5-7 доба). Аналізуючи отримані результати, слід відзначити, що значне зменшення летальності в ранні терміни пов'язане з радіозахисною дією ліпосомальних засобів, яка проявляється в полегшенні кишкового синдрому та позитивному впливі на перебіг кістковомозкового синдрому гострої променевої хвороби. Пригнічення кровотворення, викликане опроміненням, спостерігали на 10 добу у всіх групах тварин. Картина периферійної крові при цьому характеризувалось відносною нейтрофілією та лімфопенією. Дослідження препаратів кісткового мозку виявили пригнічення проліферації та порушення диференціації клітинних клонів. Однак, слід зауважити, що хоча більше половини досліджуваних показників мієлограми у лікованих ЛК і ліпіном тварин достовірно відрізнялись від норми, в той же час, різниця між групами із застосуванням ліпосомальних засобів та нелікованим контролем теж була статистично вірогідною (р< 0,05), що засвідчує позитивний лікувальний вплив досліджуваних засобів, який, однак, не призводить до повного одужання (табл.. 2).

Таблиця 2 Показники периферійної крові опромінених мишей та при застосуванні ЛК і ліпіну на 10 добу після опромінення (n=5-7)

Примітка. ¹ - р< 0,05 порівняно з інтактними тваринами.

На 21 добу після опромінення показники периферійної крові тварин, лікованих ЛК і ліпіном, демонструють позитивну динаміку поступового відновлення клітинного складу, порівняно з нелікованими тваринами (р<0,05) (табл. 3). Співвідношення клітинних форм у кістковому мозку лікованих тварин також поступово нормалізувалось, що виявилось у зменшенні коефіцієнта гранулоцити/лімфоцити. Заслуговує на увагу той факт, що за умов застосування ЛК дані мієлограми були більш наближеними до норми, зокрема за кількістю мієлобластів, паличкоядерних нейтрофілів та лімфоцитів, а у групі з використанням ліпіну ці показники, хоч і суттєво відрізнялись (р<0,05) від контролю, але залишались істотно зміненими, порівняно з ідентифікованими у здорових тварин У мієлограмах усіх груп тварин на час закінчення експерименту теж відмічено позитивну динаміку: у лікованих ЛК і ліпіном показники практично не відрізнялись від норми, а у препаратах опромінених нелікованих мишей спостерігали достовірну різницю вмісту майже всіх досліджуваних клітин.

Таблиця 3 Показники периферійної крові опромінених мишей та при застосуванні ЛК і ліпіну на 21 добу після опромінення (n=5)

Примітки: ¹ - р< 0,05 порівняно з інтактними тваринами;

² - р< 0,05 порівняно з нелікованими тваринами.

Аналізуючи результати морфогістологічних досліджень тканин тонкої кишки, можна стверджувати, що ЛК і ліпін сприяли зменшенню ділянок некрозу ворсин та залоз, прискоренню репаративних процесів у слизовій оболонці кишечника, відновлювавли мікроструктуру ворсинок, про що свідчить динаміка її позитивних змін з 10 до 30 доби після опромінення. При ультраструктурному вивченні препаратів тонкої кишки опромінених тварин на 10 добу формування патології відмічали у нелікованих ознаки зруйновної цитоплазматичної мембрани епітеліоцитів слизової оболонки, набряк і некроз клітин, а також руйнування мембран мітохондрій та їх деструкцію. При лікуванні тварин ЛК і ліпіном спостерігали порушення цілісності мембран епітеліоцитів, в той же час, структура мітохондрій та їх мембрана збережені. Результати електронномікроскопічного дослідження на 21 добу продемонстрували, що введення опроміненим тваринам ЛК і ліпіну призвело до покращення ультраструктури епітеліоцитів: відновлена цілісність плазматичних мембран, місцями вони електронно-ущільнені, що може бути пов'язане із включенням в їх структуру ліпосом. Чисельність мітохондрій в цитоплазмі збільшилась. Дослідження впливу ЛК і ліпіну на стан системи ПОЛ і АОЗ корелювали із результатами гематологічних і морфогістологічних досліджень (табл.. 4). Важливо, що вплив ліпіну і ЛК на вміст ДК і ТБК-АП був рівнозначним. Опромінення суттєво пригнічувало активність СОД (на 20%) і каталази (на 30%), і збільшувало вміст церулоплазміну на 77%, порівняно з нормою. ЛК і ліпін наближали активність цих АО ферментів до норми, в той час, як лікування кверцетином в гранулах, який у даній серії експериментів був використаний в якості референтного препарату не викликало суттєвого покращення вказаних показників.

Таблиця 4Вплив кверцетину, ліпіну та ЛК на активність ферментів АОЗ в сироватці крові щурів через 10 діб після опромінення (n=10)

Примітки: ¹ - р<0,05 порівняно з інтактними;

² - p<0,05 порівняно з контролем;

³ - p<0,05 порівняно з ЛК;

⁴ - p<0,05 порівняно з ліпіном.

Таким чином, результати отримані в дослідах на тваринах, що були піддані опроміненню іонізуючою радіацією в середньолетальній дозі, переконливо свідчать про наявність виражених протипроменевих властивостей ліпосомальної форми кверцетину і ліпіну. Профілактична протипроменева дія у ЛК і ліпіну відсутня. Введення ЛК і ліпіну в лікувальному режимі істотно підвищує виживання, збільшує середню тривалість життя опромінених мишей, змінює динаміку загибелі тварин, зсуваючи її на більш пізні терміни, полегшує перебіг кишкового та кістково-мозкового синдромів гострої променевої хвороби. Досліджений позитивний протирадіаційний лікувальний ефект ЛК спостерігали при введенні в дозі 100 і 20 мг/кг, а для ліпіну досліджена ефективна доза - 20 мг/кг. Основна увага при виконанні третього етапу радіобіологічних досліджень була присвячена вивченню впливу ЛК на зміни судинної реактивності в опромінених тварин. Відомо, що при багатьох патологічних процесах та після опромінення іонізуючою радіацією спостерігається виразне зменшення здатності судинної стінки до розслаблення і збільшення чутливості до констрикторних впливів. Введення ЛК тваринам відразу після опромінення, тобто в розпалі активації процесів ВРО та формування ланцюгових реакцій ПОЛ, викликало позитивний протекторний ефект. Аналізуючи результати, отримані при вивченні впливу вазоконстрикторів - універсального деполяризатора - хлористого калію та норадреналіну (рис. 1) за умов введення ЛК опроміненим тваринам, слід відмітити, що амплітуда скоротливих реакцій препаратів тварин цієї групи практично не відрізнялась від реакцій препаратів аорти контрольних інтактних щурів. Це свідчить про те, що ліпосомальний кверцетин знижує чутливість до іонів К⁺ і має здатність нормалізувати викликану іонізуючим опроміненням гіперреактивність гладеньких м'язів судин і не впливає на їх чутливість до норадреналіну. Дослідження дилататорних реакцій під впливом ацетилхоліну (АХ) при введенн ЛК внутрішньоочеревинно виявило, що на 9 день пострадіаційного періоду в судинах цих тварин спостерігалось практично повне відновлення ендотелій-залежного розслаблення на АХ - його величина не відрізнялась від відповідних контрольних величин для здорових судин та із значним ступенем достовірності була більшою за величину розслаблення судин опромінених нелікованих тварин. При додаванні ЛК в робочу камеру в умовах in vitro, судини тварин цієї піддослідної групи реагували майже так само, як судини інтактних контрольних тварин. Підсумовуючи отримані вище вказані результати, можна твердити, що використання ЛК є ефективним під час формування та при сформованій променевій судинній патології на її ранніх стадіях. На нашу думку, стабілізуюча дія ЛК в таких умовах є результатом його антиоксидантної дії. ЛК включається у процеси ПОЛ, і, імовірно, інактивує частину вільних радикалів, що виникли внаслідок опромінення, тим самим, обмежує вплив і пошкоджуючу дію АФК на судинну реактивність. Можливо також, що відновлення дилататорної здатності судин при одноразовому введенні ЛК відбувається завдяки пригніченню небажаних наслідків оксидантного впливу вільних радикалів, індукованих радіацією, за рахунок усунення їх частини при взаємодії з ліпосомами та кверцетином. Таким чином, ЛК є ефективним засобом для відновлення нормальної скоротливої функції кровоносних судин після опромінення іонізуючою радіацією. Позитивний характер впливу ЛК полягає, з одного боку, в пригніченні вільнорадикальних процесів, а з іншого - у відновленні функціональної активності ендотелію та нормалізації ендотелій-залежних реакцій за рахунок відновлення бар'єрних властивостей ендотелію.

Рис. 1. Вплив ЛК на криві доза-ефект для норадреналіну, одержані на ізольованих препаратах аорти інтактних та опромінених (6 Гр) щурів. По вісі ординат - амплітуда скорочення (мг), по вісі абсцис -lg концентрації норадреналіну в буферному розчині. Примітка: * - р<0,05 порівняно з контролем та лікованими або преінкубованими ЛК препаратами.

Підтвердження антигіпертензивної ефективності ЛК ми отримали також і при визначенні артеріального тиску у щурів за умов опромінення, яке було проведене шляхом вимірювання його у хвостовій артерії тварин за допомогою комплексу Sphygmomanometer S-2 (HSE, Німеччина). На 9 добу після моделювання патології в групі опромінених (нелікованих) тварин спостерігалось підвищення АТ в середньому на 26 мм рт. ст., тобто на 24% порівняно з рівнем АТ до опромінення, в той час як у тварин, що отримували ЛК в дозі 1 мг/кг маси тіла відразу після моделювання ураження, цей показник практично не відрізнявся від початкового. Гастропротективну та репаративну активність ЛК ми вивчали на моделях виразкових уражень шлунку. У нашій роботі було використано дві моделі виразок шлунку - гостру етанол-преднізолонову, на якій досліджували профілактичну активність ЛК, та субхронічну аспіринову - з метою вивчення лікувальної та лікувально-профілактичної ефективності ЛК. В дослідженні противиразкова дія ЛК, в першу чергу, вивчалася за показниками впливу на стан слизової оболонки (СО) на основі макроскопічного обстеження, оскільки саме ці показники відображають ступінь репарації.

При профілактичному режимі введення ЛК за умов моделювання гострої етанол-преднізолонової виразки шлунку спостерігали зменшення звиразкування СО, а саме: у 4 рази нижчий виразковий індекс порівняно з нелікованим контролем та у 2 рази - порівняно з референтними препаратами. Відповідно, противиразкова активність ЛК була найвищою і становила 71%. Відмічений також позитивний вплив на активність процесів ПОЛ. Антиоксидантна активність ЛК проявилась у значному зменшенні кількості первинних і вторинних продуктів ліпопероксидації у сироватці крові, що достовірно відрізняло показники у групі із використанням досліджуваного засобу від таких у всіх інших групах з модельованою патологією. Результати морфогістологічних досліджень СОШ піддослідних тварин, лікованих ЛК, корелювали з вищевикладеними показниками. Таким чином, аналізуючи отримані дані, профілактичну противиразкову ефективність ЛК, при дозуванні 30 мг/кг, можна пояснити як антирадикальною дією, так і антиліпооксигеназною протизапальною активністю кверцетину на фоні «замісної» фосфоліпідної активності ліпосом. Дослідження противиразкової активності ЛК в умовах субхронічної виразки шлунку, викликаної ацетилсаліциловою кислоьою було цікаве тим, що саме ця модель є найбільш наближеною до виразкового пошкодження шлунку людей, що тривало приймають цей або інші НПЗЗ. На даній моделі виразки ми вивчали лікувально-профілактичну та лікувальну ефективність ЛК в дозах 30 і 60 мг/кг. При лікувально-профілактичному режимі застосування ЛК вводили паралельно з ацетилсаліциловою кислотою, тобто в період формування ерозивно-виразкових пошкоджень СО. Аналізуючи результати, слід відмітити, що саме при такому способі застосування спостерігалось значне пригнічення виразкового процесу. Введення ЛК зменшувало кількість тварин, у яких утворювались виразки, в 1,5 рази порівняно з б-токоферолом (p<0,05) та у 2 рази порівняно з кверцетином в гранулах (p<0,05) при обох способах дозування. Противиразкова активність ЛК була найвищою і становила 78% при дозуванні його 30 мг/кг. Пригнічення активності процесів ПОЛ було найбільш виражене під впливом ЛК, що можна пояснити характером його антирадикального впливу і зменшенням деструктивних процесів саме в період утворення пошкоджень. За умов лікувального режиму введення ЛК призначали після закінчення введення ацетилсаліцилової кислоти, тобто вже на фоні сформованої виразкової патології. На час звершення експерименту ерозивно- виразкові дефекти були відмічені у третини тварин, лікованих ЛК при обох дозуваннях, що було у 2 рази менше ніж при лікуванні б-токоферолом (p<0,05) та в 2,6 - ніж у лікованих кверцетином в гранулах (p<0,05). Противиразкова активність була найвищою при застосуванні ЛК в кількості 60 мг/кг, а за впливом на активність процесів ВРО, при обох дозуваннях були отримані практично рівнозначні дані. Результати вивчення морфогістологічної структури шлунків піддослідних тварин підтвердили найбільшу репаративну активність ЛК при порівнянні із референтними препаратами. Аналізуючи результати, одержані при вивченні противиразкової активності ЛК на моделі аспіринової виразки при різних режимах введення, можна зробити висновок, що ЛК чинить більшу противиразкову дію, ніж препарати порівняння, при обох режимах введення, однак, він є більш ефективним при лікувально-профілактичному введенні. Аналіз макроскопічного дослідження СО шлунку щурів, одержаний на 2 моделях виразкового ураження, дає можливість стверджувати, що ЛК проявив найбільшу активність в дозі 30 мг/кг за умов лікувально-профілактичного введення при аспіриновій виразці (78%; рис. 2.).

Размещено на http://allbest.ru

Рис. 2. Противиразкова активність (%) ЛК та препаратів порівняння при лікувально-профілактичному режимі введення у щурів з аспіриновою виразкою. Примітки: Ток - б-токоферолу ацетат; Кв- кверцетин в гранулах.

Таким чином, можна зробити висновок, що залежно від режиму введення, противиразкова активність ЛК змінюється наступним чином: лікувально-профілактичний (аспіринова виразка) > профілактичний (етанол-преднізолонова виразка) > лікувальний (аспіринова виразка). Така різниця антиульцерогенної активності може бути здебільшого пояснена сукупністю мембранопротективної дії ліпосом в процесі утворення дефектів слизової та антиліпооксигеназної протизапальної та антирадикальної дії кверцетину, за рахунок чого спостерігається зменшення деструктивних процесів в слизовій оболонці шлунку. Не випадково, що при лікувально-профілактичному режимі введення ми спостерігаємо максимальну противиразкову активність ЛК порівняно з іншими режимами введення, тому що в даній ситуації проводиться не тільки лікування, але й попереджується поширення ураження, не зважаючи на продовження контакту з ульцерогенним агентом.

Гепатопротекторну дію досліджували на моделях уражень печінки, викликаних застосуванням токсичних речовин (етанолу та тетрахлорметану) та медикаментозних гепатитів (парацетамолового, тетрациклінового, ізоніазидового). Одним з найбільш поширених уражень печінки є алкогольний гепатит, він розглядається як передвісник або початкова і обов'язкова стадія розвитку цирозу печінки. При експериментальному гострому етаноловому гепатиті нами була встановлена висока ефективність ЛК в дозі 10 мг/кг маси тіла. Зокрема, про виражений антиоксидантний та антирадикальний вплив ЛК свідчить той факт, що кількісні показники вмісту первинних і вторинних продуктів ліпопероксидації в сироватці крові та тканинах печінки були достовірно найбільш наближеними до показника інтактних тварин порівняно з контролем та тварин, у яких застосовували референтні препарати. Введення дослідним тваринам досліджуваного та референс-препаратів сприяло позитивній динаміці у відновленні балансу системи АОЗ. Слід відмітити, що за впливом на активність каталази та церулоплазміну, ЛК переважав всі референс-препарати, в той же час, достовірно відрізняючись від показника інтактних тварин (р<0,05). Активність СОД при введенні ЛК наближалась норми, а референс - препарати справляли значно менший вплив на цей фермент. При аналізі впливу ЛК на систему ПОЛ-АОЗ відзначений виразний позитивний терапевтичний ефект, який, в свою чергу, призводив до оптимізації функцій гепатоцитів. Під впливом ЛК спостерігали виражену тенденцію до нормалізації активності процесів цитолізу і холестазу. Так, активність амінотрансфераз та лужної фосфатази (ЛФ) при введенні досліджуваного засобу була достовірно нижчою ніж у контролі, і практично наближалась до показників інтактних тварин, що свідчить про зменшення проявів холестазу, можливо, за рахунок зменшення клітинної інфільтрації і набряку. ЛК спричиняв позитивний вплив на показники білкового, жирового і вуглеводневого обміну. Дослідження детоксикуючої функції печінки шляхом визначення тривалості гексеналового сну у піддослідних тварин продемонструвало більш виражену активність ЛК, як порівняно з контролем, так і стосовно еталонних препаратів - гепатопротекторів з антиоксидантною дією, що були використані в якості препаратів порівняння. Статистичне дослідження з використанням дискримінантного, дисперсійного та кластерного аналізу переконливо довело, що за лікувальною ефективністю в умовах гострого алкогольного гепатиту досліджуваний засіб прирівнюється до еталонного препарату силібору і значно переважає токоферол та кверцетин в гранулах.

Моделювання гострого токсичного гепатиту тетрахлорметаном дає можливість виявляти гепатопротекторні властивості речовин, оскільки в експериментальній фармакології він застосовується як класична мембранотропна отрута, що викликає посилення вільно-радикального та перекисного окиснення. Під впливом ЛК за умов тетрахлорметанового гепатиту динаміка показників ПОЛ була спрямована на відновлення їх початкового рівня: вміст первинних та кінцевих продуктів ліпопероксидації був достовірно меншим, спостерігалась також нормалізація активності ферментів системи АОЗ (табл.. 5).. Це може бути пов'язане із здатністю ЛК до «зв'язування» іонів Fe⁺⁺, які є обов'язковим компонентом модельних систем ферментативного та неферментативного ПОЛ, за рахунок кверцетину.

Таблиця 5Вплив ЛК та препаратів порівняння на деякі показники про- та антиоксидантного стану у щурів за умов гострого тетрахлорметанового гепатиту (M±m, n=7-10)

Примітки: 1. ¹ - р<0,05 порівняно з інтактними тваринами;

2. ² - р <0,05 порівняно з контролем;

3. ³ - р <0,05 порівняно до дозування ЛК 60 мг/кг.

Зменшення процесів цитолізу гепатоцитів та холестазу під впливом ЛК було на рівні відповідних показників у групах тварин, лікованих тіотриазоліном та силібором, і достовірно більш вираженим, ніж при застосуванні б-токоферолу (табл.. 6).

Таблиця 6. Вплив ЛК та препаратів порівняння на структурно-функціональні показники стану печінки щурів за гострого тетрахлорметанового гепатиту (Мm; n=7-10)

Примітки: ¹ - p<0,05 порівняно з інтактними тваринами;

² - p<0,05 порівняно з контролем;

³ - p<0,05 порівняно з лікованими ЛК тваринами.

Відмічена позитивна динаміка змін білкового, жирового та вуглеводневого обміну, що проявилась тенденцією до нормалізації вмісту альбумінів і глобулінів, загальних ліпідів та бета-ліпопротеїдів у сироватці крові та глікогену у печінці. За всіма вищезгаданими показниками ефективність ЛК прирівнювалась до тіотриазоліну, і перевищувала силібор та токоферол. Щодо відновлення детоксикуючої функції печінки, то ЛК значно переважав усі референс-препарати. Слід також відмітити, що на даній моделі гепатиту ми вводили ЛК у 2 дозуваннях - 60 і 150 мг/кг - для з'ясування ефективної дози та виявлення можливого прооксидантного ефекту ЛК. Аналізуючи результати, можемо стверджувати, що ЛК при обох дозуваннях виявив виразний фармакотерапевтичний ефект і не спричиняв прооксидантної дії при введенні його в дозі 150 мг/кг.

За введення парацетамолу спостерігали розвиток гепатоцелюлярного типу пошкодження печінки, показником якого є високий рівень процесів цитолізу. Введення ЛК супроводжувалось вираженим зменшенням інтенсивності цитолітичних процесів. Активність АлАТ була в 2,5 рази меншою, ніж у контролі, при обох способах дозування (p<0,05), а АсАТ - в 1,7 рази (p<0,05). Активність ЛФ знизилась на 19% при введенні 30 мг/кг ЛК (p<0,05) і на 18% при 60 мг/кг (p<0,05). При введенні тваринам ЛК в кількості 30 і 60 мг/кг відмічена чітка тенденція і до нормалізації параметрів обміну речовин: вміст в-ліпопротеїдів, ХС сироватки крові, глікоген печінки наблизились до відповідних показників здорових тварин. Аналізуючи ефективність ЛК порівняно з ліпіном та кверцетином, що були використаниі в даному експерименті як препарати порівняння, слід відмітити його достовірно більший вплив на систему ПОЛ - АОЗ, а саме: пригнічуючий вплив на рівень первинних і вторинних продуктів ліпоперокидації у сироватці крові (ДК і ТБК-АП) та ТБК-АП у гомогенаті печінки; нормалізацію активності каталази; зменшення активності маркера цитолізу гепатоцитів АлАТ (р<0,05). На нашу думку, це можна пояснити синергізмом антиоксидантної дії прямого антиоксиданта кверцетину та непрямим антиоксидантним впливом ліпосом.

Сьогодні вважається, що вільнорадикальні процеси є універсальним неспецифічним механізмом пошкоджуючої дії шкідливих чинників, а оксидативний стрес відіграє провідну роль у формуванні більшості патологічних форм ураження печінки. Аналіз проведених нами досліджень на моделях експериментальних медикаментозних гепатитів (МГ) показав, що всі вони характеризувались суттєвою активацією процесів ПОЛ. Зокрема, вміст первинного продукту ПОЛ - ДК - в сироватці крові зростав від 20% (р<0,05) при тетрацикліновому до 62% (р<0,05) при ізоніазидовому гепатиті. Кількість ТБК-АП теж зростала як у сироватці крові - від 24% (р<0,05) при МГ, викликаному парацетамолом - до 57% при ізоніазидовому гепатиті, так і в гомогенаті печінки - на 65% при введенні туберкулостатика і на 53% - 55% при моделюванні гепатитів тетрацикліном і парацетамолом відповідно. Оскільки ці продукти утворюються в процесі пероксидації фосфоліпідів і жирних кислот, то їх накопичення може свідчити про пошкодження мембран гепатоцитів і є ознакою ураження печінки. Цікаво, що за результатами проведеного поглибленого статистичного аналізу (дисперсійного та дискримінантного) доведено, що вміст ДК і АлАТ у сироватці крові найбільш повно характеризують перебіг процесу.

При введенні тваринам ЛК у всіх експериментальних серіях модельованих гепатитів та при різному дозуванні (по 30 і 60 мг/кг при ураженні парацетамолом; по 60 і 150 мг/кг при введенні ізоніазиду і тетрацикліну) спостерігали позитивні зміни, що характеризувались виразним пригніченням активності ВРО. Так, кількість ДК в сироватці крові хоч і відрізнялась від такої в інтактних тварин (р<0,05), в той же час, була достовірно меншою порівняно з показником нелікованого контролю (табл..7). Накопичення кінцевих продуктів ліпопероксидації в гомогенаті печінки під впливом ЛК теж суттєво зменшувалось і відрізнялось від контролю, хоча, у всіх серіях тварин, що отримували лікування, цей показник був достовірно вищий (р<0,05) порівняно до значень у інтактних тварин, що, можливо, пояснюється короткою тривалістю лікування.

Таблиця 7 Вплив ліпосомальних засобів та препаратів порівняння на показники ліпопероксидації у щурів з парацетамоловим гепатитом (M±m, n=7-10)

Примітки: ¹- р<0,05 порівняно з інтактними;

²- р<0,05 порівняно з контролем;

³- р<0,05 порівняно з лікованими ЛК по 30 мг/кг;

⁴- р<0,05 порівняно з лікованими ЛК по 60 мг/кг.