Культуральні, молекулярно-біологічні та антигенні властивості вакцинних штамів erysipelothrix rhusiopathiae

1. Визначення оптимальної заражаючої дози збудника бешихи контрольного штаму, що викликає зараження свиней / В.Ф. Павлов, А.Ф. Ображей, М.Г. Остапець, О.А. Тарасов // Ветеринарна медицина України. - 2000. - №8. - С. 26-27 (здобувач брав участь в проведенні дослідів, аналізі і узагальненні результатів).

2. Тарасов О.А., Ображей А.Ф., Сапейко В.П. Чутливість польових та музейних штамів збудника бешихи свиней до антибіотичних речовин // Ветеринарна біотехнологія. - 2004. - №5. - С. 140-143 (здобувач провів експериментальні дослідження, зроблено висновки, підготовлено статтю до друку).

3. Дослідження імуногенності емульсин-вакцин проти бешихи свиней на лабораторних тваринах / О.А. Тарасов, А.Ф. Ображей, М.Г. Остапець, В.Ф. Бабак, А.М. Головко, В.Г. Скрипник, Н.Г. Пінчук // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Харків, 2005. - Т. 2, №85. - С. 1063-1066 (здобувач провів виготовлення експериментальних варіантів вакцин та дослідження на лабораторних тваринах з визначення протективного ефекту).

4. Тарасов О.А. Дослідження імуногенності експериментальних інактивованих моноштамних емульсин-вакцин проти бешихи свиней в дослідах на лабораторних тваринах // Ветеринарна біотехнологія. - 2005. - №6. - С. 197-204.

5. Деклараційний патент України на корисну модель 10833 Україна, МПК С12N1/20, А61К39/02. Штам бактерій Erysipelothrix rhusiopathiae М-2ВК для виготовлення інактивованої вакцини проти бешихи свиней / О.А. Тарасов, А.Ф. Ображей, О.М. Дерябін (Україна)/ Інститут ветеринарної медицини УААН - № u200507495; Заявл. 27.07.2005; Опубл. 15.11.2005, бюл. №11. - 4 с. (здобувач провів експериментальні дослідження та оформив заявку на патент).

6. Деклараційний патент України на корисну модель 10834. Україна, МПК G01N33/00. Спосіб виявлення бактерій роду Erysipelothrix виду Erysipelothrix rhusiopathiae у біоптатах або патологічному матеріалі, або кормах, або об'єктах зовнішнього середовища / О.А. Тарасов, А.Ф. Ображей, О.М. Дерябін, Д.М. Іродов, О.Г. Дерябіна (Україна) / Інститут ветеринарної медицини УААН - №u200507497; Заявл. 27.07.2005; Опубл. 15.11.2005, бюл. №11. - 2 с. (здобувач провів експери-ментальні дослідження та оформив заявку на патент).

7. Методичні рекомендації з діагностики бешихи свиней методом полімеразної ланцюгової реакції / А.Ф. Ображей, О.А. Тарасов, О.М. Дерябін, О.Г. Дерябіна. - Київ, 2005 - 15 с. (здобувач брав участь у проведенні дослідів, оформленні протоколів).

8. Біопрепарат „Емульсин-вакцина проти бешихи свиней інактивована”: ТУУ 24.4 - 05510830-059: 2006. - Чинний від 13.10.2006. - Київ, 2006. - 17 с. (здобувач брав участь у проведенні експериментальних досліджень та оформленні нормативної документації).

9. Тест система „Бешиха - ПЛР тест” для виявлення ДНК Erysipelothrix rhusiopathiae методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ТУ У 24.2 - 05510830 - 067: 2006. - Чинний від 13.10.2006. - Київ, 2006. - 22 с. (здобувач брав участь у проведенні експериментальних досліджень та оформленні нормативної документації).

10. Вивчення нешкідливості та протективності інактивованої емульсин вакцини проти бешихи свиней / А.Ф. Ображей, О.А. Тарасов, І.І. Матяж //Ветеринарна медицина України. - 2007. - №2. - С. 39-42 (здобувач брав участь у плануванні дослідів, проводив щеплення та контрольне зараження дослідних тварин, обробку результатів дослідів).

11. Аналіз поліморфізму гена білка spa A Erysipelothrix rhusiopathiae / А.Ф. Ображей, О.М. Дерябін, О.А. Тарасов, О.Г. Дерябіна // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Харків, 2007. - №88. - С. 161-165 (здобувач дослідив молекулярно-біологічні властивості штамів бактерій бешихи щодо гена spa A в ПЛР ).

12. Вивчення антигенних властивостей Erysipelothrix rhusiopathiae різних штамів/ А.Ф. Ображей, О.А. Тарасов, О.М. Дерябін // Наук. вісник ЛНАВМ імені С.З.Гжицького, Львів, 2007. - Т. 9, № 1 (32). - С. 114-119 (здобувач провів експериментальні дослідження).

13. Тарасов О.А. Порівняльна оцінка живильних середовищ для культивування Erysipelothrix rhusiopathiae // Наук. вісник ЛНАВМ імені С.З. Гжицького. - Львів, 2007. - Т. 9, № 3 (34). - С. 192-198.

АНОТАЦІЇ

Тарасов О.А. Культуральні, молекулярно-біологічні та антигенні властивості вакцинних штамів Erysipelothrix rhusiopathiae - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - Ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2008.

На підставі проведених культурально-біохімічних, мікробіологічних, серологічних і молекулярно-біологічних досліджень підібрано та охарактеризовано штам Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК для виготовлення інактивованої вакцини проти бешихи свиней, оптимізовано склад живильного середовища та термін культивування з метою отримання максимальної біомаси бактерій. Запропоновано метод та режим інактивування бактерій бешихи, експериментально обґрунтовано застосування для виробництва вакцини ад'юванта “Montanide ISA 25”. Імуногенність штаму Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК, що мав інсерцію в гені spaA, підтверджено в дослідах на лабораторних тваринах і свинях.

Встановлено, що 11 штамів збудника бешихи свиней різних серотипів (1, 2а, 2в, N та нетиповані ізоляти) не відрізнялись між собою за біохімічними і культурально-морфологічними ознаками та мали однаковий розмір гена spaA - 1880 нуклеотидних пар.

Уперше встановлено інсерцію в гені spaA у ДНК Erysipelothrix rhusiopathiae штаму М-2 ВК завбільшки 400 нуклеотидних пар.

Експериментально підтверджено високу протективну активність штаму Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК у дослідах на мишах та свинях. Експериментальна емульсин-вакцина через 14 діб після підшкірного введення в дозі 2 Ч10⁹ м.к. забезпечувала захист 92 % щеплених мишей та 75 % піддослідних свиней через шість місяців після одноразового внутрішньом'язового щеплення в дозі 8 Ч10⁹ інактивованих бактерій бешихи.

Ключові слова: штам, бешиха свиней, ген протективного білка, ад'ювант, вакцина, імуногенність.

Тарасов А.А. Культуральные, молекулярно-биологические и антигенные свойства вакцинных штаммов Erysipelothrix rhusiopathiae - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - Ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2008.

На основании проведенных культурально-биохимических, микро- биологических, серологических и молекулярно-биологических исследований подобрано и охарактеризовано штамм Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК для изготовления инактивированной вакцины против рожи свиней, оптимизированы состав питательной среды и сроки культивирования с целью получения максимальной биомассы бактерий. Предложены метод и режим инактивирования бактерий возбудителя, экспериментально обосновано применение для производства вакцины адъюванта “Montanide ISA 25”. Иммуногенность Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК, у которого впервые была обнаружена инсерционная мутация в гене основного протективного протеина spaA, подтверждена в опытах на лабораторных животных: белых мышах и свиньях.

Установлено, что 11 штаммов возбудителя рожи свиней различных серотипов (1, 2а, 2в, N и нетипированные полевые изоляты) не различались между собой по биохимическим и культурально-морфологическим признакам и имели одинаковый размер гена spaA - 1880 нуклеотидных пар, что было подтверждено в ПЦР с использованием праймеров, рассчитанных на полный ген, и только в ДНК бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae штамма М-2 ВК установлена инсерция в гене spaA размером 400 нуклеотидных пар, которая, как мы полагаем, усилила иммуногенность данного штамма по сравнению с другими, использованными в проведенных опытах. При исследовании ДНК всех штаммов в ПЦР с праймерами, рассчитанными на участок гена spaA, отличий в размерах амплификатов установлено не было.

Подтверждено, что штамм Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК, наряду со штаммом 1933, в иммуноферментном анализе (непрямой вариант ИФА) проявлял наивысшую антигенную активность по отношению к гипериммунным сывороткам крови, полученным на антигены Erysipelothrix rhusiopathiae штаммов ВР-2 вар. ИВМ, 149, Ш та М-2 ВК, то есть был одинаково активным как по отношению к гомологичным, так и к гетерологичным сывороткам.

При изучении суточных культур методом последовательных разведений на мясопептонном агаре Хоттингера (МПАХ) установлено, что наибольшее накопление бактерий всех штаммов происходило при культивировании на модифицированной нами среде Фейста (СФМ) и количество бактерий колебалось от 8,56±0,08Ч10⁹ КОЕ (штамм 149) до 10,57±0,45Ч10⁹ КОЕ (штамм К) в 1 см³, что в 2,7 раза (р < 0,05) превышало их содержание при культивировании в МПБХ (от 2,27±0,03 Ч10⁹ КОЕ (штамм 149) до 4,17±0,03 Ч10⁹ КОЕ (штамм К) в см³), а также в 1,46 раза (р < 0,05), чем при культивировании на среде Фейста (СФ) (от 5,82±0,04Ч10⁹ КОЕ (штамм ВР-2 вар. ИВМ) до 6,88± 0,01Ч10⁹ КОЕ (штамм К) в 1 см³). Наибольшее накопление бактериальной массы - 9,02±0,04Ч10⁹ КОЕ в 1 см³ для бактерий штамма М-2 ВК регистрировали при культивировании на СФМ.

Наибольшее накопление бактериальной массы штаммом М-2 ВК при культивировании на СФМ также подтверждалось измерением оптической плотности культуральной жидкости через 24 часа роста. На СФМ она составляла 5,01±0,04 единиц, на СФ - 3,53±0,03 единиц и на МПБХ - 2,77±0,03 единиц.

Культивирование отдельных штаммов возбудителя рожи свиней в среде МПБХ приводило к снижению исходного значения рН среды с 7,3±0,1 до диапазона значений от 6,23±0,07 (штамм ВР-2 вар. ИВМ) до 5,17±0,03 (штамм М-2 ВК), в СФ до 6,68±0,12 единиц (штамм ВР-2 вар. ИВМ) и до 4,95±0,06 (штамм К). При культивировании штаммов в СФМ значение рН снижалось до 6,53 ± 0,13 (штамм 149) и 6,75±0,06 (штамм ВР-2 вар. ИВМ).

При исследовании динамики роста E. rhusiopathiae М-2 ВК по сравнению с апатогенным вакцинным штаммом ВР-2 вар. ИВМ было подтверждено, что максимальное накопление бактерий (9,8-11,4Ч10⁹ КОЕ в 1 см³) происходит на 18-ом часу с начала культивирования на среде СФМ при (36,7±0,3)°С.

Доказано, что выращивание вакцинного штамма М-2 ВК на модифицированной нами среде Фейста при температуре (36,7±0,3)°С в течение 24 часов обеспечивает наибольшее накопление биомассы бактерий рожи в культуральной жидкости до 9,02±0,04Ч10⁹ КОЕ/см³ при оптимальном значении рН (6,65±0,04) в конце культивирования.

Установлено, что полная инактивация бактерий рожи свиней с сохранением антигенных свойств и структуры бактериальных клеток происходит при добавлении формальдегида в количестве 0,3% и выдерживании при комнатной температуре в течение 96 часов.

На основании проведенных исследований, путем инактивирования бактерий рожи штамма М-2 ВК 0,3%-м раствором формалина и добавления 25% адъюванта “Montanide ISA 25”, нами была изготовлена экспериментальная серия инактивированной эмульсин-вакцины против рожи свиней с содержанием антигена 4Ч10⁹ м. к. в 1 см³.

Экспериментальная эмульсин-вакцина, которая была изготовлена на основе антигена, полученного из инактивированных формалином бактерий E. rhusiopathiae штамма М-2 ВК, через 14 суток после однократного подкожного введения в дозе 2Ч10⁹ м. к. обеспечивала защиту 92% вакцинированных мышей от заражения патогенным штаммом Erysipelothrix rhusiopathiae 149 в дозе 100 LD₅₀ и 75% опытных свиней через шесть месяцев после однократной внутримышечной прививки в дозе 8Ч10⁹ м.к. от заболевания при контрольном заражении рожистыми бактериями контрольного штамма К в дозе 3Ч10⁹ м. к..

Таким образом, нами предложен штамм E. rhusiopathiae М-2 ВК, который использован при разработке технологического регламента и технических условий биопрепарата „Эмульсин-вакцина против рожи свиней инактивированная” (ТУ У 24.4-05510830-059: 2006), регистрационное свидетельство №1933-04-0241-06 от 4 июля 2006 года. Экспериментально подтверждена достаточная протективная активность Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК в опытах на белых мышах и свиньях.

Ключевые слова: штамм, рожа свиней, ген протективного белка, адъювант, вакцина, иммуногенность.

Tarasov A. The cultural, molecular-biological and antigenic properties of Erysipelothrix rhusiopathiae vaccine strains - Мanuscript

The thesis for obtaining the degree of doctor of philosophy in veterinary medicine, specialty 16.00.03 - Veterinary microbiology and virology. - The National Agrarian University, Kyiv, 2008.

On the base of conducted cultural-biochemical, microbiological, serological and molecular - biological investigations it was choused and characterized strain Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 VК for making inactivated vaccine against swine erysipelas, optimized nutrient media and terms of cultivation for obtaining maximal bacterial biomass. It was offered the method and the order of the inactivation of erysipelas bacteria and experimentally substantiated using of adjuvant “Montanide ISA 25”. The immunity of the Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 VК strain, which was characterized as mutant strain with insertion in the main protective gene spa A, was confirmed in the experiments carried out on laboratory mouse and swine in pig farm condition.

It was substantiated, what 11 strains of erysipelas bacteria of different serotypes (1, 2a, 2b and unidentified isolates) had no biochemical and cultural - morphological peculiarities and had equal gene spaA size - 1880 b.p.

It was confirmed what strain Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 VК among with 1933 strain were the most active in indirect ELISA with hyperimmune serums against antigens

Erysipelothrix rhusiopathiae strains ВР-2 var. ІVМ, 149, Ш and М-2 VК.

Experimentally proved enough protective activity of Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 ВК strain in experiments with using mouse and pigs.

Experimental emulsion-vaccine on the base of the inactivated with formalin bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae М-2 VК in 14 days after single shot injection (dose per mouse - 2Ч10⁹ microbial cells) provided 92% protection of vaccinated mouse and 75% pigs in six months after single shot vaccination with vaccine, contained 8Ч10⁹ inactivated microbial cells.

Key words: strain, swine erysipelas, the protective protein gene, adjuvant, vaccine, immunity.

Размещено на Allbest.ru