Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

16.00.03 - Ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

План

Культуральні, молекулярно-біологічні та антигенні властивості вакцинних штамів erysipelothrix rhusiopathiae

Тарасов Олександр Анатолійович

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини Української академії аграрних наук

Науковий керівник - кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник, членкор УААН Ображей Анатолій Федорович, Інститут ветеринарної медицини УААН, директор

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор, членкор УААН Риженко Василь Петрович, Інститут ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії анаеробних інфекцій

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Бабкін Михайло Валерійович, Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів, завідувач відділу біотехнології і контролю якості вірусних препаратів

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус №4, кім. №28

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради С.В. Міськевич

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Бешиха є однією з найбільш поширених хвороб свиней, а її збудник Erysipelothrix rhusiopathiae здатний викликати захворювання тварин багатьох видів та людей (Урбан В.П., 1981; Геведзе В.И., Андросик Н.Н., Ленькова В.А., 1982; McCarthy D.H., 1986; Воронин Е.С., Романова М.В., 1987; Bricker J.M., Saif Y.M., 1997; Brooke C.J., Riley T.V., 1999; Wood R.L., 1999; Fidalgo S.G., Riley T.V., 2004).

За кількістю неблагополучних пунктів та рівнем летальності бешиха посідає сьоме місце серед 14 найбільш поширених інфекційних хвороб свиней, а за кількістю профілактичних щеплень - друге місце після профілактичної вакцинації проти класичної чуми свиней (Рахманов A.M., Яременко М.А., 2003).

Дослідженнями вітчизняних та зарубіжних вчених встановлено етіологію бешихи свиней, визначено епізоотологічні особливості її перебігу, розроблено методи діагностики, лікування та специфічної профілактики (Mc Carthy D.H., 1986; Bricker J.M., Saif Y.M., 1997; Brooke C.J., Riley T.V., 1999; Wood R.L., 1999; Fidalgo S.G., Riley T.V., 2004).

Однак, незважаючи на систематичні щеплення свиней, застосування антибіотиків та проведення ветеринарно-санітарних заходів, захворювання на бешиху свиней виявляють як в Україні, так і в країнах близького та далекого зарубіжжя. За допомогою проведених в останні роки досліджень встановлено, що спалахи бешихи в нашій державі зумовлені відсутністю достатньо ефективної та безпечної інактивованої вакцини проти бешихи свиней (Сініцин В.А., Ображей А.Ф., Остапець М.Г., Трясоруб О.Я., 1995).

Створення високоефективних вакцин потребує вивчення імуногенезу на молекулярному рівні, адже спонтанні та індуковані мутації спричиняють утворення нових штамів, у тому числі придатних для використання як виробничих (Shimoji Y., Mori Y., Fischetti V.A., 1999).

Для запобігання захворювання свиней на бешиху в Україні застосовують три живі вакцини - із штаму E. rhusiopathiae ВР-2, вар. ІВМ, із штамів ВР-2 і 6/24 (комерційна назва “Рузівак”), із штаму матриксу другої вакцини Конєва (комерційна назва „Бешивак”) та одну інактивовану - концентровану ГОА формолвакцину (комерційна назва „Бешиформ”) (Вербицький П.І., Головко А.М., 2004).

За даними Н.И. Тарасенок (1974), Y. Shimoji з співавторами (1994), Y. Imada з співавторами (1999, 2004), застосування живих вакцин на основі атенуйованих штамів, у тому числі ВР-2, може призвести до виникнення поствакцинальної бешихи свиней через наявність у вакцинних штамів гетерогенності за ознакою вірулентності.

У зв'язку з відсутністю в Україні високоефективної інактивованої вакцини проти бешихи свиней та потенційною небезпекою застосування живих вакцин, світовою тенденцією переходу до використання лише інактивованих вакцин, підбір високоімуногенних штамів з урахуванням їх культуральних, антигенних та молекулярно-біологічних особливостей, оптимізація складу живильних середовищ та режимів культивування бактерій бешихи для забезпечення максимального накопичення біомаси, придатної для створення ефективних інактивованих вакцин проти бешихи свиней, є актуальною проблемою, розв'язання якої дозволить ефективно вирішувати питання специфічної профілактики бешихи свиней.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є складовою частиною науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини Української академії аграрних наук за державним завданням на 2001-2005 рр. 06.03.01 “Розробити інактивовану емульсин-вакцину проти бешихи свиней”, номер державної реєстрації 0101U000790.

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень було вивчення культуральних, молекулярно-біологічних та антигенних властивостей штамів Erysipelothrix rhusiopathiae та пошук виробничого штаму, найбільш придатного для виготовлення інактивованих вакцин.

Для досягнення мети було висунено такі завдання:

вивчити культуральні, ферментативні, антигенні, молекулярно-біологічні та імуногенні властивості наявних у колекції Інституту ветеринарної медицини УААН штамів збудника бешихи свиней;

провести молекулярно-біологічні дослідження перспективних штамів Erysipelothrix rhusiopathiae;

оптимізувати склад живильних середовищ для культивування вакцинного штаму бактерій бешихи;

розробити метод інактивування вакцинних штамів та підібрати оптимальний ад'ювант для конструювання інактивованої вакцини проти бешихи свиней;

провести дослідження лабораторних зразків інактивованих моно- та полівакцин на нешкідливість та імуногенність в дослідах на лабораторних тваринах;

вивчити придатність та ефективність експериментально підібраного вакцинного штаму бактерій бешихи для виробництва інактивованої вакцини.

Об'єкт дослідження - збудник бешихи свиней та засоби її специфічної профілактики.

Предмет дослідження - визначення культурально-морфологічних, молекулярно-біологічних, антигенних, імуногенних та протективних властивостей штамів бактерій бешихи свиней.

Методи дослідження. Вивчення культуральних, ферментативних та молекулярно-біологічних властивостей штамів бактерій бешихи проводили загальноприйнятими методами після культивування на живильних середовищах, облік накопичення біомаси E. rhusiopathiae здійснювали методом послідовних розведень з подальшим висіванням на щільні живильні середовища; специфічні сироватки одержували методом гіперімунізації лабораторних тварин антигенами бактерій різних штамів; вивчення молекулярно-біологічних властивостей проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); аналіз протеїнового профілю бактерій бешихи досліджували за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі; антигенні властивості збудника бешихи відносно специфічних сироваток крові та наявність специфічних антитіл досліджували методом непрямого ІФА; ефективність вакцин вивчали зараженням щеплених тварин контрольними патогенними штамами E. rhusiopathiae 149 і К.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні проведено молекулярно-біологічні дослідження за геном основного протективного білка spaA музейних, вакцинних та окремих польових штамів E. rhusiopathiae, що використовуються для виробництва вакцин, та епізоотичних штамів, які циркулюють в Україні.

Вибір напрямків досліджень, матеріал і методи виконання роботи

Загальна методика та основні методи досліджень. Робота виконувалась впродовж 2000-2006 рр. у лабораторіях біотехнології бактеріальних препаратів та молекулярної біології Інституту ветеринарної медицини УААН. Дослідження протективної активності експериментальної вакцини проти бешихи свиней, виготовленої на основі антигену E. rhusiopathiae М-2 ВК, проводили в умовах господарства АПК „Криворіжсталь” (нинішня назва - АПК ВАТ „Арселор Міттал Кривий Ріг”).

При вивченні молекулярно-біологічних та антигенних властивостей E. rhusiopathiae використовували TEMED, 2-МЕ, ЕДТА - Merck; акріламід (2Х), бісакріламід, персульфат амонію - Serva^®; Coomassie R250 та Coomassie G250, Тween-20, Тріс-HCl, oртофенілендіамін, антитіла проти імуноглобулінів свині та миші, мічені пероксидазою хрону - Sigma^®; гліцерин - Fluka^®; агарозу NA, бромистий етидій, маркери молекулярної маси білків - Pharmacia^®; маркер "1 kb DNA ladder" - Stratagene^®; маркер “100 b(+) DNA ladder” - Fermentas^®; БСА (fr.V) - Boehringer Mannheim; Montanide ISA-25 (Seppіc^®); повний та неповний ад'юванти Фрейнда - Difco^®; знежирене молоко, мікробіологічні барвники - генціанвіолет, фуксин, розчин Люголя, метиленовий синій.

У роботі використовували штами бактерій E. rhusiopathiae 27, 149, 193, 251, 419, 1689, 1893, 1933, ВР-2 вар. ІВМ, М-2 ВК, К та Ш.

Вивчення нешкідливості, імуногенності та протективних властивостей експериментальних вакцин проводили на 1170 білих мишах масою 17±1г, 20 мурчаках масою 250±50 г та 124 підсвинках 3,5-4-місячного віку.

Для культивування E. rhusiopathiae застосовували м'ясопептонний бульйон та агар Хотінгера (МПБХ та МПАХ). При пошуку оптимального середовища для культивування вакцинних штамів бактерій бешихи в порівняльному аспекті використовували середовище Фейста (СФ), виготовлене за прописом автора (Feist H. et al., 1976) та модифіковане нами середовище Фейста (СФМ) складу: 6 г глюкози, 15 г пептону (Becton Dickinson, USA), 5 г дріжджового екстракту (Difco), 0,5 г аргініну (Sigma), 0,5 cм³ олеїнової кислоти (Merck), 0,2 г сульфату заліза (Merck) та 0,02 г сульфату цинку (Merck) в 0,2 M натрієвому фосфатному буфері, води дистильованої до 1000 cм³ (рН середовища 7,6±0,2).

Культивування бактерій бешихи у рідких живильних середовищах проводили за температури (36,7±0,3) С протягом 18-24 годин, на щільних - 48-72 години.

Тинкторіальні властивості культур бактерій бешихи вивчали візуально, продивляючись пробірки у проникаючому світлі. Морфологію колоній вивчали при триразовому збільшенні за допомогою лупи. Типовість бактерій та наявність дегенеративних форм визначали при мікроскопії мазків, пофарбованих за Грамом.

Вивчення біохімічних (ферментативних) властивостей штамів бактерій бешихи проводили за допомогою тест-системи API^® Сoryne фірми BioMeriex, France.

Кількість бактерій бешихи в культуральних рідинах визначали методом послідовних розведень з подальшим висіванням на агар Хотінгера і виражали у колонієутворюючих одиницях (КУО).

Порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей ДНК штамів бактерій бешихи, що досліджувались, а також розрахунок олігонуклеотидних праймерів виконували за допомогою програмного забезпечення „Vector NTI” v.8.0 (InforMax). При розрахунку специфічних олігонуклеотидних праймерів були використані послідовності ДНК бактерій бешихи, які зареєстровані в міжнародній базі даних сиквенсів генів GenBank, що є складовою міжнародного проекту International Nucleotide Sequence Database Collaboration. Як вихідна матриця була використана повна послідовність гена білка spaA (реєстраційний номер за міжнародним банком генів АВ019124) (Shimoji Y. et al. 1999; Shimoji Y., 2000).

Синтез розрахованих нами праймерів був виконаний фірмою “ThermoHybaid. BioSciences” (Німеччина).

Для вивчення молекулярно-біологічних властивостей штамів бактерій бешихи застосовували полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР).

Електрофорез білків проводили з метою аналізу протеїнового профілю бактерій бешихи із застосуванням методу електрофорезу в 12% та 15% поліакріламідному гелі у денатуруючих умовах за методикою U. Laemmli (1970).

Для вивчення антигенних властивостей досліджуваних бактерій бешихи різних штамів використовували імуноферментний аналіз у вигляді непрямого варіанта (Imada Y., Mori Y., Daizoh M. at al., 2003). Реакцію проводили на 96-лункових стриперованих пластикових планшетах (Nunc^®).

З метою підбору методу інактивування культур E. rhusiopathiae в порівняльному аспекті добові культури бактерій спочатку інактивували додаванням 0,3%-го розчину формаліну (Merck^®) (Н₂СО)_n (37%-й водний розчин формальдегіду) з подальшим витримуванням при кімнатній температурі (18-20°С) протягом 96 годин. Формалін перед змішуванням з культурою розводили стерильним фізіологічним розчином в об'ємному співвідношенні 1:1. В другому варіанті до культур бактерій бешихи додавали 0,1 Н розчин натрію гідроксиду, доводячи до рН 12 та витримували при кімнатній температурі 6 годин, після чого додаванням 1Н розчину HCl рН інактивованої культури доводили до 7,3±0,1.

Для підбору ад'юванту, придатного для виготовлення інактивованих вакцин проти бешихи свиней, ми в порівняльному аспекті вивчили та дослідили: 10%-й розчин алюмінію гідроксиду, який додавали до добових бульйонних культур бактерій бешихи в кількості 4%; суміш вазелінової олії з ланоліном у об'ємному співвідношенні 83:17 та суміш мінеральної олії Marcol 52 (ESSO, France) з ланоліном у співвідношенні 70:30, які додавали до культури в кількості 50%; готовий ад'ювант Montanide ISA 25 (Seppic, France), який додавали до культури в об'ємі 25%.

При виготовленні експериментальних зразків емульсин-вакцин як водну фазу використовували добові бульйонні культури бактерій бешихи, інактивовані 0,3%-м формаліном.

Щеплення тварин проводили з дотриманням правил асептики та антисептики. Щеплення мишей здійснювали шляхом підшкірного введення вакцин за допомогою шприца в об'ємі 0,2 см³. Свиням вакцину вводили внутрішньом'язово в дозах, передбачених схемою досліду.

Контрольне зараження мишей проводили шляхом підшкірного введення 0,2 см³ культури E. rhusiopathiae контрольного штаму 149 з вмістом 100 LD₅₀ живих бактерій бешихи. Періодично перед зараженням визначали LD₅₀ контрольного штаму для білих мишей.

Контрольне зараження свиней проводили шляхом внутрішньодермального введення бактерій E. rhusiopathiae К, розведених фізіологічним розчином, з латеральної сторони тіла, посередині умовної лінії від лопатки до стегна в 5 місць на відстані між ними 2-3 см в об'ємі по 0,2 см³. Всього кожній тварині сумарно вводили по 3 Ч10⁶ бактерій бешихи штаму К в об'ємі 1 см³.

Всіх заражених тварин щоденно протягом 10 діб піддавали індивідуальному клінічному огляду та дворазовій термометрії о 8 та 17 годинах. Оцінювали стан тварин, розмір та характер запалення шкіри в місцях внутрішньодермального зараження.

Активність нейтрофілів крові визначали в опсоно-фагоцитарній реакції за загальноприйнятим методом (Чумаченко В.Е. із співавт., 1990).

Протективну активність експериментальної інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней, виготовленої на основі антигену бактерій E. rhusiopathiae штаму М-2 ВК з ад'ювантом Montanide ISA 25, вивчали в комісійних дослідах на свинях за розробленою нами методикою, яка була затверджена Державним департаментом ветеринарної медицини України (наказ №53 від 05.05.2005 р.).

Всього було щеплено 109 підсвинків, у тому числі:

- три групи тварин (№№1, 2 та 3), відповідно, по 14, 25 та 27 голів, вакцинували дворазово з інтервалом 14 діб у дозах по 1, 2 та 3 см³, із вмістом по 2, 4 та 6Ч10⁹ бактерій бешихи (по 4, 8 і 12 Ч10⁹ м. к.);

- одну групу тварин (№4) в кількості 27 голів щепили одноразово в дозі 4 см³ (8Ч10⁹ м. к.).

З метою визначення напруженості імунітету проти бешихи у вакцинованих свиней через 46 та 180 днів після останнього щеплення від дослідних груп відбирали по 5 вакцинованих та 5 контрольних тварин та заражали внутрішньодермально патогенними бактеріями збудника бешихи контрольного штаму К у попередньо підтитрованій дозі.

Результати експериментальних досліджень оброблені загальноприйнятими методами статистики (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962) з використанням комп'ютерної програми „Microsoft Excel 7.0”. При цьому визначали середню арифметичну величину (М), її середньоквадратичне відхилення (у) та похибку середньої арифметичної (m). Вірогідність середніх величин (Р) між групами або в порівнянні з вихідними даними визначали за критерієм Ст'юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вивчення морфологічних та культурально-біохімічних властивостей збудника бешихи свиней різних штамів. Бактерії бешихи всіх штамів, що досліджувались (авірулентного штаму ВР-2 вар. ІВМ, патогенних контрольних штамів 149, К, Ш та помірно патогенних штамів 1933, 419, М-2 ВК, 1689, 1893, 93, 251), характеризувалися типовими культурально-морфологічними ознаками і добре росли в МПБХ та на середовищі Фейста з утворенням через 20-24 годин помутніння без плівки та пристінного кільця, яке при струшуванні мало вигляд так званих „муарових хвиль”, а при стоянні культур з часом утворювався осад, який при струшуванні піднімався у вигляді косички. На МПАХ через 48-72 години культивування бактерії бешихи утворювали дрібні гладенькі, прозорі, росинчасті колонії з рівними краями (S-форми), які через 72-96 годин набували ніжно-блакитного кольору. В мазках спостерігали Грам-позитивні тонкі, прямі палички, розташовані поодиноко або попарно. При вивченні ферментативних властивостей E. rhusiopathiae з використанням системи API^® Сoryne („Biomeriex”, France) встановлено, що всі досліджувані штами позитивно реагували з піролідоніларіламінідазою та ацетил-В-глюкозамінідазою, ферментували глюкозу та лактозу. Ферментативні властивості авірулентного штаму ВР-2 вар. ІВМ, патогенних контрольних штамів 149, К, Ш та помірно патогенних штамів 1933, 419, М-2 ВК, 1689, 1893, 93, 251 не відрізнялися.

Вивчення молекулярно-біологічних властивостей збудника бешихи. В дослідженнях були використані розраховані нами дві пари олігонуклеотидних праймерів:

- #ЕR1 та #ЕR2, які фланкують регіон гена spaА E. rhusiopathiae, що дозволяє диференціювати Е. rhusiopathiae від E. tonsillarum:

#ЕR1 - 5'-CGATTATATTCTTAGCACGCAACG-3'

#ЕR2 - 5'-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACT-3'

- #spaА_sn та #spaА_asn, які фланкують повний ген spaА E. rhusiopathiae:

#spaА_sn - 5'-CATATGAAAAAGAAAAAACACC-3'

#spaА_asn - 5'-GTCGACCAGATTTTAAACTTCCATCGTTC-3'

При електрофорезі результатів ампліфікації ДНК авірулентного штаму ВР-2 вар. ІВМ, патогенних польових ізолятів К та Ш, помірно вірулентних виробничих штамів 1933, 419, 1893, 93, М-2 ВК, контрольних заражаючих штамів 149 (для мишей) та 27 (для голубів) не встановлено відмінностей в досліджуваній ділянці ДНК гена spaА, на який були розраховані праймери.

Розмір ампліфікатів у всіх досліджуваних штамів становив 914 нуклеотидних пар (н.п.).

Цим було підтверджено гіпотезу про консервативність даної ділянки гена spaА E. rhusiopathiae та встановлено, що різниця в патогенності між зазначеними штамами не обумовлена відмінностями в дослідженій ділянці гена spaА.

М К(-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М

E. rhusiopathiae з праймерами #ЕR1 та #ЕR2, штами:

1 - М-2 ВК; 2 - Ш; 3 - К; 4 - ВР-2 вар. ІВМ; 5 -1933; 6 - 93; 7 - 149; 8 - 419;

9 - 1893; 10 - 27; М - маркери молекулярної ваги (“100 bp DNA ladder”);

К(-) - негативний контроль.

При електрофоретичному дослідженні отриманих нами ампліфікатів ДНК повного гена spaА E. rhusiopathiae встановлено, що їх розмір у всіх штамів, що досліджувались, відповідав розрахунковим даним - 1880 п.н., за винятком ДНК бактерій штаму М-2 ВК, розмір ампліфікату якої був більшим, ніж у інших штамів, і становив близько 2266 н.п. Нами було зроблено припущення, що це обумовлено наявністю інсерційної мутації в гені spaА E. rhusiopathiae М-2 ВК, завбільшки орієнтовно 400 н.п.

Електрофоретичним дослідженням в поліакриламідному гелі сумарного бактеріального білка Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК, у якого виявлено відмінності в розмірі гена spaA, нами було встановлено, що піку 66 кДа білкового маркера відповідає пік білка з молекулярною масою близько 67 кДа, який був ідентифікований нами як spaA, що відповідало розмірам цього білка, описаним J.E. Galan, J.F. Timoney, 1990 та I. Imada, N. Goji, H. Ishikawa et al., 1999. На підставі проведених досліджень ми зробили висновок, що зміни в гені spaA E. rhusiopathiae штаму М-2 ВК не впливають на продукування білка spaA.

Вивчення антигенної спорідненості бактерій бешихи свиней різних штамів. При проведенні досліджень цільноклітинних антигенів бактерій бешихи штамів 93, 251, 149, 1933, К, ВР-2 вар. ІВМ, М-2 ВК у непрямому варіанті ІФА встановлено, що всі вони проявили антигенну активність по відношенню до специфічних сироваток крові, отриманих на антигени E. rhusiopathiae штамів 149, К, ВР-2 вар. ІВМ, Ш та М-2 ВК.

Найвищу активність проявили антигени бактерій бешихи штамів М-2 ВК та 1933 як з гомологічними, так і з гетерологічними сироватками, отриманими на антигени патогенних штамів 149 та Ш та на антиген авірулентного штаму ВР-2 вар. ІВМ. Ці штами ми використовували при створенні експериментальних зразків інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней.

Визначення вірулентності E. rhusiopathiae для лабораторних тварин. Для визначення патогенності музейних штамів збудника бешихи свиней E. rhusiopathiae за LD₅₀ було проведено серію дослідів на мишах.

У результаті проведених досліджень встановлено, що найвищою патогенністю характеризувалися штами E. rhusiopathiae 149 (LD₅₀ для білих мишей становила 144±20 КУО на голову) і К (LD₅₀ для білих мишей становила 187±9 КУО на голову), дещо нижча вірулентність виявлена у штаму Ш, LD₅₀ якого становила 922±218 КУО на білу мишу. Ці штами можуть бути запропоновані для застосування як контрольні заражаючі при дослідженні імуногенності та протективних властивостей вакцин. Штами, що застосовувалися для виготовлення інактивованих вакцин, характеризувалися середньою або слабкою вірулентністю для білих мишей (LD₅₀ коливається від 14926±607 КУО у штаму 93 до 59721±1847 КУО у штаму 1933). Штам ВР-2 вар. ІВМ, який застосовують для виготовлення живої вакцини проти бешихи свиней, був непатогенним для мишей навіть в дозі, більшій 1Ч10⁶ КУО на мишу.

Визначення заражаючої дози патогенних штамів бактерій бешихи для мишей та свиней. Для визначення LD₅₀ контрольного високовірулентного штаму E. rhusiopathiae 149 було проведено дослід на мишах з восьми груп (по десять голів у групі), яким підшкірно в ділянці спини вводили по 0,2 см³ розтитрованої фізіологічним розчином сухої бульйонної культури з вмістом живих бактерій в кількості від 15±6 до 1000±49 в 1 см³. У результаті дослідів було встановлено, що LD₅₀ контрольного штаму 149 для мишей становила 104±3,3 КУО.

З метою визначення інфікуючої дози E. rhusiopathiae контрольного штаму К для зараження свиней при визначенні імуногенності вакцин було підібрано три групи тварин по 5 голів породи велика біла віком 3,5 місяців, клінічно здорових з температурою тіла в межах фізіологічної норми, не вакцинованих проти бешихи свиней.

Свиней дослідних груп заражали живими бактеріями бешихи контрольного штаму К внутрішньодермально. Свиням кожної групи вводили по 1 см³ культури з вмістом для свиней групи №1-2Ч10⁶ бактерій бешихи, групи №2-1Ч10⁶ бактерій бешихи, групи №3-0,5Ч10⁶ бактерій бешихи.

Захворювання свиней контрольної групи розпочиналося переважно на другу добу після введення патогенних бактерій бешихи. В місцях введення спостерігали характерне для бешихи запалення шкіри. З розвитком захворювання температура тіла підвищувалась до 42°С. У деяких заражених свиней процес набував генералізації. Спостерігали слабкість кінцівок, яка прогресувала - свині переважно лежали і майже не рухались.

Таким чином, ми встановили, що оптимальною заражаючою дозою збудника, яка викликає захворювання 100% свиней, є доза 1±0,04Ч10⁶ бактерій бешихи штаму К при внутрішньодермальному способі введення.

Підбір живильних середовищ та оптимізація умов культивування бактерій бешихи. З метою підбору найбільш придатних живильних середовищ та оптимізації умов культивування для одержання максимальних кількостей бактеріальної маси E. rhusiopathiae чотири штами (149, ВР-2 вар. ІВМ, М-2 ВК, Ш) в порівняльному аспекті культивували на МПБХ, середовищі Фейста (СФ) та модифікованому нами середовищі Фейста (СФМ) за температури (36,7±0,3) °С протягом 24 годин.

Методом посіву серійних розведень отриманих добових культур на МПАХ встановлено, що найбільший вміст бактерій всіх штамів отримано при культивуванні на СФМ. Вміст живих бактерій бешихи в культурах при вирощуванні на СФМ коливався від 8,56±0,08Ч10⁹ (штам 149) до 10,57±0,45Ч10⁹ (штам К) КУО в 1 см³, що в 2,7 рази (р < 0,05) перевищувало їх вміст при культивуванні в МПБХ (від 2,27±0,03Ч10⁹ КУО (штам 149) до 4,17±0,03Ч10⁹ КУО (штам К) в 1 см³ культури), та в 1,46 рази (р < 0,05) - при культивуванні на СФ (від 5,82±0,04Ч10⁹ КУО (штам ВР-2 вар. ІВМ) до 6,88± 0,01Ч10⁹ КУО (штам К) в 1 см³ культури). Найбільше накопичення бактеріальної маси E. rhusiopathiae М-2 ВК - 9,02±0,04Ч10⁹ КУО в 1 см³ ми отримували лише при культивуванні на СФМ.

Найбільше накопичення бактеріальної маси штамом М-2 ВК при культивуванні на СФМ підтверджувалось також вимірюванням оптичної густини відповідної культуральної рідини через 24 години після засівання. На СФМ вона становила 5,01±0,04 одиниць, СФ - 3,53±0,03 одиниць, на МПБХ - 2,77±0,03 одиниць.

Культивування окремих штамів збудника бешихи в середовищі МПБХ призводило до зменшення вихідного значення рН середовища з 7,3±0,1 до 6,23±0,07 (штам ВР-2 вар. ІВМ) та до 5,17±0,03 (штам М-2 ВК); в СФ - до 6,68±0,12 одиниць (штам ВР-2 вар. ІВМ) та до 4,95±0,06 (штам К). При культивуванні штамів у СФМ значення рН зменшувалось до 6,53±0,13 (штам 149) та 6,75±0,06 (штам ВР-2 вар. ІВМ).

При додатковому дослідженні динаміки росту E. rhusiopathiae М-2 ВК порівняно з апатогенним вакцинним штамом ВР-2 вар. ІВМ було підтверджено, що максимальне накопичення бактерій (9,8-11,4Ч10⁹ КУО в 1 см³) проходить на 18 годину культивування на середовищі СФМ при (36,7±0,3)°С (рис. 4).

Підбір методів інактивування бактерій бешихи виробничих штамів. При додаванні до культур E. rhusiopathiae штамів М-2 ВК, ВР-2 вар. ІВМ та К 0,3% розчину формаліну з подальшим витримуванням при кімнатній температурі (19±1)°С протягом 96 годин спостерігали повну інактивацію бактерій бешихи, що підтверджувалось відсутністю росту на всіх середовищах та збереженням структури клітин.

Додавання 0,1 Н розчину натрію гідроксиду до рН 12 та витримування при кімнатній температурі протягом 6 годин з подальшим зменшенням рН культури до 7,3±0,1 додаванням 1Н розчину HCl також забезпечувало повне інактивування бактерій, але призводило до порушення антигенної структури.

З метою забезпечення збереження структури клітин, зручності застосування та забезпечення консервуючої дії для інактивування бактерій бешихи виробничих штамів нами було рекомендовано 0,3%-й розчин формаліну з подальшим витримуванням при кімнатній температурі (19±1)°С протягом 96 годин.

Підбір ад'ювантів для інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи.

З метою підбору оптимальних ад'ювантів до інактивованих 0,3%-м формаліном добових культур бактерій бешихи окремо додавали 4% 10-відсоткового розчину алюмінію гідроксиду, по 50% суміші вазелінової олії з ланоліном та суміші мінеральної олії марколу з ланоліном, а також ад'ювант Montanide ISA 25 в кількості 25% і перемішували протягом 3-5 хвилин до утворення стійкої емульсії.

Лише ад'ювант Montanide ISA 25, який додавали до культури в кількості 25%, забезпечував утворення стійкої однорідної емульсії за консистенцією, подібною до молока, яка не розшаровувалась при зберіганні протягом 12 місяців (термін спостереження), та придатної для введення тваринам без додаткових підігрівань. Після підшкірного та внутрішньом'язового введення цієї емульсії лабораторним тваринам та свиням у місці введення утворювалось незначне припухання, яке протягом 10-14 діб повністю розсмоктувалось без будь-якого впливу.

Емульсії на основі сумішей вазелінової олії та ланоліну, а також марколу з ланоліном були густими, потребували додаткового підігрівання для зручного введення за допомогою шприца, а в місцях внутрішньом'язового введення тваринам викликали припухання, що не розсмоктувались протягом 14 днів і більше.

Виготовлення експериментальних серій інактивованих емульсин-вакцин проти бешихи свиней, дослідження на нешкідливість, реактогенність та імуногенність на мишах. Для вивчення імуногенності та нешкідливості запропонованих нами штамів E. rhusiopathiae ми виготовили вакцини із інактивованих формаліном бактерій штамів М-2 ВК, 251 та 1933; суміші інактивованих бактерій штамів 1933 та М-2 ВК, а також із суміші бактерій штамів 1933, 251 та М-2 ВК (табл. 1) з вмістом 1±0,1Ч10⁹ інактивованих бактерій бешихи в 0,2 см³ з додаванням 25% ад'юванту Montanide ISA 25. вакцинний ад'ювант бешиха свиня

Всі варіанти експериментальних зразків вакцин протягом 10 діб після підшкірного введення в дозі 0,2 см³ (1±0,1Ч10⁹ інактивованих бактерій) не спричиняли захворювань, загибелі або інших змін у піддослідних мишей, що свідчить про їх нешкідливість та ареактогенність.

Після підшкірного контрольного зараження всіх піддослідних мишей E. rhusiopathiae штаму 149 у дозі 100LD₅₀ було встановлено, що кращий захист (92%) забезпечувала вакцина із штаму М-2 ВК, найгірший був пов'язаний з вакцинами, виготовленими із антигенів штамів 1933 та 251 (по 25%), а у вакцин, виготовлених із антигенів суміші штамів, протективний ефект залежав від вмісту антигену штаму М-2 ВК та становив 67% при застосуванні вакцини, виготовленої на основі антигену двох штамів та 33% - трьох штамів (табл. 1).

Для підтвердження гіпотези щодо найвищої імуногенної активності штаму E. rhusiopathiae М-2 ВК на мишах, щеплених в дозі 1±0,1210⁹ інактивованих мікробних клітин (м.к.) в 0,2 см³, були досліджені експериментальні інактивовані вакцини, виготовлені за тією ж технологією з антигенів штамів E. rhusiopathiae - М-2 ВК; 93; 251; 419 та 1933.

Таблиця 1

Показники нешкідливості та імуногенності інактивованих емульсин-вакцин проти бешихи свиней, виготовлених на основі ад'юванта Montanide ISA 25 в дослідах на білих мишах, щеплених у дозі 0,2 см³ (1±0,1 Ч10⁹ м.к.)

Після зараження всіх піддослідних мишей E. rhusiopathiae 149 в дозі 100 LD₅₀ було встановлено, що вакцина зі штаму 251 забезпечувала захист 30%, зі штаму 419 - 20%, а із штаму 1933 - 40% щеплених тварин при загибелі всіх тварин контрольної групи та щеплених вакциною із штаму 93. Нами було підтверджено найвищу протективну активність антигену бактерій бешихи штаму М-2 ВК. Вакцина, виготовлена на основі цього антигену, забезпечувала захист від загибелі 90% щеплених мишей при контрольному зараженні (табл. 2).

При дослідженні крові, відібраної з серця щеплених дворазово моноштамними вакцинами мишей, спостерігали підвищення фагоцитарної активності нейтрофілів. Так, після щеплення мишей вакциною із антигену бактерій штаму М-2 ВК відсоток фагоцитозу збільшився з 31,0±3,42 до 62,0±1,77 (Р<0,05).

Таблиця 2

Показники нешкідливості та імуногенності інактивованих моноштамних емульсин-вакцин проти бешихи свиней при введенні білим мишам (доза 0,2 см³ з вмістом 1±0,12 10⁹ м.к.)

При застосуванні вакцини із штаму 93 відсоток фагоцитозу збільшився з 27,0±2,31 лише до 32±1,12 (Р<0,05); вакцини із штаму 251 - з 35,0±1,42 до 51±2,19; із штаму 419 - з 26,0± 5,121 до 52±1,87 та із штаму 1933 - з 26,0±1,9 до 46±2,25 на фоні стабільності рівня фагоцитозу нейтрофілів крові мишей контрольної групи (табл. 3).

Таблиця 3

Показники фагоцитарної активності макрофагів крові мишей, щеплених інактивованими моноштамними емульсин-вакцинами (M±m, n=10)

Примітка* - Р< 0,05 порівняно з показниками контрольної групи (до щеплення)

Фагоцитарний індекс нейтрофілів у два рази - з 2,0± 0,02 до 4,5±0,19 (Р< 0,05) - збільшувався лише при застосуванні вакцини із штаму М-2 ВК. Застосування інших вакцин (табл. 3) призводило лише до незначного збільшення показника фагоцитарного індексу при відносній стабільності його у крові, відібраній від тварин контрольної групи.

При дослідженні сироваток крові від мишей після щеплення інактивованою емульсин-вакциною зі штаму 93 титри специфічних антитіл до збудника бешихи свиней становили 4,2±0,11 log2; вакциною зі штаму 251 - 5,2±0,11 log2; вакциною зі штаму 419 - 4,2±0,11 log2; зі штаму 1933 - 5,2±0,11 log2 , а зі штаму М-2 ВК - 7,3± 0,21 log2 при майже однакових титрах антитіл у всіх тварин до щеплення та відсутності змін титрів антитіл до антигенів збудника бешихи у сироватках крові контрольних тварин.

Отже, в результаті проведених досліджень встановлено, що штам Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК, який має інсерцію в гені spaA, проявив найвищі протективні властивості в дослідах на мишах. На штам М-2 ВК одержано деклараційний патент України на корисну модель за № 10833.

Виготовлення та контроль якості експериментальної серії інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней. На підставі проведених нами досліджень шляхом інактивування бактерій бешихи штаму E. rhusiopathiae М-2 ВК 0,3 %-м розчином формаліну та додавання 25 % ад'юванта “Montanide ISA 25” було виготовлено експериментальну серію інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней із вмістом 4 Ч10⁹ інактивованих м.к. в 1 см³.

Вакцина була стерильною та нешкідливою для мишей. Через 14 діб після одноразового підшкірного щеплення в дозі 0,5 см³ вакцина забезпечувала захист 90 % вакцинованих тварин від загибелі після зараження бактеріями контрольного штаму E. rhusiopathiae 149 в дозі 100 LD₅₀ в 0,2 см³.

Вивчення нешкідливості та імуногенності експериментальної інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней в дослідах на свинях.

Для вивчення нешкідливості та імуногенності експериментальної інактивованої емульсин-вакцини проти бешихи свиней було вакциновано чотири групи тварин. Три групи, по 14, 25 та 27 голів відповідно, вакцинували дворазово з інтервалом 14 діб у дозах по 1, 2 та 3 см3 вакцини, із вмістом по 2, 4 і 6 Ч109 м. к відповідно. Тварин четвертої групи в кількості 27 голів щепили одноразово в дозі 4 см3 (8Ч109 м. к.). Контрольних тварин не щеплювали.