Роль трансформувального фактора росту beta1 в регуляції структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу за цукрового діабету

Рис.12. Експресія мРНК фактора росту сполучної тканини (CTGF) у дермальних фібробластах. Інкубація з різними концентраціями глюкози, як на рис.11, крім того - 30 мМ глюкози +10 мкМ лосартану (L) або PD123319, 5,5 мМ глюкози+2 нг/мл TGFbeta1, 5,5 мМ глюкози+2 нг/мл TGFbeta1+300 нг/мл нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл (AB-TGFbeta1), 30 мМ глюкози+300 нг/мл AB-TGFbeta1. А - приклад аналізу методом RT-PCR; Б- нормалізація смуг CTGF до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, *** - P<0,01, у порівнянні до 5,5 мМ глюкози.

Рис.13. Експресія фактора росту сполучної тканини (CTGF) у дермальних фібробластах. Інкубація з різними концентраціями глюкози і блокаторами рецепторів АТ1, АТ2, як на рис.12. А - приклад аналізу методом Western blotting; Б - нормалізація смуг CTGF до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, *** - P<0,01, у порівнянні до 5,5 мМ глюкози.

На рис.8 і у табл.2 наведено дані, які свідчать, що стимуляція експресії, секреції і активації TGFbeta1 у дермальних фібробластах не відбувається за збільшення концентрації глюкози.

У поточному розділі ми підтвердили ці дані, застосовуючи інші лінії клітин. Для того, щоб довести непричетність TGFbeta1 до змін експресії CTGF в умовах підвищення концентрації глюкози ми порівняли ефект нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл на експресію CTGF, що була індукована екзогенним TGFbeta1 і 30 мМ глюкози.

Екзогенний TGFbeta1 і підвищений рівень глюкози стимулювали експресію мРНК CTGF (рис.12).

Однак, нейтралізуючі анти-TGFbeta1 антитіла скасовували збільшення експресії CTGF, що було індуковане TGFbeta1, але були неефективними у випадку підвищеної концентрації глюкози. Таким чином, підвищення концентрації глюкози індукує експресію CTGF дермальними фібробластами через стимуляцію експресії AT1, але незалежно від TGFbeta1.

Наступним важливим моментом цієї частини досліджень було вивчення можливої ролі системи Ang II - AT1 у індукованих збільшенням концентрації глюкози змінах синтезу і секреції фібронектину.

Використовуючи інші лінії дермальних фібробластів, ми знову зафіксували збільшення експресії мРНК (рис.14), білка (рис.15) та секреції фібронектину (рис.16) за підвищення концентрації глюкози. Блокада AT1 лосартаном повністю нормалізувала експресію і секрецію фібронектину, але нейтралізуючі анти-CTGF антитіла тільки частково зменшували ці показники, і продукція фібронектину залишалась вірогідно більшою, ніж за умов нормальної концентрації глюкози. Слід підкреслити, що нейтралізуючі анти-CTGF антитіла скасовували стимуляцію екзогенним CTGF синтезу і секреції фібронектину, а неспецифічні антитіла були неефективними.

Рис.14.Експресія мРНК фібронектину дермальними фібробластами. Інкубація з різними концентраціями глюкози, блокаторами АТ1, АТ2, TGFbeta1 і анти- TGFbeta1 антитілами, як на рис.12. Крім того - 5,5 мМ глюкоза+50 нг/мл CTGF, 5,5 мМ глюкоза+CTGF+400 нг/мл анти-CTGF антитіл (AB-CTGF), 30 мМ глюкози+AB-CTGF. А-приклад аналізу методом RT-PCR; Б- нормалізація смуг фібронектину до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, *- P<0,05, ***- P<0,01 у порівнянні до 5,5 мМ, ⁺- P<0,05 у порівнянні до 30 мМ глюкози.

Рис.15. Експресія фібронектину дермальними фібробластами. Інкубація, як на рис.14. А - приклад аналізу методом Western blotting; Б - нормалізація смуг фібронектину до GAPDH. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, **- P<0,02, ***- P<0,01 у порівнянні до 5,5 мМ, ⁺- P<0,05 - до 30 мМ глюкози.

Рис.16. Секреція фібронектину дермальними фібробластами. Інкубація, як на рис.14. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12,*- P<0,05, ***- P<0,01 у порівнянні до 5,5 мМ, ⁺⁺- P<0,02 - до 30 мМ глюкози

Блокада AT1 лосартаном повністю нормалізувала експресію і секрецію фібронектину, але нейтралізуючі анти-CTGF антитіла тільки частково зменшували ці показники, і продукція фібронектину залишалась вірогідно більшою, ніж за умов нормальної концентрації глюкози. Слід підкреслити, що нейтралізуючі анти-CTGF антитіла скасовували стимуляцію екзогенним CTGF синтезу і секреції фібронектину, а неспецифічні антитіла були неефективними.

Абсолютна залежність стимуляції експресії і секреції фібронектину від сигнальної системи Ang II - AT1 в умовах підвищення концентрації глюкози і тільки часткова залежність від збільшення експресії CTGF означає, що активація системи Ang II - AT1 може індукувати експресію інших факторів (або рецепторів до них), які модулюють синтез фібронектину. Це було, зокрема, продемонстровано для рецепторів епідермального фактору росту фібробластів дерми [Yahata et al., 2006] і для фактору росту фібробластів-2 міоцитів серця [Fisher et al.,1997].

Щодо потенційних механізмів, які можуть бути відповідальними за збільшення експресії AT1 і CTGF в дермальних фібробластах за збільшення концентрації глюкози, то, зрозуміло, що це питання потребує спеціальних досліджень. Загалом, вважається, що до цих явищ має бути причетним розвиток оксидативного стресу з залученням транскрипційного фактору NF-кB [Li et al., 2000].

Ми показали також, що в умовах підвищення концентрації глюкози збільшення експресії CTGF і синтезу та секреції фібронектину відбуваються незалежно від TGFbeta1, оскільки антитіла, що нейтралізують його дію, не змінюють рівень обох показників, але скасовують ефект екзогенного цитокіну. Ці результати знову свідчать на користь того, що структурно-функціональний стан позаклітинного матриксу сполучної тканини шкіри за гіперглікемії не залежить від TGFbeta1. Отримані нами результати та їх співставлення з іншими дослідженнями [Ahmed et al., 2004; Denton et al., 2008] виявляють важливе значення локальних систем ренін-ангіотензиноген для розвитку фібротичних змін різного ґенезу у різних тканинах.

Підсумовуючи все наведене вище, можна заключити: збільшення концентрації глюкози стимулює експресію рецептора AT1 в дермальних фібробластах, що призводить до незалежної від TGFbeta1 індукції експресії CTGF, який, в свою чергу, стимулює експресію і секрецію фібронектину.

Роль TGFbeta1 у структурно-функціональних змінах стану позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин за підвищення концентрації глюкози. Дезорганізуючий вплив підвищення концентрації глюкози на стан позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин є добре відомим явищем, особливо, стосовно надлишкової акумуляції білків, що вважається типовою ознакою діабетичних ускладнень. Однак, питання щодо значення TGFbeta1 залишалось невирішеним остаточно, навіть для таких класичних маркерів змін білків ендотеліального матриксу за умов гіперглікемії, як фібронектин і PAI-1 [Pascal et al., 1999, Zhu et al., 2004].

Згідно з нашими результатами, TGFbeta1 опосередковує стимуляцію секреції фібронектину і PAI-1 у ендотеліальних клітинах (iHUVEC та ECV304) за збільшеного рівня глюкози. Цей висновок випливає з пригнічення секреції обох речовин нейтралізуючими анти-TGFbeta1 антитілами за надлишку глюкози, стимуляції їх секреції екзогенним цитокіном і відсутності адитивності ефектів підвищення концентрації глюкози та TGFbeta1. Однак, застосування нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл не призводить до повної нормалізації цих показників.

Інші фактори, окрім TGFbeta1, також мають бути залученими до механізму патогенетичного ефекту гіперглікемії на білки ендотеліального матриксу, як це вже відомо для IGF-1 і ендотеліну-1 [Khan et al., 2006, Ban and Twigg, 2008].

Вплив підвищеної концентрації глюкози на GAG компонент ендотеліального матриксу був досліджений значно гірше, за виключенням відомого зменшення акумуляції HS. TGFbeta1 не опосередковує це явище, і вважається, що до нього причетна активація ендотеліальних гепараназ [Han et al, 2005]. Згідно з нашими даними, підвищення концентрації глюкози не тільки пригнічує акумуляцію HS, але стимулює (1,5-2 рази) акумуляцію CS та DS в усіх компартментах ендотеліальних культур (iHUVEC та ECV304). TGFbeta1 обумовлює зміни акумуляції CS та DS, оскільки вони повністю нормалізуються застосуванням нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл і імітуються екзогенним цитокіном. Останнє узгоджується з стимуляцією TGFbeta1 синтезу CS і DS у різних типах ендотеліальних клітин [Kobayashi et al., 1992, Kaji et al.,2000].

Акумуляція HA за підвищення рівня глюкози не змінюється у кондиційованому середовищі клітин, але у 1,5 рази збільшується у перицелюлярнму матриксі (рис.17), що призводить до вірогідного збільшення відношення між акумуляцією ¹⁴С-HA у матриксі і середовищі. Нейтралізуючі анти-TGFbeta1 антитіла нормалізують вказані показники, а екзогенний TGFbeta1 імітує ефект збільшення рівня глюкози. Отримані результати свідчать на користь того, що TGFbeta1 є медіатором ефекту підвищеної концентрації глюкози на акумуляцію HA.

Рис.17. Акумуляція гіалуронової кислоти (HA) у перицелюлярному матриксі клітин ECV304. Інкубація (48 годин): 5,6 і 30 мМ глюкози, 30 мМ глюкози+0,75 мМ в-D-ксилозиду (в-D-xyl), 30 мМ глюкози+500 нг/мл AB-TGFbeta1, 5,6 мМ глюкози+1 нг TGFbeta1, 5,6 мМ глюкози+1 нг TGFbeta1+0,75 мМ в-D-xyl. Дані наведено як M±m, для кожної групи n=12, **-P<0,02, ***-P<0,01 у порівнянні з 5,6 мМ глюкози, ⁺-P<0,05, у порівнянні з 30 мМ глюкози, ^#-P<0,05 у порівнянні з TGFbeta1.

Важливий доказ причетності TGFbeta1 до збагачення матриксу ендотеліальних клітин на HA за підвищення рівня глюкози був отриманий при вивченні механізму цього явища. Як відомо, вміст HA у перицелюлярному матриксі ендотеліальних клітин (глікокаліксі) майже виключно визначається взаємодією HA з CD44, а на будь-який вплив, дію TGFbeta1, у тому числі, ендотеліальні клітини (окрім ендотелію тканин ока) відповідають тільки змінами зв'язування HA з CD44 [Mohamedzeh et al., 1998, Nandi et al., 2000].

Зміни у взаємодії між HA і CD44 виразно відображуються у змінах адгезії клітин до іммобілізованої HA.

Рис.18. Адгезія клітин ECV304 до іммобілізованої гіалуронової кислоти. Інкубація, як на рис.17. Окремі групи клітин, інкубованих з 30 мМ глюкози і TGFbeta1, перед вивченням адгезії обробляли 1од/мл хондроітинази ABC (ChABC). Дані наведено як M±m, для кожної групи n=12, **-P<0,02, ***-P<0,01 у порівнянні до 5,6 мМ глюкози, ⁺⁺-P<0,02, ⁺⁺⁺ -P<0,01 у порівнянні до 30 мМ глюкози, ^##-P<0,02 у порівнянні до TGFbeta1.

Інкубація ендотеліальних клітин з підвищеною концентрацією глюкози або з TGFbeta1 стимулює їх адгезію до іммобілізованої HA (рис.18), але не до полі-D-лізину. Нейтралізуючі анти-TGFbeta1 антитіла нормалізують адгезію, стимульовану збільшенням рівня глюкози. Оскільки експресія CD44 не змінюється ні під впливом підвищеної концентрації глюкози, ні під дією екзогенного TGFbeta1 (рис.19), збільшення адгезії клітин до HA може визначатися стимуляцією зв'язуючих властивостей CD44. Як відомо, зв'язуючі властивості CD44 обумовлені посттрансляційною модифікацією рецептора приєднанням ланцюгів sGAG, і, головним чином, CS [Ponta et al., 2003], значне збільшення акумуляції якого у матриксі ендотеліальних клітин було відмічено нами за підвищення рівня глюкози. Ми припустили, що стимуляція посттрансляційних змін CD44 приєднанням ланцюгів CS, опосередкованим TGFbeta1, може бути причетною до збільшення зв'язуючих властивостей CD44 під впливом підвищення рівня глюкози. Конкурентне інгібування в-D-ксилозидом кон'югації ланцюгів sGAG з коровими білками протеогліканів (CD44, зокрема) зменшувало адгезію ендотеліальних клітин до HA (рис.18) і акумуляцію перицелюлярної ¹⁴С-HA (рис.17), стимульованих надлишком глюкози або TGFbeta1.

Рис.19. Експресія рецептору CD44 ендотеліальними клітинами (ECV304). Інкубація, як на рис.17, дані наведено як M±m, n=12 для всіх груп.

Зменшення адгезії клітин преінкубацією з хондроітиназою ABC продемонструвало (рис.18), що саме ланцюги CS обумовлюють стимуляцію адгезії в обох випадках. Ні хондроітиназа B (деградує DS), ні кератаназа (деградує кератан сульфат), ні гепаритиназа І (деградує HS) не змінювали адгезію ендотеліальних клітин до іммобілізованої HA. Аналогічні результати були отримані з використанням клітин iHUVEC.

Таким чином, збільшення акумуляції CS, DS і HA в ендотеліальних клітинах за підвищення концентрації глюкози, з одного боку, скасовується нейтралізуючими анти-TGFbeta1 антитілами, а з другого, імітується екзогенним цитокіном. Схожість ефектів підвищеного рівня глюкози та екзогенного TGFbeta1 підкреслюється відсутністю змін експресії CD44 і однаковим ефектом чинників, які здатні змінювати посттрансляційну модифікацію рецепторів. Отже, властива ендотеліальним клітинам специфічність регуляції рівня HA у їх перицелюлярному матриксі виявляється і за дії підвищення концентрації глюкози

Отримані дані свідчать, що за умов підвищеної концентрації глюкози TGFbeta1 опосередковує стимуляцію продукції фібронектину і PAI-1 ендотеліальними клітинами і повністю обумовлює збагачення їх перицелюлярного матриксу на гіалуронову кислоту, хондроітин сульфат і дерматан сульфат.

Активація TGFbeta1 в ендотеліальних клітинах за підвищення концентрації глюкози. У попередньому розділі роботи, де наданий аналіз ролі TGFbeta1 у дезорганізації позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин за підвищення концентрації глюкози, під TGFbeta1 розумілась активна форма цитокіну, а питання про секрецію латентного TGFbeta1 і його перетворення в активну форму не розглядалось. Оскільки ефект збільшення концентрації глюкози на активацію TGFbeta1 в ендотеліальних клітинах і, зокрема, значення TSP-1-залежного механізму, були недослідженими, ми вважали доцільним розглянути це питання окремо. Згідно з нашими даними, підвищення концентрації глюкози стимулює секрецію латентного TGFbeta1 і його активацію в ендотеліальних клітинах (табл.3), і результати інших, більш пізніх, досліджень підтвердили цей висновок [Vasquez et al., 2007, Takamura et al., 2008]. Зрозуміло, що для надактивації TGFbeta1 завдяки TSP-1-залежному механізму необхідно збільшення концентрації TSP-1 у позаклітинному просторі, але ми не виявили змін у секреції TSP-1 за підвищеної концентрації глюкози (табл.3). Аналогічні результати були отримані з використанням клітин ECV304.

Таблиця 3. Секреція і активація TGFbeta1, секреція TSP-1, продукція оксиду азоту (NO) і синтез циклічного гуанозін монофосфату (cGMP) ендотеліальними клітинами (iHUVEC) за підвищеної концентрації глюкози (M±m)

Інкубація, як на рис.17, концентрація речовин визначена протягом останніх 24 годин,**-P<0,02 у порівнянні до 5,6 мМ глюкози.

Дані літератури щодо цього питання обмежуються суперечливими результатами двох досліджень: про зменшення [Shiebani et al., 2000] або збільшення [Bhattacharya et al., 2008] експресії мРНК TSP-1, без визначення секреції TSP-1. Відомо, що стимуляція синтезу TSP-1 може відбуватися через пригнічення утворення NO і cGMP [Wang et al., 2002, Ridnour et al., 2005]. Однак, ми не зареєстрували змін цих показників за підвищеної концентрації глюкози (табл.3), що узгоджується з незміненою секрецією TSP-1. Можливо, активація TGFbeta1 у ендотеліальних клітинах за підвищення концентрації глюкози є наслідком зниження рівня відновленого глутатіону, що перетворює димер TGFbeta1 на неактивні мономери [White et al., 1999], і зниження рівня якого збільшує концентрацію активного TGFbeta1. Однак, з'ясування цього питання потребує детальних досліджень.

Загалом, наведені дані свідчать, що підвищення концентрації глюкози стимулює збільшення продукції і активації TGFbeta1 в ендотеліальних клітинах, але активація TGFbeta1 відбувається поза TSP-1-залежним механізмом.

Дезорганізація позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин під впливом D-димеру фібрину. Зростання концентрації D-димеру фібрину (DD) у циркуляції за цукрового діабету корелює з розвитком багатьох діабетичних ускладнень, але механізм цього явища залишається невідомим. DD пригнічує експресію ендотеліальної NO-синтази в ендотеліальних клітинах in vitro і знижує синтез NO [Freedman et al., 1995]. Оскільки зменшення рівня NO стимулює активацію TGFbeta1, ми вважали доцільним вивчити вплив DD на TSP-1-залежну активацію TGFbeta1 і на її наслідки стосовно структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин.

DD пригнічує синтез NO від 42,87±5,09 (n=5) до 26,54±3,11 (n=5) пмоль NO₂^-/мл (P<0,02) і синтез cGMP від 117,6±12,5 (n=12) до 64,1±6,8 (n=12) пг/мл, (P<0,01) клітинами iHUVEC, але стимулює секрецію TSP-1 і активацію TGFbeta1, не впливаючи на секрецію тотального TGFbeta1 (рис.20). Додавання W-пептиду (але не Y-пептиду) нормалізує DD-індуковану активацію TGFbeta1, що вказує на функціонування класичного TSP-1-залежного механізму активації TGFbeta1 за цих умов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.20. Вплив DD на секрецію TSP-1 та активацію TGFbeta1 в клітинах iHUVEC. Інкубація (48 годин): 3,5 мкМ DD та DD+1 мкМ W- або Y-пептиду. Дані наведено як M±m, для всіх груп n=12, ***- P<0,01 у порівнянні до контролю.

Як показано на рис.21, DD стимулює секрецію фібронектину і акумуляцію перицелюлярних CS та HA. Медіатором впливу DD на ці показники є TGFbeta1, оскільки W-пептид і нейтралізуючі анти-TGFbeta1 антитіла скасовують ефект DD.

Однак, зменшення акумуляції HS не залежить від TGFbeta1 (рис.21) і може бути пов'язаним з ефектом DD-індукованого пригнічення синтезу NO.

Рис.21. Вплив DD на секрецію фібронектину і акумуляцію перицелюлярних хондроітин сульфату (CS), гіалуронової кислоти (HA) і гепаран сульфату (HS) у перицелюлярному матриксі ендотеліальних клітин (iHUVEC). Інкубація з DD та DD+W, як на рис.20. Крім того - DD+500 нг/мл нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл (AB-TGFbeta1). Дані наведено у відсотках від контролю для кожної проби. Для всіх груп n=12, **- P<0,02, ***- P<0,01 у порівнянні з контролем.

Відомо, що нестача NO призводить до деградації HS і одночасного збільшення ступеню його сульфатування, що погіршує антикоагуляційні властивості HS (зв'язування з антитромбіном, АТ) [Okasora et al, 1992, Gallagher, 1997]. L-NMMA, конкурентний інгібітор синтезу NO, імітує дію DD на акумуляцію HS і його зв'язування з антитромбіном, а додавання аскорбінової кислоти, стимулятору синтезу NO, до клітин, інкубованих з DD, скасовує його дію. Аналогічні дані були отримані з меншими концентраціями (1,5 мкМ) DD і при використанні ендотеліальних клітин аорти кроля. Отже, зміни акумуляції і структури HS під впливом DD обумовлені пригніченням синтезу NO. Ми з'ясували, що пригнічення синтезу NO під впливом DD і зміни стану ендотеліального матриксу опосередковуються взаємодією ICAM-1 з фрагментом фібриногену 117-133, експонованому в DD. Передумовою для цих досліджень була необхідність у активації експресії ICAM-1 для виявлення дії DD, оскільки за стандартних умов культивування ендотеліальних клітин експресія ICAM-1 в них пригнічена [Crook et al., 2000]. Було застосовано два наступні підходи. По-перше, ми використали синтетичний пептид NNQKIVNLKEKVAQLEA (gamma 3), амінокислотна послідовність якого відповідає послідовності амінокислот 117-133. Під дією gamma 3, як і під дією DD, пригнічувався синтез NO з відповідними негативними змінами акумуляції і властивостей HS, а також пригнічувався синтез cGMP, внаслідок чого зростала TSP-1-залежна активація TGFbeta1. Активація TGFbeta1 стимулювала секрецію фібронектину і збагачення перицелюлярного матриксу ендотеліальних клітин на CS і HA. Контрольний пептид з випадковою послідовністю тих же амінокислот, що і gamma 3, був неефективним. По-друге, преінкубація клітин з анти-ICAM-1 антитілами блокувала взаємодію 117-133 з ICAM-1 і скасовувала, таким чином, зміни зазначених показників під дію DD і під дією gamma 3.

Слід відзначити також, що найбільш складним і цікавим виявився вплив DD на секрецію PAI-1 ендотеліальними клітинами. Індукована дією DD активація TGFbeta1 стимулювала секрецію PAI-1, однак DD збільшував цей показник (майже у 3 рази) і в тому випадку, коли не проводилась активація експресії ICAM-1. Отже, цей ефект DD не залежав від взаємодії ICAM-1 і 117-133, що узгоджувалось з відомим фактом стимуляції транскрипції PAI-1 в фібробластах під впливом DD [Olman et al., 1999]. Відповідно, блокада TSP-1-залежної активації W-пептидом та застосування нейтралізуючих анти-TGFbeta1 антитіл не впливали на секрецію PAI-1 у неактивованих і тільки частково зменшували його секрецію у активованих клітинах на відміну від повної нормалізації секреції фібронектину.

Таким чином, D-димер фібрину зменшує акумуляцію перицелюлярного HS ендотеліальних клітин і погіршує його антикоагуляційні властивості, що пов'язано з пригніченням синтезу оксиду азоту. D-димер стимулює секрецію фібронектину і PAI-1 та сприяє збагаченню позаклітинного матриксу ендотеліальних клітин на гіалуронову кислоту і хондроітин сульфат. Ці ефекти D-димеру обумовлені TSP-1-залежною активацією TGFbeta1.

Висновки

Робота присвячена вирішенню актуальної наукової проблеми щодо функціональної ролі TSP-1-залежної активації TGFbeta1 у змінах стану позаклітинного матриксу клітин різного типу за цукрового діабету. Показано, що для мезангіальних і ендотеліальних клітин та дермальних фібробластів підвищення концентрації глюкози стимулює акумуляцію ведучих регуляторних компонентів позаклітинного матриксу - фібронектину і гіалуронової кислоти. З'ясовано, що механізми реалізації патогенетичного впливу збільшення рівня глюкози різні для кожного типу клітин. Встановлено ключову роль TSP-1 у TGFbeta1 - залежних порушеннях позаклітинного матриксу мезангіальних клітин, що створює теоретичну основу для розробки нових методів терапії діабетичних нефропатій на основі блокади шляху TSP-1 - TGFbeta1.

1. Спільною рисою ускладнень цукрового діабету вважається дезорганізація структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу, головним регулятором метаболізму якого є TGFbeta1. Тому стимуляція синтезу і сигналінгу TGFbeta1 за гіперглікемії має принципово важливе значення для розвитку діабетичних ускладнень. Відомо, що детермінуючим етапом регуляції дії TGFbeta1 є активація його латентної форми, що за гіперглікемії найвірогідніше відбувається внаслідок взаємодії з TSP-1. Залишалось невідомим, чи здатен ендогенний TSP-1 активувати TGFbeta1 за підвищеної концентрації глюкози, і, якщо здатен, то чи забезпечує ця надактивація зміни позаклітинного матриксу, притаманні цукровому діабету. Отримання відповіді на це питання стало предметом даного дослідження, проведеного з використанням клітин різного типу.

2. В мезангіальних клітинах, дермальних фібробластах і ендотеліальних клітинах людини функціонує механізм TSP-1-залежної активації TGFbeta1. В мезангіальних клітинах за підвищення концентрації глюкози TSP-1-залежна активація TGFbeta1 обумовлює збільшення експресії і секреції фібронектину та інгібітору активатора плазміногену-1, збільшення експресії фактора росту сполучної тканини і стимуляцію синтезу гіалуронової кислоти. В дермальних фібробластах за підвищення концентрації глюкози стимулюється експресія і секреція фібронектину та акумуляція гіалуронової кислоти, але не змінюється експресія і секреція TSP-1 та експресія, секреція і активація TGFbeta1.

Дермальні фібробласти хворих на цукровий діабет 2-го типу з хронічними виразками кінцівок характеризуються збільшенням акумуляції гіалуронової кислоти в позаклітинному матриксі, збільшенням експресії CD44 і пригніченням проліферації порівняно до фібробластів хворих без виразок і контрольних клітин. Секреція та активація TGFbeta1 однакові для всіх груп клітин. В дермальних фібробластах за підвищення концентрації глюкози збільшується експресія рецептора тип-1 до ангіотензину ІІ, що призводить до незалежної від TGFbeta1 індукції експресії фактора росту сполучної тканини. Збільшення експресії фактора росту сполучної тканини, в свою чергу, стимулює експресію і секрецію фібронектину. В ендотеліальних клітинах за підвищення концентрації глюкози TGFbeta1 є медіатором збільшення продукції фібронектину і інгібітору активатора плазміногену-1 та акумуляції гіалуронової кислоти, хондроітин і дерматан сульфатів, але секреція TSP-1 не змінюється і надлишкова активація TGFbeta1 не обумовлюється дією TSP-1-залежного механізму. D-димер фібрину пригнічує акумуляцію і знижує антикоагуляційні властивості перицелюлярного гепаран сульфату ендотеліальних клітин і одночасно індукує TSP-1-залежну активацію TGFbeta1, стимулює продукцію фібронектину і інгібітору активатора плазміногену-1, акумуляцію гіалуронової кислоти і хондроітин сульфату у позаклітинному матриксі. Виявлена нормалізація структурно-функціонального стану мезангіального матриксу, що відбувається внаслідок блокади TSP-1-залежної активації TGFbeta1, створює теоретичну основу для розробки методів терапії діабетичних нефропатій.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Евдокимова Н.Ю. Синтез, секреция и механизм действия инсулина / Н.Ю. Євдокимова // В “Клиническая диабетология», Київ :“Здоров'я”, 1998. - С.34-45.

2. Yevdokimova N.Yu. Activation of paracrine growth factors by heparan sulphate induced by glucocorticoid in A549 lung carcinoma cells / N.Yu.Yevdokimova, R.I. Freshney // Br. J. Cancer.- 1997. - V.76, № 3. - P.281-289.

3. Yevdokimova N.Yu. High glucose modulates insulin responsiveness of carbohydrate metabolism and glycosaminoglycan synthesis in human cultured dermal fibroblasts / N.Yu.Yevdokimova, A.S.Yefimov // Diabetol. Croat. - 1997. - V. 26, № 2. - P. 75-81.

4. Yevdokimova N.Yu. The ability of high glucose to modulate insulin action is preserved in IDDM fibroblasts / N.Yu.Yevdokimova, A.S.Yefimov // Diabetol. Croat. - 1997. - V. 26, № 3. - P. 129-134.

5.Євдокимова Н.Ю. Стимуляція інсуліном синтезу глікозаміногліканов у дермальних фібробластах хворих на інсулінозалежний цукровий діабет в умовах підвищеного рівня глюкози / H. Ю.Євдокимова, А.С. Єфімов // Журн. АМН України. - 1998. - T.4, № 2. - C. 314-323.

6. Ефимов А.С. Актуальные вопросы лечения сахарного диабета и его осложнений / А.С. Ефимов, Маньковский Б.Н., Костюк Е.П., Скробонская Н.А.,Ткач С.Н, Карабун П.М, Зуева Н.А, Ефимов Д.А, Евдокимова Н.Ю., Соколова Л.К., Орленко В.Л, Землянская С.В., Сахарова Ю.В, Новицкая А.В. // Журн АМН України. - 2000. - Т.6, № 3. - С. 471-484.

7. Yevdokimova N.Yu. High glucose does not increase insulin-stimulated heparan sulphate synthesis in IDDM dermal fibroblasts / N.Yu.Yevdokimova, A.S. Yefimov // Diabetol Croat. - 2000. - V.29, № 2. - P. 67-77.

8. Yevdokimova N.Yu. Thrombospondin-1 is the key activator of TGF-beta1 in human mesangial cells exposed to high glucose / N.Yu.Yevdokimova, N.Abdel Wahab, R.M. Mason // J. Am. Soc. Nephrol. - 2001. - V.12, № 4. - P. 703-712.

9. Wahab N.A. Role of connective tissue growth factor in the pathogenesis of diabetic nephropathy / N.A. Wahab, N.Yu. Yevdokimova, B.S. Weston, T. Roberts, X.J. Li, H. Brinkman, R.M. Mason // Biochem. J. - 2001. - V. 359, № 1. - P. 77-87.

10. Yevdokimova N.Yu. Effects of wheat germ agglutinin and concanavalin A on the accumulation of glycosaminoglycans in pericellular matrix of human dermal fibroblasts. A comparison with insulin / N.Yu.Yevdokimova, A.S.Yefimov // Acta Biochim. Polon. - 2001. - V.48, № 2. - P. 563-572.

11. Yevdokimova N.Yu. High-glucose induced alterations of extracellular matrix of human skin fibroblasts are not dependent on TSP-1-TGFbeta1 pathway / N.Yu. Yevdokimova // J. Diabetes Complications. - 2003. - V.16, № 6. - P. 355-365.

12. Yevdokimova N.Yu. Fibrin D-dimer impairs the accumulation and anticoagulant properties of heparan sulphate and stimulates plasminogen activator inhibitor-1 secretion by rabbit aortic endothelial cells / N.Yu. Yevdokimova, L.D Veselovska, G.K. Gogolinska, O.M. Buchanevich, G.V. Kosyakova, P.G. Gritsenko, E.V. Lugovskoj, S.V. Komisarenko // Acta Biochim. Polon. - 2003. - V. 50, № 1. - P. 279-289.

13. Yevdokimova N.Yu. The influence of high ambient glucose level on the production of pericellular glycosaminoglycans by cultured endothelial cells / N.Yu. Yevdokimova, S.V. Komisarenko // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75, № 5 - С. 55-62.

14. Євдокимова Н.Ю. Тромбоспондин-1-залежний механізм активації трансформувального фактора роста бета-1 у культивованих ендотеліальних клітинах людини / Н.Ю.Євдокимова, С.В. Комісаренко // Укр. біохім. журн.- 2004. - Т.76, № 5. - С. 83-89.

15. Yevdokimova N.Yu. TGFbeta1 is involved in high glucose-induced accumulation of pericellular chondroitin sulphate in human endothelial cells / N.Yu. Yevdokimova, S.V. Komisarenko // J. Diabetes Complications. - 2004. - V. 18, № 5. - P. 300 -308.

16. Skok M.V. The effect of simulated microgravity on hybridoma cells / M.V. Skok, L.M. Koval, Y.I. Petrova, O.Yu. Lykhmus, D.V. Kolibo, S.V. Romanyuk, N.Yu. Yevdokimova, S.V. Komisarenko // Acta Astronaut. - 2005. - V.56, № 8. - P. 721-728.

17. Yevdokimova N.Yu. Hyaluronic acid production and CD44 expression in cultured dermal fibroblasts of diabetic patients (non-insulin-dependent diabetes mellitus) with and without chronic ulcers on the lower extremity / N.Yu.Yevdokimova, S.E. Podpryatov // Wound Repair. Regen. - 2005. - V.13, № 2. - P. 181-188.

18. Євдокимова Н.Ю. Молекула міжклітинної адгезії-1 (ICAM-1) ендотеліальних клітин опосередковує ефект D-димеру фібрину на акумуляцію та властивості перицелюлярного гепаран сульфату / Н.Ю. Євдокимова, Е.В. Луговський, С.В. Комісаренко // Доповіді НАН України. - 2005. - №. 4. - C. 170-174.

19. Yevdokimova N.Yu. Elevated level of ambient glucose stimulates the synthesis of high-molecular-weight hyaluronic acid by human mesangial cells. The involvement of transforming growth factor в1 and its activation by thrombospondin-1 / N.Yu. Yevdokimova // Acta Biochim. Pol. - 2006. - V. 53, № 2. - P. 383-393.

20. Євдокимова Н.Ю. Метилен бісфосфонова кислота змінює спектр перицелюлярних глікозаміногліканів та зв'язувальні властивості CD44 ендотеліальних клітин людини / Н.Ю. Євдокимова, Н.П. Карлова, Н.C. Баранова, С.В. Комісаренко // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т.78, № 4 . - С. 95-103.

21. Yevdokimova N.Yu. The up-regulation of angiotensin II receptor type 1 and CTGF are involved in high-glucose-induced fibronectin production by cultured human dermal fibroblasts / N.Yu. Yevdokimova, S.E. Podpryatov // J. Dermatol. Sci. - 2007. - V.47, № 2. - P. 127-139.

22. Євдокимова Н.Ю. Гіалуронова кислота, рецептор CD44 та їхня роль в ускладненнях цукрового діабету (огляд) / Н.Ю.Євдокимова // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т.80, № 5. - С. 5-44.

23. Yevdokimova N.Yu. Insulin influence on glycosaminoglycan synthesis in skin fibroblasts / N.Yu.Yevdokimova // 2^nd Symposium of Tissue Culture Societies of Central Europe, Krakow (Poland), June 25-28, 1997.: Folia Hist. Cytobiol. - 1997. - V.35, Suppl.2. - P.47.

24. Yevdokimova N.Yu. Comparison of the alterations of glycosaminoglycan synthesis in cultured skin fibroblasts under the influnce of insulin and plant lectins/. N.Yu. Yevdokimova // 17^th International Lectin Meeting, Wurzburg (Germany), September 24-27, 1997.: Europ.J.Cell.Biol. - 1997. - V.74. Suppl.46. - P.39.

25. Yevdokimova N.Yu. The accelerated growth of IDDM fibroblasts is accompanied by the lack of low-salt-elution fraction of pericellular heparan sulphate / N.Yu. Yevdokimova, Freshney R.I. // 17^th Joint Meeting of the British Endocrine Societies, Edinburgh (Great Britain), March 23-25, 1998.: J.Endocrinol. - 1998. - Vol.156, suppl. - P.133

26. Yevdokimova N.Yu. The influence of D-dimer on GAG component of endothelial extracellular matrix / N.Yu.Yevdokimova, S.V.Komisarenko // XYIII^th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Paris (France), July 6-12, 2001.: J. Thromb. Haemost. - 2001. - V.4, Suppl. - P.2799.

27. Yevdokimova N.Yu. TGFbeta1 activation by TSP-1 is not involved in high-glucose induced disturbances of ECM in human skin fibroblasts / N.Yu.Yevdokimova, E.Yu. Lichmus // Cell Interactions and Cellular Complexity: 43^rd Meeting of the European Tissue Cell Society, Granada (Spain), September 30-October 3, 2001.: Abstract Book. - 2001. - P.32.

28. Євдокимова Н.Ю. Роль глікозаміногліканів у розвитку діабетичних ускладнень / Н.Ю. Євдокимова, А.С. Єфімов, Л.Д. Веселовська, С.В. Комісаренко // YIII-й Український біохімічний з”їзд, Чернівці (Україна),1-3 жовтня, 2002.: Укр. біохім. журн. - 2002. - Т.74, № 4a - С.98-99.

29. Yevdokimova N.Yu. The role of TSP-1 activation of TGFbeta1 in the development of fibrotic complications in IDDM / N.Yu.Yevdokimova // The International Meeting “Frontiers in Autoimmunity”, Keszthely (Hungary), September 8-18, 2002.:Abstract Book. - 2002. - P.6.

30. Yevdokimova N.Yu. The role of TSP-1 activation of TGFbeta1 in glucose-induced extracellular matrix derangement /N.Yu.Yevdokimova, S.V.Komisarenko // Molecular Mechanisms of Cell Activation: 4^th Parnas Conference, Wroclaw (Poland), September 15-17, 2002.:Abstract Book - 2002. - P. 24.

31. Yevdokimova N.Yu. The blockade of TSP-1-dependent TGFbeta1 activation in mesangial cells prevented the late growth inhibitory effect of high glucose and decreased matrix accumulation. // 16^th Annual Meeting of the European Diabetic Nephropathy Study Group, Elsinore (Denmark), May 2-3, 2003.:Abstract Book - 2003 - P.3.

32. Yevdokimova N.Yu The activation of transforming growth factor beta-1 by thrombospondin-1 and extracellular matrix derangement / N.Yu. Yevdokimova S.V.Komisarenko // Установчий з'їзд Українського товариства клітинної біології, Львів (Україна), 25-28 квітня, 2004.: Тези доповідей. - 2004 - С.136.

33. Yevdokimova N.Yu. D-dimer-induced derangement of endothelial extracellular matrix partially is mediated by TSP-1-dependent activation of TGFbeta1 / N.Yu. Yevdokimova, E.V., Lugovskoj S.V.Komisarenko // XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney (Australia), August 6-12, 2005.: J. Thromb. Haemost. - 2005 - V.3, Suppl 1.- OR009.

34. Yevdokimova N.Yu. The blockade of TSP-1/TGFbeta1 pathway prevented high glucose-induced late growth inhibition of mesangial cells / N.Yu.Yevdokimova, R.M. Mason // Molecular Mechanisms of Cellular Cignaling: 5th Parnas Conference, Kyiv (Ukraine), April 26-29, 2005.: Укр.біохім. журн. - 2005. - Т.77, № 2. - С.86.

35. Yevdokimova N.Yu. The role of TGFbeta1 in glycosaminoglycan metabolism in diabetes mellitus /N.Yu.Yevdokimova // 31th Congress of Federation of European Biochemical Societies, Istanbul (Turkey), June 24-29, 2006.: FEBS J. -2006. - V.273, Suppl.1. - P.54.

36. Yevdokimova N.Yu. TGFbeta1 is responsible for high-glucose-induced enrichment of ECM with hyaluronic acid. Different mechanisms for endothelial and mesangial cells / N.Yu.Yevdokimova, S.V.Komisarenko //Molecular mechanisms of Cellular Signalling: 6^th Parnas Conference, Krakow (Poland),May 30-June 2, 2007.:Acta Biochim. Pol. - 2007. - V.54, Suppl 2. -P.9-10.

37. Yevdokimova N.Yu. The shortage of reduced glutathione is involved in TGFbeta1 activation in hyperglycaemic endothelial cells. Possible link to cell “memory” / N.Yu.Yevdokimova, S.E. Podpryatov // 1^st Annual Meeting of the Diabetes and Cardiovascular Disease (EASD Study Group), Turin (Italy), November 21-23, 2008.: Diabetes Vasc. Dis. Res. - 2008 - V.5.,№ 4 - P.380.

Анотації

Євдокимова Н.Ю. Роль трансформувального фактору росту beta1 в регуляції структурно-функціонального стану позаклітинного матриксу за цукрового діабету. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено дослідженню функціональної ролі тромбоспондин-1 (TSP-1) - залежної активації трансформувального фактору росту beta1 (TGFbeta1) у дезорганізації позаклітинного матриксу внаслідок гіперглікемії. позаклітинний матрикс діабет beta1

Представлені дані є принципово важливими для розуміння механізмів розвитку діабетичних ускладнень і підкреслюють значення підвищення експресії TGFbeta1 у мезангіальних і ендотеліальних клітинах за збільшення концентрації глюкози.

Показано, що активація TGFbeta1 внаслідок дії TSP-1 є ключовим фактором надлишкової акумуляції компонентів мезангіального матриксу в умовах підвищення рівня глюкози.

Для ендотеліальних клітин, виявлено, що TGFbeta1 також є медіатором змін стану позаклітинного матриксу, індукованих підвищеною концентрацією глюкози, але TSP-1 не обумовлює активацію TGFbeta1. D-димер фібрину спричиняє дезорганізацію ендотеліального матриксу, що частково залежить від TSP-1- залежної активації TGFbeta1.

Зміни стану позаклітинного матриксу дермальних фібробластів, які відбуваються під впливом підвищеного рівня глюкози, не залежать від активації шляху TSP-1 - TGFbeta1.

Збільшення експресії рецепторів тип-1 до ангіотензину ІІ і наступне збільшення експресії фактору росту сполучної тканини опосередковують стимуляцію синтезу фібронектину внаслідок дії підвищеної концентрації глюкози на дермальні фібробласти.

Ключові слова: цукровий діабет, позаклітинний матрикс, трансформувальний фактор росту beta1, тромбоспондин-1, фібронектин, гіалуронова кислота.

Евдокимова Н.Ю. Роль трансформирующего фактора роста beta1 в регуляции структурно-функционального состояния внеклеточного матрикса при сахарном диабете. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04-биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертация посвящена изучению функциональной роли тромбоспондин-1 (TSP-1) - зависимой активации трансформирующего фактора роста beta1 (TGFbeta1) в дезорганизации внеклеточного матрикса под влиянием гипергликемии.

Представленные в работе данные принципиально важны для понимания механизмов развития разнообразных осложнений сахарного диабета, обобщающей чертой которых является дезорганизация структуры внеклеточного матрикса.

В работе показано, что физиологический механизм активации латентной формы TGFbeta1 - взаимодействие с TSP-1, функционирует в мезангиальных и ендотелиальных клетках человека и дермальных фибробластах в услових нормальной концентрации глюкозы.

Выяснено, что активация этого механизма при повышении уровня глюкозы в мезангиальных клетках является ключевым моментом для изменения состояния внеклеточного матрикса.

Блокада TSP-1 - зависимой активации TGFbeta1 полностью нормализует увеличенную продукцию не только фибронектина, но и ингибитора активатора плазминогена тип-1 и экспрессию фактора роста соединительной ткани, т.е. нормализует уменьшение деградации и избыточное накопление других белков и протеогликанов матрикса.

Впервые показанная стимуляция экспрессии гиалуронан синтазы-2 в мезангиальных клетках под влиянием увеличения уровня глюкозы также полностью определяется гиперактивацией TGFbeta1 за счет взаимодействия с TSP-1. Блокада активации нормализует экспрессию гиалуронан синтазы-2 и синтез высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (HA).

Стимуляция продукции фибронектина и аккумуляции HA в дермальных фибробластах под влиянием повышенного уровня глюкозы на фоне отсутствия изменений со стороны экспрессии и секреции TSP-1 и TGFbeta1 и активации последнего является экспериментальным подтверждением концепции о независимости состояния внеклеточного матрикса соединительной ткани кожи при диабете от действия TGFbeta1.

Правильность этой точки зрения иллюстрируется демонстрацией глубоких нарушений системы HA - рецепторы СD44 в фибробластах больных диабетом 2-го типа с хроническими язвами стопы. Фибробласты больных диабетом с язвами отличаются не только от контрольных фибробластов, но и от клеток больных диабетом без язв, что наблюдается при одинаковой для всех групп клеток секреции и активации TGFbeta1.

Впервые обнаружено, что увеличение уровня глюкозы приводит к up-регуляции экспрессии дермальными фибробластами рецептора тип-1 ангиотензина ІІ, следствием чего является увеличение экспрессии фактора роста соединительной ткани и стимуляция синтеза фибронектина. TGFbeta1 не вовлечен в наблюдаемые явления, что подчеркивает общебиологическое значение локальных систем ренин-ангиотензиноген для развития фибротических изменений в разных тканях.

Выяснено, что в эндотелиальных клетках медиатором индуцированной повышенным уровнем глюкозы стимуляции продукции фибронектина и ингибитора активатора плазминогена тип-1 является TGFbeta1, но его активация происходит вне TSP-1 - зависимого механизма.

Впервые показано, что при увеличении концентрации глюкозы TGFbeta1 полностью определяет обогащение матрикса эндотелиальных клеток высокомолекулярной HA.

Это явление обусловлено увеличением связывающих свойств рецептора CD44 вследствие присоединения цепей хондроитин сульфата к его коровому белку и подтверждает специфичность ендотелиальных клеток в отношении механизма регуляции уровня HA в их гликокаликсе.

Впервые проведенные исследования влияния D-димера фибрина на внеклеточный матрикс эндотелиальных клеток выявили уменьшение аккумуляции гепаран сульфата и ухудшение его антикоагуляционных свойств. Индукция TSP-1-зависимой активации TGFbeta1 стимулировала продукцию фибронектина, аккумуляцию HA и хондроитин сульфата в перицеллюлярном матриксе.

Причиной этих изменений является снижение синтеза оксида азота эндотелиальными клетками, непосредственно влияющее на свойства гепаран сульфата и опосредовано (через уменьшение синтеза циклического гуанозин монофосфата) стимулирующее синтез TSP-1. Установлено, что индуцируемые D-димером изменения структурно-функциональных свойств ендотелиального матрикса обусловлены связыванием фрагмента г117-133 фибриногена, который экспонирован в D-димере, с молекулой межклеточной адгезии-1.

Полученные данные свидетельствуют об общебиологическом значении TSP-1-зависимого механизма активации TGFbeta1 и важны для понимания механизмов регуляции структурно-функционального состояния внеклеточного матрикса различных типов клеток.

Эти результаты являются теоретической базой для разработки фармакологических средств терапии нефропатий различного генеза путем блокады активации TGFbeta1, подчеркивают важность контроля систем коагуляция-фибринолиз и создают предпосылку для поиска способов лечения хронических диабетических язв на основе использования гиалуроновой кислоты.

Ключевые слова: сахарный диабет, внеклеточный матрикс, трансформирующий фактор роста beta1, тромбоспондин-1, фибронектин, гиалуроновая кислота.

Yevdokimova N.Yu. The role of transforming growth factor beta1 in the regulation of structural-functional state of extracellular matrix in diabetes mellitus. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

The work deals with the study of the functional role of thrombospondin-1 (TSP-1) - dependent transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) activation in extracellular matrix derangement due to hyperglycaemia.

The presented data help to understand the mechanisms of diabetes complications development, as well as underline the importance of high-glucose-induced TGFbeta1 up-regulation in mesangial and endothelial cells. The activation of TGFbeta1 by TSP-1 was shown to be the key event in the excessive accumulation of mesangial matrix due to high glucose conditions.

As to endothelial cells, TGFbeta1 was demonstrated to be the mediator of high-glucose-induced extracellular matrix deteriorations, but TSP-1 is not responsible for TGFbeta1 activation. Fibrin D-dimer was found to induce the derangement of endothelial extracellular matrix that partially is mediated by TSP-1 - dependent TGFbeta1 activation. In contrast, the alterations of extracellular matrix in dermal fibroblasts treated with high glucose are not dependent on TSP-1 - TGFbeta1 pathway. The up-regulation of angiotensin II receptor type-1 and the consequent increase of connective tissue growth factor expression are involved in fibronectin synthesis stimulation due to high glucose effect on dermal fibroblasts.

Key words: diabetes mellitus, extracellular matrix, transforming growth factor beta1, thrombospondin-1, fibronectin, hyaluronic acid.

Размещено на Allbest.ru