Роль трансформувального фактора росту beta1 в регуляції структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу за цукрового діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

УДК 547.96:615.252+576.52

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Спеціалність 03.00.04 - Біохімія

Роль трансформувального фактора росту beta1 в регуляції структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу за цукрового діабету

ЄвдокимовА Наталія Юріївна

Київ-2009

Дисертація є рукописом

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор, академік НАН і АМН України Комісаренко Сергій Васильович, Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, директор інституту, завідувач відділу молекулярної імунології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, член-кор. НАН і АМН України Тронько Микола Дмитрович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, директор інституту, завідувач відділу патофізіології ендокринної системи; доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України провідний науковий співробітник лабораторії медичної біохімії; доктор біологічних наук, Лукаш Любов Леонідівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу генетики людини.

Захист відбудеться 30 червня 2009 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Киів, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (м. Киів, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 28 травня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Цукровий діабет (diabetes mellitus) є групою гормонально-метаболічних системних захворювань, які характеризуються підвищеною концентрацією глюкози в крові через дефіцит інсуліну або/та порушення дії інсуліну. Прогресуюче поширення цукрового діабету в останні десятиріччя набуло характеру пандемії, і, за розрахунками Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я, через 20 років у світі буде приблизно 400 млн хворих на діабет. Головними типами цукрового діабету є діабет типу 1 (інсуліно-залежний діабет), обумовлений деструкцією в-клітин підшлункової залози, тобто абсолютною недостатністю інсуліну, та діабет типу 2 (інсуліно-незалежний діабет), який пов'язаний з резистентністю тканин до інсуліну, тобто з відносною недостатністю інсуліну. Хронічна гіперглікемія, яка вважається головним чинником ускладнень цукрового діабету обох типів, веде до патологічних змін і дисфункції багатьох органів і систем організму через розвиток мікро- та макроангіопатій. Найбільш суттєвими механізмами дії гіперглікемії є утворення «кінцевих» продуктів неензиматичного глікозилювання, розвиток мітохондріальної дисфункції, оксидативного стресу, активація поліолового та гексозамінового шляху, активація протеінкінази С, зміни експресії та активності багатьох цитокінів і факторів росту [Brownlee, 2005; Aronson, 2008]. Більшість цих механізмів діють комбіновано, і, наприклад, формування продуктів неензиматичного глікозилювання сприяє активації ростових факторів та утворенню активних метаболітів кисню, які, в свою чергу, можуть стимулювати накопичення продуктів неензиматичного глікозилювання. Активація протеінкінази С змінює експресію ростових факторів, але й сама протеінкіназа С є об'єктом регулювання факторами росту.

Узагальнюючою рисою різноманітних ускладнень цукрового діабету є дезорганізація структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу різних тканин організму [Hayden et al., 2005; Ban and Twigg, 2008]. Цей феномен є наслідком стимуляції синтезу і пригнічення деградації білків, які присутні у матриксі за нормальних умов, появі нових білків, збільшення акумуляції і зміни структури глікозаміногліканів та нестачі деяких з глікозаміногліканів. Головним модулятором метаболізму позаклітинного матриксу є трансформувальний фактор росту beta1 (TGFbeta1) [Border et al., 1994; Leask et al., 2004]. Значення цього фактору для розвитку діабетичних ускладнень є надзвичайно важливим, оскільки в умовах підвищеної концентрації глюкози in vivo та in vitro відбувається не тільки стимуляція синтезу і секреції TGFbeta1, але й збільшення експресії його рецепторів і активація сигналінгу, що забезпечує зростання чутливості клітин до TGFbeta1 і підсилення їх біологічної відповіді [Ban and Twigg, 2008].

Абсолютна більшість клітин секретує TGFbeta1 у латентному стані, у комплексі зі спеціальними «маскувальними» білками, коли він не здатен до зв'язування з рецепторами і до стимуляції біологічної відповіді. [Munger et al., 1997]. Тому першим і детермінуючим етапом регуляції дії TGFbeta1 є активація його латентної форми. Запропоновано різні механізми активації TGFbeta1, але не всі з них актуальні за гіперглікемії. Наприклад, один з головних фізіологічних механізмів - активація шляхом протеолізу «маскувального» білка, неможливий, оскільки підвищення концентрації глюкози пригнічує активність ензимів, що здійснюють цей вибірковий протеоліз. Найбільш вірогідним способом активації TGFbeta1 за підвищення концентрації глюкози є дія тромбоспондину-1 (TSP-1), оскільки його експресія за цих умов зростає. Однак, нез'ясованим залишалось, чи здатен ендогенний TSP-1, індукований підвищенням концентрації глюкози, активувати латентний TGFbeta1, і, якщо здатен, то чи забезпечує ця активація зміни у позаклітинному матриксі, притаманні цукровому діабету. Отримання відповіді на це питання обумовило основний напрямок наших досліджень, що є актуальними не тільки з фундаментальної, але й з практичної точки зору, оскільки вони одночасно створюють основу для розробки нових підходів для терапії ускладнень цукрового діабету.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках держбюджетних наукових тем відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України: «Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів» (1999-2003 рр., ДР № 0199V000273; 2004-2008 рр., ДР № 0104V003280) і «Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування» (2002-2006 рр., ДР № 0102V006218; 2007-2011рр., ДР № 0107V007187); в рамках держбюджетних наукових тем Інституту ендокринології і обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України: «Поглиблене вивчення окремих ланок патогенезу цукрового діабету і діабетичних ангіонейропатій з метою теоретичного обґрунтування та розробки нових методів їх діагностики та лікування» (1995-1997 рр., ДР № 0195U006844) та «Вивчити нові методи лікування цукрового діабету і його ускладнень» (1996-1999 рр., ДР № 0196U012297); Інституту хірургії та трансплантології АМН України "Вивчити стан регіонарної лімфогемодинаміки за наявності дефекту тканин гомілки та стопи та розробити методи їх лікування" (на базі хірургічного відділення Міської клінічної лікарні №1, 2000-2002 рр., ДР № 0198U001096). Роботу було підтримано грантами Державного фонду фундаментальних досліджень № 05.07/143 «Роль продуктів деградації фібрин(оген)у, що містять E- та D- домени, у зрушеннях синтезу глікозаміногліканів позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин» (2001-2006 рр., ДР № 0101U007193) і № 18.040 «Дослідження засобів хімічної модифікації фрагментів гіалуронової кислоти з метою оптимізації адгезії клітин», (2006-2007 рр., ДР № 0207U006032); грантами Royal Society (Великобританія, 1995 р.) за темою «Дослідження глікозаміногліканів за фенотипових змін клітин» та Wellcome Trust (Великобританія, 1998-1999 рр.) за темою «Роль тромбоспондину-1 у діабетичних нефропатіях». Відповідно, частину досліджень дисертант виконав у Бітсоновських лабораторіях Університету м. Глазго і у Відділі біомедичних наук Імперського Коледжу м. Лондон.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з'ясування функціональної ролі TSP-1-залежної активації TGFbeta1 у змінах стану позаклітинного матриксу за цукрового діабету.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- розробити методичний підхід для аналізу змін акумуляції гіалуронової кислоти і різних груп сульфатованих глікозаміногліканів позаклітинного матриксу;

в умовах нормальної концентрації глюкози

- визначити, чи функціонує TSP-1-залежний механізм активації TGFbeta1 для мезангіальних і ендотеліальних клітин та дермальних фібробластів людини ;

в умовах підвищеної концентрації глюкози:

- для всіх зазначених типів клітин дослідити експресію і секрецію фібронектину і інгібітора активатора плазміногену тип-1, акумуляцію глікозаміногліканів в різних компартментах клітинних культур, експресію і секрецію TSP-1, TGFbeta1 і активацію останнього;

- для мезангіальних клітин вивчити ефект блокади TSP-1-залежної активації TGFbeta1 на продукцію фібронектину, інгібітору активатора плазміногену тип-1, фактору росту сполучної тканини та синтез гіалуронової кислоти;

- для дермальних фібробластів дослідити активність системи ангіотензин ІІ / рецептор тип 1 і визначити експресію фактору росту сполучної тканини;

- для ендотеліальних клітин з'ясувати, чи опосередковує TGFbeta1 збільшення продукції фібронектину і інгібітору активатора плазміногену тип-1 та надлишкову акумуляцію глікозаміногліканів;

- дослідити ефект D-димеру фібрину на акумуляцію і властивості перицелюлярного гепаран сульфату ендотеліальних клітин, TSP-1-залежну активацію TGFbeta1, секрецію фібронектину та інгібітору активатора плазміногену тип-1, акумуляцію хондроітин сульфату і гіалуронової кислоти.

Об'єкт дослідження. Білкові та глікозаміногліканові компоненти позаклітинного матриксу.

Предмет дослідження. TSP-1-залежна активація TGFbeta1

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених досліджень отримано нові дані щодо функціонування TSP-1-залежного механізму активації TGFbeta1 у клітинах різного типу, які обгрунтовують загальнобіологічне значення цього механізму в регуляції дії TGFbeta1.

Вперше було продемонстровано, що у мезангіальних клітинах TSP-1-залежна активація TGFbeta1 за підвищення рівня глюкози обумовлює стимуляцію синтезу і секреції не тільки фібронектину, а й інгібітору активатора плазміногену тип-1 та фактору росту сполучної тканини, отже, індукує зменшення деградації і надлишкову акумуляцію інших білків і протеогліканів у матриксі. Вперше показано, що підвищення акумуляції гіалуронової кислоти у мезангіальних клітинах за збільшення концентрації глюкози обумовлено стимуляцією експресії гіалуронан синтази-2 внаслідок індукції TSP-1-залежного механізму активації TGFbeta1.

Стимуляція підвищеною концентрацією глюкози продукції фібронектину і акумуляції гіалуронової кислоти у дермальних фібробластах, на фоні відсутності стимуляції експресії, секреції і активації TGFbeta1 свідчить про незалежність структурно-функціональних змін у матриксі сполучної тканини шкіри за цукрового діабету від дії TGFbeta1. Підтвердженням цієї концепції є глибокі негативні зміни системи гіалуронова кислота - рецептор CD44 і погіршення проліферативних властивостей фібробластів хворих на діабет 2-го типу з хронічними виразками стопи, що відрізняє ці клітини від контрольних фібробластів і фібробластів хворих без виразок, всупереч однаковій секреції і активації TGFbeta1 в клітинах всіх груп.

Вперше показано, що у дермальних фібробластах в умовах підвищення концентрації глюкози активується сигнальний шлях ангіотензину ІІ внаслідок збільшення експресії рецепторів тип-1. Надекспресія рецепторів тип-1 призводить до індукції експресії фактору росту сполучної тканини і стимуляції синтезу фібронектину, що підкреслює загальнобіологічне значення локальних систем ренін-ангіотензиноген для розвитку фібротичних змін у різних тканинах.

З'ясовано, що в ендотеліальних клітинах TGFbeta1 є медіатором збільшення продукції фібронектину і інгібітору активатора плазміногену тип-1 та надлишкової акумуляції гіалуронової кислоти, хондроітин та дерматан сульфатів, але активація TGFbeta1 відбувається поза дії TSP-1-залежного механізму. Збагачення матриксу ендотеліальних клітин на гіалуронову кислоту обумовлено підвищенням зв'язуючих властивостей рецептора CD44 внаслідок збільшення їх гліканації хондроітин сульфатом під впливом TGFbeta1. Отже, специфічність регуляції вмісту гіалуронової кислоти у глікокаліксі ендотелію вперше показана для умов підвищення концентрації глюкози.

Вперше проведені дослідження впливу D-димеру фібрину на позаклітинний матрикс ендотеліальних клітин виявили суттєві структурно-функціональні зміни його стану. Стимуляція TSP-1-залежної активації TGFbeta1, яка обумовлена D-димер - індукованим пригніченням синтезу оксиду азоту, призводить до відповідного збільшення секреції фібронектину і інгібітору активатора плазміногену тип-1 та збагаченню позаклітинного матриксу на хондроітин сульфат і гіалуронову кислоту. Навпаки, D-димер зменшує акумуляцію перицелюлярного гепаран сульфату і пригнічує його антикоагуляційні властивості, що не залежить від активації TGFbeta1, а безпосереднє пов'язане з нестачею оксиду азоту. З'ясовано, що зазначені негативні структурно-функціональні зміни стану позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин опосередковані взаємодією фрагменту г117-133, експонованого у D-димері, з молекулою міжклітинної адгезії-1.

Практичне значення роботи. Отримані дані свідчать про те, що TSP-1-залежна активація TGFbeta1 є ключовим фактором надлишкової акумуляції і дезорганізації мезангіального матриксу за розвитку діабетичних нефропатій і являють собою базу для розробки фармакологічних засобів терапії цих ускладнень цукрового діабету на основі блокади активації TGFbeta1.

Глибокі негативні зміни у системі гіалуронова кислота - рецептор CD44 і погіршення проліферативних властивостей фібробластів хворих на діабет 2-го типу з хронічними виразками стопи на фоні незміненої секреції і активації TGFbeta1 цими клітинами узгоджуються з відомою нечутливістю хронічних діабетичних виразок до екзогенного цитокіну і є передумовою для пошуку інших засобів їх терапії, одним з яких може бути гіалуронова кислота.

Виявлені зміни структурно-функціонального стану перицелюлярного матриксу ендотелію під впливом D-димеру фібрину частково пояснюють феномен високого ступеню кореляції між концентрацією D-димеру в крові і наявністю ускладнень цукрового діабету і підкреслюють важливість контролю систем коагуляція-фібриноліз за цієї патології.

Отримані дані свідчать про прогностичне значення підвищення рівня компонентів позаклітинного матриксу та їх регуляторів у крові та сечі хворих на цукровий діабет щодо розвитку мікро- та макроангіопатій.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1995-2008 рр. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних літератури, проведено аналіз експериментальних даних, сформульовано основні положення та висновки. Всі експериментальні дослідження, результати яких наведені в роботі, виконані автором власноручно. За участі пров. інженера Н.С. Баранової проведено культивування дермальних фібробластів та клітин Mv1Lu, визначена експресія CD44, секреції інгібітору активатора плазміногену тип-1 і фібронектину (розділ 3.5.1) За участі м.н.с. Л.Д. Веселовської проведений хроматографічний аналіз продуктів деградації гепаран сульфату (розділ 3.6.1). Визначення рівня оксиду азоту проводилось с.н.с., к.б.н. О.В.Буханевич та м.н.с Г.В. Косяковою, а отримання і очистка D-димеру фібрину - пров.інженером Г.К. Гоголінською та с.н.с., к.б.н. П.Г. Гриценком (Інститут біохімії НАН України ім.О.В.Палладіна). Зразки шкіри та біоптати для культур дермальних фібробластів отримані в діабетологічному відділі Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України та у хірургічному відділенні Міської клінічної лікарні №1. Формування груп хворих на цукровий діабет проведене академіком НАН і АМН України А.С. Єфімовим (Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка) і професором С.Є. Подпрятовим (Міська клінічна лікарня №1).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на наукових семінарах Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України (2002-2009 рр), 2^nd Symposium of Tissue Cultures Societies of Central Europe (Краків, Польща, 1997 р.), 17^th International Lectin Meeting (Вюрцбург, Німеччина, 1997 р.), 17^th Joint Meeting of British Endocrine Societies (Единбург, Великобританія, 1998 р.), ХVIII^th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Париж, Франція, 2001 р.), 43^rd International Congress of the European Tissue Culture Society (Гренада, Іспанія, 2001 р.), УІІІ Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002 р.), 2-ій Міжнародній конференції “Мікроциркуляція та вікові зміни”, (Київ, 2002 р.), International Meeting “Frontiers in Autoimmunity” (Кештели, Угорщина, 2002 р), 4^th Parnas Conference (Вроцлав, Польща, 2002 р.), 16^th Annual Meeting of the European Diabetic Nephropathy Study Group (Ельсінор, Данія, 2003 р.), Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004 р.), XX^th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, (Сідней, Австралія, 2005 р.), 31^th Congress of Federation of European Biochemical Societies (Стамбул, Туреччина, 2006 р.), 6^th Parnas Conference (Краків, Польща, 2007 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 37 наукових робіт, з них 21 стаття у періодичних наукових спеціальних виданнях України, що включені у перелік, затверджений ВАК України та міжнародних наукових журналах, глава у монографії «Клиническая диабетология», 1998 р. та 15 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів, заключення, висновків та списку використаних літературних джерел (537 найменувань). Дисертацію викладено на 300 сторінках, проілюстровано 74 рисунками, 18 таблицями.

Перелік умовних скорочень: TGFbeta1 - трансформувальний фактор росту бета1; TSP-1 - тромбоспондин-1; PAI-1 - інгібітор активатору плазміногену тип-1; GAG - глікозаміноглікани; sGAG - сульфатовані глікозаміноглікани; HA - гіалуронова кислота; CD44 - рецептор гіалуронової кислоти; HS - гепаран сульфат; CS - хондроітин сульфат, DS - дерматан сульфат; CTGF - фактор росту сполучної тканини; GAPDH - гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназа; NO - оксид азоту; NO₂^- - нітрит аніон; L-NMMA - N^G-монометил-L-аргінін; cGMP - циклічний гуанозин монофосфат; AngII - ангіотензин ІІ; АТ - рецептори тип 1; ICAM-1 - молекула міжклітинної адгезії тип-1.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасні дані про структуру, синтез, сигналінг і біологічні ефекти TGFbeta1. Окремий підрозділ присвячений секреції і активації TGFbeta1, і особливу увагу приділено TSP-1 -залежному механізму активації TGFbeta1. Аналіз даних щодо функціонування різних механізмів активації TGFbeta1 за гіперглікемії пояснює доцільність вивчення саме TSP-1-залежного механізму в цих умовах. Окремо розглянута інформація стосовно структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу мезангіальних і ендотеліальних клітин і дермальних фібробластів за підвищення концентрації глюкози, а також причетність TGFbeta1 до змін, що відбуваються. Цей підрозділ обґрунтовує раціональність досліджень, проведених в ході виконання дисертаційної роботи.

Матеріали і методи.

Культивування клітин проводили у специфічних для кожного типу клітин поживних середовищах: мезангіальні клітини людини (Європейська колекція культур) - RPMI 1640, дермальні фібробласти людини (культури отримували у лабораторії) - EMEM, ендотеліальні клітини вени пуповини людини (іHUVEC, Інститут імунології та експериментальної терапії Польської Академії Наук та ECV304, Європейська колекція культур) і ендотеліальні клітини аорти кроля (Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України) - М199 або DMEM/F12, клітини карциноми легенів (A549, Американська колекція культур) - HamF10/DMEM, епітеліоподібні клітини легенів норки (Mv1Lu, Європейська колекція культур) - DMEM. До середовища додавали стандартну суміш антибіотиків (пеніцилін, стрептоміцин, амфотеріцин В), 2 мМ глютаміну, 10% (7%-для іHUVEC) ембріональної сироватки теляти (FCS) та спеціальні добавки для культивування мезангіальних (інсулін, трансферін, селеніт) і ендотеліальних (фактор росту ендотелію, гепарин) клітин. Ендотеліальні клітини культивували на поверхнях, вкритих 0,5% желатином.

Отримання первинних культур дермальних фібробластів проводили методом ензиматичної дезагрегації тканини і методом експлантатних культур.

Для вивчення проліферативних властивостей клітин визначали кінцеву сатураційну щільність і час подвоєння популяції. Крім прямого визначення кількості живих клітин в гемоцитометрі використовували забарвлення з сульфородаміном В (SRB) [Skehan et al., 1990].

Для визначення адгезії ендотеліальних клітин до іммобілізованої гіалуронової кислоти суспензію клітин обробляли гіалуронат ліазою і вносили в плати, вкриті гіалуроновою кислотою або полі-D-лізином (контроль) [Lesley et al., 1990]. Через годину визначали кількість прикріплених клітин.

Концентрація білків і пептидів у кондиційованому середовищі визначалася методом ELISA і з використанням відповідних «кітів» на основі ELISA. Визначення концентрації TGFbeta1 проводили ELISA-kit (R&D Systems,UK), а ангіотензину ІІ - з використанням Ang II EIA-kit (SPI-BIO, France).

Експресію рецепторів CD44 визначали методом клітинної ELISA [Harley et al, 2000].

Для визначення концентрації TGFbeta1 методом інгібування проліферації клітин Mv1Lu [Howe et al., 1990] клітини вносили у 96-лункові плати і після прикріплення додавали середовище, кондиційоване експериментальними клітинами. Для визначення активного TGFbeta1 середовище додавалось безпосереднє, а для визначення тотального TGFbeta1 середовище інкубували при 80^оС або підкислювали. За 3 дні кількість клітин визначалась методом забарвлення з SRB. Для стандартної кривої (0,01-1 нг/мл) застосувався тромбоцитарний TGFbeta1.

Для визначення експресії мРНК методом RT-PCR тотальну РНК екстрагували з використанням RNA Bee-kit (AMS Biotechnology). Після визначення відношення А₂₆₀/А₂₈₀ РНК піддавали реверсній транскрипції і ампліфікації, застосовуючи RT-PCR kit (Invitrogen). Одночасно проводилась ампліфікація гену гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази (GAPDH).

Визначення експресії білків методом Western blotting здійснювали згідно стандартному протоколу. Для детекції використовували хемілюмінесцентний реагент ECL+Plus. Результати нормалізували до смуг GAPDH або бета-актину.

Продукція оксиду азоту (NO) визначалась вимірюванням концентрації NO₂^- у кондиційованому середовищі ендотеліальних клітин за реакцією Гріса.

Для визначення тотального клітинного cGMP використовувався EIA-kit (Amersham Biosciences).

Концентрація лактату у кондиційованому середовищі визначалась ензиматично.

Визначення включення радіоактивно мічених попередників синтезу глікозаміногліканів у їх окремі групи. Клітини інкубували з D-[1-³H]-глюкозаміном (пит. радіоактивність 3,5-6,5 Кі/ммоль) або [2-¹⁴C]-ацетатом (пит. радіоактивність 2,5-4,5 Кі/ммоль). Включення попередників у гіалуронову кислоту (HA), гепаран (HS), хондроітин (CS) та дерматан (DS) сульфати визначали у компартменти кондиційованого середовища, перицелюлярного матриксу та клітинного моношару. Для цього після інкубації клітин кондиційоване клітинами середовище відбирали, а до клітин додавали 0,05% трипсин. До клітинної суспензії додавали інгібітор трипсину, суспензію центрифугували. Супернатант позначали як компартмент перицелюлярного матриксу, а осад - як компартмент клітинного моношару [Heinegard and Sommarin, 1987]. Проби обробляли проназою Е (8-9 од/мл, 18 годин, 50^оС), центрифугували у Centriprep-3, наносили на 2 мл колонки Poly-Prep з DEAE-целюлозою, елюювали ступеневим градієнтом NaCl (0,1 М, 0,28 М, 0,4 М, 0,7 М) і визначали радіоактивність отриманих фракцій. Для ідентифікації різних груп глікозаміногліканів відповідні фракції об'єднували, деградували специфічними ферментами і визначали радіоактивність. Матеріал суміші CS та DS, нечутливий до хондроітинази AC, являв собою DS, різниця у радіоактивності - складала CS.

Дослідження ступеню N-сульфатування і N-незаміщення HS та його зв'язування з антитромбіном. Об'єднані фракції, які вміщали HS, піддавали дезамінуючій деградації HNO₂ за pH 1,5 та 3,9, що дає змогу визначити ступінь N-сульфатування у першому випадку [Shivley and Conrad, 1976], і ступінь N-незаміщення - у другому [Lindahl et al., 1973]. Взаємодію ¹⁴С-HS з антитромбіном визначали за використання антитромбін-агарози.

Для аналізу розподілу ³Н-гіалуронової кислоти за молекулярною масою її препарати хроматографували на Sephacryl S-1000. Колонку калібрували Healon GV (7000 кДа), декстраном блакитним (2000 кДа), декоріном (100 кДа) та ³Н-глюкозаміном (215 Да).

Концентрацію глікозаміногліканів визначали m-гідроксидифеніловим мікрометодом [van den Hoogen et al., 1998] або реакцією з карбазолом [Bitter and Muir, 1962].

Аналіз даних, розрахунки та графічні роботи проводили, використовуючи програму Microsoft Excel 2003. Всі дані нормалізовані до 10⁵ клітин (за виключенням зазначених окремо). Визначення кожного параметру у кожному експерименті включало контроль на збільшення осмотичного тиску застосуванням відповідної концентрації маннітолу. Вплив специфічних антитіл до факторів росту і рецепторів контролювався визначенням дії неспецифічних IgG. Відмінність вважалась вірогідною за P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення.

Методичний підхід для визначення акумуляції гіалуронової кислоти та окремих груп сульфатованих глікозаміногліканів. Вибір методичного підходу для одночасного вивчення змін акумуляції гіалуронової кислоти (HA) та сульфатованих глікозаміногліканів (sGAG) є складною проблемою, оскільки всупереч формальній належності до одного класу сполук, вони дуже відрізняються за структурою і метаболізмом та, відповідно, за методами їх визначення. HA визначається за взаємодією з гіаладгеринами, а sGAG - методом ELISA. Застосування цих методів часто призводить до артефактних результатів, оскільки взаємодія HA з гіаладгеринами неконтрольованим чином залежить від розміру полімеру, а надзвичайна варіабельність структури sGAG здатна унеможливити їх ідентифікацію застосованим антитілом. Найбільш раціональним підходом для наших досліджень уявляється аналіз включення радіоактивних попередників синтезу глікозаміногліканів (GAG) у HA та окремі групи sGAG. Оригінальність методу полягає в застосуванні спільного попередника (³H-глюкозаміну або ¹⁴С-ацетату) синтезу всіх GAG і в визначенні включення у HA та окремі групи sGAG кондиційованого середовища, матриксу та клітинного моношару одночасно. Такий підхід дає уявлення про стан загального метаболізму всіх груп GAG, дозволяє визначати розмір молекул HA і ступінь N-сульфатування та N-незаміщення HS.

Для розділення різних груп GAG було обрано DEAE-целюлозу і NaCl як елюент. Спочатку було використано DEAE-целюлозну мембрану (DEAE Memsep 1000) і хроматографічну систему середнього тиску (ConSep, Perceptive Biosystems), яка формувала градієнт NaCl. Розділення суміші комерційних HA, HS та CS дозволило визначити профіль градієнту NaCl: 9-10 мл 0,28 М - елюція HA, 9-10 мл 0,4 М- елюція HS, 9-10 мл 0,7 М - елюція CS. Ці дані узгоджуються з результатами застосування інших DEAE-носіїв, а визначення концентрації GAG показало, що після хроматографії у фракціях знаходиться ~ 95% нанесених HA, HS та CS. Метод був застосований для вивчення профілю перицелюлярних GAG клітин A549 та дермальних фібробластів. Клітини інкубували з ³Н-глюкозаміном, і після виділення загальних ³Н-GAG (окремо із різних компартментів культур) отримували різні їх типи хроматографією на DEAE Memsep 1000. Матеріал першого піку (~0,1 M NaCl) являв собою глікопротеїни і не аналізувався в подальших дослідженнях. Різні типи ³Н-GAG ідентифікувались деградацією специфічними ензимами.

З метою спрощення методу було використано 2 мл колонки Poly-Prep (BioRad) з DEAE-целюлозою і ступеневий градієнт NaCl з збільшеними об'ємами кожної концентрації (21 мл - 0,1 М, 30 мл - 0,28 М, 21 мл - 0,4 М, 15 мл - 0,7 М). Пряме порівняння розділення ³Н-GAG (отриманих з одного і того ж зразка клітин А549 або дермальних фібробластів) на Memsep 1000 з використанням градієнта концентрації системи ConSep, і колонок Poly-Prep з вказаним ступеневим градієнтом показало відсутність різниці між їх профілями елюції. Радіоактивність HA в відсотках від загальної радіоактивності GAG складала 49,9±0,5 проти 52,8±0,6; HS - 23,8±0,3 проти 24,2±0,2; CS/DS - 12,4±0,1 проти 13,5±0,1, відповідно для мембрани DEAE Memsep 1000 (n=6) і DEAE-целюлози у колонках Poly-Prep (n=6). Використання ¹⁴С-ацетату продемонструвало, що включення у різні типи GAG у відсотках від їх загальної радіоактивності не змінювалось у порівнянні з ³Н-глюкозаміном, хоча абсолютні значення включення були меншими.

Розглянутий підхід був застосований для клітин різних типів і для вивчення ефектів різних чинників на акумуляцію перицелюлярних GAG. Було підтверджено превалювання sGAG над HA у матриксі ендотеліальних клітин різного походження, а для клітин iHUVEC було показане зростання відношення HS до CS під дією метилен бісфосфонової кислоти. Одночасне інгібування включення ¹⁴С-ацетату у CS у різні компартменти культур свідчило про зміни загального метаболізму CS, що раніше було продемонстровано виключно із застосуванням ³²SO4 і тільки для органної культури кісток та пухлинних клітин [Katoh et al., 1991; Timar et al., 1995]. Метод виявився корисним для вивчення перицелюлярних GAG суспензійних культур, і було підтверджено, що CS та DS є основними типами GAG у клітинах В-лімфоцитарного походження [Makatsori et al., 2001]. За допомогою розглянутого підходу показано, що інсулін, відомий модулятор синтезу HA і HS в різних клітинах, стимулював їх акумуляцію, але не впливав на акумуляцію CS та DS у перицелюлярному матриксі дермальних фібробластів. У фібробластах хворих на цукровий діабет 1-го типу (без нефропатій) акумуляція HS і ступінь його N-сульфатування не відрізнялись від цих показників для контрольних клітин, що відповідало відсутності конститутивного дефекту у експресії та активності N-деацетілази/N-сульфотрансферази у таких хворих [Yard et al., 2002].

Наведені результати і їх співставлення з даними літератури дозволяють вважати доцільним застосування цього простого і інформативного методичного підходу для вивчення структурно-функціональних змін глікозаміногліканів матриксу мезангіальних і ендотеліальних клітин та дермальних фібробластів за підвищення рівня глюкози .

TSP-1-залежний механізм активації TGFbeta1 у мезангіальних клітинах, дермальних фібробластах та ендотеліальних клітинах людини. Аналіз літературних даних дозволив припустити, що активація TGFbeta1 за підвищеної концентрації глюкози, скоріше за все, має відбуватися через дію TSP-1. Однак, цей механізм активації був показаний виключно для ендотеліальних клітин аорти бика, отже, необхідно було пересвідчитися в його актуальності для клітин людини, що були обрані для досліджень: мезангіальних клітин гломерул, дермальних фібробластів і ендотеліальних клітин, отриманих з вени пуповини (iHUVEC та ECV304).

Першим доказом функціонування зазначеного механізму було дозо-залежне підвищення концентрації активного TGFbeta1 (аTGFbeta1) під впливом екзогенного TSP-1 у кондиційованому середовищі (рис.1) без змін секреції тотального цитокіну мезангіальними клітинами. Концентрація тотального TGFbeta1 за 1000 нг/мл TSP-1 складала 3,08±0,34 проти 3,12±0,36 нг/мл у контролі. Для дермальних фібробластів і ендотеліальних клітин ефект екзогенного TSP-1 був аналогічним.

Рис.1. Вплив TSP-1 на концентрацію активного TGFbeta1 у кондиційованому середовищі мезангіальних клітин. Час інкубації - 48 годин, одночасно з 500 нг/мл TSP-1 додавали 100 нМ пептиду GGWSHW (W) або пептиду GGYSHW (Y). Дані наведено як M±m, для кожної концентрації TSP-1 n=9,*** - P<0,01 у порівнянні до контролю.

Визначальним етапом активації TGFbeta1 [Schultz-Cherry et al, 1995] є взаємодія фрагменту G418GWSHW423 молекули TSP-1 зі зрілою частиною латентної форми цитокіну. Як показано на рис.1, 100-кратний молярний надлишок синтетичного пептиду GGWSHW (W-пептид) скасовує активацію TGFbeta1, індуковану 500 нг/мл (1,04 нМ) TSP-1, а GGYSHW (Y-пептид) є неефективним. Це свідчить про конкурентне інгібування W-пептидом зв'язування екзогенного TSP-1 з ендогенним TGFbeta1.

Найважливішим доказом функціонування TSP-1-залежного механізму активації TGFbeta1 є здатніость W-пептиду конкурувати з ендогенним TSP-1. Наші дослідження (рис.2) показали, що W-пептид дозозалежно знижував рівень активного цитокіну для мезангіальних клітин, не впливаючи на секрецію тотального TGFbeta1 (3,07±0,28 нг/мл за 10 мкМ W-пептиду) і TSP-1 (28,1±3,5 проти 27,47±2,0 нг/мл, для 10 мкМ W-пептиду і контролю, відповідно). Така ж сама конкуренція відбувалася між W-пептидом і ендогенним TSP-1 за взаємодію з TGFbeta1, що продукується дермальними фібробластами і ендотеліальними клітинами.

Рис.2. Вплив W-пептиду на активацію мезангіального TGFbeta1. Дані наведено як M±m, для всіх концентрацій W- або Y-пептидів n=9, *** - P<0,01 у порівнянні до контролю.

Таким чином, ми довели функціонування TSP-1 - залежного механізму активації TGFbeta1 у цих типах клітинах, і їх використання у подальших дослідженнях є доцільним.

Роль TSP-1-залежної активації TGFbeta1 у дезорганізації позаклітинного матриксу мезангіальних клітин під впливом підвищення концентрації глюкози. На момент початку нашої роботи стимуляція продукції TSP-1 за збільшення концентрації глюкози була показана тільки в одному дослідженні на рівні експресії мРНК [Holmes et al, 1997], тому першим завданням цієї частини роботи було вивчення експресії і секреції TSP-1. в цих умовах. За підвищення рівня глюкози відбувається стимуляція експресії і секреції TSP-1 і секреції і активації TGFbeta1 (рис.3 і табл. 1), що не пов'язано з осмотичним тиском. Додавання W-пептиду не змінювало секрецію TSP-1 і тотального TGFbeta1, але пригнічувало активацію цитокіну, а блокада транскрипції TSP-1 антисенс нуклеотидом зменшувала секрецію TSP-1 і активацію TGFbeta1, не змінюючи секрецію тотального TGFbeta1. Отже, обидва підходи блокували TSP-1 - залежну гіперактивацію TGFbeta1 за підвищення рівня глюкози.

Збільшення концентрації глюкози стимулювало експресію і секрецію фібронектину та інгібітору активатора плазміногену тип-1 (PAI-1) (рис.4, рис.5, табл.1), що узгоджувалось з результатами інших досліджень і дозволило використати ці показники для з'ясування значення TSP-1-залежної активації TGFbeta1 у дезорганізації позаклітинного матриксу мезангіальних клітин.

Рис.3. Експресія мРНК TSP-1 в мезангіальних клітинах. Інкубація (48 годин): 4 і 30 мМ глюкози, 30 мМ глюкози+1 мкМ W- або Y-пептиду, 30 мМ глюкози+2 мкМ антисенс (AS) або контрольного (С) олігонуклеотиду до TSP-1. А - приклад аналізу методом RT-PCR; Б - нормалізація смуг TSP-1 до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=9, *** - P<0,01 у порівнянні до 4 мМ глюкози.

Таблиця 1 - Концентрація TSP-1, активного (а) і тотального (т) TGFbeta1, фібронектину і PAI-1 у кондиційованому мезангіальними клітинами середовищі (24 год)

Інкубація, як на рис.3, дані наведено як M±m, * - P<0,05, *** - P<0,01 - у порівнянні до 4 мМ глюкози .

Блокада TSP-1-залежної активації TGFbeta1 W-пептидом і антисенс олігонуклеотидом нормалізувала підвищення експресії і секреції фібронектину та PAI-1 (рис.4, рис.5, табл.1).

Рис.4. Експресія мРНК фібронектину і PAI-1 у мезангіальних клітинах. А - приклад аналізу методом RT-PCR; Б-нормалізація смуг фібронектину і PAI-1 до GAPDH. Умови інкубаці, як на рис.3, дані наведено як M±m, для всіх груп n=9, *** - P<0,01 у порівнянні до 4 мМ глюкози.

Рис.5. Експресія фібронектину і PAI-1 у мезангіальних клітинах. А - приклад аналізу методом Western blotting; Б - нормалізація смуг фібронектину і PAI-1 до beta-актину. Умови інкубаці, як на рис.3. дані наведено як M±m, для всіх груп n=9, *** - P<0,01 - у порівнянні до 4 мМ глюкози.

Отже, стимуляція збільшенням рівня глюкози секреції TSP-1 обумовлює активацію TGFbeta1, яка, в свою, чергу, індукує експресію і секрецію мезангіальними клітинами фібронектину і PAI-1. Нормалізуюча дія блокади W-пептидом TSP-1-залежної активації TGFbeta1 стосовно індукції фібронектину і PAI-1 спостерігалась при подовженні інкубації клітин в умовах підвищення концентрації глюкози до трьох тижнів. Крім того, ми показали, що підвищення концентрації глюкози призводить до up-регуляції експресії мРНК фактора росту сполучної тканини (CTGF), який індукується TGFbeta1 і опосередковує багато біологічних ефектів останнього [Leask and Abraham, 2004]. W-пептид також повністю нормалізував експресію CTGF.

Що стосується впливу підвищення концентрації глюкози на GAG комопонент матриксу мезангіальних клітин, то включення ³Н-глюкозаміну у CS та DS не змінювалось, але зменшувалось - у HS всіх компартментів культур. Пригнічення акумуляції HS у мезангіальних клітинах за гіперглікемії добре відомо, воно не обумовлено дією TGFbeta1 [Raats et al., 2000], і ми вивчали його для підтвердження адекватності використаної нами системи досліджень.

За підвищення концентрації глюкози відбувалась індукція акумуляції HA у матриксі (рис.6) і середовищі мезангіальних клітин.

Рис.6.Акумуляція гіалуронової кислоти (HA) у перицелюлярному матриксі мезангіальних клітин. Інкубація з різними рівнями глюкози, W- i Y-пептидами, як на рис.3, крім того - 4 мМ глюкози +4 мг/мл TGFbeta1, 30 мМ глюкози+30 мкг/мл нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіла (АB-TGFbeta1). ³Н-глюкозамін вносили на останні 24 години інкубації. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=9, **- P<0,02, *** - P<0,01 - у порівнянні до контролю.

Було з'ясовано (рис.7), що ці зміни обумовлені збільшенням експресії гіалуронан синтази-2 (HAS2), яка синтезує HA найбільшого розміру [Wiegel and De Angelis, 2007]. Мезангіальні клітини не експресували HAS1 (як і інші клітини нирок), а експресія HAS3 не змінювалась.

Порівняння впливу підвищення рівня глюкози на акумуляцію HA, її властивості і експресію HAS2 мезангіальними клітинами з ефектом екзогенного TGFbeta1 та нейтралізуючих дію TGFbeta1 антитіл (рис.6, рис.7) дозволило дійти до висновку, що TGFbeta1 опосередковує ефект збільшення концентрації глюкози на синтез HA. Цей висновок добре узгоджується з інформацією стосовно стимуляції синтезу виключно високомолекулярних форм HA під дією TGFbeta1 [Jacobson et al., 2000; Meran et al., 2007].

Рис.7. Експресія мРНК гіалуронан синтази-2 (HAS2). Інкубація і кількість експериментів, як на рис.6. А - приклад аналізу експресії мРНК HAS2 методом RT-PCR; В - нормалізація смуг HAS2 до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=9, *** - P<0,01 - у порівнянні до контролю.

Оскільки блокада активації TGFbeta1 додаванням W-пептиду повністю нормалізувала (рис.6) збільшення акумуляції HA, збагачення загального пулу HA на її високомолекулярні форми і надекспресію HAS2 за підвищення рівня глюкози, ми вважаємо, що саме TSP-1 - залежна активація цитокіну обумовлює зміни у синтезі і структурі HA у цих умовах.

Наведені експериментальні дані свідчать про те, що TSP-1 - залежний механізм відіграє ключову роль в активації TGFbeta1 і повністю обумовлює збільшення продукції фібронектину та PAI-1, індукцію експресії CTGF, синтезу та акумуляції високомолекулярної гіалуронової кислоти, що є типовими ознаками структурно-функціональних змін стану мезангіального позаклітинного матриксу за підвищення концентрації глюкози.

Структурно-функціональний стан позаклітинного матриксу дермальних фібробластів і система TSP-1/TGFbeta1 за підвищення концентрації глюкози. Незважаючи на те, що дермальні фібробласти дуже давно використовуються для вивчення різних ефектів підвищення концентрації глюкози у системах in vitro, інформація відносно стану їх позаклітинного матриксу за цих умов є вкрай обмеженою, всупереч відомим і добре документованим змінам сполучної тканини шкіри за умов цукрового діабету in vivo [Sternberg et al., 1985; Hanna et al., 1987; Huntley, 1989]. Згідно з нашими результатами, найбільш демонстративними виявились зміни експресії і секреції фібронектину і зміни в акумуляції HA. Інкубація клітин протягом 2-7 діб з підвищеною концентрацією глюкози дозозалежно стимулювала експресію мРНК фібронектину (~ на 30% для 11 мМ і 70% для 30 мМ глюкози), експресію білка (35% та 120%) і секрецію (55% і 95%) фібронектину (абсолютні значення і приклади аналізу експресії мРНК і білка наведені на рис.14-16). Збільшення акумуляції HA у кондиційованому середовищі і матриксі фібробластів також залежало від часу інкубації.

Після 4 діб інкубації клітин з 30 мМ глюкози включення ³Н-глюкозаміну у перицелюлярну HA підвищувалось до 7,6?10³±0,8?10³ імп/хв (n=15) від 5,2?10³±0,6?10³ імп/хв (n=14) за контрольних умов, P<0,02. Включення попереднику у HA середовища складало 22.1?10⁴±2,4?10⁴ імп/хв (n=15) проти 16,3?10⁴±1,8?10⁴ імп/хв (n=15), для підвищеного і нормального рівня глюкози, відповідно, P<0,05.

У матриксі фібробластів збільшення акумуляції HA відбувалось за рахунок виключно високомолекулярної фракції, а у середовищі - за рахунок всіх фракцій, що свідчить на користь пригнічення деградації HA [Stern et al., 2006]. Зміни продукції фібронектину та акумуляції HA не були пов'язаними з осмотичним тиском.

Однак, збільшення концентрації глюкози не впливало на експресію мРНК TGFbeta1 і TSP-1 у дермальних фібробластах (рис.8).

Рис.8. Експресія мРНК TGFbeta1 і TSP-1 дермальними фібробластами. Інкубація (48 годин): 5,5 і 30 мМ глюкози. А - приклад аналізу експресії мРНК методом RT-PCR; Б - нормалізація смуг TGFbeta1 і TSP-1 до GAPDH. Для всіх груп n=12, використано дві окремі лінії клітин.

Таблиця 2. Концентрація TSP-1, активного (а) і тотального (т) TGFbeta1 у кондиційованому дермальними фібробластами середовищі (M±m)

Відсутність змін у експресії TGFbeta1 і TSP-1 спостерігалась також після 7 діб інкубації за підвищення концентрації глюкози. Крім того, ми не відмітили змін у цих показниках при застосуванні двох інших ліній дермальних фібробластів і інших праймерів для визначення експресії мРНК.

Секреція TSP-1 і TGFbeta1 та активація останнього також не змінювались за підвищення рівня глюкози (табл.2). Для визначення секреції і активації TGFbeta1 застосовували ще дві лінії дермальних фібробластів, отже, загальна кількість ліній, які були вивчені, становила шість. Клітини були отримані від людей різного віку та статі, локалізація шкіри для встановлення ліній клітин і метод отримання первинних культур теж були різними. Наведені дані, за нашою думкою, дозволяють зробити висновок стосовно того, що дермальні фібробласти людини не відповідають на підвищення концентрації глюкози збільшенням продукції TSP-1 і TGFbeta1 і активацією TGFbeta1. Отже, збільшення рівня глюкози стимулює синтез і секрецію фібронектину дермальними фібробластами і акумуляцію HA цими клітинами, але TSP-1 - залежний механізм активації TGFbeta1, актуальність якого доведена для дермальних фібробластів у контрольних умовах, не має відношення до регуляції стану позаклітинного матриксу в даному випадку. Пізніше, наші результати були підтверджені інформацією про відсутность змін експресії і секреції TGFbeta1 за підвищення концентрації глюкози у дермальних фібробластах з одночасною стимуляцією експресії і активності металопротеіназ і зменшенням продукції тканинного інгібітору металопротеіназ [Solini et al., 2006].

Таким чином, отримані нами результати свідчать на користь гіпотези стосовно непричетності TGFbeta1 до змін структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу сполучної тканини шкіри за цукрового діабету.

Специфічність фенотипу дермальних фібробластів хворих на цукровий діабет тип 2, який супроводжується хронічними виразками стопи. Певним підтвердженням гіпотези щодо незалежності стану матриксу сполучної тканини шкіри від TGFbeta1 можуть бути результати порівняння фенотипових властивостей дермальних фібробластів хворих на цукровий діабет 2-го типу, що мають хронічні виразки, з властивостями клітин хворих без виразок і контрольних фібробластів. Лінії клітин були отримані від 4 здорових донорів, 4 хворих на діабет 2-го типу без виразок і 4 хворих на діабет з виразками. Вік здорових донорів відповідав віку хворих на діабет (55-75 років), тривалість захворювання не відрізнялась між двома групами, інші ускладнення діабету були відсутні. Культури фібробластів хворих на діабет з виразками ініціювались з неушкоджених ділянок шкіри, розташованих далеко від місця виразки, що унеможливлювало вплив самої виразки на фенотип клітин.

Концентрація активного і тотального цитокіну в кондиційованому середовищі фібробластів хворих з виразками дорівнювала, відповідно, 0,23±0,02 нг/мл (n=16) і 4,09±0,45 нг/мл (n=16), а фібробластів хворих без виразок - 0,21±0,02 нг/мл (n=16) і 3,85±0,43 нг/мл (n=16), отже, секреція і активація TGFbeta1 для обох груп клітин не відрізнялась від контрольних (див.табл.2) значень. Незважаючи на цей факт, фібробласти хворих на діабет з виразками акумулювали більше високомолекулярної HA в перицелюлярному матриксі (рис.9,А) і експресували більше CD44 (рис.9,Б). Фібробласти обох «діабетичних» груп синтезували однакову кількість лактату (на 35% більше контрольних клітин), але екзогенний лактат стимулював акумуляцію перицелюлярної HA тільки в клітинах хворих з виразками, а чутливість цих клітин до дії лактату стосовно стимуляції експресії CD44 була на 40% вищою.

Рис.9. Акумуляція перицелюлярної гіалуронової кислоти (HA) і експресія CD44 контрольними фібробластами та клітинами хворих на цукровий діабет 2-го типу. А - включення ³Н-глюкозаміну у HA, Б - експресія CD44. Дані наведено як M±m з 2-х експериментів для кожної лінії у 2-х повторностях, * - P<0,05, у порівнянні до контролю.

Фібробласти хворих на цукровий діабет 2-го типу демонстрували пригнічення проліферації (рис.10), що узгоджувалось з даними попередніх досліджень [Giernat, 1993; Hehenberger et al., 1999].

Рис.10. Проліферація контрольних фібробластів та клітин хворих на цукровий діабет 2-го типу. Кількість експериментів, як на рис.9, m не перевищували 10% від M.

Клітини хворих на діабет з виразками мали подовжений lag-період, збільшення часу подвоєння популяції (47,6±2,4 (n=16) проти 61,3±5,7 годин для контролю (n=16), P<0,05), і зниження конфлюєнтної щільності (32,9±2,9 (n=16) проти 26,7±2,2х10³ клітин/см² для контролю (n=16), P<0,01), яке не було властиве клітинам хворих без виразок

Таким чином, підвищення акумуляції перицелюлярної HA, експресії CD44 і чутливості до дії екзогенного лактату відрізняє фібробласти хворих на діабет з виразками не тільки від контрольних клітин, але й від фібробластів хворих без виразок. Ці ж риси можуть бути причетними до глибоких негативних змін у проліферативних властивостях дермальних фібробластів від хворих з виразками in vitro, і, отже, до трансформації гострих ран у хронічні виразки у таких хворих.

Система ангіотензин ІІ - рецептори тип-1 і експресія CTGF у дермальних фібробластах за підвищення концентрації глюкози. Оскільки збільшення концентрації глюкози не впливає на продукцію і активацію TGFbeta1 у дермальних фібробластах, але стимулює синтез і секрецію фібронектину, ми вважали доцільним з'ясувати можливий механізм цього явища. У клітинах різних типів підвищений рівень глюкози активує локальну систему ангіотензин ІІ (Ang II) - рецептор тип-1 (АТ1) через стимуляцію утворення Ang II і/або експресію АТ1 [Lavrentyev et al., 2007, Asbun et al., 2005]. Активація цієї системи здатна безпосередньо, поза TGFbeta1, індукувати експресію CTGF і біологічну відповідь, і, зокрема, синтез фібронектину. Всі компоненти системи утворення Ang II, рецептори АТ1 і АТ2 та CTGF експресовані у дермальних фібробластах, але вплив збільшення концентрації глюкози на ці параметри був недослідженим.

Рис.11. Експресія рецептора АТ1 у дермальних фібробластах. Інкубація: 5,5 і 30 мМ глюкози. А-приклад аналізу методом RT-PCR, Б-нормалізація смуг АТ1 до GAPDH, В-приклад аналізу методом Western blotting; Г- нормалізація смуг АТ1 до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, *** - P<0,01 порівняно до контролю.

Згідно з нашими даними, експресія компонентів утворення Ang II і його концентрація не змінюються за підвищення рівня глюкози, але відбувається індукція експресії АТ1 (рис.11). Крім того, збільшення концентрації глюкози призводить до дуже значного підвищення експресії CTGF, відповідно, на рівні мРНК і білка (рис.12 і рис.13), що не обумовлено осмотичним тиском. Блокатор AT1, лосартан, скасовував стимуляцію експресії CTGF (рис.12 і рис.13), на відміну від PD123319 (блокатор AT2), отже, стимуляція експресії AT1 за підвищення концентрації глюкози обумовлює збільшення експресії CTGF.